Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ef reseptorit ovat suurin perhe reseptorityrosiinikinaasien. Yhdessä niiden ligandien, Efrii-, ne täyttävät useita biologisia toimintoja. Poikkeava ilmentymä Ephs /Efrii- mikä lisää Ef reseptorin Efriini ligandi suhde on kriittinen tekijä kasvainten synnyssä, mikä osoittaa, että tiukka sääntely Ef ja efriini ilmaisu on välttämätön normaalille solujen käyttäytymiseen. 3′-transloimattomat alueet (3’UTRs) selostukset tärkeässä vielä laajalti underappreciated rooli valvonnassa proteiinin ilmentymisen. Perustuu oletukseen, että paralogues suurten geeniperheiden saattaa esiintyä konservoituneen järjestäminen säätelyelementtejä niiden 3’UTRs haimme uutta bioinformatiikan /molekyylibiologian lähestymistapa 3’UTR sarjoissa Ef /efriini selostukset. Havaitsimme klustereita motiiveja koostuu sytoplasman polyadenylaatio- elementtien (CPE), AU-rikas elementtejä (ARE) ja Hur sitoutumiskohtiin. Nämä klusterit sitoa useita RNA-vakauttava ja epävakautta aiheuttavien tekijöiden, kuten Hur. Yllättäen, huolimatta sen yleisesti hyväksytty merkitys kuin mRNA-stabiloivan proteiinin, me osoittavat lisäksi, että sitoutuminen Hur näihin klustereihin todella horjuttaa Ef /efriini selostukset kasvainsolulinjoissa. Niinpä knockdovvn Hur suuresti moduloi ilmentyminen useiden Ephs /Efrii- sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Yhdessä meidän tutkimukset viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen HUR kuten monissa etenevä kasvaimia voi olla aiheuttajaa varten disarranged Ef reseptorin efriini ligandin suhde johtaa suurempaan kudoksen invasiivisuus.

Citation: Winter J, Roepcke S, Krause S , Müller EY, Otto A, Vingron M, et al. (2008) Comparative 3’UTR analyysi voidaan tunnistaa Regulatory Clusters että Drive Ef /efriini Expression in Cancer Cell Lines. PLoS ONE 3 (7): e2780. doi: 10,1371 /journal.pone.0002780

Editor: Thomas Preiss, Victor Chang Sydämen Research Institute, Australia

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2008; Hyväksytty: 25 Kesäkuu 2008; Julkaistu: 23 heinäkuu 2008

Copyright: © 2008 Winter et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ rahoitti Deutsche Volkswagenstiftung ja Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 577, projekti A6 SS).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

3’untranslated alueet (3’UTRs) mRNA keskeisessä asemassa ovat posttranskriptionaalisella geenin ilmentymisen säätelyyn, esimerkiksi muuntamalla mRNA lokalisointi [1], [2], [3], vakaus [4], ja käännös [ ,,,0],5], [6]. Sen lisäksi, joilla on sitoutumiskohtia äskettäin löydetty MikroRNA, 3’UTRs voi satama motiiveja, jotka ovat vuorovaikutuksessa RNA: ta sitovia proteiineja. Nämä aiheet ovat yleensä lyhyen sekvenssin osat, joiden toiminta voi vaikuttaa niiden sekundaarirakenteissa [7]. Siksi niiden tunnistaminen tietokonealgoritmien on vaikeaa ja yleensä tuottaa lukuisia vääriä positiivisia.

Tunnistaa 3’UTR motiiveja käytimme uusi lähestymistapa, joka perustuu kahteen oletukseen: ensimmäinen, paitsi koodaavat alueet vaan myös elementtien 3’UTRs, jotka ovat välttämättömiä geenin toimintaan voidaan konservoituneet paralogues suurten geeniperheiden; Toinen, mRNA: t, jotka koodaavat proteiineja, jotka toiminnallisesti vuorovaikutuksessa tai täyttää tarpeettomia toimintoja voisi näytteille säilyneitä järjestäminen säätelyelementtejä niiden 3’UTRs. Tämän tutkimiseksi valitsimme perheitä Efriini ligandien ja Ef reseptoreihin. Perhe Eph-reseptorien on suurin alaperhe reseptorityrosiinikinaasien. Ef reseptorit on jaettu kahteen alaluokkaan, joka perustuu niiden ligandin erityispiirteet. Yleensä Ef A (EphA) reseptorit sitoutuvat glykosyylifosfatidyyli ankkuroituja efriini ligandeina (ephrinA) (lukuun ottamatta EphA4), kun taas Ef B (EphB) reseptorit sitoutuvat transmembraanidomeeni sisältäviä efriini B ligandeja (ephrinB) [ ,,,0],8]. Kuitenkin tuoreet tiedot viittaavat siihen, että yhteisvaikutuksia voi esiintyä myös yli luokat [9]. Sitoutumisessa niiden samankaltaisiin efriini ligandit, Ef reseptorit autophosphorylate ja aktivoi alavirran signalointikaskadien (eteenpäin signalointi). Vaikka niillä ei ole katalyyttistä aktiivisuutta itse, molemmat luokat Efriini ligandit voivat aktivoida signaalintransduktioreitteihin jälkeen vuorovaikutuksen Ef reseptorien (reverse signalointi) [10].

