Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lisääntyvä näyttö osoittaa, että eri syöpäsolutyyppien kykenevät tuottamaan IgG. Tarkka toiminta syövän johdettu IgG ei kuitenkaan ole selvitetty. Tässä olemme osoittaneet, että ilmentyminen IgG geenien V (D) J-rekombinaation 80 tapauksissa peräsuolen syöpiä, 4 koolonsyöpäsolulinjoissa ja kasvaimen suuntaan immuunijärjestelmä puutteellinen hiirimallissa. IgG ilmentyminen liittyi kasvaimen erilaistumiseen, pTNM vaiheessa imusolmuke osallistuminen ja tulehduksellinen soluttautuminen ja korreloi positiivisesti ilmaisuja sykliini D1, NF-KB ja PCNA. Lisäksi tutkimme vaikutus syövän johdettu IgG on pahanlaatuinen käyttäytymistä paksusuolisyövän soluja ja osoittivat, että tukos IgG lisännyt apoptoosin ja heikensivät mahdollisuuksia ankkuri riippumattoman pesäkkeiden muodostumisen ja syöpäsoluinvaasiota. Nämä havainnot viittaavat siihen, että IgG syntetisoida peräsuolen syöpä solujen on mukana kehityksen ja kasvun paksusuolisyövän ja lukkiutuvat IgG voi olla mahdollinen hoito hoidettaessa tämä syöpä.

Citation: Niu N, Zhang J, Huang T Sun Y, Chen Z, Yi W, et al. (2012) IgG Expression in Human peräsuolen syövän ja sen suhteesta Cancer Cell käyttäytymistä. PLoS ONE 7 (11): e47362. doi: 10,1371 /journal.pone.0047362

Editor: Georgina L. Hold, University of Aberdeen, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 9. kesäkuuta, 2012 Hyväksytty: 11 syyskuu 2012; Julkaistu: 01 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Niu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia nuorten ja keski-ikäisten Tutkijat Research Awards Fundation Shandongin maakunnassa (nro BS2011SW051), ja National Natural Science Foundation of China NN (nro 81100885). Kirjoittajat myöntävät myös National Natural Science Foundation of China JG (nro 30971150). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Viime aikoina useita raportteja on julkaistu kuvaava ilmaus immunoglobuliinien ei-lymfosyyttejä myös useita sarkoomat ja karsinoomat [1] – [4]. Ennen näiden raporttien immunoglobuliini oli aina tiedetään tuottavan pelkästään B-lymfosyytit. IgG: tä on havaittu paksusuolisyöpäkudoksessa muutamia tapauksia ja fragmentti IgG vakioalueen on nähty pari koolonsyöpäsolulinjoissa. Vastaisella vasta-aineella CA215, joka oli osa immunoglobuliinien ilmaistaan ​​munasarjasyöpäsoluja, Lee et ai havaittu IgG: n raskaan ketjun pysyviä alueita, paksusuolen syövän kudoksissa positiivinen suhde 44% [1], [5]. Vuonna 2003, Qiu et ai osoittaneet ilmentymistä IgG kudoksissa 6 tapausta ja peräsuolen syöpä (CRC) ja joka koolonkarsinoomasolulinja (HT29) [3]. RT-PCR, Kimoto et al havaittu IgG: n raskaan ketjun vakioalueen peräisin koolonisyöpäsolulinja SW116 [2].

In vitro

tutkimus, jossa HT 29 koolonikarsinoomasolulinjan indusoitu ASODN ehdotti, että syöpä johdettu IgG tukahdutetaan apoptoosin [6], mikä oli sopusoinnussa tulosten Lee et al [1] ja Qiu et al [3], jotka osoittivat kasvaimen kasvun estämistä, joiden masolulinjassa eläimillä ja in vitro kokeissa. Nämä havainnot antavat aihetta olettamukseen, että syöpä johdettu IgG edistää paksusuolen syövän kasvua ja tämä on painopiste tässä tutkimuksessa.

