Krooninen sairaus

tiivistelmä

Semiconductor kvanttipistei- edustavat uutta luokkaa fluoroforien ainutlaatuinen fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet, jotka mahdollistavat merkittävän laajentamisen nykyisen sovelluksia fluoresoivan kuvantamisen ja optista diagnostiikka. Kompleksit Kvanttipisteiden ja vasta-aineet ovat lupaavia visualisointiin aineita loisteputki havaitsemiseksi valikoiva biomarkkereita yliekspressoituvat tuumorikudoksissa. Ohessa kuvataan rakentamisen itsejärjestyvien loisteputki kompleksit Kvanttipisteiden ja anti-HER1 tai anti-HER2 /neu scFv-vasta-aineita ja niiden vuorovaikutusta viljeltyjen kasvainsolujen. Sitova strategia perustuu hyvin erityinen ei-kovalenttinen vuorovaikutus kahden proteiinien, barnasegeenin ja barstargeenin, käytettiin yhdistää kvanttipisteiden ja kohdistaminen vasta-aineita. Tällainen strategia mahdollistaa yhdistyvät kohdentamista ja visualisointi toimintoja yksinkertaisesti vaihtelemalla vastaavia moduuleja fluoresoivan monimutkainen.

Citation: Zdobnova TA, Stremovskiy OA, Lebedenko EN, Deyev SM (2012) itsejärjestyvien komplekseja Kvanttipisteiden ja scFv vasta-aineet syöpäsolu Targeting ja Imaging. PLoS ONE 7 (10): e48248. doi: 10,1371 /journal.pone.0048248

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 21 syyskuu 2012; Julkaistu: 25 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 Zdobnova et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Venäjän perustutkimusrahaston (hanke nro. 12-04-00757-a, 11-04-12091-OFI-m-2011, ja 10-04-01506), puheenjohtajiston Venäjän tiedeakatemian (Molecular Nanomateriaalit) ja opetus- ja tiedeministeri Venäjän federaation (hanke nro. 16.740.11.0497, 14.740.11.0253, 16.512.11.2053 ja 11.G 34. 31,0017). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suurista menetelmiä fluoresoivien tuumorien visualisoinnin on yksi, joka perustuu havaitsemiseen valikoiva biomarkkereita yli-ilmentynyt kasvainkudoksissa, jonka avulla paljastaen kasvaimen tyyppi, metastaattinen prosesseja, kasvaimen lääkeresistenssi, jne. [1]. Contrasting aineita käytetään tähän tarkoitukseen koostuvat yleensä kahdesta osasta, tai moduulit: visualisoivaa moduuli, joka on vastuussa kohteen havaitsemisen ja kohdistaminen, joka sitoutuu selektiivisesti tietyn solutyypin.

Viime vuosikymmenen, loisteputki puolijohde nanocrystals, kutsutaan kvanttipistei- (QD), ovat herättäneet paljon huomiota kuin visualisointiin aineina biologisissa sovelluksissa. Kaikkein edullisin ominaisuudet QD ovat merkittäviä fluoresointikirkkauden, valostabiilius, leveä heräte ja kapea emissiospektrien, ja rikas paletti spektrisesti viritettävä emissiokaistat jne Nämä ominaisuudet mahdollistavat monivärinen merkintöjä ja samanaikainen tunnistaminen erilaisten biologisten kohteiden sekä pitkäaikaisina bio-kuvantaminen [2].

koska kohdistaminen moduuli, scFv vasta näytti olevan lupaava sekä

in vitro

ja

in vivo

sovelluksissa [ ,,,0],3]. ScFv-vasta-aineet koostuvat yhdestä polypeptidin yhdistävien vaihtelevat domeenit immunoglobuliinin kevyen ja raskaan ketjun, jotka on liitetty peptidisidoksen avulla. Tällainen vasta-aine johdannaisia ​​voidaan valmistaa bakteeri-ilmentämisjärjestelmissä vakaana proteiinien säilyttää antigeenispesifisyys täyspitkä vasta-aine, mutta josta puuttuu Fc-domeeni, joka on vastuussa efektorifunktio immunoglobuliinien ja yleensä ei ole toivottavaa in vivo kohdistaminen sovelluksissa.

tässä työssä mallin vasta-aineita (kuten kohdistaminen moduuli), päätimme kasvaimen vastainen 425scFv [4] ja 4D5scFv [5], jotka selektiivisesti sitoutuvat oncomarkers HER1 /EGFR ja HER-2 /neu, vastaavasti. Nämä oncomarkers ovat transmembraaninen proteiinien perheeseen kasvutekijän reseptoreita, joita yli-ilmennetään monissa kasvainsoluissa ja on suuri ja ennustavia merkitys [6]. Aiemmin nämä scFv: t, on käytetty onnistuneesti kohdennettua antoa varten fluoresoivien proteiinien ja terapeuttisia aineita kasvainsolujen [7], [8], [9], [10].