Tällä solutasolla, signalointi Ef reseptorit ja Efrii- johdot joko lisääntynyt tarttuvuus (vetovoima) tai vähentynyt tarttuvuus (vastenmielisyys) on vuorovaikutuksessa solujen. Nämä vasteet ovat tärkeitä välittämisessä monenlaisia ​​biologisia vaikutuksia, mukaan lukien angiogeneesi, solu erottelu, soluunkiinnittymisaktiivisuutta, solu morphogenesis, ja soluliikkuvuus [11]. Useat näistä prosesseista ovat käsistä aikana tuumorigeneesiprosessin esiin mahdollinen kriittinen rooli Ef /efriini signalointia kehittämiseen monien ihmisen syöpien. Mukaisesti, että patofysiologiaan, useita Ephs ja Efrii-, mukaan lukien EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphB2, EphB3, ja efriini-A1, on yli-ilmentynyt erilaisia ​​kasvaimia, ja näytteille enimmäkseen kasvaimen edistäviä ominaisuuksia [11], [12 ].

Expression malleja Ephs ja Efrii- ovat monimutkaisia, ja niiden oikea ilmaisu on tärkeää oikean toiminnan monien edellä mainittuja menetelmiä. Siksi hienosäädetään sääntely Ef /efriini ilmaisua sekä transkriptiota ja posttranskriptionaalisella tasolla näyttäisi olevan välttämätön. Transkriptionaalisella tasolla, Eph-reseptorien ja efriini ligandeja on liitetty alavirran tavoitteet monista eri transkriptiotekijöiden, mukaan lukien homeodomain proteiinit [13], ja p53-proteiinin perheen [14], [15], [16], [17]. Paljon vähemmän tiedetään posttranskriptionaalisella sääntelyä. On kuitenkin olemassa näyttöä osallistumisen 3’UTR: ylössäätely EphA2 reseptorin axons rajan keskiviivan välittyy erittäin konservoitunut sekvenssi transkriptio n 3’UTR joka sisältää sytoplasmisen polyadenylaatio elementti (CPE) [18].

Tässä on järjestelmällisesti kerännyt 3’UTR sekvenssit hiiren Ef reseptorit ja Efriini ligandien ja seulottiin niitä

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT jaksoryhmittymät. Olemme tunnistaneet kolme erilaista motiiveja useiden Ef /efriini 3’UTRs: CPEs, AU-rikas elementtejä (ARE), ja Hur sitoutumiskohtia. Vaikka jotkut näistä motiivien todettiin jaetaan ilmeisesti sattumanvaraisesti vastaavissa 3’UTRs, toiset todettiin puettu klustereita, jotka ovat erittäin konservoituneita eri selkärankaisten lajien. Lisäksi tunnistimme useita RNA-sitovia proteiineja, kuten Hur, jotka ovat vuorovaikutuksessa näiden klustereita, ja osoitamme, että EfnA2, EphA2, ja EphA4 ovat suoria posttranskriptionaalisella tavoitteita HUR syöpäsolulinjoissa. Yllättäen huomasimme, että Hur ei toimi vakauttavana tekijänä ekspression näiden Ef /Efrii-, mutta että se horjuttaa sanomansa.