Toistaiseksi suhde IgG ilmaisun ja kliinis-ja biologisten merkkiaineiden [7] – [9] liittyviä ennustetta ja hoitovastetta CRC ei ole tutkittu. Tässä tutkimuksessa ensin tutkineet ilmaus IgG kudoksessa 150 CRC sekä analysoi niiden korrelaatio IgG ilmaisun ja useita kliinispatologiset ja biologiset ominaisuudet. Sitten IgG tuotanto vahvistettiin neljässä CRC solulinjoissa sekä proteiinia ja mRNA-tasoja. Useat alueet IgG: n raskaan ja kevyen ketjun ja olennaisia ​​entsyymejä IgG-synteesi havaittiin näytteissä. Vaikutukset IgG pahanlaatuisiin biologista käyttäytymistä, kuten leviämisen, klooni muodostumista, invaasio ja apoptoosin tutkittiin kokeissa vasta-neutralointi ja siRNA esto. Tulokset antavat oivalluksia uusiin kliinis-patologisia rooleja syövän johdettujen IgG CRC ja vahvistaa perusteet kehittää hoitoja, jotka kohdistuvat syöpää johdettu IgG.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä

Formaliinifiksoidusta, parafiiniin upotetut kudokset 150 tapausta, jotka oli käsitelty /analysoitu CRC ja vastaaviin normaaleihin peräsuolen limakalvo yksilöt (käytettiin negatiivisina kontrolleina) ja kaksikymmentä tuoretta biopsianäyttei- kolorektaalisen adenokarsinooman kerättiin Affiliated Hospital Weifangin Medical University. pTNM vaiheessa tehtiin mukainen TNM pysähdyspaikan järjestelmä AJCC /UICC: [10]. Eriyttämiset on syöpiä luokiteltiin hyvin /kohtalainen tai heikko. Inflammatorinen tunkeutuminen arvioitiin kriteerien mukaisesti kroonisen tulehduksen (mononukleaarisia infiltraatiota) kuvattu aiemmin [11]. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Weifang Medical University ja kirjallinen suostumus saatiin potilailta.

Solulinjat

Ihmisen CRC solulinjat eri erilaistumisen (kohtuullisesti erilaistunut, HT29 ja SW480; huonosti eriytetty, LOVO ja HCT116) [12] ja Raji (B lymfosyyttisen leukemian solulinjassa positiivisena kontrollina), Jurkat (T lymfaattinen leukemia solulinjassa negatiivisena kontrollina) ostettiin ATCC (kesäkuu 12, 2008). CRC solulinjoja viljeltiin DMEM ultralow-IgG naudan sikiön seerumia (Gibco, Carlsbad, CA, USA) ja DMEM vain 12-24 tuntia ennen koetta.

immunohistokemia

Immunohistokemia ( IHC) suoritettiin CRC ja Hyväksytty marginaalinen kudosten asianmukaiset tarkastukset kuten aiemmin on kuvattu [13], [14]. Tiedot ensisijainen vasta immunoglobuliini γ ketju (Igγ), immunoglobuliini κ ketju (IgK), CEA (karsinoembryoninen antigeeni), CD16 (FcyR III), CD32 (FcyR II), CD64 (FcyR I), P53, PCNA, Bcl-2 MMP-2, NF-KB: n ja sykliini-D1, on lueteltu taulukossa S1. Normaalia vuohen seerumia substituoitu primaarinen vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina. Double merkinnöistä IgG ja NF-KB: n tai sykliini D1 tai PCNA syöpäsoluissa suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [15].

Pisteytys immunoreaktiivisuus

Värjätyt leikkeet tutkittiin ja teki itsenäisesti 2 kirjoittajat (NN ja WY) ilman tietoa kliinis datan. Arviointi suoritettiin viidellä satunnaisesti valittu syöpä alueita 400-kertaisella suurennuksella. Tasot IgG ilmentymisen syöpäsoluissa perustuivat summa pisteet positiivisten solujen prosenttiosuuden (pisteytettiin: 0 = 5%, 1 = 5-25%, 2 = 25-50%, 3 = 50%) ja että värjäytymisen intensiteetti (pisteytettiin: 0, signaali ei, 1, vaaleanpunainen tai vaaleanpunainen; 2, punainen, 3, tummanpunainen). Tapaukset pistein 0-3 leimattiin ”heikosti värjätään” ja tapauksia 4-6 kuten ”voimakkaasti värjättyä”. Nuclear-sijaitsee proteiinit vain sijoitettiin mukaan niiden positiivinen prosenttiosuutta syöpäsoluissa [16]: 25% oli ryhmitelty ”negatiivinen”, ≥25% oli ryhmitelty ”positiivinen”.