Tällä hetkellä on olemassa kaksi lähestymistapaa on QD konjugaatio kohdentamisaineita: suora konjugointi ja konjugaation kautta sovittimen molekyylejä. Suora konjugaatio ei ole optimaalinen menetelmä, koska kohdistaminen aineita ovat muuttuneet aikana konjugaation menettelyn. Esimerkiksi vasta-aineita konjugoituna QD säilyttää antigeenispesifisyydeltään mutta niiden affiniteetti voi merkittävästi vähentää. [11]. Lisäksi suora konjugaatio QD kohdistusryhmään vasta-edellyttää testaamalla vasta-aineen aktiivisuus kussakin yksittäistapauksessa.

käyttö itsejärjestyvien adapterit – pieni ja ”tahmea” molekyylejä, tehokkaasti ja nimenomaan sitoutumaan toisiinsa muodostamatta homodimeerien, näyttää olevan lupaavampi menetelmä sitomaan kohdistaminen vasta-aine QDS. Tässä työssä esittelemme barnasegeenin-barstar järjestelmä (BBS) kuin universaali työkalu tuottaa loisteputki komplekseja eri selektiivisyyden ja parametrit fluoresenssin perusteella QDS ja scFv vasta-visualisointiin syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Bakteeri-ilmentyminen ja puhdistus rekombinanttiproteiinien

mutantti barstar C40 /82A (tässä kutsutaan barstar), villityypin barnasegeenin [7], [12], yhdistelmä-DNA-anti- HER2 /neu 4D5scFv ja anti-HER1 425scFv vasta-aineet [13] sekä (4D5scFv)

2-Bn fuusioproteiini [14] tuotettu

Escherichia coli

ja puhdistettiin kuten aiemmin on kuvattu [7].

ekspressioplasmidin 425scFv-B-fuusioproteiinia rakennettiin pohjalta PSD-4D5scFv-barstargeenin plasmidista [15] (

kuva 1

). Genetic engineering tavoin, solujen viljely ja solujen lyysi suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. DNA-fragmentti, joka koodaa 425scFv proteiinia monistettiin pKM30425M1ChCl plasmidista [4] käyttämällä alukkeita 5’GACTCGATATCGAAGTGCAACTGCAGCAGTC ja 5’CTGTGGAATTCCCGTTTGATCTCCAGTTCTG. Tuote on vahvistus kloonattiin PSD-4D5scFv-barstargeenin plasmidin sijasta 4D5scFv geenin avulla EcoRV ja EcoRI restriktioendonukleaaseilla. Tuloksena PSD-425-B-His

6 konstrukti varmistettiin sekvensoimalla.

425scFv-B-His

6 konstruktio alkaa N-pään lyhyen FLAG tag (F, tummansininen ) ja sen jälkeen 425scFv V

H-linkkeri-V

L suunta (V

H, syaani, L, harmaa, V

L, turkoosi), 16 aminohapon sarana linkkeriä (vihreä ), barstargeenin (violetti). Konstrukti päättyy His

6-tag (tumman sininen), on kiinnitetty C-päähän 425scFv-barstar fuusioproteiinin. Fuusio geeni on valvonnassa

lac

promoottori.

OMpA

– signaalipeptidi kohdennetusta eritystä rekombinanttiproteiinin että

E. coli

periplasmasta.

tuotannossa 425scFv-Bs sisältävä His

6-tag

C

-pään,

Escherichia coli

-kanta BL21 transformoitiin PSD-425-B-His

6 ja kasvatettu lysogenian liemessä (LB) 28 ° C: ssa. 425scFv-B-ilmentyminen indusoitiin lisäämällä 0,5 mM IPTG on OD

550 0,8. Bakteerit inkuboitiin sitten 28 ° C: ssa 12 tuntia. Solut kerättiin, sentrifugoitiin, ja pelletti suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (0,01 M Tris-HCl, pH 8,3, 0,1 M NaCl ja 10 mM EDTA) ja sonikoitiin jäillä. Sitten lysaattia sentrifugoitiin 22000 g: llä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pelletti käytettiin puhdistamatta Hänen

6-leimatun proteiinin Ni

2 + -NTA-pylvästä (Qiagen) denaturoivissa olosuhteissa mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Proteiini denaturoitiin 8 M ureaa, laskostetaan uudelleen 5 tuntia käyttämällä lineaarista gradienttia 8-0 M ureaa ja eluoitiin 250 mM imidatsolia. Lopulliseksi puhdistamiseksi 425scFv-Bs, eluointi fraktiot laimennettiin 20-kertaisesti, levitetään Q Sepharose FF 1-ml: n kolonniin (GE Healthcare) ja eluoitiin käyttäen lineaarista gradienttia 0-500 mM NaCl.

SDS /PAGE analyysi proteiinien suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti käyttäen 14% (ja barnaasin ja barstar) tai 12,5% (muiden rekombinanttiproteiinien) polyakryyliamidigeeleillä.