Tulokset

Euroopan 3’untranslated alueet selostukset hiiri Ef reseptorit ja efriini ligandien

Jotta saadaan täydellinen kokoelma täyspitkän 3’UTR sekvenssejä mRNA Ef reseptorien ja efriini ligandeja, ensin uutettu kaikki käytettävissä hiiren Ef /efriini sekvenssit GenBank tietokannasta NCBI. Vain polyadenyloituina selostukset pidettiin täyspitkä, ja vain niin katkaisemalla variantit, jotka sisältävät sekä (i) konsensus heksameerin sekvenssin lähellä katkaisukohta ja (ii) poly (A) hännän otettiin mukaan analyysiin. Puutteellinen selostukset laajennettiin poly (A) tail kohdistamalla 3’complete EST tietoja käyttämällä ohjelmiston CAP3 (liittymistä numeroiden taulukko S1). C-terminaaliset lyhennetyt isoformit eivät olleet mukana tutkimuksessa.

katsoo, koodaavat alueet ja eksoni /introni-rajat [19] ovat hyvin konservoituneita eri jäsenten Eph-reseptorin ja efriini ligandin geenin perheissä 3’UTRs selostukset osoittavat korkeaa monimuotoisuus pituus ja järjestys: samat kuin efriini ligandien vaihtelevat 552 bp (EfnA4) ja 3171 bp (EfnB2) ja ne on Ef reseptorien 198 bp (EphB6) ja 3310 bp (EphA4) (Fig. 1, taulukko S1). Lisäksi emme voineet havaita mitään merkittävää säilyttäminen on sekvenssin tasolla, joko välillä 3’UTRs ja Ef reseptorin transkriptien tai näistä Efriini ligandien (tuloksia ei ole esitetty).

Scheme 3’UTRs Eph /Efrii-. Otaksuttu

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT jaksoryhmittymät korostetaan eri väreillä, säilyttäminen välillä ihmisen /hiiren, ihmisen /hiiren /Xenopus näkyy tähdellä /avoimet ympyrät.

Ortologiset säilyttämisen välillä ihmisen ja hiiren vaihteli 60%: sta 80%, joka on verrattavissa genomin laajuinen keskiarvo 69% [20].

Vaihtoehtoinen polyadenylaatiokohtia löydettiin 3’UTRs on EfnA4, EfnB2, EphA3, ja EphA7 (Fig. 1).

Euroopan 3’untranslated alueet selostukset Ef reseptorien ja Efriini ligandit sisältävät hyvin säilyneitä

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT jaksoryhmittymät

Kuten edellä sekvenssit Ef /efriini 3’UTRs ovat hyvin heikosti konservoitunut paralogues. Kuitenkin posttranskriptionaalisella asetus perustuu usein lyhyt

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT sekvenssimotiiveja, ja geenejä, jotka koodaavat proteiineja, jotka toiminnallisesti vuorovaikutuksessa ja /tai geenejä, jotka kuuluvat samaan geeniperheen voidaan olettaa sisältävän konservoituneita 3’UTR motiiveja. Havaitsemaan tällaiset elementit me skannattu 3’UTRs hiiren Ef /efriini selostukset tunnettujen

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT jaksoryhmittymät (ks https://genereg.molgen.mpg.de/cgi-bin/regEchse/regEchse.pl: kuviot, jotka on sisällytetty haku on lueteltu ”valitse tiedossa motiivi; Hur sitoutumiskohdat tunnistettiin käyttämällä Transterm https://uther.otago.ac.nz/Transterm.html). Yllättävää kyllä, tämä johti tunnistamiseen kolmen näkyvä motiivien-CPEs, ARE ja Hur sitoutumiskohdat-useiden kohdalla Ef /efriini 3’UTRs (Fig. 1). CPE ovat translaation ohjausyksiköt joka on sijaittava lähellä poly (A) päällä toimivaksi [21]. Siksi kuviossa 1, vain ne CPEs jotka täyttävät tämän kriteerin [0-250 emäsparin päässä poly (A) hexamer] on kuvattu. Hur vuorovaikutuksessa useiden AUUUA toistoja [22] ja U-rikas venyy suurella affiniteetilla. Viime aikoina on ryhdytty yrityksiin sen tarkemmin määritellä Hur sitomiskohta [23], [24]. Sarjassa sitoutumiskokeissa Meisner et al. päätelty, että Hur sitoutumiskohta on 9-meerinen NNUUNNUUU. Yllättävää kyllä ​​tämä motiivi havaittiin olevan läsnä kaikissa validoitu HUR tavoitteet, ja yhden pisteen mutaatio motiivi riittää täysin tuhota Hur sitova. Tässä tutkimuksessa etsittäessä Hur sitoutumiskohdista perustui tämän motiivin. Sekä ARE ja Hur sitoutumiskohdat havaittiin kaikissa osissa 3’UTRs. Osa motiivien löydettiin eristetty, ei-päällekkäisiä osia. Muissa tapauksissa, CPE havaittiin päällekkäisiä ARE tai Hur sitoutumiskohtien tai ARE: joissa Hur sitoutumiskohdista. Huomattavaa on, että kaikki kolme motiiveja, jotkut useita kopioita, todettiin yhdessä klustereissa (Fig. 1, taulukko S2). Nämä klusterit osoittavat kaksi erillistä lokalisointi kuvioita: sijaita missä tahansa 3’UTR ilman selvää parempana erityinen alue (esim EphA3, ks. 1) tai erityisesti puettu että 3′-terminaalisten alueella 3’UTR lähellä polyadenylaatiokohta (esim EphA2, ks. 1).