cRNA -koetinvalmisteen ja in situ

sopiva pituus koetin ISH oli 300-500 emäsparia, ja pysyvät alueet κ ja λ ketju oli liian lyhyt ollakseen tehokas antureista. Näin ollen kaksi erityistä cRNA antisense suunnattu ihmisen immunoglobuliini G1 raskaan ketjun (IGHG1) valmistettiin ja in situ -hybridisaatio (ISH) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [4], [17]. Nielurisojen kudosta ja kudosten imusuonten kyhmyjä peräsuolen seinään käytettiin positiivisena kontrollina, ja nielurisojen kudosta dioja inkuboidaan sense koettimien tai CRC kudosta inkuboitiin liity koetin käytettiin negatiivisina kontrolleina.

Short tandem uusintaa

Short tandem-toisto (STR) analyysi CRC solulinjojen suoritettiin MAA · HUAGENE BIOSCIENCES CO., LTD (Guangzhou, Kiina) käyttäen PowerPlex 16 HS System (Promega).

virtaussytometrialla

havaitsemiseksi IgG, virtaussytometrialla HT29, SW480, HCT116, LOVO solulinjoja suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [3]. Monoklonaalinen hiiren anti-ihmis-Igγ (1:500, Sigma) ja FITC-leimatulla vuohen anti-hiiri-IgG (1:100, Jackson, West Grove, PA, USA) käytettiin ensisijaisen ja toissijaisen vasta-aineita. Raji solulinjaa käytettiin positiivisena kontrollina. FITC-CD19 (Sigma) käytettiin tarkistaa mahdolliset saastumisen B-lymfosyyttien.

Immunofluoresenssikoe kaksinkertainen värjäys

Immunofluoresenssitesti (IF) Kaksoisvärjäys Igγ ja IgK suoritettiin solulinjoissa kuten aiemmin on kuvattu [4], [13]. Vuohen anti-kani-lgG-TRITC (1:100, Jackson) tai vuohen anti-hiiri-IgG-FITC: llä (1:100, Jackson) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Normaali hiiri-IgG ja normaalia kanin IgG: tä (Santa Cruz) käytettiin sen sijaan, että ensisijainen vasta-aineita. DAPI (sininen signaali) (1:500; Sigma) käytettiin havainnollistamaan ytimeksi.

RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin solulinjoista käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). RQ1 RNase-free DNase (Promega, Madison, WI, USA) käytettiin hoitamaan RNA-näytteet sulkea pois kontaminaatio genomista DNA: ta. Viisi ug kokonais-RNA käänteiskopioitiin oligo (dT)

18-aluketta (Fermentas, Burlington, Ontario, Kanada) käyttäen SuperScript III käänteistranskriptaasi (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollan.

PCR oli suoritetaan LA Taq polymeraasia (Takara, Dalian, Kiina). Spesifisiä alukkeita IGHG1, kolmannen komplementaarisuuden määrittävä alue (CDR3) raskaan ketjun geenin (joka sisältää VDJ-sekvenssin), vakio (IgK) ja muuttujan (VK) alueella IgK, vakioalueen Igλ (Igλ), Iγ-Cy steriili ituradan transkriptit (Iγ-Cy), aktivaation aiheuttama sytidiinideaminaasin (AID), rekombinaatio aktivoiva geeni -1 ja 2 (RAG1 ja rag2) olivat samat kuin aikaisemmin on kuvattu [3], [4]. CD19 monistettiin jättää saastumisen lymfosyyttien ja β-aktiini monistettiin sisäisenä viitteenä [3]. Tiedot alukkeet taulukossa S2. Tunnistaminen PCR-tuote varmistettiin DNA-sekvensoinnilla ja räjäytys.