QD konjugaatio

QDS kanssa fluoresenssiemissio maksimi 565 tai 605 nm käytettiin suunnittelussa visualisoimalla moduulin. Karboksyyliryhmä päällystettyjä QDS (Qdot 565 ITK ™ karboksyyli kvanttipisteiden ja Qdot 565 ITK ™ karboksyyli kvanttipisteiden, Invitrogen) konjugoitiin jommankumman BBS proteiineista käyttämällä EDC /NHS kytkentäkemia. 2 uM QDS 0,1 M MES (pH 6,0) ja 0,5 M NaCl ensin aktivoitiin EDC: tä (~ 2 uM) ja NHS (-5 uM) huoneen lämpötilassa 15 min ajan. Reaktioseos levitettiin Sephadex G-25-pylvääseen ja eluoitiin puskurilla, joka sisältää 40 mM Na2B4O7 ja 30 mM KH2PO4, pH 8,0. Seuraavaksi eluoidaan aktivoiduille hiukkasille sekoitettiin barstar tai barnasegeenin liuotetaan samaan puskuriin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktioseos levitettiin Sephadex G-25-pylväässä ja sitoutumattomien proteiinien eluoitiin PBS: llä (pH 7,4). QD: proteiini moolisuhteet optimoida kutakin proteiinia.

agaroosigeelielektroforeesi

elektroforeesi QDS ja QD-konjugaattien suoritettiin käyttäen 1% agaroosigeelillä TAE-puskurissa (50 mM tris-asetaatti , 1 mM EDTA, pH 7,6), 10 V /cm 30 min. QDS laimennettiin TAE ja sekoitetaan 6 × latauspuskuria (50% glyserolia, 0,1% Bromifenolisini) ennen lastausta geelille. Geelit visualisoitiin kanssa Transilluminator Multi Doc-Se Digital Imaging järjestelmän.

Barstar ja barnasegeenin aktiivisuusanalyysiä

ribonukleaasiaktiivisuuden barnasegeenin, (4D5scFv)

2-Bn ja QD-Bn konjugaatit testattiin happoon liukenematonta RNA presipitaatioanalyysissä kuvattu [16], jossa muutos kaikkien liuoksen volyymit vähennettiin 5-kertaiseksi. Aktiivisuus barstar, 425scFv-B, ja QD-B konjugaattien arvioitiin niiden kyky estää ribonukleaasi aktiivisuutta barnasegeenin. Barnasegeenin tasaisella pitoisuutena 26 nM inkuboitiin sarja- kaksoislaimennokset barstargeenin, 425scFv-B tai QD-Bs konjugaatteja. Saadut liuokset käytetään sitten Rushizky määrityksessä [16].

arviointi vasta-aineen affiniteetin

mittaukset dissosiaatiovakio suoritettiin käyttäen BIAcore välineitä (BIAcore 3000). Rekombinantti p185

HER2-ECD tai ekstrasellulaarisen domeenin EGFR (Sino Biological, Inc.) kytkettiin päälle CM5 sirulle tiheydellä 4500 RU tavallisilla amiinikytkennällä kemiaa. Kaikki proteiinit käytettiin neljää (1 uM, 330 nM, 110 nM ja 37 nM) HBS-PE (0,1 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl: a, 3 mM EDTA, 0,005% Tween-20). Sensograms saatiin virtausnopeudella 5 ul /min 25 ° C: ssa. Dissosiaatio vaihe kesti 20 min.

Soluviljelmät

Ihmisen munasarjan adenokarsinooma SKOV-3 (HTB-77, ATCC), ihmisen epidermoidikarsinooma A431 (CLR-1555), ja kiinalaisen hamsterin munasarjan CHO (Russian Cell Culture Collection) -soluja viljeltiin McCoyn 5A-alustassa (for SKOV-3) tai RPMI-1640 (ja A431 ja CHO), jossa 10% (v /v) vasikan sikiön seerumia (HyClone), ja 2 mM

L

-glutamine. Soluja kasvatettiin 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Solun merkintöjä ja kuvantamisen

HER2 /neu-suunnattu solukuvauksessa, SKOV-3-solut yli-ilmentävät HER2 /neu olivat maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 2 x 10

4 solua per kuoppa ja viljeltiin yön yli. Solut pestiin kahdesti PBS: llä (pH 7,4) ennen värjäystä. Kaikki proteiinit ja QD konjugaatteja liuotettiin PBS: ään (pH 7,4). Kun lyhyt pesu kylmällä PBS, soluja viljeltiin sen jälkeen kanssa (4D5scFv)

2-Bn kohdistaminen proteiinin lopulliseksi pitoisuudeksi 30 nM ja sitten 80 nM QD

605-B tai QD

565-B-konjugaattien 40 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kunkin inkubaation jälkeen vaiheen, solut pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä (pH 7,4). Tulokset solujen merkintöjä analysoitiin käänteinen fluoresenssimikroskoopilla Axiovert 200 (Zeiss, Saksa). Kuvat saatiin käyttämällä CCD-kameraa (AxioCamHRc, Zeiss, Saksa) ja AxioVision ohjelmisto (Zeiss, Saksa).