ortologiset 3’UTRs,

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT jaksoelementin tärkeitä säätelytoimintoja odotetaan säilytettävä evoluution [24] . 18 on 21 hiiren Ef /efriini 3’UTRs tutkittu tässä tutkimuksessa, sekvenssit ihmisen ortologeja oli saatavilla, ja 44%, 74%, ja 72% CPE, ARE, ja Hur sitoutumiskohtien vastaavasti todettiin olevan konservoituneita lajien välillä (Fig. 1 ja 2). Ilmeisin, lähes kaikki motiivien puettu klustereissa säilytetään. Sitä paitsi nisäkkäät, ortologiset sekvenssit 3’UTRs on EfnB2 ja EphA2 alemmasta selkärankaisten

Xenopus laevis

ovat käytettävissä. Jälleen etenkin motiiveja, jotka ovat puettu klustereiden ja lähellä poly (A) päällä havaittiin säilytettävä tällä lajilla (Fig. 1 ja 2).

Multialignments edustavien esimerkkien aihekokonaisuuksien motiiveja kuin löytyi että 3′-terminaalisten osien EfnA1, EfnA4, EphA2 ja EphA4 3’UTRs. Kannat CPEs, ARE, Hur sitoutumiskohdat sekä konsensuksen heksamee- polyadenylaatiosignaalin esitetään alla rinnastukset.

tunnistaminen proteiinien, jotka sitoutuvat jaksoryhmittymät että Ef /efriini 3’UTRs

perusteella seuraavien kriteerien mukaan 3′-terminaalisten osien EfnA1, EphA2, ja EphA4 3’UTRs valittiin lisäkarakterisointia. Ensinnäkin kunkin sisältää aihekokonaisuuksien jaksoryhmittymät koostuu CPEs ja Hur sitoutumiskohdista. EphA2 ja EphA4 lisäksi sisältävät ARE näissä klustereissa. Siksi 3′-terminaalisten osien näiden 3’UTRs näytti olevan hyviä ehdokkaita proteiinien tunnistamiseksi vuorovaikutuksessa motiivi klustereita. Toiseksi kaikki kolme motiivi klustereita osoittavat suurta ortologiset säilyttäminen ihmisen (Fig. 1). Lisäksi EphA2 klusteri on erittäin konservoitunut

Xenopus laevis

(varten EfnA1 ja EphA4 ei sekvenssi oli saatavilla tämän lajin). Kolmanneksi 3′-terminaalisten alue EphA2 3’UTR on jo osoitettu täyttämään tärkeitä säätelytoimintoja [18].

testaamiseksi sitoutumisen vuorovaikutuksessa proteiinien näihin motiivi klustereita, radioaktiivisesti leimatun selostukset kattaa 3 ”päätelaite alueilla EfnA1, EphA2, ja EphA4 3’UTRs (Fig. 3a) inkuboitiin lysaatti hiiren aivoissa ja UV-silloitettu. Hiiren aivot käytettiin tässä kokeessa, koska useat tunnetut on- ja CPE-vuorovaikutuksessa proteiinit ovat erittäin ilmaistu tässä elimessä. Kompleksit erotettiin elektroforeesilla SDS-akryyliamidigeeleissä, ja kuivattiin geelit valotettiin röntgenfilmille. Mielenkiintoista on, että tämä menetelmä ei ole vain tunnistettu useita proteiineja, jotka oli sidottu motiivi klustereita kaikkien kolmen 3′-terminaalisten alueiden, mutta myös paljasti päällekkäisiä raitakuvio (Fig. 3b): proteiinit 30-45, 50, ja 75 kD sitoutuu kaikki kolme sekvenssiä, vaikka affiniteetti 3′-terminaalisten alueiden EphA2 ja EphA4 3’UTRs näytti paljon suurempi kuin se, että EfnA1 3’UTR. Proteiinit -60 ja 70 kD olivat yksinomaan havaittavissa EphA2 ja EphA4 kaistojen (Fig. 3b). Identiteettiä vuorovaikutuksessa proteiinien määritettiin RNA-proteiini avattavasta määritys ja sitä seuraava analyysi eluoitu fraktio massaspektrometrialla. Biotiinileimatuilla

