Krooninen sairaus

tiivistelmä

Äskettäin hyväksytty solunsalpaajalääkeaineet hoitoon peräsuolen syöpä ( CRC) ovat tehneet joitakin vaikutuksia; kuitenkin on kiireesti uudempia kohdennettuja tekijöille ja strategioita kiertää CRC kasvua ja etäpesäkkeiden. CRC usein esittelee luontaista vastustuskykyä kemoterapiaa ja niille, jotka eivät reagoi aluksi myöhemmin hankkia lääkeresistenssin. Mekanismi mahdollisesti herkistää CRC solujen estämällä DNA-polymeraasi β (Pol-β) toimintaa. Temozolomide (TMZ), alkyloiva aine, ja muut DNA-yhteisvaikutuksia aiheuttavien käyttää DNA-vaurioita pääasiassa korjattavaksi Pol-β-suunnattu base Leikkauskorjauksessa (BER) kautta. Aiemmissa tutkimuksissa käytimme rakenne-pohjainen molekyyli telakointi Pol-β ja tunnistettu voimakas pienmolekyylisalpaaja- (NSC666715). Esillä olevassa tutkimuksessa olemme selvittäneet mekanismia, jolla NSC666715 ja sen analogit lohko Fen1 aiheuttama säikeen-syrjäytysaktiivisuus Pol-β-suunnattu LP-BER, aiheuttavat apurinic /apyrimidinic (AP) päällä keskittymisen ja aiheuttaa S-vaihe solukierron pidätys. Induktio S-vaiheen solusyklin pysähtymisen johtaa vanhenemista ja apoptoosia CRC solujen kautta p53 /p21-reitin. Meidän alustavat tulokset osoittavat myös 10-kertainen väheneminen IC

50 temotsolomidin yhdistettynä NSC666715. Nämä tulokset antavat oppaan kehittämiseen tavoitteellisesti määritelty strategia CRC kemoterapiaa, joka perustuu toimintamekanismit NSC666715 ja TMZ. Tämä yhdistelmä strategiaa voidaan käyttää kehyksenä edelleen vähentää TMZ annokset ja vastarintaa CRC potilailla.

Citation: Jaiswal AS, Panda H, Law BK, Sharma J, Jani J, Hromas R, et al. (2015) NSC666715 ja sen analogit esto Strand-tilavuus aktiivisuus DNA Polymerase β ja voimistaa temotsolomidi aiheuttama DNA-vaurio, Vanheneminen ja apoptoosi peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 10 (5): e0123808. doi: 10,1371 /journal.pone.0123808

Academic Editor: Robert W. Sobol, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 22 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 07 maaliskuu 2015; Julkaistu: 01 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Jaiswal et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: taloudellinen tuki näissä tutkimuksissa saatiin National Institutes of Health (NIH) avustus R01-CA097031. Celprogen Inc. tuettiin muodossa palkkojen tekijöille Jay Sharma ja Jitesh Jani, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut. Jay Sharma ja Jitesh Jani työskentelee Celprogen Inc. ja taloudellisia etuja yhtiön. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmas yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuolinsyy Amerikan miehet ja naiset (Cancer Facts ja kuviot 2014 American Cancer Society, Atlanta, GA). Nykyinen lähestymistapa löytämässä syöpälääkkeitä nojaa puoliempiirisiä seulonta menettelyjä. Kuitenkin tunnistaminen aineiden tällä menetelmällä on osoittautunut tehottomaksi hoidettaessa CRC takia riittämätön ymmärtää niiden farmakologian ja niiden summa-kokonaisvaikutus kohtalosta soluista

in vivo

ympäristössä, että yhteydessä poikkeava reittejä, ja kasvaimen mikroympäristössä [1-4].

on hyvin tunnettua, että kompensoiva DNA-korjaus kapasiteetti kasvainsoluissa rajoittaa huomattavasti tehoa DNA-alkyloimalla syöpälääkkeet ja, tärkeintä, johtaa toistumisen lääkeresistenttiä kasvaimia [5-7]. DNA: n käytön, alkyloivat aineet, kuten kemoterapeuttisten perustuu niiden kykyyn laukaista solukuolema vastaus [8], ja niiden terapeuttinen teho määritetään tasapaino DNA-vaurion ja korjaus. DNA-alkylointi vaurioita aiheuttama vauriot korjataan DNA-polymeraasi β (Pol-β) -johdetussa pohja Leikkauskorjauksessa (BER), O

6-metyyliguaniini DNA-metyylitransferaasin (MGMT), ja mismatch korjaus (MMR) polkuja. On huomattava, että inhibiittorit, jotka on kehitetty syöpälääkkeiden kohdistuvat pääasiassa näiden kolmen reittejä [9, 10]. Aktiivinen hajoamistuote DNA-alkyloidaan aihiolääke-temotsolomidin (NSC362856, 3,4-dihydro-3-metyyli-4-oksoimidatso [5,1

d

] -1,2,3,5-tetratsiini -8-karboksamidi) on 5- (3-methyltriazen-1-yyli) imidatsoli-4-karboksamidi (MTIC) [11, 12], joka metyloi DNA: ta, N