HER1-suunnattu solun kuvantaminen suoritettiin samalla tavalla, käyttäen HER1 yli-ilmentyvä A431-soluja, 425scFv-Bs kohdistaminen moduulin ja QD

605-Bn tai QD

565-Bn visualisointiin moduulit.

Virtaussytometrianalyysi

Virtaussytometriako- analyysiä varten solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille (Corning) tiheydellä 4 x 10

3 solua per kuoppa ja viljeltiin yön yli. Solut värjättiin edellä kuvatulla tavalla. Värjätään solut irrotettiin PBS: llä (pH 7,4), joka sisälsi 5 mM EDTA: ta ja sentrifugoitiin. Pelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää (pH 7,4), joka sisälsi 0,1% natriumatsidia. Soluun liittyvä fluoresenssi-intensiteetti mitattiin käyttämällä FACS Calibur virtaussytometrillä (BD Bioscience) viritysaallonpituudella 488 nm (argon laser). Fluoresenssi on vähintään 10000 solua per näyte analysoitiin. Solujen autofluorisaatiota arvioitiin käyttäen PBS-käsiteltyjen solujen valvontaa.

In vitro

sytotoksisuus analyysi

sytotoksisuus käytettyjen QDS, niiden konjugaatteja ja komplekseja on solulinjaan arvioitiin käyttämällä Mikrotitrauksen määrityksessä. SKOV-3-soluja siirrostettiin tiheydellä 4 x 10

3 solua per kuoppa 96-kuoppaisen levyn, ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten soluja inkuboitiin PBS: llä (pH 7,4), joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia QD koettimien 4 ° C: ssa 1 h. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä (pH 7,4) ja viljeltiin 48 h Standart olosuhteissa. 48 tunnin kuluttua, solujen elävyys arvioitiin standart MTT-analyysi, kuten on kuvattu [9]. Solun elinkelpoisuus ilmaistiin prosentteina optinen tiheys käsittelemättömien solujen kahdesta kokeesta tehtävä kolmeen kertaan.

Tulokset

Yleinen strategia: barnasegeenin-barstar järjestelmä

meidän edellinen työ, barnasegeenin-barstar järjestelmä (BBS) kehitettiin alun perin vasta-multimerisaatiodomeeni [15], [17]. Bakteerien ribonukleaasi barnasegeenin iältään

Bacillus amyloliquefaciens

ja sen luonnollinen estäjä barstargeenin ovat pieniä proteiineja (12 ja 10 kDa, vastaavasti) on erittäin korkea affiniteetti sitovia (K

d~10

-14 M) [18], joka on verrattavissa affiniteetti streptavidiini-biotiini vuorovaikutus [19]. Täällä käytetään näiden proteiinien molekyyli- adapterit saada sarjan itsejärjestyvien loisteputki komplekseja perustuu kvanttipistei- eri anti-kasvainspesifisyys ja väri (

Taulukko 1

). Koettimet koostuvat visualisointiin moduulin, eli QDS konjugoitu yhteen BBS proteiinien (joko barstar tai barnaasin) ja kohdistaminen moduulin, eli anti-kasvain-vasta-aineiden fuusioituna kumppani BBS-proteiinia (joko barnaasin tai barstar, vastaavasti ) (

kuvio 2A

). Tuloksena visualisointiin ja kohdistaminen moduulit voidaan yhdistellä eri tavoin riippuen molekyylien spesifisyys ja optiset ominaisuudet tarvitaan johonkin tiettyyn kuvantamiseen tehtävä (

kuva 2B

).

Sitovat QDS scFv vasta-aineet kulkeutuvat barnasegeenin-barstargeenin molekyyli sovittimet (a) ja BBS-pohjainen molekyyli rakentaja käsittää joukon vaihtelevan fluoresoivaa ja kohdentamalla moduulit (B) on esitetty.

kohdistaminen moduuli: rakentaminen ja karakterisointi tunnustamista proteiinit

anti-HER1 425scFv ja anti-HER2 4D5scFv vasta-aineita käytettiin kohdennusmolekyylejä kohdennetusta toimituksen QDS tuumorisoluihin. Saimme useita 425scFv ja 4D5scFv fuusioproteiineja kanssa barnasegeenin tai barstar erilaisina yhdistelminä. Kaksi fuusioproteiineja, joilla on korkein ilmaus saannot valittiin kohdentaminen moduulit QDS toimitus: yksiarvoinen 425scFv fuusioitu barstargeenin (425scFv-Bs) ja kahdenarvoisen 4D5scFv fuusioitu barnasegeenin ((4D5scFv)

2-Bn).

kohdistaminen fuusioproteiineja tuotettiin

E. coli

ja puhdistettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Proteiinit saadaan olivat odotettavissa molekyylipaino ja homogeenisyys mukaan SDS-PAGE (

kuva 3A

). Dissosiaatiovakio on (4D5scFv)