–

vitro

-transcribed selostukset vastaavat 3′-terminaalisten alueelle EphA2 3’UTR inkuboitiin lysaatin hiiren aivoista ja vedetään alas streptavidiinilla magneettisten helmien. Transkriptien antisense-orientaatiossa valitun alueen käytettiin negatiivisena kontrollina kokeessa. Kompleksit erotettiin SDS-PAGE: lla, värjättiin kolloidisella Coomassie, ja vanteet erityisesti rikastettu saadun näytteen kanssa siinä mielessä, transkriptien analysoitiin sähkösumutusionisaatiota (ESI) massaspektrometrialla. Mielenkiintoista on, että lisäksi useita proteiineja, joiden tiedetään olevan osallisena transkription ja mRNA-myeliinin ilmentymisen tekijä 2 (MyEF-2); heterogeeninen ydinaseiden ribonukleoproteiini- M (hnRNP M); pitkälle ylävirtaan sitova proteiini 1 (FUSE-sitova proteiini 1, FBP); silmukoinnin tekijä, proline- ja glutamiini-rikas (PSF) -Me tunnistetaan AUF1 ja KSRP, kaksi ARE-sitovat proteiinit (ARE-BPs), jotka ovat tunnettuja säätelijöitä mRNA: n stabiilisuuteen (Fig. 3c, taulukko 1). Vahvista vuorovaikutuksen toistimme RNA-proteiini pulldown määritys. Tällä kertaa kuitenkin, RNA-proteiini-kompleksit siirrettiin PVDF-kalvoille ja vuorovaikutuksessa proteiinit havaittiin spesifisillä vasta-aineilla. Kuten odotettua, KSRP sidottu RNA-koetin, joka vastaa EphA2 3’UTR pään alueen, mutta ei antisense-negatiivinen kontrolli (Fig. 3d). Mielenkiintoista, joka koskee AUF1, voisimme vain havaita sitoutuminen p45 ja p42-isoformeja, mutta ei p40 ja p37-isoformit. Lisäksi ARE ja CPE-kuviot, The 3′-terminaalisten osa EphA2 3’UTR satamat Hur sitoutumiskohtaa konsensuksen NNUUNNUUU. Kuitenkin, Hur ei tunnistettu kuin vuorovaikutuksessa proteiinin massaspektrometria analyysiä. Testata suoraan sitoutumiseen Hur inkuboimme Western blot membraanin vastaan ​​kohdistettu vasta endogeenisen Hur proteiinia. Kuten odotettua, Hur havaittiin spesifisesti vuorovaikutuksessa ja 3′-terminaalisten alueen EphA2 3’UTR.

(A) kaaviossa on 3’UTRs of EfnA1, EphA2 ja EphA4 kuten kuvassa. 1. Koettimet käytetään UV-ristisidosyhdisteiden ja RNA-proteiini pulldown määrityksissä osoitetaan (B) UV-ristisidosyhdisteiden proteiini lysaatti hiiren aivoissa ja radioaktiivisesti leimattuja koettimia, jotka vastaavat ryhmittyneet motiiveja läsnä 3′-terminaalisten osien EfnA1, EphA2 ja EphA4 3 ’UTR. (C) 10% SDS-geelillä värjättiin kolloidisella Coomassie esittää proteiinit eluoitiin streptavidiinilla helmiä kytketty biotinyloitu koetin, joka vastaa 3′-terminaalisten osa EphA2 3’UTR (vasen kaista) tai vastaavan antisense-sekvenssi (oikealla kaistalla ). Differential nauhat leikattiin irti ja analysoitiin massaspektrometrialla. Proteiini identiteettejä annetaan. (D) Western blot analyysit RNA-proteiini pulldowns proteiini lysaatti hiiren aivoissa ja biotinyloitu antureista vastaavat 3′-terminaalisten osan EphA2 3’UTR (vasen kaista) tai vastaavaan antisense-sekvenssi (oikea kaista). KSRP, AUF1, Hur ja hnRNP A0 osoitetaan käyttäen spesifisiä vasta-aineita. (E) western blot analyysit RNA-proteiini-pulldowns proteiini lysaatti hiiren aivoissa ja biotinyloitu koettimia, jotka vastaavat 3’-terminaalisten osien Ef /efriini 3’UTRs tai EphA2 antisense-sekvenssi. HUR ja AUF1 osoitetaan käyttäen spesifisiä vasta-aineita.