7-metyyliguaniini (N

7meG), N

3-metyyliadeniinin (N

3meA), N

3-metyyliguaniini (N

3meG) ja O

6-metyyliguaniini (O

6meG) alenevassa järjestyksessä reaktiivisuus. BER vastaa korjaus 70%, 5% ja 9% N

7-MeG, N

3-MeG, ja N

3-Mea vaurioita aiheuttama TMZ, vastaavasti [13- 16]; kuitenkin mahdollinen hyöty Pol-β kuin tavoite BER reitin esto ei ole tutkittu.

aiemmissa tutkimuksissa, olemme osoittaneet, että pieni molekyyli NSC666715 [4-kloori-N- [5- (4-kloorianilino) -1 H-1,2,4-triatsol-3-yyli] -5-metyyli-2-sulfanylbenzenesulfonamide] jäljittelee vuorovaikutusta adenomatoottisen polypoosin coli (APC) ja Pol-β ja läppä endonukleaasi 1 (Fen1) salpaa Pol-β-suunnattu BER koulutusjakson, ja tehostaa sytotoksisuutta TMZ ja CRC [17]. TMZ tuottaa katkeamisen aikana BER välittämää korjaus N

7-MeG ja N

3-mea adduktit. Keskeyttäminen ryhmäpoikkeusasetuksen reitin voi edistää sytotoksisuutta TMZ johtuu kertyminen AP sivustoja jälkeen sukupolven DNA katkeamisen [18]. Temotsolomidi-solukuolema on raportoitu välittyvän useita reittejä tyypistä riippuen syöpäsolujen ja lääkkeen pitoisuus.

Jos AP sivustot on korjattu, ne kasaantuvat ja johtavat yksijuosteiseen DNA tauot (SSBs) että viivyttää DNA replikaatiohaarukan ja muodostavat kaksijuosteiset (ja yksijuosteiseen) DNA taukojen S-vaiheen. Nämä aukirullaamaton haarukat laukaista apoptoosin, kun ne romahtaa muodostaen yksipuolinen kaksijuosteiset DNA katkoksia (DSB: t) [19]. Kemoterapian aiheuttama DSB liittyvät vanhenemista ja apoptoosia [20, 21]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme miten saarto BER-reitin NSC666715 (ja sen analogit) voi olla mukana TMZ aiheuttama AP päällä kertymistä, ja vanhenemista ja apoptoosia HCT116 CRC soluissa. Keskeinen hypoteesi on, että saarron ryhmäpoikkeusasetuksen indusoi merkittävää kertymistä TMZ-välitteisen AP sivustoja johtaa vanhenemista seuraa kaspaasi 3 /PARP1 pilkkominen. Tämä on ennustettu johtaa CRC kasvun inhibition apoptoosin kautta, mikä johtuu alentuneesta anti-apoptoottisen proteiinin, Bcl2, ja kohonneita pro-apoptoottisen proteiinin, Bax [22, 23].

Materiaalit ja menetelmät

ylläpito solujen ja hoidon

HCT116 ihmisen paksusuolen syövän solulinjoissa villiin

p53

geeni (p53

+ /+) tai

p53

geeni-pudotuspelit (p53

– /-) tai

p21

geeni-pudotuspelit (p21

– /-) kasvatettiin McCoyn 5a väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ( FBS, HyClone), 100 U /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä. HCT116-solulinja saatiin ATCC: ltä (Manassas, VA). Tämä solulinja on käytetty, koska se on vastustuskykyinen alkylointiaineita vuoksi MMR puute. HCT116 (p21

– /-) ja HCT116 (p53

– /-) solulinjat saatiin Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University) [24, 25].

Oligonukleotidit ja kemikaalit

Oligonukleotidit pitkän patch (LP) -BER määritys ostettiin Sigma-Genosys (Woodlands, TX). T4-polynukleotidikinaasia (PNK) hankittiin New England Biolabs (Ipswich, MA) ja radionuklidi [γ-

32P] ATP ostettiin Perkin Elmer, Inc. (Boston, MA). Pienmolekyylisalpaajien (pkt) NSC666715 ja sen analogien NSC661073 [N- (5-anilino-1 H-1,2,4-triatsol-3-yyli) -4-kloori-5-metyyli-2-sulfanylbenzenesulfonamide], NSC666713 [2 – [2 – [(5-anilino-1 H-1,2,4-triatsol-3-yyli) sulfamoyyli] -5-kloori-4-metyylifenyyli] sulfanylacetic happo], NSC666717 [4-kloori-N- [5- (3-metoksianilino) -1 H-1,2,4-triatsol-3-yyli] -5-metyyli-2-sulfanylbenzenesulfonamide], ja NSC666719 [4-kloori-5-metyyli-N- [5- (naftalen-2 -ylamino) -1 H-1,2,4-triatsol-3-yyli] -2-sulfanylbenzenesulfonamide], ja temotsolomidin saatiin Developmental Therapeutics Program National Cancer Institute National Institutes of Health (DTP, NCI-NIH ). Kemiallinen rakenne Näiden pkt on esitetty kuviossa 1.