2-Bn puhdistetusta p185

HER2-ECD oli ~2.2 nM. Tämä arvo on samaa mieltä hyvin kuin vanhempien 4D5scFv vasta-aine (~5.2 nM). Entsymaattinen aktiivisuus on valmistettu (4D5scFv)

2-Bn arvioidaan happo liukenematonta RNA presipitaatioanalyysissä [16] oli ~8% natiivin barnasegeenin aktiivisuus (

kuvion 3B

). Vertailun aktiivisuus barnasegeenin fuusioituna eri proteiinien on raportoitu olevan ~75% jokaista entsyymiä molekyyliä 4D5scFv-dibarnase proteiini [7] ja -80% ja barnasegeenin fuusioitunut eksotoksiini A

Pseudomonas aeruginosa

[20]. Oletettavasti, fuusioimalla kaksi vasta-aineen molekyylien barnasegeenin tuloksia steerisen esteen vaikutus ja samanaikainen lasku RNaasi-aktiivisuuden.

(A) 12% SDS-PAGE vahvistetaan puhdistus (4D5scFv)

2-Bn ( a, 71 kDa) ja 425scFv-Bs (a ’, 40 kDa), Coomassie Brillian Blue R-25 värjäytynyttä geeliä; standardi proteiinimarkkeri (M) ja fuusioproteiini kaistat (P) on esitetty. (B) RNaasiaktiivisuuden (4D5scFv)

2-Bn (yhtenäinen viiva) verrattuna aktiivisuuteen vapaa barnasegeenin (katkoviiva) ja arvioitiin hapolla liukenematonta RNA presipitaatioanalyysissä. (C) esto vapaa barnasegeenin by 425scFv-Bs (yhtenäinen viiva) verrataan inhibitiota ilmainen barstargeenin (katkoviiva).

dissosiaatiovakio (4D5scFv)

2-Bn maasta puhdistettu EGFR oli ~ 2 uM. Rakenteessa barnasegeenin inhibition 425scFv-Bs oli samanlainen kuin vapaalla barstargeenin (

kuva 3C

). Siten barstargeenin-osa 425scFv-Bs fuusioproteiini säilytti sen toiminnallisuutta.

visualisointi loisteputki moduulit: konjugointi QDS kanssa BBS proteiinien

Seuraavat QD konjugaatit kanssa BBS proteiinien saatiin myöhempää käyttää visualisointiin loisteputki moduulit: QD

605-B, QD

605-Bn, QD

565-B, ja QD

565-Bn. QDS voidaan käyttää yhdessä barnasegeenin sisältävien kohdistaminen moduuli ((4D5scFv)

2-Bn) konjugoitiin barstar, kun taas voidaan käyttää barstar-ainetta sisältävä moduuli (425scFv-Bs) konjugoitiin barnasegeenin. Barnasegeenin ja barstargeenin konjugoitiin QDS käyttämällä EDC /NHS kytkentäkemia. Aikana Reaktion aktivoitujen karboksyyliryhmien pinnalla QDS reagoivat ε-aminoryhmien proteiinin lysiinitähteiden sekä α-aminoryhmä N-terminaalisen tähteen jolloin muodostuu vakaa amidisidosten.

tehokkuus konjugaation vaiheen varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla (

kuva 4A

). Olosuhteissa hyödynnetään elektroforeesin setup (pH 7,6), ei-konjugoitu QDS ovat negatiivisesti varautuneita, ja siten siirtyä katodi anodin (

kuviossa 4A

,

kaista 1, 4

). Kun lisäksi BBS proteiinien QD suspension, elektroforeettisen liikkuvuuden nanohiukkasten näyttää vaikuttaa eri tavoin, riippuen lisätty proteiini. Migraatio kuvio seoksen QDS ja negatiivisesti varautuneiden barstar (pl 4,6), on samanlainen kuin vapaan QDS (

kuviossa 4A

,

kaista 2

) .Vuonna sijaan, lisäksi positiivisesti ladattu barnasegeenin (pl 9,8), jotka voivat sitoutua QDS takia sähköstaattisen vetovoiman johti sotkee ​​vaelluskäyttäytyminen (

kuva 4A

, kaista 5).