Perustuu koosta yhtäläisyyksiä 30-45 kD, UV-silloittamalla määritys ehdotti sitovat saman proteiineihin 3′-terminaalisten osien EfnA1, EphA2, ja EphA4 3’UTRs (Fig. 3b). Tämä saattaa osoittaa, että ilmaus useita Ef reseptorit ja Efrii- säännellään yhteinen mekanismi. Sen todistamiseksi, että identtisiä proteiineja sitoutuvat motiivin klustereiden tunnistettu useissa Ef /efriini 3’UTRs, suoritimme lisää RNA-proteiini pulldown määrityksissä kanssa

–

vitro

-transcribed ja biotinyloitua 3 ’ terminaalin osat kaikki Ef /efriini 3’UTRs, jotka sisältävät ARE, CPE ja /tai Hur sitoutumiskohtia (taulukko 2). Lisäksi käytimme 3 ’terminaalin osa Ef 3’UTR joka ei sisällä tällaista motiivin (EphA1; ainoa motiivi yksilöidyt 3’UTR tämän transkriptin on Hur sitomiskohta ulkopuolella sijaitsevat 3’ päätteen osa ). Jälleen kompleksit siirrettiin PVDF-kalvoille, ja nämä inkuboitiin vasta-aineiden kanssa havaitsemaan 32 kD HUR proteiinia ja neljä AUF1 isoformia, P37, p40, p42 ja p45, vastaavasti. Yllätykseksemme huomasimme, että molemmat HUR ja AUF1 p42 /p45 sidottu joihinkin mutta ei kaikkia selostukset (Fig. 3e), sekä sitova malleja molemmat proteiinit olivat vain osittain päällekkäisiä: sekä Hur ja AUF1 vuorovaikutuksessa 3’terminaalin alueilla EfnA2, EfnB2, EphA2, EphA4, ja EphA6 3’UTRs, mutta vain AUF1 sidottu 3 ’pään alueisiin EfnA1, EphA3, ja EphB1 3’UTRs (Fig. 3e). Ei sitoutumiseen joko AUF1 tai Hur nähtiin 3’terminaalisen alueen EphA1, joka ei sisällä motiivi.

Lähemmin koostumus eri 3’UTR päätekappaleet paljasti, että AUF1 oli sidottu kaikki ARE sisältävien transkriptien paitsi EphA7, mutta myös neljä selostukset, jotka eivät sisällä ARE (EfnA1, EfnB2, EphA6, EphB1). Sitovien Hurin läsnäolo konsensus Hur sitoutumiskohtaan oli välttämätön mutta ei riittävä: emme voineet havaita sitovia Hurin jollekin selostukset puuttuu tämän sivuston; kuitenkin, kahdeksan sisältävien transkriptien sivustosta, Hur sidottu EfnA2, EfnB2, EphA2, EphA4, ja EphA6 mutta ei EfnA1, EfnB3, ja EphB1.

Koska Hur sitoutuu yksijuosteista RNA: ta, se oli ehdotti, että Hur sitoutumiskohta saattaisi olla olettaa tietty konformaatio läpikäymään suuren affiniteetin Hur sitova [24]. Siksi käytimme Mfold ohjelma ennustaa sekundaarirakenteita 3’UTR koettimia, jotka olimme käytetään RNA-proteiini-avattavan määrityksessä. Kanssa tulosten Meisner et al. (2004), huomasimme, että Hur oli vuorovaikutuksessa vain sellaisten transkriptien joissa Hur sitoutumiskohtia ennustettiin sijaita yksijuosteiset silmukat (Fig. 4a). HUR sitoutumiskohdat jäljellä selostukset olivat kaikki (ainakin osittain) sijaitsee kaksijuosteisen alueilla (Fig. 4b) ja siten mahdollisesti saavuttamattomissa Hur.