kemialliset rakenteet NSC666715 ja sen analogit NSC661073, NSC666713, NSC666717 ja NSC666719 on piirretty käyttäen ChemDraw ohjelmistoa.

synteesi ja leimaus DNA alustat

vaikutuksen tutkimiseksi -teollisuuden on Pol-β-suunnattu säikeen-siirtymä ja LP-BER toimintaa, 63-meerioligonukleotidiä syntetisoitiin, kuten on kuvattu aiemmin [26]. Nukleotidisekvenssi tämän oligonukleotidi sisältää AP päällä analogisen tunnetaan F (3-hydroksi-2-hydroksimetyylitetrahyd-), joka on sijoitettu 24-nt ja nimitystä F-DNA: ta (5′-CTAGATGCCTGCAGCTGATGCGCFGTACGGATCCACGTGTACGGTACCGAGGGCGGGTCGACA-3 ’). F-DNA puhdistettiin geelillä ja leimattiin [γ-

32P] ATP: tä 5′-päähän käyttäen T-4-polynukleotidikinaasia ja hehkutetaan komplementaarisen oligonukleotidin juosteen.

In vitro

säikeen-siirtymä synteesi ja LP-BER Pitoisuus

Pol-β-suunnattu säikeen-vausmäärityksessä reaktioseos koottiin 30 ul: n tilavuudessa 30 mM Hepes, pH 7,5, 30 mM KCI, 8,0 mM MgCl

2, 1,0 mM DTT: tä, 100 ug /ml BSA: ta, 0,01% (v /v) Nonidet P-40, 2,5 nM

32P-leimattu 63-meeri F-DNA-substraatin, 2 nM AP-endonukleaasi 1 (APE1), 5 nM Pol-β ja 0-125 uM -teollisuuden. LP-BER Reaktio saattaa käyttövalmiiksi puhdistettujen proteiinien lopullisessa reaktiotilavuudessa 30 ui, joka sisälsi 30 mM HEPES, pH 7,5, 30 mm KCI, 8 mm MgCl

2, 1 mm ditiotreitolia, 100 ug /ml naudan seerumin albumiinia, 0,01% Nonidet P-40, 0,5 mm: n ATP: tä, ja 10 um: dATP, dCTP, dGTP ja dTTP. Reaktioseos koottu jäällä lisäämällä 0,5 nm APE1, 2,5 nm Pol-β, 10 nm läppä endonukleaasi 1 (Fen1), ja 100 nm: n DNA-ligaasi-I, ja sitten inkuboitiin 5 minuuttia. Reaktiot aloitettiin lisäämällä 2,5 ng

32P-leimattu 63-meeri F-DNA, jota seuraa inkubointi 37 ° C: ssa 45 min. Reaktio lopetettiin lisäämällä Stop Buffer -valmistetta (0,4% (w /v) SDS: ää, 5 mM EDTA, 1 ug proteinaasi K) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 30 min [17, 26-29]. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa, DNA otettiin talteen fenoli /kloroformi-uutolla ja etanolisaostuksella. Talteen DNA pestiin kylmällä 70% etanolilla ja suspendoitiin näyte lastaus väriainetta. Reaktiotuotteet erotettiin 15%: sta akryyliamidia ja 7 M ureageelillä. Radioaktiiviset signaalit visualisoitiin autoradiografialla.

Western blot-analyysi

Western blot -analyysiä varten, yksisoluiset suspensiot HCT116-solut maljattiin (0,5 x 10

6 solua per 60 mm malja ) kolmena kappaleena. 24 tunnin kuluttua, kun solut on kiinnitetty levyihin, niitä käsiteltiin pienmolekyylisalpaaja- (t) yksinään tai yhdessä Temotsolomidilla 48 tuntia. Muutokset proteiinin tasot jälkeen hoitoon SMI: n määritettiin Western blot -analyysillä käyttäen kokosolu-uutteita. Vasta-aineita käytetään havaitsemaan tasoja p53, p21, Bcl2, Bax, Poly [ADP-riboosi] polymeraasi 1 (PARP-1), pilkottiin PARP1, pilkottiin kaspaasi 3, kaspaasi 3, apoptoosia indusoivan tekijän (AIF) ja GAPDH saatiin Cell Signaling Technologies (Danvers, MA).

arvio AP sivustoja genomista DNA

arvioimiseksi määrän AP sivustoja, yhden solususpensio HCT116-solujen maljattiin ( 0,5 x 10