Laser capture mikrodissektion (LCM) avustavat RT-PCR

LCM avustaa RT-PCR suoritettiin 20 tapauksessa juuri jäädytetty kirurgisten CRC näytteet kuten aikaisemmin on kuvattu [4]. IGHG1, IgK, CDR3 rekombinaatio segmentti, CD19 ja β-aktiini monistettiin samoja alukkeita kuin RT-PCR. Lymfosyytit imusuonten kyhmyjä paksusuolen seinään käytettiin positiivisena kontrollina, ja veden sijasta cDNA-templaattia käytettiin negatiivisena kontrollina. Näytteet, joissa havaittavissa CD19 jätettiin myöhemmissä kokeissa.

Western blot ja siRNA alassäätöä

sytosolin proteiineja neljästä ihmisen CRC solulinjoissa (40 ug /kaista) analysoitiin 10% SDS -sivu (Igγ ei-pelkistävissä olosuhteissa ja IgK pelkistävissä olosuhteissa). Standard ihmisen seerumin IgG: tä (0,02 ug /kaista, Sigma) käytettiin positiivisena kontrollina. Vuohen anti-ihmis Igγ (1:2500; Sigma) tai hiiren anti-humaani IgK (1:2000, Abcom) käytettiin ensisijaisena vasta-aineita.

siRNA (5′-CCAAGGACACCCUCAUDAUTT-3 ’, 5 ”-AUCAUGAGGGUGUCCUUGGTT-3 ’) on suunniteltu mukaan vakioalueen syövän peräisin olevan IgG: n ja transfektoitiin LOVO solun X-tremeGene siRNA Transfection Reagent (Roche, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Satunnaisessa järjestyksessä käytettiin negatiivisena kontrollina. Tehokkuus IgG alas säätelevä todennettiin Western blot.

Eläinkokeet

Viljellyt LOVO soluja (5 x 10

6) on SC ympättiin edessä vasemmalla kainalot ja sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) hiiriä. Viisikymmentä ui verta saatiin silmän laskimosta kapillaariputkesta 0., 7., 14. ja 21. päivänä istutuksen jälkeen. 1 ui seerumia analysoitiin 10% SDS-PAGE: ssa ei-pelkistävissä olosuhteissa, joilla on sama vasta-aineilla kuten edellä on kuvattu. Päivänä 21, kasvaimet kerättiin ja H 25%) havaittiin positiivinen hyvin eriytetty adenokarsinoomat (kuvio 1 C), kun taas yhden syöpäsolujen tai ryhmittyneet ne olivat positiivisia kohtuullisesti erilaistunut adenokarsinoomia, ja suurin osa syöpäsolujen ( 50% ) oli positiivisia huonosti eriytetty adenokarsinoomat (kuvio 1 D). Vuonna syöpä pesiä soluttautuminen syvemmälle lihaksikas kerros, positiivinen suhde oli suurempi ja värjäytymisen intensiteetti vahvempaa kuin infiltroituneen syöpäsoluja sijaitsee limakalvon (kuvio 1 E ja D).

IgG mRNA (IGHG1 ) oli havaittavissa sytoplasmassa syöpäsolujen kanssa in situ (kuvio 1A, oikea paneeli, kuvio S1 A). Spesifisyys antureista ja tiukkuuden ISH oli vakiintunut 2 paria koettimia (antisense ja sense) eri alueille IgG vakioalueen ja yksi satunnainen etuyhteydettömille anturi. Kaikki 2 antisense antoi täysin identitical jakelun ja intensiteetin myönteisiä signaaleja. Kun positiivinen kontrolli, imunestejärjestelmän kyhmyt ja peräsuolen seinän (kuvio S1 B), IGHG1 sijaitsi sytoplasmassa B-lymfosyyttejä. Vuonna negatiiviset kontrollit (random koetin soveltaa CRC kudoksiin ja sense-koettimien soveltaa nielurisojen kudosta), mitään positiivista signaalia ei havaittu (kuvio S1 C ja D). Kaikki tapaukset positiivisen IgG immuunivärjäysmenetelmällä olivat myös positiivisia IGHG1 mRNA in situ -hybridisaatiota. Läsnäolo IgG mRNA Lisäksi vahvistettiin kanssa LCM avustaa RT-PCR (Kuva 1 F ja G). IGHG1 ja IgK olivat molemmat monistettiin onnistuneesti jälkeen, eristämisen syöpäsoluja jäädytetty CRC näytteistä. Kaikki kaksikymmentä näytteet testattiin positiivisesti. Lisäksi, CDR3, kuten V-D-J-sekvenssin, on myös monistettiin onnistuneesti näistä näytteistä. Ei CD19 selostukset olivat havaittavissa siten, lukuun ottamatta B-lymfosyyttien saastuminen. CD19, IGHG1, IgK, ja CDR3 olivat kaikki monistettiin positiivisista kontrollinäytteistä. Ei bändi oli havaittavissa kun negatiivinen kontrolli käytettiin.