(A) elektroforeettinen liikkuvuus QDS ja QD -conjugates 1% agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-asetaatti-EDTA-puskuriin (pH 7,4). QDS alkavat katodi (-) ja anodi (+). Kaistat: 1 – QD

605, 2 – sekoitus QD

605 ja barstargeenin (ilman EDC), 3 – QD

605-B-konjugaatin, 4- QD

565, 5 -mixture QD

565 ja barnasegeenin (ilman EDC), 6 – QD

565-Bn konjugaattia. (B) Normalized fluoresenssispektrejä QD

565 (sininen viiva), QD

605 (violetti käyrä) ja niiden konjugaattien, QD

565-Bn (vihreä viiva) ja QD

605-Bs ( punainen viiva). (C) ribonukleaasiin aktiivisuus QD

605-Bn (punainen viiva ja ympyrät) ja vapaan barnasegeenin RNAasi aktiivisuutta estämällä QD

605-B (sininen viiva yleinen). QD

605 (vihreä viiva) eivät vaikuta ribonukleaasiaktiivisuuden barnasegeenin.

kovalenttiset konjugointi QDS kanssa BBS proteiinien käyttäen EDC ristisidostekijä johti merkitseviä muutoksia muuttokäyttäytymisen. QD-Bs konjugaattien näytteillä pienempi liikkuvuus kuin alkuperäisen QDS tai seoksesta QDS ja vapaa barstargeenin, joka osoittaa onnistuneen funktionalisointi QD pinnan (

kuva 4A

, kaista 3

). QD-Bn konjugaatit tuskin jättää kuoppiin agaroosigeelistä, oletettavasti johtuen neutralointiin negatiivinen varaus QD kun konjugaatio barnasegeenin (

kuva 4A

, kaista 6

) Meillä myös testattu QDS ja BBS proteiinien säilyttämisestä niiden ominaisuudet sisällä konjugaatteja. Fluoresenssispekroskopian mittaukset osoittivat, että emissiospektreissä sekä kvantti saannot QD fluoresenssiä konjugoitumalla barnasegeenin tai barstargeenin pysynyt lähes muuttumattomana (

kuva 4B

). Happo-liukenemattomia RNA presipitaatioanalyysissä [16] osoittaa, että QD-Bn konjugaatit säilyttävät funktionaaliset ominaisuudet barnasegeenin, eli ribonukleaasi aktiivisuus, ja QD-B konjugaatit säilyttävät barnasegeenin-sitomiskyky ja barnasegeenin inhibition aktiivisuus (

kuviossa 4C

).

live solukuvauksessa

HER1- ja HER2-yli-ilmentäviä syöpäsolulinjoja, mukaan lukien A431 ihmisen epidermaalista (3 x 10

6 HER1 reseptorit /solu [21]) ja ihmisen munasarjakarsinooman SKOV-3 (2,6 x 10

5 HER2 /neu reseptorit /solu [22]) soluja, testaamaan valitaan spesifisen värjäytymisen kasvainsolujen kanssa itsejärjestyvien loisteputki komplekseja. HER1- ja HER2 /neu-negatiivinen kiinalaisen hamsterin munasarjan solut (CHO) käytettiin kontrolleina.

suuri ongelma solujen kuvantamisen QDS on, että QD koettimet ovat yleensä ”tahmea” ja usein sitoutuvat epäspesifisesti solukalvon, proteiinit, ja soluväliaineen [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29]. Ei-spesifinen sitoutuminen riippuu pinnan ominaisuuksista QD ja käytetyt solulinjat. Olemme arvioineet epäspesifisen sitoutumisen ominaisuudet alkuperäisen karboksyloidun QDS käytetään fluoresoiva koetin rakentamiseen. Kuten esitetään

kuva 5

(

Aa ja B – vihreä linja

), huomattava ei-spesifinen sitoutuminen havaitaan QD

605 inkuboidaan SKOV-3, A431 ja CHO-solujen 4 ° C: ssa. Olemme syyksi taso ei-spesifisen sitoutumisen sähköstaattiset vuorovaikutukset negatiivisesti varautuneiden QDS kanssa solun pinnalla. Näin ollen, on suunnattu ja spesifisen värjäytymisen kasvainsolujen kanssa QDS on tarpeen ei ainoastaan ​​asianmukaisen kohdentamiseen oncomarker kiinnostavia, mutta myös vähentää ei-spesifisen sitoutumisen QDS. Vähentää ei-spesifisen sitoutumisen, QDS usein muutettu poly (etyleeniglykoli) (PEG), hydrofiilisen polymeerin, jota käytetään rutiininomaisesti tällaisiin tarkoituksiin biologisissa sovelluksissa. Mutta esillä olevassa työssä tarvitaan PEGylointi voidaan välttää. Yllättäen huomasimme, että QD konjugointi sekä BBS-proteiinit – barnaasin ja barstar – vähentää ei-spesifisen sitoutumisen QDS solun pinnalla. Kun soluja inkuboitiin QD

605-B tai QD

605-Bn 4 ° C: ssa, heikko tai ei fluoresoivaa signaalia ei havaittu solun pinnalla, mikä osoittaa, että QDS konjugoitu BBS proteiineilla on vähäinen ei- spesifinen sitoutuminen (

kuva 5

, Ab ja B-oranssi linja QD

605-B tai keltainen linja QD

605-Bn

). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin QD

565 ja niiden konjugaattien. Näin ollen käyttö BBS proteiinien sallittaisiin sitoutumisen QDS kanssa kohdistaminen vasta-aineita, mutta myös vähentää ei-spesifisen sitoutumisen QDS solun pinnan.