6 solua kuoppaa kohti) kolmena kappaleena kuuden kuopan levyillä. Kun solut on kiinnitetty levyt, ne esikäsiteltiin 2 h 25 uM NSC666715, NSC666717 ja NSC666719 seurasi 500 uM temotsolomidin hoitoa vielä 48 tuntia. Solut kerättiin ja AP sivustot määritettiin käyttäen kuvattua menettelyä aiemmissa tutkimuksissa [30, 31]. Genomi-DNA käsiteltyjen ja käsittelemättömien ryhmien eristettiin käyttäen GenElute Nisäkkäiden genomi-DNA: n eristä- Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Viisi 10 ug genomista DNA: ta 150 ul: ssa 1x PBS: ää inkuboitiin 1 mM aldehydin reaktiivisen koetin (ARP) (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) 37 ° C: ssa 10 min, minkä jälkeen saostettiin etanolilla ja liuotettiin lopuksi 1x TE-puskuria (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 7,2) ja kvantitoitiin.

ARP reagoi AP sivuston sisältävän genomisen DNA: ta ja muodostaa kompleksin, joka voidaan kvantitatiivisesti havaita käyttäen kemiluminesenssiosoitusta. Lyhyesti, yksi ug ARP-käsitelty lämmöllä denaturoitua DNA slot-blotattiin positiivisesti varatulle nailonkalvolle (Amersham Corp., Piscataway, NJ). Nailonmembraanille imeytettiin 5 x SSC (0,75 M NaC1, 0,075 M trinatriumsitraatti), 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan, kuivataan hetken aikaa ilmassa ja paistettiin tyhjöuunissa 80 ° C: ssa 1-2 tuntia. Kalvo esi-inkuboitiin 10 ml: lla Tris-NaC1 puskuria, joka sisälsi BSA: ta (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaC1, 1 mM EDTA, 0,5% kaseiinia, 0,25% BSA, ja 0,1% Tween 20: tä) huoneenlämpötilassa 1 h. Sitten membraania inkuboitiin samassa liuoksessa, joka sisältää streptavidiini-konjugoitua piparjuuriperoksidaasi (BioGenex, San Ramon, CA) huoneenlämpötilassa 30-45 min. Kalvo huuhdeltiin kolme kertaa 10 minuuttia kutakin pesupuskurilla (0,26 M NaC1, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HC1, ja 0,1% Tween 20, pH 7,5), ja piparjuuriperoksidaasi entsymaattinen aktiivisuus on membraani visualisoitiin käyttämällä ECL-reagenssilla (Amersham Corp., Piscataway, NJ). Kalvo altistettiin sitten röntgenfilmille (Kodak XAR 5x, Kodak) 5-10 sekuntia. Kehitetyn kalvo analysoitiin kvanti- AP sivustoja käyttäen ImageJ ohjelmaa (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014 ). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Vanheneminen liittyy β-galaktosidaasin aktiivisuus määritys (SA-Pgal Assay) B

Vanheneminen liittyy-β-gal-aktiivisuus mitattiin kuten aiemmin on kuvattu [32, 33] kanssa vähäisiä muutoksia [34]. HCT116-soluja esikäsiteltiin 2 h pkt seurasi TMZ hoitoa vielä 48 tuntia. Solut subkonfluentteja viljelmiä pestiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), kiinnitettiin 4% (v /v) paraformaldehydillä PBS: ssä 10 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja pestiin jälleen kolme kertaa PBS: llä. Soluja inkuboitiin tuoreita värjäys, joka sisälsi 1 mg /ml 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli β-D-galaktosidi (X-gal), 40 mM sitruunahappoa, natriumfosfaattia (pH 6,0), 5 mM kalium- ferrisyanidi, 5 mM kaliumferrosyanidia, 150 mM NaCl ja 2 mM MgCl

2 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sininen-värjättyjen solujen havaittiin mikroskoopilla (Leica DMI 4000B). Määrä vanhenemista-associate β-gal-positiivisia soluja havaittiin ja analysoitiin mikroskoopilla (Leica DMI 4000B), ja määrä SA-β-gal-positiivisten solujen (sinisiä soluja) laskettiin yhteensä jää alue kuva. Olemme mielivaltaisesti visuaalisen tuotteiden poissulkemiseksi väärien positiivisten solujen taustana SA-β-gal-positiivisten solujen määrätyllä alueella on otettu kuva. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina SA-β-gal-positiivisten solujen kokonaismäärään soluihin [35].

