Krooninen sairaus

tiivistelmä

RB1 ​​

indusoitavissa kiertynyt kela 1 (RB1CC1, joka tunnetaan myös FIP200) näyttelee rooli parantaminen RB1 reitti läpi suoran sitoutumisen runsaasti GC alue 201bp ylävirtaan (alkaen ATG) ja

RB1 ​​

promoottori. Täällä tunnistimme hSNF5 ja p53 sitoutumisena kumppanit RB1CC1 immunosaostuksella ja Immunofluoresenssimääritykset. Vuorovaikutus näiden molekyylien ja RB1 reitti analysoitiin määrityksissä kromatiinin immunosaostus, lusiferaasi-reportteri, käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio ja immunoblottaus. Kasvaimen kasvun tukahduttaminen RB1CC1 arvioitiin virtaussytometrialla tai solukasvumäärityksessä. Ydin- RB1CC1 monimutkainen liittyy hSNF5 ja /tai p53 aktivoida transkriptiota

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

, ja tukahdutti kasvaimen solujen kasvua. Lisäksi ydinvoiman RB1CC1 ilmaisu merkittävästi korreloi kuin RB1 ja p16 in rintasyöpäkudosnäytteessä

in vivo

, ja Ki-67 leviämisen indeksi oli riippuvainen p53 sekä RB1CC1. Tämä tutkimus osoittaa, että RB1CC1 yhdessä hSNF5 ja /tai p53 parantaa RB1 reitin kautta transkription aktivoitumisen

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

. Arviointi RB1CC1 ilmaisun yhdistettynä RB1 ja p53 tila odotetaan tarjoavan hyödyllistä tietoa kliinisessä käytössä ja tulevaisuuden hoitostrategioita rintasyövässä.

Citation: Chano T, Ikebuchi K, Ochi Y, Tameno H, Tomita Y, Jin Y, et ai. (2010) RB1CC1 Aktivoi RB1 Pathway ja estää leviämisen ja Cologenic Survival in Human Cancer. PLoS ONE 5 (6): e11404. doi: 10,1371 /journal.pone.0011404

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: Marraskuu 9, 2009; Hyväksytty: 9. kesäkuuta 2010 lähtien Julkaistu: 30 kesäkuu 2010

Copyright: © 2010 Chano et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain KAKENHI (Grant-in-tuki tieteellisen tutkimuksen painopistealueet; nro 20012025) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology, Japani; ja Japanin Society of Laboratory Medicine rahaston edistämisohjelman tieteellisen tutkimuksen. Nämä rahoituslähteitä ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätöstä julkaista, valmisteluun käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

retinoblastooma tuumorisuppressoriproteiinia (RB1) säätelee G1 /S-vaiheen solusyklin etenemisen ja on kriittinen välittäjä antiproliferatiivinen signalointi. Vaikka fosforylaatio on tärkeä rooli toiminnallisen sääntelyn RB1, transkriptionaalinen säätely RB1 on paljon vähemmän tunnettujen [1]. RB1-indusoituva kiertynyt kela 1 (RB1CC1: symboli käytetään tässä, joka on hyväksynyt Human Genome Organization [HUGOn] Gene nimikkeistökomitealle, se tunnetaan myös FIP200, polttoväli adheesiokinaasi perheille vuorovaikutuksessa proteiinin 200 kDa) tunnistettiin kuin RB1 polku säädin, joka erityisesti Parantaa

RB1 ​​

transkriptio [2], [3]. Äskettäin olemme osoittaneet, että ydin- RB1CC1 sitoutuu GC-rikas alue 201bp ylävirtaan (alkaen ATG) ja RB1 promoottorin ja aktivoi ekspressiota RB1 [4]. Geneettinen uudelleenjärjestely

RB1CC1

on myös ehdotettu olevan osallisena kasvainten synnyssä rintasyövän [3], [5]. Mielenkiintoista on, että on raportoitu, että RB1CC1 sitoutuu ja stabiloi p53 [6], mikä viittaa siihen, että RB1CC1 saattaa olla tärkeä välittäjä, joka yhdistää RB1 ja p53 polkuja. Nykyinen tutkimus tutkii mekanismia RB1CC1 tehostumista RB1 reitin. RB1CC1 muodostaa kompleksin p53 ja /tai hSNF5, kromatiinin-remodeling tekijä, solutumissa, ja aktivoi transkription

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

. Lisäksi ydinvoiman RB1CC1 merkittävästi korreloi RB1 ja p16 ilmentymistä rintasyöpäkudosnäytteessä

in vivo

.