korrelaatio IgG ilmaisutapoja kliinis ja biologiset ominaisuudet CRC

Taulukko 1 esittää korrelaatio IgG ilmentymisen ensisijainen syöpäsolujen kanssa eri kliinis muuttujia. Oli korkeampi taajuus vahva IgG ilmaisun huonosti eriytetty adenokarsinooma (67,3%) kuin paremmin erilaistuneet (hyvin ja kohtuullisesti erilaistunut, 33,7%, P = 0,035). IgG ilmaus ei osoittanut merkittävää eroa joukossa yksilön pTNM vaiheet (P = 0,091). Kuitenkin, kun vertasimme IgG ilmaisua vaiheen I-II kasvain kanssa, että vaiheen III-IV, jälkimmäinen oli korkeampi taajuus vahva värjäytyminen kuin teki entisen (59.7 vs. 32,5%, P = 0,027). Kun syöpiä heikoilla tulehduksellinen tunkeutumisen verrattiin vahvojen tulehduskeräytymää, oli taipumusta entisen saada korkeampi taajuus voimakkaan värjäytymisen kuin jälkimmäinen (49,5 vs. 33,3%, P = 0,041). Aikavälillä imusolmuke lavastus, CRC vaiheessa N

1 ja N

2 miehitetty merkittävästi korkeamman IgG-positiivinen suhde (54,8, 63,9 vs. 32,5%, P = 0,042). Ei ollut mitään merkittävää korrelaatiota IgG ilmaisun iän, sukupuolen, syövän sijainti tai kasvumalli (kaikki P 0,05).

Taulukossa 2 esitetään suhde IgG ilmaisun ja ilmauksia useiden biologisten merkkiaineiden. IgG ilme positiivisesti korrelaatio ilmauksia sykliini D1 (P = 0,046), NF-KB (P = 0,019), ja PCNA (P = 0,037), ja negatiivinen korrelaatio ilmaus Bcl-2 (P = 0,041), eikä merkittävää korrelaatiota ilmaisuja MMP-2 ja p53 (molemmat P 0,05). Kolokalisaation sykliini D1, NF-KB tai PCNA (tumavärjäystä) ja IgG (sytoplasminen värjäys) oli selvästi osoitettu kaksinkertaisella-immunovärjäyksellä (kuvio 1 H).

ilmentäminen IgG-proteiinin ja sen mRNA CRC solulinjoissa

identiteetit käytetty CRC solulinjoja varmennetaan STR testi ja profiilit osoittivat 100% vahvistuksen kanssa, jonka ATCC (kuva S2 A ja B). Pitoisuus IgG ultralow-IgG FBS soluviljelyyn vahvistettiin 2,3 ± 0,9 ng /ml, joka on riittävän matala, jotta kokeessa. IgG proteiinin ilmentyminen osoitettiin kaikissa neljässä CRC solulinjoissa IF. Co-ilmentymä Igγ ja IgK Lisäksi vahvistettiin (kuvio 2A). Igγ ja IgK pääasiassa paikantuvat sytoplasmaan, ja osittain ytimet syöpäsoluja. Ei IgG signaalia ei havaittu Jurkat-soluissa.