Fluoresenssi solulajittelu- (FACS) B

määrittämiseksi solusyklin etenemisen profiili, me päällystetty HCT116-solujen 60 mm kudosviljelymaljoille ja kasvoi niitä, kunnes ne saavuttivat 60% konfluenssiin. HCT116-soluja esikäsiteltiin 2 h NSC666715 (50 uM) ja PFTα (10-30 uM) ja sen jälkeen TMZ (500 uM) vielä 48 tuntia kuten taulukossa 1 legenda. Solut kerättiin, pestiin kerran jääkylmällä PBS: llä, ja käsiteltiin FACS-analyysillä, kuten aiemmin on kuvattu [36]. Solun DNA-pitoisuus analysoitiin käyttäen Becton-Dickinson FACScan-virtaussytometrillä (San Jose, CA). Ainakin 10000 solua näytettä pidettiin aidatulla alueilla käytetään laskelmissa. Vaihteluväli G

0 /G

1, S, G

2 /M ja osa-G

1 vaihe (apoptoottisia soluja) lasketaan perustuen niiden vastaavia DNA sisällön histogrammien. Tulokset analysoitiin ja ilmaistiin prosenttiosuuksia aidatulla soluihin käyttäen ModfitLT 3.1 -ohjelman (Verity Software House, Topsham, NE).

Tilastollinen

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa ja tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE. One Way varianssianalyysi (ANOVA) laskettiin SigmaPlot 9 (Systat Software, San Jose, CA). Yhden-tailed t-testiä käytettiin vertaamaan mitään merkittävää eroa kontrollin ja käsiteltyjen välillä ryhmiä. Kriteeri tilastollinen merkitsevyys oli p 0,05. Länsi blotting tuloksia, kaistaintensiteettejä mitattiin käyttämällä ImageJ ja normalisoidaan GAPDH.

Tulokset

Pol-β estäjä NSC666715 ja sen analogit estävät LP-BER käytettäessä

vuonna vitro

käyttövalmiiksi järjestelmän

Tässä tutkimuksessa testasimme useita analogeja NSC666715, kuten NSC661073, NSC666713, NSC666717, ja NSC666719 niiden kyky estää LP-BER. Edustaja LP-BER Tulokset esitetään kuvassa 2. ulkonäkö 23-mer viillon tuotteen Lane 2 osoittaa toiminnallinen aktiivisuus APE1 proteiinia. Pol-β-välitteistä 1-nt sisällytetty 24-mer tuotteen Lane 3 ja lohkon siirtymän tuotteiden Lane 4. stimulaation säikeen-siirtymä synteesi Pol-β by Fen1 on vakiintunut piirre Fen1 välittämää LP-BER [28, 29, 37, 38]. Näissä kokeissa, osoitimme, että pkt vähentää Fen1-välitteisen juosteen-syrjäytysaktiivisuus Pol-β (kuvio 2, vertaa kaista 5 6-9, 10-13, 14-17, 18-21, ja 22-25, vastaavasti), seurauksena estetty LP-BER (kuvio 2, vertaa 63-mer korjattu tuote kaista 4 6-9, 10-13, 14-17, 18-21, ja 22-25, vastaavasti). -teollisuuteen Edelleen osoitti saarron LP-BER 50 uM; mutta suurin vertailukelpoinen saarto nähtävissä pienemmillä pitoisuuksilla suoritettiin NSC666715 ja sen kaksi analogit NSC666717 ja NSC666719 (kuvio 2, vertaa kaista 5 14-17, 18-21 ja 22-25, vastaavasti).

LP-BER määritettiin käyttäen

in vitro

rekonstruoitu koejärjestelmässä.

paneeli A

esittää kokeellista protokollaa. Määritys yksityiskohdat on esitetty materiaalit ja menetelmät.

Paneeli B

esitetään autoradiogrammi LP-BER, joka on tyypillinen kolmesta eri kokeesta. Kaista 1 esittää

32P-leimattua 63-mer F-DNA: ta ja kaista 2 esittää 23-mer tuote jälkeen APE1 viilto. Kaista 3 esittää Pol-β-välitteinen säikeen-siirtymä synteesi. Kaista 4 esittää Pol-β-välitteinen säikeen-siirtymä synteesi stimuloi Fen1 (kaista 4). Kaista 5 esittää täydellisen korjaus 63-meeri F-DNA läpi LP-BER-reitin läsnä ollessa APE1, Pol-β, Fen1 ja DNA-ligaasi-I kaistat 6-9, 10-13, 14-17, 18 -21 ja 22-25 osoittavat vaikutuksen eri pitoisuuksia Pol-β-inhibiittorit NSC 661073, 666713, 666715, 666717 ja 666719 on LP-BER aktiivisuutta.