Tulokset

RB1CC1 muodostaa kompleksin hSNF5 ja /tai p53

yrittivät ensin tunnistaa RB1CC1 sitovia proteiineja in MCF-7-rinta- syöpäsolujen im- määritys, jota seuraa nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS). Kromatiinin remodeling tekijä, hSNF5 (tunnetaan myös nimellä BAF47 tai INI1) oli mukana immunosaostettiin RB1CC1 (Fig. 1A). Pull-down-määritys käyttäen RB1CC1 poistetaan-mutantit osoittivat, että C-terminaalinen alue RB1CC1 (aa 1364-1594) oli tarpeen vuorovaikutus hSNF5 (Fig. 1 B ja C). N-pään RB1CC1 myös vuorovaikutuksessa p53: n [6], joten katsottiin, että RB1CC1 voi muodostaa kompleksin hSNF5 ja /tai p53 estää kasvaimen kasvua. Kompleksin muodostuminen RB1CC1, hSNF5 ja p53 arvioitiin immunosaostuksella ja immunofluoresenssilla määrityksissä. RB1CC1, hSNF5 ja p53 olivat yhteistyössä immunosaostettiin kahdenlaisia ​​tunnistavien vasta-aineiden eri sivustoja (aa. 25-271 ja 549-817) ja RB1CC1; koostumuksen kunkin sakat on erilainen, mikä johtuu todennäköisesti edullinen fraktiot kullekin vasta-aineelle (Fig. 1 D). RB1CC1-1 ja -2 vasta ollut taipumus sitoutua edullisemmin ydin- ja sytoplasman jakeet, vastaavasti. hSNF5 ja runsaasti ydin- p53 (joka voisi olla fosforyloitu ja hitaasti liikkeelle PAGE) voisi olla mieluiten kerasaostuvat välisen kompleksin ydin- RB1CC1 ja RB1CC1-1 vasta-aine. Vastavuoroisesti RB1CC1-2 vasta-aine saattaa vallitsevasti sitoutua runsaasti sytoplasman RB1CC1 sekä hSNF5 ja muutama p53 solulimassa. RB1CC1, hSNF5 ja p53 olivat yhdessä lokalisoitu solutumissa lukuun ottamatta nucleoli (Fig. 1 E ja F; kuvio. S1). Tiedot osoittivat, että RB1CC1 muodostaa kompleksin hSNF5 ja /tai p53 pääosin solutumien.

(A) MCF-7-solujen lysaatit immunosaostettiin (IP) anti-RB1CC1 vasta-aineella ja analysoitiin SDS-PAGE hopeavärjäyksellä. Molekyylin, että yhteistyössä immunosaostettiin RB1CC1 tunnistettiin hSNF5 nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS). (B) Flag-RB1CC1 ja HA-hSNF5 kotransfektoitiin HEK293-soluihin. Lysaatit immunosaostettiin anti-Flag tai anti-HA-vasta-aine, ja analysoitiin immunoblot kuten on osoitettu. Arrowheads osoittavat yhteistyössä immunosaostetun signaaleja. (C) HEK293-solut transfektoitiin sekä HA-hSNF5 villityypin (koko) ja Flag-RB1CC1 variantteja; villityypin (wt), DCCA, dccB, DLZ, LZC, DCC ja Fcc. Lohkokaaviot RB1CC1wt ja mutantit ovat myös merkitty vasemmalle puolelle. Suorakulmio osoittaa sitoutumiskohta hSNF5, ja rikki suorakulmio osoittaa, että p53. Solulysaatit immunosaostettiin anti-HA-vasta-aineen ja immunoblotattiin kuten on osoitettu. (D) MCF-7-lysaatit immunosaostettiin kaksi erilaista anti-RB1CC1 vasta-aineella ja analysoitiin immunoblot. (E) RB1CC1 (vihreä), hSNF5 (punainen), p53 (sininen) ja yhdistetyn kuvan HeLa-soluissa. Jokainen proteiini immunofluorescently leimattu Alexa 488, 594 tai 350 vastaavasti. Mittakaava, 50 pm. (F) RB1CC1 (vihreä), DAPI ja yhdistetyn kuvan HeLa-soluissa. RB1CC1 on immuno-leimattu Alexa 488, ja DAPI näkyy sininen fluoresenssi solutumissa. Mittakaava, 50 pm.

RB1CC1 sitoutuu ja aktivoi edistäjiä RB1, p16 ja p21, yhteistyössä p53 ja /tai hSNF5

RB1CC1 [2], [4] , [6] ja hSNF5 [7], [8], [9], [10], parantaa transkription molekyylien mukana RB1 reitin, joten tutki RB1CC1, hSNF5 ja p53 sitoutuvat promoottorialueet

RB1

,

p16

ja

p21

. Kromatiinin immunosaostus (chip), joissa käytetään vasta-aineita RB1CC1, hSNF5 ja p53 osoitti, että promoottori fragmentit

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

, joka monistettiin HeLa cell chromatin , saostettiin kullekin vasta-aineelle (Fig. 2A), viittaa siihen, että molekyylit rekrytoidaan promoottorialueiden RB1 kautta. Osallistuminen näiden kolmen molekyylien ilmentymistä