V: Igγ ja IgK havaitaan kaikissa neljässä CRC riviä Kaksoisvärjäys immunofluoresenssilla (Igγ, TRITC, IgK, FITC, yhdistäminen, keltainen.). Bars = 50 pm. B: Prosenttiosuus IgG positiivisten solujen Raji, HT29, SW480, ja LOVO. C: agaroosigeelielektroforeesi RT-PCR-monistuksen tuotteet. R, DNaasia käsitellään RNA templaattina; C, cDNA templaattina. D: IgG havaitseminen Western blot kaikissa neljässä solulinjoissa. E: IgG-proteiini ja mRNA havaitaan IHC ja ISH kasvaimissa korjatuille 21 päivän LOVO solujen SCID-hiirissä. IgG on havaittavissa seerumeissa päivänä 7, 14, ja 21.

saastuminen B-lymfosyyttien hylättiin käyttäen FITC-leimatut immunovärjäyksen CD19 (kuva S2 C). Prosenttiosuus IgG-positiivisten solujen määritettiin FACS Igγ vasta-aineella. Prosenttiosuus IgG-positiivisten solujen oli 75,2%, 20,04%, 24,4%, 39,54%, ja 30,91% Raji, HT29, SW480, LOVO ja HCT116 solulinjoissa vastaavasti (kuvio 2B). Keskimääräinen IgG-positiivinen solu prosenttiosuus kohtuullisesti erilaistunut HT29 ja SW480-solulinjat (22,22%) oli pienempi kuin huonosti eriytetty LOVO ja HCT116-solulinjat (35,23%, P = 0,043).

RT-PCR , herkkyys ja spesifisyys olivat vakiintuneet useita kokeita. Ensimmäinen, RNaasi-vapaata DNaasia käytettiin poistamaan mahdolliset vaikutukset genomisen DNA: n. CD19 monistettiin sulkea pois mahdollinen saastuminen B-lymfosyyttien. Toiseksi useat alueet IgG: n raskaan ja kevyen ketjun ja olennaisia ​​entsyymejä IgG-synteesi tutkittiin. Kolmanneksi laaja positiivinen ja negatiivinen kontrolli käytettiin samaa vahvistusta. Edelleen, kaikki monistetut tuotteet sekvensoitiin ja tunnistettiin ne monistettujen tuotteiden vahvistettiin. Käyttämällä RT-PCR: llä, IGHG1, IgK, VK, Igλ ja Iγ-Cy-transkriptit havaittiin kaikissa neljässä solulinjoissa, jossa intensiteetit positiivisen nauhojen ollessa heikompi kuin sen Raji-soluja. Lisäksi CDR3, kuten V (D) J rekombinaatio sekvenssin ja RAG1 ja rag2 havaittiin myös, kun taas AID havaittiin vain LOVO ja HCT116 solulinjoissa (kuvio 2C ja kuvio S1E).

neljäkymmentä (40) ug kokonaisproteiinia uutettiin kustakin solulinjasta. Proteiinin kokonaismäärän ajettiin Western blot geeli ja saatetaan reagoimaan vasta-aineen IgG. Vyöhyke on sama molekyylipaino, mutta heikompana kuin bändi saatiin 0,02 ug ihmisen IgG havaittiin (kuvio 2D). Sitä parempi solulinjoja eriytetty, vähemmän IgG ilmaistiin. Ali- tilassa IgK vyöhykkeet havaittiin 25 KD HT29, SW480, LOVO ja HCT116 solulinjoissa. Samanlaisia ​​havaintoja Huang et al [21], myös havaittiin ylimääräinen juova 23 KD HT29, SW480, ja LOVO solulinjat. Määrät IgK olivat vähemmän kuin standardi seerumin IgG.

ilmentäminen ja eritys IgG tuumoreita SCID-hiirissä

21. päivänä siirrostuksen jälkeen viljeltyjen LOVO soluja SCID hiirissä kasvaimet kerättiin. Kasvain koostui aihekokonaisuuksien syöpäsolujen kanssa epäselvä solun rajojen ilman strooman. Kaikki syöpäsolut olivat IgG positiivisia, jossa rakeinen positiivisia signaaleja sytoplasmassa. Jakelu IGHG1 havaitun mRNA in situ -hybridisaatiota oli samanlainen kuin IgG-proteiinin havaittu IHC (kuvio 2E).

SDS-PAGE osoitti, että kuten syövän kasvaessa huomattavasti vahvempi bändejä ihmisen IgG havaittiin seerumeissa SCID-hiirten (kuvio 2E).