Pol-β säikeen iskutilavuuden estäjät lisäävät taakkaa AP sivustoja CRC-soluissa sen jälkeen, kun temotsolomidin hoidon seurauksena solutoksisuuteen

näissä kokeissa olemme määritetään laajuus DNA-vaurion tai AP: n generointi sivustoja jälkeen temotsolomidi hoidon läsnä ollessa tai puuttuessa -teollisuuteen että HCT116-solulinjassa. Testatut pkt (NSC666715, NSC666717 ja NSC666719) osoitti kasvua AP sivustoja (kuvio 3, vertaa kaista 1, 2), ja taakka AP sivustoja lisäsi edelleen yhdistelmällä käsittelemällä TMZ (kuvio 3, vertaa kaista 1, jossa 3 ja 4, vastaavasti). Koska -teollisuuteen estää Pol-β-reitin ja eivät häiritse MMR polku, odotetusti ei ollut merkitsevää eroa tasolla AP sivustoja sekä MMR-puutteellinen ja MMR-asiantunteva HCT116 solulinjoissa jälkeen TMZ hoito yksinään tai yhdessä jossa pkt (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että pkt NSC666715, NSC666717, ja NSC666719 ovat spesifisiä Pol-β-suunnattu saarto ryhmäpoikkeusasetuksen koulutusjakson, ja siksi mukana TMZ aiheuttama kertyminen AP sivustoja.

Soluja esikäsiteltiin 2 h 25 uM pienmolekyylisalpaajien NSC666715, NSC666717 ja NSC666719, jota seuraa käsittely 500 uM temotsolomidin vielä 48 tuntia. Genomi-DNA eristettiin ja käsitellään AP päällä määrittämiseksi, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.

paneeli A

esittää slot blot analyysi AP sivustoja HCT116-soluissa käsiteltiin 25 uM NSC666715, NSC666717 ja NSC666719 ja 500 uM TMZ.

Paneeli B

esittää kvantitatiivinen analyysi AP sivustoja. Tulokset esitetään keskiarvona ± SE kolmen eri määrityksen. * = Merkittävästi erilainen kuin hoitamattomaan verrokkiryhmään (P 0,05).

TMZ indusoi p21 tasoilla kautta p53-reitin

Voit selvittää TMZ aktivoi p53 /p21-reitin ja onko NSC666715 osoittaa mitään vaikutusta tämän reitin kautta, käsittelimme HCT116-soluja temotsolomidilla yksinään tai yhdessä NSC666715. Tulokset osoittivat merkittävä kasvu sekä p53 ja p21 tason jälkeen TMZ hoito yksinään (kuvio 4A ja 4B, vertaa kaista 1 ja 2). Käsittely NSC666715 yksinään ei ollut vaikutusta p53 tasolla, mutta p21 nousivat (kuvio 4A ja 4B, vertaa kaista 1 ja 3). Tämä viittaa siihen, että NSC666715 saattavat vaatia hyvin vähän p53 aktiivisuutta p21 aktivaation tai aiheuttaa p21 kautta p53-riippumaton mekanismi. Yhdistelmä temotsolomidin ja NSC666715 lisääntynyt p53 ja p21 tasoilla, mutta samassa määrin kuin niiden yksittäisten hoitojen (kuvio 4A ja 4B, vertaa raidat 1-4).

HCT116-soluja esikäsiteltiin eri pitoisuuksilla PFTα ja 50 uM NSC666715 2 tuntia ja sitten 500 uM TMZ yksinään tai yhdessä vielä 48 tuntia. Solut kerättiin, ja solulysaatit valmistettiin ja käsiteltiin Western blot-analyysi. Paneeli A esittää immunoblot-p53, p21, GAPDH ja β-aktiini-proteiineja. Paneeli B on kvantitatiivinen edustus p53 ja p21-proteiinin tasoa normalisoinnin jälkeen kanssa GAPDH. Kaista 1 esittää p53 ja p21-proteiinin tasot hoitamattomaan verrokkiryhmään ja kaista 2 ja 3 käsittelyn jälkeen 50 ja 500 uM NSC666715 ja temotsolomidin, vastaavasti. Tulokset Lane 4 ovat yhdistelmä hoidon 50pM NSC666715 ja 500 uM TMZ. Tulokset Lane 5 ovat yhdistelmästä hoidon 50pM NSC666715 ja 30pM PTFα. Tulokset Kaistat 6-8 osoittavat p53 ja p21 tasot hoidon jälkeen 10, 20 ja 30 uM PFTα, vastaavasti. Tulokset Kaistat 9-11 ja 12-14 ovat yhdistelmähoidot joko 500 uM TMZ ja 10, 20 ja 30 uM PFT, tai 50pM NSC666715, 500pM TMZ ja 10, 20 ja 30 uM PFT, vastaavasti. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE kolmesta eri kokeesta. * Ja

# = Merkittävästi erilainen kuin käsittelemätön kontrolli (P 0,05).

edelleen ymmärtää onko lisäys p21 tasoilla jälkeen TMZ ja NSC666715 hoito oli p53-riippuvainen, päätimme p53 ja p21 tasoilla HCT116-soluissa (joka sisältää villityyppisen p53 ja p21) ja HCT116 (p53