(A) Optinen mikroskopia on HER1overexpressing A431-soluja, jotka oli esi-inkuboitu QD

605 (a), QD

605-Bn (b), 425scFv-Bs ja QD

605-Bn (c). HER1-negatiivinen CHO-soluja käytettiin verrokkeina varten värjäämällä 425-B ja QD

605-Bn (d). Kuten lisävalvontatoimenpiteitä kilpailevan sitoutumisen testi vapaan 425scFv ja anti-HER1 425scFv-B /QD

605-Bn kompleksi suoritettiin (e). Vasen rivi, kirkas-kentän kuva; oikea rivi, fluoresenssi kuvaa 488 nm: n virityksellä ja 605 nm: n emissio huiput. (B) virtaussytometria SKOV-3, A431 $ \\ rasteri (70%) = ”RG1” $ CHO-soluja inkuboitiin QD

605 (vihreä viiva), QD

605-Bn (keltainen viiva), QD

605-B (oranssi linja), (4D5scFv)

2-Bn ja QD

605-B (punainen viiva), 425scFv-Bsand QD

605-Bn (sininen viiva).

’armament’of QD-BBS proteiinikonjugaateilla kanssa kohdistaminen vasta sallitaan tietty merkintöjä ja kuvantaminen kasvainsolujen. Yleinen strategia erityisiä kasvainsolun Merkintäsäännösten itsejärjestyvien loisteputki QD-scFv monimutkainen perustuu BBS järjestelmä on esitetty

kuva 6

(vasemmalla)

. Kasvaimen soluja esi-inkuboida kohdistamista fuusioproteiinin ja sitten värjättiin QD-BBS proteiinikonjugaateilla. Visualisointiin moduuli on kytketty soluun liittyvä kohdistuksen moduulin kautta barnasegeenin-barstar vuorovaikutusta. Siten QD

605-Bn konjugaattien tehokkaasti värjätään HER1 pinnalla A431-soluja sen jälkeen, kun soluja inkuboitiin 425scFv-B kohdistettu proteiini (

kuva 5

, Ac

) . Samoin SKOV-3-solut yli-ilmentävät HER2 /neu oli kuvattu peräkkäisellä käsittelyllä (4D5scFv)

2-Bn ja QD

605-B. Ohjaimia HER1- ja HER2 /neu-negatiivinen CHO-solut eivät osoittaneet värjäytymistä, mikä osoittaa sitoutumisspesifisyys kohdennettujen itsejärjestyvät komplekseja. Lisäksi, kun A431-soluja käsiteltiin anti-HER1 fluoresoivan kompleksin ja vapaan 425scFv (moolisuhde 01:02), sitoutuminen kompleksin solukalvoon estyi täysin (

kuva 5

, ae

). Vastaavia tuloksia saatiin käyttäen SKOV-3-soluja, anti-HER2 /neu monimutkainen ja vapaa 4D5scFv.

Legends kuten kuviossa 1.

käyttö QD

565- bs moduuli mahdollistaa suorittaa solukuvauksessa vihreä spektrialueella. Näin ollen, QD-scFv komplekseja halutun anti-kasvain erityispiirteet ja fluoresoivat spektrit saatiin yhdistämällä visualisoida ja kohdentamalla moduulit (taulukko 1).

Lisäksi, kasvaimen solut onnistuneesti kuvannetaan yksivaiheisella menetelmällä käyttäen esiasennettu QD-scFv komplekseja. Tässä tapauksessa kohdistettu moduuli (425scFv-Bs tai (4D5scFv)

2-Bn), ja visualisointiin moduuli (Bn-QD tai Bs-QD, vastaavasti) esisekoitettiin kompleksin muodostukseen, jota seuraa inkubointi kasvainsolujen saadulla komplekseja. (

kuva 6

).

Vaikka QDS ovat ainutlaatuisia värjäysreagenssia mitattuna niiden photophysical ja kemialliset ominaisuudet, niiden käyttöä biolääketieteen sovelluksissa yhä kiistelty johtuu niiden mahdollisten sytotoksisuutta. Suoritimme alustavia kokeita, jotta voidaan arvioida sytotoksisuus käytettyjen kvantti dotes ja niiden konjugaattien ja kompleksit. Sytotoksisuus testejä ei osoittanut mitään merkittävää vaikutusta QD

605 ja QD

565 (sekä niiden johdannaiset) selviytymisen SKOV-3 (

kuva 7

). Nämä tulokset vastaavat hyvin julkaisemien tietojen aikaisempi osoittavat, että kvanttipisteiden polymeeripinnoitetaan kuori pitoisuuksina tarvitaan visualisointiin erityisen pinnan reseptorien osoita mitään vaikutusta selviytymisen soluviljelmissä [30].