Blockade syövän johdettu IgG vaikuttaa biologista käyttäytymistä CRC-solujen

verrattuna negatiivisiin kontrolleihin (hiiren seerumia ja anti-ihmis-IgM) , anti-ihmis-IgG osoitti huomattavasti proliferaation inhibitiota LOVO-solut, erityisesti 100 ja 1000 nM (kuvio 3A). Siitä aiheutuvista kokeilu, päätimme 100 nM tehokkaimpana pitoisuus. Koska kanin anti-hiiri-IgG voi estää sitoutumisen hiiren anti-ihmis-IgG ihmisen IgG-molekyylien seurauksena steerisen esteen [22], se voidaan antagonisoida anti-ihmis-IgG: llä. Hoito kanin anti-hiiri-IgG tehokkaasti laantui inhibitio syöpäsolun kasvua hiiren anti-ihmis-IgG (kuvio 3B).

: MTS eri pitoisuuksia anti-ihmis-IgG (10-1000 nM ) vasta-aine. B: Hoito kanin anti-hiiri-IgG kasvattaa apoptoosin hinnat LOVO soluissa. C: apoptoottiset prosentuaalinen Lövön solujen on suurempi inkubaation jälkeen IgG-vasta kuin IgM tai hiiren seerumia. D: estyminen syöpää peräisin IgG aiheuttaa morfologisia muutoksia. E: IgG-vasta vähenee pahanlaatuinen ankkuri riippumatonta kasvua CRC soluja. F: Blockade of cancer johdettu IgG estää hyökkäyksen mahdollisuudet CRC soluja. Bars = 50 pm.

apoptoosin analyysi (kuvio 3C) osoitti, että hoito IgG-vasta johti korkeampi apoptoottisten LOVO solujen (40,16%) verrattuna hoidettiin IgM (13,7% , P = 0,0364) tai hiiren seerumia (10,9%, P = 0,0417).

morfologiset piirteet Lövön soluja vaikuttaa myös käsittelemällä IgG vasta-aineella (kuvio 3D). Kun inkuboitiin anti-IgM-vasta-aineen (100 nM), LOVO solut kasvoivat löyhästi samalla kehittää useita solun prosesseja. Sitä vastoin inkuboitiin anti-IgG-vasta-(100 nM), LOVO solut tuli pyöreä paljon vähemmän määrää solun prosesseja ja osoitti rajoitetun klusterilähtöisellä kasvumalli.

Soft agar-analyysi osoitti, että LOVO syöpäsolujen co -cultured anti-ihmisen IgG-vasta kasvoivat hitaammin ja syntyy huomattavasti pienempiä pesäkkeitä, jotka eivät olleet avoimia ja oli epäselvä solujen reunoja, kuin saman LOVO syöpäsolut hoidettu anti-ihmisen IgM (kuvio 3E). Hoito PBS sijasta IgG-vasta tulokset ovat samanlaisia ​​kuin hoidettu anti-ihmisen IgM. Keskimäärin pesäkkeenmuodostusta LOVO soluissa, joita käsiteltiin anti-humaani-IgG: tä (23,7 ± 5,2 /35 mm: n taso) oli merkittävästi pienempi kuin LOVO käsiteltyjen solujen IgM-vasta-aineen (46,1 ± 3,2 /35 mm tasossa, P = 0,0374).

soluinvaasiota määrityksessä osoitti, että keskimäärin tunkeutuneet solujen oli pienempi Lövön soluja inkuboitiin anti-ihmis-IgG vasta-ainetta (32,3 ± 3,9) kuin niissä inkuboitu IgM (116,5 ± 5,2, P = 0,0293) (kuvio 3F).

vaikutus IgG häiriöitä biologista käyttäytymistä CRC solujen

tutkia mahdollisia rooleja IgG biologista käyttäytymistä tarkemmin, alas säätely IgG ilmaisun kanssa siRNA häiriöitä oli suoritetaan. Kuten kuviossa S3 A, on yli 50% IgG-proteiinin synteesi vähentää tehokkaasti siRNA. MTS, IgG alassäätöä tukahdutti leviämisen Lövön soluja (kuva S3 B). Anneksiini V-PI immunofluoresenssilla kaksinkertainen värjäys osoitti, että varhainen (anneksiini V +) ja myöhään (PI +) apoptoottisia soluja lisääntynyt IgG pudotus siRNA verrattuna si-ohjaus (kuva S3 C). Samaan aikaan, IgG pudotus laski myös transwell-soluja (kuvio S3 D).