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

todensi käyttöön sh-RNA

RB1CC1

(sh –

RB1CC1

),

hSNF5

(SH-

hSNF5

) ja

p53

(SH-

p53

) HeLa- soluihin . Knockdown vaikutukset

RB1CC1

,

hSNF5

,

p53

,

p21

,

p16

ja

RB1 ​​

mRNA ilmaisun analysoitiin semikvantitatiivinen RT-PCR. SH-

RB1CC1

ja SH-

hSNF5

vähentynyt mRNA tasot

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

, kun taas SH-

p53

laski vain

p21

mRNA (Fig. 2B). Toisin sanoen, RB1CC1 ja hSNF5 ovat velvollisia pitämään puhtaaksikirjoitukset

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

, kun taas p53 vaatii nimenomaan transkriptioon

p21

. RB1CC1 merkittävästi aktivoinut edistäjinä

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

(Fig. 2C), ja knockdovvn RB1CC1 kukistettu (Fig. 2D). Nämä promoottori parannukset mukaan RB1CC1 verrattiin joukossa HeLa, TTC642 (hSNF5-null) ja H1299 (p53-null) soluja, jotta vahvistaa vaatimusta hSNF5 tai p53 kun RB1CC1 aktivoi

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

. RB1CC1 kyennyt tarjoamaan paranevat merkittävästi

RB1 ​​

ja

p16

promoottoreita TTC642 soluissa, ja oli vain pieni rooli

p16

ja

p21

transkription H1299 soluissa (Kuva. 2E). Ottaen huomioon RB1 reitin aloittaman RB1CC1, RB1CC1 vaatii hSNF5, tehostamiseen

RB1 ​​

ja p53, tehostamiseen

p21

transkriptiot, mutta sekä hSNF5 ja p53 tarvitaan RB1CC1 parantamiseksi

p16

transkriptio. Yhteenvetona RB1CC1 vaatii vuorovaikutusta sekä hSNF5 ja p53 antaa vahvan aktivointi

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

promoottorit.

(A ) Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) analyysi suoritettiin HeLa-soluissa. Kromatiinin immunosaostettiin anti-RB1CC1, anti-p53, tai anti-hSNF5 vasta-aine. Kukin saostunut DNA analysoitiin kvantitatiivisia ja semi-kvantitatiivinen PCR käyttäen promoottoria alukkeita varten

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

. Signaali-intensiteetit perusteella määriteltiin, jotka ovat peräisin tulo DNA (2 ng /ul), HeLa-soluja, jotka oli asetettu 1000. (B) Semi-kvantitatiivinen RT-PCR tehtiin yksittäisen jakson numero kunkin transkriptin HeLa-soluissa käsitelty shRNA varten

RB1CC1

,

hSNF5

tai

p53

. SH-

GL3

, SH-

p21

ja SH-

p16

käytettiin verrokkeina. Suluissa on näytetty PCR-sykliä numeroita. (C-D) HeLa-soluissa, lusiferaasiaktiivisuus promoottori

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

kasvoi merkittävästi, kun transfektio ekspressoivan plasmidin RB1CC1 (RB1CC1wt) (

C

) ja väheni huomattavasti kun knockdovvn RB1CC1 käyttäen SH-

RB1CC1

-1 ja -2 (

D

), verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu pcDNA tai sh-RNA ryntäily vastaavasti kontrolleina. Arvot antavat keskiarvot ± keskivirheet alkaen neljänä kokeiluja. (Studentin t-testi, tähdellä (*) osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja pcDNA ja RB1CC1wt välillä tai ryntäily ja SH-

RB1CC1

. *, P 0,05, ja **, p 0,01). Tehokkuus yli-ilmentymisen tai knockdovvn RB1CC1 validoitiin Western blotit kuten ylemmässä paneelit. (E) käyttöönoton jälkeen RB1CC1wt, lusiferaasiaktiivisuudet promoottoreita

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

verrattiin joukossa HeLa, TTC642 (hSNF5-null) ja H1299 (p53-null) soluissa. Tähdellä (**) osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja (Studentin t-testi; p 0,01) välillä HeLa ja TTC642 välillä tai HeLa ja H1299.