Suhteellisen solujen elinkelpoisuus SKOV -3 solujen käsittelyn jälkeen alkuvaiheen QDS (punainen viiva), niiden konjugaattien kanssa barstar (sininen viiva) ja niiden monimutkainen 4D5scFv (oranssi viiva) esitetään.

keskustelu

poikkeuksellinen fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet QDS mahdollistaa monivärinen ja pitkän aikavälin kuvantaminen, mikä olennaisesti parantaa nykyisiä menetelmiä syöpäsolun loisteputki kuvantaminen ja multiplex profilointi molekyyli kasvainmerkkiaineet [2].

HER1 ja HER2 /neu oncomarkers, epidermaalisen kasvutekijän reseptorin perheenjäseniä, avainasemassa synnyssä ja etenemisessä tietyntyyppisten kasvainten, mukaan lukien kohdun limakalvon, munasarjojen, rinta-, eturauhas- ja keuhkosyöpä, ja ovat kliinisesti merkittäviä kasvainmerkkiaineet [6].

selektiivisen kasvainsoluihin yliekspressoivat biomarkkerit kiinnostava, QDS on funktionalisoitu kohdennusmolekyylejä. Monoklonaalisia vasta-aineita HER1 [31] ja HER2 [31], [32], [33], [34], [35] sekä EGF, luonnollista ligandia HER1 [36], [37], [38], on käytetty menestyksellisesti ohjaavia osia suunnittelun kasvaimen vastaisen varjoaine, joka perustuu QDS. Kuitenkin, täyspitkä vasta-aineet ovat suhteellisen suuria, niin määrä vasta-aineita, jotka voidaan liittää pintaan QDS on rajallinen ja sisäisen kasvaimen jakelu nanohiukkasten estyy, mikä rajoittaa käyttöä täyspitkän vasta-aineita QD kohdistaminen aineita. ScFv näyttävät olevan edullisempaa sukupolven HER1- tai HER2 /neu-kohdistettuja QD antureista, koska ne ovat pienempiä kuin täyspitkää vasta mutta säilyttävät antigeenispesifisyyteen ja korkea binging affiniteetti vanhempien vasta-aineita. Muita etuja scFv vasta-aineiden kohdistaminen moduulit sisältävät suhteellinen yksinkertaisuus tuotantoaan bakteereissa, alhainen immunogeenisyys, ja puute vasta efektoritoiminnan [17].

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet mahdollisuutta in vitro ja in vivo kuvantaminen kasvainsolujen käyttäen nanopartikkeleita, jotka on konjugoitu scFv-vasta-aineet kohdistuvat HER1 [38], tai HER2 /neu [39].

käyttö itsejärjestyvien adapterit (pieni ”tahmea” molekyylit, jotka sitoutuvat toisiinsa korkea hyötysuhde ja spesifisyys mutta eivät muodosta homodimeerejä) on lupaavampi lähestymistapa QD-vasta-aineen sitoutumista kuin suoraan konjugaatio. Muodostuminen komplekseja, joissa nämä molekyylit ei ole merkittävää vaikutusta vasta-affiniteetti ja mahdollistaa helpon valmistelua erilaisia ​​yhdistelmiä vasta erilaiset spesifisyydet ja QDS eri fluoresenssispektrejä.

Tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet perustuvaa on hyvin erityinen ja voimakas ei-kovalenttinen (eli sähköstaattinen) vuorovaikutus kahden proteiinien, barnasegeenin ja barstargeenin, kuten itsejärjestyvien molekyyli sovittimia. Affiniteetti barnaasin ja barstar on verrattavissa ja (strept) avidiini-biotiini-järjestelmän, vahvin tiedossa biomolekyylejä.

BBS valittiin, koska lukuisia merkittäviä ominaisuuksia välttämätöntä suunnittelun kohdistaminen moduulien . (I) Biotiini ei ole peptidi, sen kiinnittämiseen proteiineja, esim. vasta-aineita, jonka geeni tekniikan menetelmillä ei ole mahdollista. Kemialliset linkittäminen on kaoottinen, yleensä epäspesifinen suhteen kiinnityksen geometria ja vaatii usein kehittyneitä jälkeinen muutos komponenttien erottaminen. Sen sijaan molemmat osat BBS ovat geneettisesti koodattu, jonka avulla voidaan luoda kohdistaminen moduuleja fuusioproteiinit koodaa yksittäinen geeni ilmaistu bakteeri- järjestelmissä [15] .Barnase ja barstargeenin ovat vastakkaisesti varautuneita ja siten antaa meille mahdollisuuden valita sopivin BBS proteiinia kutakin vasta-ainetta käytetään rakentamisessa kohdistaminen moduuleja. Tämä auttaa välttämään komplikaatioita proteiinien eristämiseksi, esimerkiksi keskinäinen ”tarttumista” domeeneista saadun rekombinanttiproteiinin. Lisäksi, barnasegeenin ainesosana rekombinanttiproteiinien voi toimia molekyyli- kaperonin varmistetaan niiden oikea laskostuminen [40]. (Ii) Kumpikaan BBS-proteiinit analogit nisäkkäillä, mikä vähentää ei-spesifisen tausta, kun järjestelmää käytetään

in vivo

.