Keskustelu

Lisääntynyt seerumin IgG- ja IgA-havaitaan usein potilailla, joilla on epiteelisyöpien [23], [24], mukaan lukien ne, joilla on CRC [25], [26]. Lisäksi, IgG ja IgA on todettu ilmentyvän solulinjoissa ja kudoksissa eri epiteelin syövän tyypit, mukaan lukien CRC [3], [4], [6], [27], [28]. Vaikka ilmiö Ig ilmaisun syövissä on vakiintunut, toiminta syövän johdettujen Ig edelleen epäselvä. Lisäksi tiedetään vähän väliset suhteet syövän johdettu IgG ja kliinis-ja biologista käyttäytymistä syöpäkasvainten. Chen et ai. ovat äskettäin raportoitu, että ilmaus IgG pehmytkudoksen sacomas liittyi kasvaimen ja ilmaus PCNA, Ki-67 ja sykliini D1 [29]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme vahvistaneet läsnäolo IgG ilmentymisen ja peräsuolen solujen sekä proteiinin ja mRNA-tasoja. Puute immunoglobuliini reseptorin ilmentymisen ja havaitseminen IgG mRNA CRC soluissa sulkea pois mahdollisuutta, että kiertävä IgG otettiin nämä syöpäsolut. Osoitimme positiivinen korrelaatio IgG ilme, kasvaimen erilaistumiseen luokalla pTNM vaiheessa ja imusolmuke osallistuminen. Expression IgG oli voimakkaampi CRC kudoksissa huono erilaistumista tai pTNM III-IV, kuin niillä, joilla paremmin erilaistumista tai pTNM I-II. IgG ilmaisu saattaa negatiivisesti yhteydessä tulehduksellinen tunkeutuminen, kuten syöpiä kevyempiä tulehduksellinen tunkeutumisen osoitti vahvempi IgG ilme. Meidän havainnot kolorektaalisyövässä kudoksissa ovat johdonmukaisia ​​sen havaintojen peräsuolen solulinjoissa, jotka osoittavat alempi määrä IgG syöpäsoluissa kohtalaisen erilaistumisen (HT29 ja SW480), kun verrattiin huono erilaistumisen (LOVO ja HCT116). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että syöpä johdettu IgG saattaa olla mukana prosessissa dedifferentiaation, soluttautuminen ja etäpesäke kulutustarviketta, ja että se saattaisi olla itsestään suojaava rooli aikana syövän kehittymisen. Itse asiassa tietyissä olosuhteissa immunoglobuliineja on havaittu edistävän syövän kasvua [30], [31], ja tämä ilmiö on pääosin johtuvan suojaus kohde- epitooppeja pinnalla syöpäsolujen ”anti-kasvain” vasta-aineet [32 ], [33]. Yksi tutkimuksessa munasarjasyöpäpotilaalle ehdotti, että tällainen estäviä vasta-aineita voidaan poikkeuksellisesti glykosyloitu IgG-molekyylit, jotka eivät kykene nostattamaan immuunivasteita [24]. Lisäksi immunoglobuliinin raskasta ketjua, T-solujen reseptoreihin (kuten TCR-a ja TCR-b), immunoglobuliinin kaltainen soluadheesiomolekyylit (kuten CD47, CD54, CD58), havaittiin myös ilmentyvän syöpäsoluissa [34]. TCR: n ja IgG-vasta-aineita johti komplementista riippuva sytotoksisuus ja apoptoosia syöpäsolulinjoja. Niinpä nämä ”Immunoglobuliinisuperperheen proteiinit” oletettiin olevan itsestään suojaava ja mukana leviämisen syöpäsolut [34]. Vaihtoehtoisesti välillinen asema IgG edistämisessä kasvaimen kasvu voisi liittyä transformoiva kasvutekijä beeta (TGF-β), joka kuljettaa immunoglobuliineja ja on osoitettu estävän sytolyyttisen T-soluvasteita [35].