RB1CC1 aktivoi RB1 reitin ja estää kasvaimen kasvua

sen arvioimiseksi, RB1CC1 parantaa RB1 väyliä tukahduttaa syöpäsolujen kasvua, HeLa-solut lentivirally transdusoitiin

RB1CC1

cDNA: ta tai shRNA. Kohdunulkoinen ilmaus RB1CC1 lisäsi proteiinin tasot p53, p21, p16 ja RB1 ja estivät solujen kasvua (Fig. 3A ja B, vasen paneeli). Sen sijaan pudotus endogeenisen RB1CC1 mukaan SH-

RB1CC1

laski tasoja p53, hSNF5, p21 ja p16, ja parannettu solujen kasvua (Fig. 3A ja B, oikea paneeli). Sama kokeet kaksi rintasyövän solulinjat (MCF-7 ja SK-BR3) saatiin samanlaisia ​​tuloksia (kuvio. S2A-D). In

RB1CC1

-transduced solujen määrä G0 /G1-faasi-soluja lisättiin samanaikaisesti lasku numerot solujen S ja G2 /M-vaiheessa. Käyttöönotto SH-

RB1CC1

pienensi G0 /G1 väestö ja lisääntynyt väestön solujen S ja G2 /M (Fig. 3C Fig. S2E).

(A) HeLa-solut oli lentivirally transdusoitiin

RB1CC1

tai SH-

RB1CC1

. Lysaatit immunoblotattiin kuten on osoitettu. (B) Kasvu määritykset HeLa-soluissa transdusoitiin kuten

. Tiedot kvantitoitiin kolminkertaisista kokeista (alempi palsta). Edustavia immunobloteilla, levyt ja keskimääräinen pesäkemäärät ± keskivirheet esitetään. (C) Kun lentiviruksen muutos RB1CC1 ilmaisun, NIH3T3-solut analysoitiin virtaussytometrialla.

RB1CC1

ja SH-

RB1CC1

on merkitty punaisella (vasemmalla) ja sininen (oikealla), tässä järjestyksessä. Tiedot (keskiarvo prosentit ± standardipoikkeamat) vahvistettiin kolmena kappaleena kokeissa ja edustava virtaussytometrianalyysin kuvaaja on osoitettu. pLenti6 ja sh-GL3 käytettiin verrokkeina. Nuolet osoittavat, että eläkemenot (nuoli ylös) ja vähenee (down-nuoli) olivat tilastollisesti merkitseviä mukaan Studentin t-testiä; p 0,05 (D) RB1CC1, hSNF5 ja p53 muodostavat transkription monimutkainen solutumissa, ja aktivoi

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

.

Yhteenvetona todettakoon, että edellä mainitut tiedot osoittivat, että RB1CC1 muodostivat kompleksin hSNF5 ja /tai p53, ja maailmanlaajuisesti aktivoitua transkriptiota

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

(Fig. 3d).

ilmaisullinen analyysi molekyylien mukana RB1CC1-RB1 väylän rintasyöpiä

in vivo

arvioimiseksi korrelaatio proliferatiivisen aktiivisuuden ja edellä mainittujen RB1CC1 polun RB1 aktivoinnin, joissa p53: n ja hSNF5 kasvainkudoksessa

in vivo

, arvioimme ilmaisulliset tilan RB1CC1, RB1, p16, p21, Ki-67, p53 ja hSNF5 59 rintasyöpätapausta. Neljä tapausta RB1 nullizygotes osoitti korkean Ki-67 leviämisen indeksi (keskiarvo ± keskivirhe = 69,7 ± 6,6%). Immunoreaktiivisuus p53-viitaten p21 ilmentymistä-jaettiin kahteen ryhmään, ”normaali” (p53nor) varten heikkoa värjäytymistä ja ”epänormaali” (p53ab) vahvaa värjäytymistä, mikä erittäin osoitti, että mutantti p53-proteiini on kertynyt. Oli 41 ja 14 tapausta p53nor ja p53ab vastaavasti tässä sarjassa. hSNF5 oli hyvin yllä rintasyöpiä, riippumatta RB1CC1 tai p53: (tietoja ei näytetty). Immuunihistokemialliset tulokset RB1CC1 kvantitatiivisesti luokiteltiin I-III. Grade III, jotka ilmentävät RB1CC1 runsaasti solutumissa, kirjattiin RB1CC1 (+), kun taas laadut I-II ilman ydin- RB1CC1 kirjattiin (-) (Fig. 4A). Kuten raportoitu aiemmin [4], ilmentyminen RB1 oli melko hyvin korreloi RB1CC1 ilme tapauksissa kirjataan RB1CC1 (+) ja oli suurempi kuin RB1CC1 (-) tapaukset (Fig. 4B, vasemmalla). p16-ilmentyminen korreloi myös positiivisesti ydin- RB1CC1 ilme (Fig. 4B, 2

nd vasemmalla). Nimeäminen indeksit p21 ja Ki-67 p53nor tapauksissa – mutta ei p53ab tapauksissa – oli hyvin korreloi ilmaisun aseman RB1CC1 (Fig. 4B, 3

rd vasemmalle ja oikealle). Yhdessä ilmaus tila RB1CC1 ja p53 liittyvän kohonneeseen ilmauksia RB1, p16 ja p21, mikä puolestaan ​​vaikutti Ki-67 indeksi proliferaatioaktiivisuuden kliinisessä rintasyöpiä. Siksi immunohistokemiallinen tila RB1 ja p53 samoin kuin RB1CC1 olisi hyvä ennustajia proliferatiivinen toimintaa; Siten RB1CC1-RB1 reitin osoitettu kokeissa voisi olla merkittävä rooli etenemistä kliinisiin rintasyöpään.