Näkyy ovat toissijaisia ​​rakenteita käytetyt anturit UV -crosslinking ja RNA-proteiini-avattavasta kokeet, jotka vastaavat 3′-terminaalisten osien Ef /efriini 3’UTRs kuin ennustettu Mfold. (A) antureilla Hur sitoutumiskohdat sijaitsevat yksijuosteista alueilla (tähdellä), joka osoitti korkean affiniteetin sitoutuminen Hurin. (B) Probes missä Hur sitoutumiskohtia ennustettiin olevan päässeen kaksijuosteiseen alueilla.

Toissijainen rakenne suhteellisen lyhyessä osittainen transkriptio voivat poiketa merkittävästi rakenteen koko 3’UTR ja siksi ehkä ei heijasta konformaatio

in vivo

. Jotta saadaan käsitys sisältää välineiden Hur sitoutumiskohtien kanna vuonna Ef /efriini 3’UTRs käytimme Mfold algoritmi ennustaa sekundäärirakenteiden koko 3’UTRs. Mielenkiintoista, lukuun ottamatta EfnB3 ja EphA1, kaikki hiiren Ef /efriini 3’UTRs sisältävät ainakin yhden Hur sitoutumiskohdan ennustettu olevan osa yksijuosteisen alueen tai ulkopuolelta kuvattujen motiivin klusterit, mikä viittaa erityisen tärkeä rooli Hur sääntely Ef /efriini lauseke (Fig. S1).

Hur säätelee ilmentymistä Ef /Efrii- syöpäsolulinjoissa

Epänormaali ilmaus Ef /Efrii- on raportoitu erilaisia ​​syöpiä, ja liittyy huonoon ennusteeseen ja myöhemmissä vaiheissa maligniteetti [11], [25]. Vaikka merkittäviä toimia on otettu selvittämisessä transkription säätelyyn Ef /Efrii- syöpäsolulinjoissa ja syöpäkudokset, posttranskriptionaalisella asetus on laiminlyöty. Seitsemänkymmentä kaksi prosenttia Hur sitoutumiskohtien hiiren Ef /efriini 3’UTRs ovat konservoituneet ihmisen (katso edellä). Sen testaamiseksi, havaintomme hiiren soluissa sovelletaan myös ihmisen soluja me immunosaostettiin Hur päässä kohdunkaulan masolulinjassa HeLa ja astrosytooma /glioblastoomasolulinjan U373MG (Fig. 5a) käyttäen anti-Hur-vasta, ja suoritettiin RT-PCR: immunosaostaa spesifisten alukkeiden kanssa EfnA2, EphA2, ja EphA4, jotka ovat kolme mRNA: iden tiedetään olevan erittäin ilmaistaan ​​eri syöpätyypeissä [11]. Negatiivisena kontrollina meidän suorittaa samat toimenpiteet epäspesifinen immunoglobuliini sijasta anti-Hur-vasta-ainetta (Fig. 5a ja b), ja negatiivisena kontrollina RT-PCR teimme cDNA-synteesin vaiheessa ilman käänteistranskriptaasia (tuloksia ei ole esitetty). Verrattuna negatiiviseen IgG kontrolli oli selvä rikastamisen EfnA2, EphA2, ja EphA4 viestejä Immunosaostumien molempien solulinjojen (Fig. 5b), joka osoittaa, että Hur oli sidottu Ef /efriini-mRNA:

in vivo

. Huomattavaa on, että muille kuin kohde-GAPDH viesti voi myös monistaa, vaikkakin vähemmän tehokkaasti ja samassa määrin sekä IP ryhmissä; Tämä havainto on kuvattu aikaisemmin [23], ja todentaa käyttämällä yhtä paljon syöttömateriaalin.

(A) immunosaostus endogeenisen Hur. HeLa tai U373 solulysaatit immunosaostettiin anti-Hur-vasta tai epäspesifistä IgGs. Immunosaosteita ladattiin 10% SDS-sivut ja analysoitiin western blot anti-Hur vasta-aine; HC, raskaan ketjun; LC, kevyt ketju (B) RT-PCR: llä sen jälkeen, kun RNA-uuttamalla Hur ja IgG immunosaostumat spesifisten alukkeiden kanssa EfnA2, EphA2, EphA4 ja GAPDH.