– /-) soluja (p53-pudotuspelit ja villityypin p21) kanssa TMZ yksinään tai yhdessä NSC666715. Tulokset osoittivat merkittävä kasvu sekä p53 ja p21 tason jälkeen TMZ hoito yksinään (kuvio 4A ja 4B, vertaa kaista 1, 2) in HCT116-soluissa. Tutkia, TMZ välittämää nousu p21 taso aiheutti p53, käsittelimme HCT116 (p53

– /-) solut TMZ ja määritettiin p21 tasolla. Tulokset eivät lisääntymistä p21 HCT116 (p53

– /-) solut jälkeen TMZ hoidon, mikä viittaa siihen, että toimiva p53 vaaditaan p21 induktioon (kuvio 4A). Edelleen tarkistaa tämän, me esikäsitelty HCT116-solujen pifithrin-α (PFTα), p53: n estäjä, joka alas-säätelee

p21

geenin ilmentymistä [39], jota seuraa käsittely temotsolomidihoitoon. Tulokset osoittivat, että hoito PFTα yksin HCT116-soluissa vakiintui p53 ja laski p21 tasolle samalla p21 HCT116 (p53

– /-) solut pysyivät muuttumattomina (kuvio 4A, vertaa kaistoja 6-8) osoittaa, että p53 on osallisena p21 asetuksen (kuvio 4A ja 4B, vertaa kaistoja 6-8). PFTα laski myös p21-tasojen annoksesta riippuvalla tavalla hoidon jälkeen TMZ yksinään tai yhdessä NSC666715 (kuvio 4A ja 4B, vertaa kaistoja 9-11 ja 12-14, vastaavasti). PFTα ja NSC666715 käsitellyt solut osoittivat joitakin kertymistä p53 ja p21-proteiineja (kuvio 4A ja 4B, kaista 5), ​​mikä viittaa siihen, että NSC666715 voi vaatia myös p53 /p21-reitin sen toimintaan.

TMZ saaneista HCT116-solut, jotka on pidätetty S-vaiheen solusyklin vapautuu PFTα hoito

osoitettu rooli p53 solusyklin pysähtymiseen seuraavat NSC666715 ja TMZ hoitoa. Olemme esikäsitelty HCT116-solujen kanssa eri pitoisuuksilla PFT-α seuraa temotsolomidin hoito FACS-analyysillä. FACS-analyysi havaittiin merkittävä S-vaiheen pysähtymisen solujen jälkeen temotsolomidin hoidon, joka väheni, kun läsnä PFTα konsentraatiosta riippuvalla tavalla (taulukko 1). Vaikka ei ollut vaikutusta NSC666715 hoito yksinään, PFTα hoito aiheutti merkittävän S-vaiheen pysähtymisen pienemmillä pitoisuuksilla. Kuitenkin korkeammilla PFTα pitoisuuksina, solut vapautettiin S-vaiheen ja kerääntynyt G

1-vaihe. PFTα hoito vähensi S-vaiheen pidätys HCT116-solujen hoidon jälkeen TMZ tai yhdessä NSC666715. PFTα ja NSC666715 käsittely yhdessä ei ollut mitään vaikutusta S-vaiheen pysähtymisen. Kertyminen solujen G

2 /M vaiheessa ennen apoptoosin alkoi 48 tuntia käsittelyn jälkeen, joko temotsolomidia yksin tai, kun läsnä on NSC666715, mutta vaikutus ei ollut merkittävä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että temotsolomidi indusoi S-vaiheessa solusyklin pysähtymisen, joihin liittyy p53-signalointireitin, joka voidaan kumottu PFTα. Olemme kuitenkin tunnustettava, että PFTα vaikutukset voivat johtua sekä p53-riippuvaisen ja riippumaton mekanismeja.

NSC666715 parantaa TMZ aiheuttamaa vanhenemista in HCT116-soluissa

Ensin määritetään onko Temotsolomidilla voi aiheuttaa vanhenemista vuonna HCT116-solut. Tulokset osoittivat kasvua SA-Pgal värjäys; indikaattori vanhenemisen, ja temotsolomidi-käsiteltyjen HCT116-soluja (kuvio 5A ja 5B). NSC666715 yksin ei merkittävästi indusoi vanhenemista paksusuolen syöpäsoluissa. Kuitenkin NSC666715 yhdessä temotsolomidin laukeaa ja useammin vanhenemisen liittyy β-gal-positiivisten solujen annoksesta riippuvaisella tavalla, ja jatkui tilastollisesti merkittävä kasvu vanhenemista. Lisäksi temotsolomidin soluihin johti 36%, 48%, 60%, 64% ja 60% induktio vanhenemisen (kuvio 6A ja 6B). Nämä tulokset korreloivat NSC666715-välitteisen kasvu kertyminen AP sivustoja ja lisääntynyt p53 /p21-aktiivisuutta, joilla on tehostunut vanhenemiseen in temotsolomidin-käsiteltyjen HCT116-soluissa.