(A) Immuunihistokemialliset laatuja RB1CC1 luokiteltiin I-III: I, negatiivinen tahra sekä sytoplasmassa ja ytimiä; II, positiivinen tahra vain sytoplasmassa ja negatiiviset ytimet; III, positiivinen tahra ytimet ja /tai sytoplasmaan. Asteet III, jotka ilmentävät RB1CC1 runsaasti solutumissa, kirjattiin RB1CC1 (+), kun taas laadut I-II ilman ydin- RB1CC1 kirjattiin RB1CC1 (-). Mittakaava osoittaa 50 um. (B) välinen korrelaatio RB1CC1 ja RB1, p16, p21 tai Ki-67 in p53normal (ylempi käyrät) ja poikkeava (alempi kuvaajat) tapauksissa. RB1CC1 (-) tai (+) tila on merkitty vaakasuora viiva, ja jokainen merkintöjä indeksi näkyy pystysuora viiva kaavioissa. Epänormaali p53: määriteltiin tapauksessa rintasyöpään, kun yli 50% kasvainsoluista olisi voimakkaasti positiivisia p53, kun taas vähemmän kuin 10% soluista oli positiivisia p21. Tällainen tapaus erittäin osoitti, että mutantti p53-proteiini oli kertynyt, ja että ehjä tehtävät p53 (kuten transkription aktivointi

p21

) olivat menetys. Opiskelijan

t

-testi käytettiin arvioimaan korrelaatiot (*, p 0,05, ja **, p 0,01).

Keskustelu

RB1CC1 on uusi säätelijänä RB1 että defosforyloi RB1 [2], [6] ja lisää sen ilme [2], [4]; Lisäksi geneettinen uudelleenjärjestely

RB1CC1

saattaa olla mukana rintasyövän kasvainten synnyssä [3], [5]. Äskettäin raportoimme että ydinvoiman RB1CC1 suoraan aktivoi

RB1 ​​

promoottori kautta 201bp ylävirtaan GC-rikas alue (-201 /U-GCbox) [4]. Selventää tarkemmin molekyylimekanismi RB1CC1 toimintaa, im- määritys seuraa LC-MS /MS on yritetty, ja kromatiinin remodeling tekijä, hSNF5 tunnistettiin. RB1CC1 myös vuorovaikutuksessa p53: n kanssa, joten RB1CC1 ajatellaan muodostaa kompleksin hSNF5 ja /tai p53: a. Uskotaan, että RB1CC1 indusoi

RB1 ​​

[2], [4] ja että hSNF5 parantaa

p16

(tunnetaan myös INK4a tai CDKN2A) ja /tai

p21

(tunnetaan myös nimellä CIP1, WAF1 tai CDKN1A) [7], [8], [9], [10]. Itse asiassa, immunosaostus ja Immunofluoresenssimääritykset ovat todenneet, että kompleksi RB1CC1, hSNF5 ja p53 muotoja solutumissa, ja siru, kvantitatiivinen RT-PCR ja Lusiferaasimäärityksiä varten

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

ovat ehdottaneet, että koordinoitu transkription parannukset näiden molekyylien vaikuttaa monimutkainen lukien RB1CC1, hSNF5 ja p53. Kuitenkin RB1CC1, hSNF5 ja p53 eivät ole yhtä tärkeitä stimulaation kunkin edistäjinä

RB1 ​​

,

p16

tai

p21

, kun taas kolme molekyylit rekrytoidaan kukin promoottori. Esimerkiksi hiljentäminen

p53

HeLa-soluissa ei ollut vaikutusta transkriptioon

RB1 ​​

, ja RB1CC1 yli-ilmentyminen voi aktivoida

RB1 ​​

promoottorin H1299 (p53- null) soluja. Nämä tarkoita, että p53 ei olennaisesti tarvitse

RB1 ​​

transkription, ja että RB1CC1 ja hSNF5 voivat tehdä yhteistyötä aktivoida

RB1 ​​

transkriptio. Näin ollen kaikki kolme molekyylejä ei aina tarvita aktivointi kunkin promoottorien, kun kaikki kolme tarvitaan koordinoitua puhtaaksikirjoitukset

RB1 ​​

,

p16

ja

p21

. Olemme myös perustaneet aikaisemmin, että ydinvoiman RB1CC1 sitoutuu ja aktivoi

RB1 ​​

promoottori [4]. Mielenkiintoista, piste-mutaatio -201 /U-GCbox on

RB1 ​​

promoottori tunnistettiin perinnöllinen retinoblastooma perhe [11]. On syytä huomauttaa, että -201 /U-GCbox on

RB1 ​​

ja sitova transkription monimutkainen, joka sisältää RB1CC1, hSNF5 ja p53 on tärkeä rooli ihmisen karsinogeneesissä.

Tässä tutkimuksessa , RB1CC1 yhteistyössä hSNF5 ja p53, aktivoi RB1 reitin ja estää kasvaimen solujen kasvua. Jotta aktivoida RB1 reitin tehokkaasti, RB1CC1 on ilmaistava solutumissa ja pitäisi muodostaa kompleksin hSNF5 ja /tai p53, ehdotetulla tavalla immunosolukemiallisten ja immunohistokemiallista dataa tämän tutkimuksen. PIASy (proteiini-inhibiittori aktivoidun STAT-proteiinin y) on vuorovaikutuksessa C-päähän (aa 1350-1594) ja RB1CC1 ja rekrytoi vuorovaikutuksessa olevan kompleksin PIASy ja RB1CC1 päässä sytoplasmasta tumaan [12]. Lisäksi PIASy säätelee negatiivisesti nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) aktiivisuus stimuloi sytoplasman RB1CC1, ja positiivisesti aktivoi p53-p21 signalointireitin yhdessä ydin- RB1CC1 [12]. Nämä tiedot näyttävät olevan sopusoinnussa meidän esitti tietoja sublocalization monimutkainen koostuu RB1CC1, hSNF5 ja p53. Ydin- molekyyli- kompleksi, kuten RB1CC1, hSNF5, p53 ja ylimääräisiä PIASy, voivat muodostaa suuren transkription komponentin aktivoimiseksi RB1 reitin koordinoidusti ja tukahduttaa tuumorigeneesiä ihmisen rintojen kudosta.

Nuclear ilmentymä RB1CC1 voisi olla tärkeä tuumorisuppressiogeeneksi. Kuten aikaisemmin on raportoitu, RB1CC1 sijaitsee paitsi ydin, mutta myös sytoplasmassa [4], [6], [13], [14]. Sytoplasminen RB1CC1 on ehdotettu olevan yhtä hiivan Atg17, ja useat tutkimukset ovat osoittaneet, että RB1CC1 toimii olennaisena molekyyli autophagy asetuksen [13], [14], [15]. Autophagy on tuumorigeneesiin, mutta sen tarkka rooli on epäselvä. On mahdollista, että autophagy on erilaisia ​​rooleja eri vaiheissa, tai yhteyksissä, kasvaimen. Young, et al. [16] ovat raportoineet, että autophagy välittää mitoosi Vanheneminen, ikkunan aikaisin kasvainten kehittymiseen. Ehdotamme, että sytoplasminen ydinvoimaa siirtyminen RB1CC1 avainasemassa in autophagy-vanhenemista -alueella. Tuloksemme

in vitro

ja

in vivo

viittaavat siihen, että RB1CC1 soittaa eri rooleissa mukaan sen subsellulaariseen sijainti. Nuclear RB1CC1 muodostaa kompleksin hSNF5, p53 ja muut komponentti, joka edistää transkriptiota RB1 reitin, viittaa mahdolliseen sidos mitoottisiin vanhenemista. Kuitenkin sytoplasminen RB1CC1 näyttäisi ole merkitystä tuumorisuppressorina aktivoimalla RB1 reitin.

Nuclear RB1CC1 ilmaisu merkittävästi korreloi kuin RB1 ja p16 in rintasyöpäkudosnäytteessä

in vivo

riippumatta p53 status. Ki-67 leviämisen indeksi ja p21 ilmaisun vaikuttivat molemmat RB1CC1 ja p53, ja Ki-67-indeksi riippuu myös RB1 asemasta. Ilmaukset RB1, p16 ja p21 vaikuttavat Ki-67 indeksi lisääntymisaktiivisuus, joten immunohistokemiallinen tilan RB1 ja p53 samoin kuin RB1CC1 voi ennustaa lisääntymisaktiivisuus kasvain. Siten esillä oleva tiedot osoittivat, että etenemistä rintasyövistä oli alle suuri vaikutus RB1CC1, sekä RB1 ja p53 status. Odotamme, että yhdistetyn immunohistokemiallinen arviointi RB1, RB1CC1 ja p53 antaa käsityksen niiden kliinisiä sovelluksia, kuten mahdollista käyttöä ennustetekijöiden biomarkkereita.