HCT116-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla temotsolomidin 48 tuntia ja sitten käsitellään SA-pgal värjäystä. Paneeli A esittää SA-Pgal värjäystä. Paneeli B esittää kvantitatiivinen analyysi SA-Pgal värjäystä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE neljälle eri arvioita. * = Merkittävästi erilainen kuin käsittelemätön kontrolli (p 0,05).

HCT116-soluja esikäsiteltiin eri pitoisuuksia NSC666715 2 tuntia, jota seuraa käsittely 250 uM temotsolomidin vielä 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut käsitellään SA-Pgal värjäystä. Paneeli A esittää SA-Pgal värjäystä. Paneeli B esittää kvantitatiivinen analyysi SA-β gal värjäys. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE neljälle eri arvioita. * Ja

# = Merkittävästi erilainen kuin käsittelemätön kontrolli tai 10, 25, 50 ja 100 uM NSC666715 käsiteltyjen ryhmien vastaavasti (p 0,05).

TMZ aiheuttama vanhenemista on p53 /p21 riippuvainen

Kun hoito

p53

ja

p21

geeni knockout HCT116 (p53

– /-) ja HCT116 (p21

– /-) solulinjat [25, 40] 500 uM TMZ 48 tuntia, havaitsimme vahvaa kasvu SA-pgal värjäytyminen HCT116-soluissa ja selvästi pienempi värjäytymistä sekä HCT116 (p53

– /-) ja HCT116 ( p21

– /-) solulinjoja (kuvio 7A ja 7B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että p53-riippuvaisen p21 aktivoitumista tarvitaan temotsolomidin aiheuttaman vanhenemisen in HCT116-soluissa.

HCT116-solujen kanssa tai ilman p53 ja p21 ilmentymistä hoidettiin 500 uM temotsolomidia 48 h, ja käsiteltiin sitten SA -βgal värjäystä. Paneeli A esittää osallistumista p53 ja p21 TMZ aiheuttamaa vanhenemista. Paneeli B on kvantitatiivinen analyysi tiedoista, jotka esitetään keskiarvona ± SE neljän eri arvioita. * = Merkittävästi erilainen kuin käsittelemätön kontrolli (p 0,05).

PFTα lohkot TMZ aiheuttamaa vanhenemista in HCT116-soluissa tai ilman NSC666715 hoitoa

edelleen vahvistaa, että tehostettu vanhenemista in HCT116 hoidon jälkeen TMZ yksinään tai yhdessä NSC666715 edellyttää p53 /p21-reitin, tutkimme SA-pgal värjäytyminen HCT116-soluissa käsitelty PFTα, NSC666715 ja TMZ yksinään tai yhdistelminä (kuvio 8A ja 8B). Hoito-olosuhteet olivat samat kuin kokeissa edellä. Hoito NSC666715 ja PFTα yksinään eivät osoittaneet mitään lisäystä SA-pGal värjäytymistä (kuvio 8A [aiii] ja 8A [b]) verrattuna kontrolliin (kuvio 8A [ai]). PFTα hoito pienensi temotsolomidin aiheuttama SA-Pgal värjäytymistä HCT116-solujen annoksesta riippuvalla tavalla (vertaa kuvio 8A [aii] kanssa 8A [c]). Lisäksi parantamiseksi SA-Pgal värjäyksen jälkeen temotsolomidin ja NSC666715 yhdistelmähoito väheni myös, kun HCT116-soluja esikäsiteltiin eri pitoisuuksilla PFTα (vertaa kuvio 8A [aiv] kanssa 8A [d]). Nämä tulokset edelleen vakiintunut rooli p53 /p21-reitin TMZ aiheuttaman vanhenemisen in HCT116-soluissa, ja tämä osoittaa, että NSC666715 välittämä BER signalointi riippuu p53 /p21-reitin.

HCT116-soluja esikäsiteltiin eri pitoisuuksilla PFTα (10-30 uM) ja /tai 50 uM NSC666715 2 h, mitä seurasi käsittely 500 uM temotsolomidia vielä 48 tuntia. Paneeli A osoittaa SA-Pgal Solujen värjäytyminen. Paneeli B esittää kvantitatiivisen analyysin määrän SA-Pgal positiivisia soluja. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE neljälle eri arvioita.

¶ = Merkittävästi erilainen kuin käsittelemätön kontrolli (p 0,05).

# = Merkittävästi erilainen kuin 50 uM NSC666715 yksin hoidetussa ryhmässä (p 0,05).

§ ja

§§ = Merkittävästi erilainen kuin 10 ja 20 uM PFTα yksin käsiteltyjen ryhmien vastaavasti (p 0,05). *, ** Ja *** = Merkittävästi erilainen kuin 500 uM TMZ yhdessä 10, 20 ja 30 uM PFTα käsiteltyjen ryhmien vastaavasti (p 0,05).

TMZ aiheuttamaa vanhenemista