Yhteenvetona olemme raportoineet täällä että RB1CC1, joka yhdistää RB1 ja p53 reittejä mahdollisena välittäjänä, muodostaa kompleksin hSNF5 ja /tai p53 joka parantaa RB1 reitin maailmanlaajuisesti. Immunohistokemiallinen arviointi RB1 ja p53 yhdessä RB1CC1 voi olla hyödyllinen biomarkkereiden kätevä, rutiini kliiniset analyysit ja antaa ennusteen biologisen käyttäytymisen rintojen kasvaimet ja /tai kasvaimia muihin elimiin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

TTC642 luovutti ystävällisesti Drs. Shigeru Ohta, Hiroyuki Shimada ja Timothy J. triche (Childrens Hospital Los Angeles, Los Angeles, CA). HeLa, HEK293, MCF-7, SK-BR3 ja H1299-solut ostettiin American Type Culture Collection (MD), ja niitä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) tai RPMI 1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. Kaikki soluviljelyalustassa täydennetty penisilliinillä (50 yksikköä /ml) ja streptomysiiniä (50 mg /ml).

Vasta-aineet ja reagenssit

Kanin antiseerumit RB1CC1 (aa. 25-271, 549 -817 koska jokainen epitooppi) tuotettiin, kuten aiemmin on raportoitu [4], [17], ja puhdistettu IgG käytettiin kokeissa. Anti-p53 (FL-393) ja anti-p21 (F-5) saatiin Santa Cruz Biotechnology (CA). Anti-HA (3F10) oli Roche (Saksa). Anti-Flag (M2) ja anti-tubuliinin α (DM 1A) hankittiin Sigmalta (MO). Toinen vasta-aineet olivat peräisin BD Biosciences (CA).

immunosaostus proteiinikompleksi seuraa neste chromatography- tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS) B

MCF-7 rintasyövän soluja lyysattiin EBC hajotuspuskuria, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,25% natriumdeoksikolaatti, 0,2 mM Na

3Vo

4, 100 mM NaF ja 1% proteaasiestäjäseostabletit (Wako Chemicals, Japani), ja sentrifugoitiin sitten 20 minuutin ajan 20000 x g 4 ° C: ssa. 5 ml: n supernatanttia (~10mg /ml) inkuboitiin 100 ug anti-RB1CC1 puhdistettiin IgG primaarista vasta-ainetta 4 ° C: ssa yön yli. Immunokompleksien sidottiin proteiini-G-agaroosin (Pierce, IL) ja vielä 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa ja pestiin viisi kertaa NETN (20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP- 40). Proteiinit sitoutunut proteiini G-Sepharose eluoitiin lisäämällä Laemmlin SDS-näytepuskuria, joka sisälsi 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10% glyserolia, 5% 2-merkaptoetanolia, 2% SDS, ja 0,01% bromifenolisinistä geeliin ja keittämällä sitä 3 minuuttia. Kun oli sentrifugoitu 10000 x g: ssä 2 minuutin ajan, supernatantti alistettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE), ja erotetut proteiinit visualisoitiin hopeavärjäyksellä. Voimakkaasti värjätään erityinen bändi in-geeli pilkottiin trypsiinillä, ja talteen peptidit analysoitiin sähkösumutusmenetelmän ioni-ansa massaspektrometriä (LCQ, Finnigan MAT, CA) kytkettynä verkossa kapillaari HPLC (Magic 2002 Michrom BioResorces, CA) ja hankkia massaspektrometria /massaspektrometria (MS /MS) spektrejä. Tiedot johdettu MS /MS-spektrit käytettiin hakemaan käännetty proteiinia tietokanta, joka koostui tietokannasta NR ja kuuden luku–frame käännetty EST-tietokanta, tunnistaa proteiinin käyttäen julkisesti saatavilla ohjelman vaania (http: //prowl.rockefeller.edu).

Plasmidi-DNA ja geeninsiirto

Ulkoinen ja sisäinen deleetiomutanttien varten

RB1CC1

(GenBank nro. NM_014781) kertyi pcDNA3.1 plasmidivektori (Invitrogen), yhdistämällä PCR-pohjainen manipulointia, jossa sopiva ulkoinen alukkeet asemissa kuvattu alla ja restriktioentsyymidigestiolla. Nukleotidien kaikki konstruktit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

RB1CC1

mutantteja DCCA, dccB, DLZ, LZC, DCC ja Fcc poisti aminohapot 863-1083, 1078-1363, 1364-1594, 1-1356, 824-1594 ja 1-863, vastaavasti ( kuva 1C, vasen paneeli). Transfektio suoritettiin käyttämällä FuGENE HD (Roche) mukaan toimittajan suosituksia. Plasmidivektorit RNAi varten

RB1CC1

valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, kahdenlaisia ​​lentiviruksen sh-RNA-vektorit (SH-

RB1CC1

-1 ja -2), jotka vastaavat eri kohde sivustoja (nt. 2070-2090 ja nt. 4611-4631, vastaavasti) on

RB1CC1

mRNA: ta (GenBank nro. NM_014781) syntetisoitiin in vitro lisäämällä keinotekoista oligonukleotidit osaksi pSIH1-H1-Puro sh-RNA-vektorin (System Biosciences, CA). Vektorit sh-RNA

hSNF5

ja

p53

valmistettiin OpenBiosystems (AL). Ei-vaientaminen valvontaa, SH-

GL3

ja ryntäily vektorit hankittiin System biotieteiden ja OpenBiosystems, vastaavasti. Lisäksi, ihmisen

RB1CC1

cDNA subkloonattiin pLenti6-vektoriin (Invitrogen). Lenti-virus siirtämällä sh-RNA: ta tai cDNA valmistettiin jokaisen pakkauksen yhdistelmä, mukaan kunkin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kloonata ja laajentaa soluja valittiin läsnäollessa puromysiini tai blastisidiinia, vastaavasti, ja käytettiin kokeissa.

Pull-down määritys

Flag-merkityn-villityypin (wt)

RB1CC1

tai sen mutantteja (DCCA, dccB, DLZ, LZC, DCC ja FCC) transfektoitiin HEK293-soluihin yhdessä HA-tagged hSNF5 (täysi). Solut hajotettiin TNE-puskuriin (20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 1% NP-40 ja 1 mM Na-

3Vo

4, joka sisältää proteaasi-inhibiittorien seos). Lysaatit sentrifugoitiin, ja supernatantit inkuboitiin anti-Flag tai anti-HA-immobilisoitu helmiä 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Helmet pestiin viisi kertaa TNE-puskuria ja keitetään läsnä Laemmlin SDS-näytepuskuria. Proteiini-kompleksit erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin PVDF-kalvolle suodattimet ja alistettiin immunoblot-analyysiin, jossa on esitetty vasta-aineilla.

immunosaostus havaita proteiinin monimutkainen

MCF-7 yksikerrossoluissa huuhdeltiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja raaputettiin jääkylmään NP-40 hajotuspuskuria (20 mmol /l Tris (pH 8,0), 137 mmol /l NaCI: a, 1% NP-40, 10% glyserolia), jota täydennettiin 1% proteaasiestäjäseostabletit (Wako Chemicals) ja 3 mmol /l Na

3Vo

4. Lysaatit inkuboitiin jään päällä 20 minuuttia, kirkastetaan sentrifugoimalla ja proteiinikonsentraatio määritettiin bikinkoniini- happo-määrityksellä (Pierce). Liuokset, jotka sisältävät 400 1000 ug proteiinia lyhyesti esikirkastettiin proteiini-G-agaroosin helmiä (Pierce) ja käytettiin sitten immunopresipitaatioreaktion 2 erilaista anti-RB1CC1 kanin polyklonaalista lgG: illä tai normaali valvonta kanin IgG: t 4 ° C: ssa yön yli, minkä jälkeen inkuboimalla proteiini-G helmiä 2 tunnin ajan kerätä immuuni- komplekseja. Lopuksi helmet pestiin NP-40 puskurin viisi kertaa, suspendoitiin uudelleen SDS-näytepuskurissa, keitetty, eroteltiin SDS-PAGE: lla ja analysoitiin immunoblot-, kuten alla on kuvattu.

immunoblot-analyysi

solut yleensä lysoitiin Western blot kuten ovat kuvanneet Sarbassov, et ai [18]. Tyhjentämisen jälkeen hajotettiin aineet sentrifugoimalla 15000 x g: ssä 1 minuutin ajan, supernatantit keitettiin SDS-näytepuskurissa. Proteiinit erotetaan SDS-PAGE siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) suodattimia. Blokkaamisen jälkeen suodattimet TBS-T: n (10 mM Tris-HCI (pH 7,6), 150 mM natriumkloridia, 0,1% Tween 20: tä), joka sisälsi 5% naudan seerumin albumiinia (BSA), suodattimia inkuboitiin yön yli ilmoitettu primaaristen vasta-aineiden TBS-T, joka sisältää 2% BSA: ta 4 ° C: ssa. Suodattimet pestiin sitten TBS-T ja inkuboitiin 1 h piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri-anti-kani, tai anti-rotta-IgG: tä (GE Healthcare, UK) laimennettuna 1:20,000 TBS-T, joka sisältää 2% BSA: ta . Usean pesun jälkeen TBS-T: n, immunoreaktiivisuus havaittiin käyttämällä ECL-järjestelmää (GE Healthcare), menettelyjen mukaisesti valmistajan suosittelemia.

immunofluoresenssimäärityksellä

MCF-7 ja HeLa-solut viljeltiin roksilla Labtek ™ kammion kalvot (BD Biosciences) 70% konfluenssiin, kiinnitettiin 1% puskuroitua formaldehydiä ja 70% etanolia, ja sitten läpäiseviksi 0,1% Triton X-100. Ensisijainen kanin anti-RB1CC1 IgG, hiiren anti-hSNF5 IgG2a (BAF48), ja kanin anti-p53-IgG: tä (FL393) konjugoitiin Alexa 488, 594 ja 350, jotka ZenonTM -leimauskittiä (Molecular Probes).