Vielä koesarjassa testasimme, onko Hur posttranscriptionally säätelee Ef /efriini ilme. Me pudotti HUR HeLa ja U373MG solujen kahdella eri Hur erityisiä siRNA oligonukleotideja (Fig. 6a ja tietoja ei näytetty) ja havaittiin EfnA2, EphA2, ja EphA4 mRNA: iden Real-Time RT-PCR 72 h transfektion jälkeen. Hur on raportoitu mRNA vakauttava proteiinia, mikä viittaa siihen, että sen knock-down johtaisi vähenemiseen Ef /efriini mRNA ilmaisun. Kuitenkin, kun taas määrä EphA2 mRNA teki laskua jälkeen knock-down Hurin meidän yllätys EfnA2 ja EphA4 mRNA nousivat merkittävästi (Fig. 6a). Voit testata, onko havaitut muutokset RNA-tasolla kuvastavat tilannetta proteiinitasolla me ladattu yhtä suuret määrät proteiinia teissa HeLa ja U373-solut jälkeen Hur knock-down ja suoritettiin Western blot-analyysi vasta-aineilla havaita EphA2 ja EphA4 (Fig. 6b) . Vuonna vahvistus Real-Time PCR kokeissa havaittiin, että ilmentyminen EphA2 proteiinin rajusti 10-kertaisesti HeLa ja 5-kertaisesti U373-soluissa jälkeen knock-down Hurin taas ilmaus EphA4 kasvoi 1,2-kertaiseksi ja 2-kertaiseksi (Fig. 6b). Ohjaus siRNA oligonukleotidit ei ollut merkittävää vaikutusta EphA2 tai EphA4 proteiinin ilmentymisen verrattuna on valetransfektoidun valvontaa. Huomattavaa on, että kaupallisesti saatavissa EphA4-vasta Tässä kokeessa käytetty tunnistaa kolme eri taajuusalueilla HeLa-soluissa (kuvio. 6b), jotka kaikki on voimistunut jälkeen Hur knock-down. Kaksi näistä kaistat voivat vastata kahta eri EphA4 isoformien kokoero 37 aminohappoa, jotka on lueteltu Genome selaimessa. Kolmas kaista voi edustaa HeLa-erityinen isoformia, joka ei ole vielä havaittu missään tavanomaisen tietokannoista.

Hur pudotettiin tietyn Hur RNAi oligonukleotidin HeLa ja U373-solut (A) mRNA ilmaus EfnA2, EphA2 ja EphA4 72 tuntia transfektion jälkeen tietyn Hur RNAi oligo verrattiin transfektio ei-äänenvaimennusjärjestelmiä ohjaus oligo mitattuna Real Time RT-PCR: llä. Suhdelukua ekspressiotasot jälkeen HUR knockdown ja Transfektiomenetelmätapa ei-hiljentäminen ohjaus oligonucleotodides näkyvät. Arvot normalisoitiin GAPDH. (B) western blot analyysit proteiinin ilmentymistä EphA2, EphA4 (kolme isoformia, katso nuolet), Hur ja GAPDH 72 tunnin kuluttua taintumisen Hurin (ylempi paneeli, kaista 3) spesifisten vasta-aineiden verrattuna pilkata-ohjaus (kaista 1) sekä ei-hiljentäminen siRNA ohjaus (kaista 2). Kvantifiointi bändejä (Against GAPDH) suoritettiin käyttäen Image Quant ohjelmiston 5.2 (alempi kuva). Kertainen nousu tai lasku ilmaisun kuvataan.

Erottaa epäsuoria transkription vaikutuksia ja ohjaamaan mRNA stabilointi aiheuttama knock-down Hurin me tukossa transkriptio aktinomysiini D 48 h transfektion jälkeen Hurin siRNA oligot tai valvontaa oligoja, ja mitataan mRNA puoliintumisajat EfnA2, EphA2, ja EphA4 Real-Time RT-PCR. Yllättäen huomasimme, että knock-down of Hurin lisäsi puoliintumisajat kaikista Ef /efriini mRNA: t testattiin. Tämä viittaa siihen, että Hur horjuttaa nämä mRNA: t (Fig. 7a), ja että lasku EphA2 viesti havaitaan sen jälkeen knock-alas Hur voi johtua toissijainen inhibition EphA2 transkription.

(A) 48 tuntia transfektion jälkeen tietyn Hur RNAi oligonukleotidi tai kontrollioligonukleotidin puoliintumisajat ja EfnA2, EphA2 ja EphA4 mRNA: t arvioitiin käyttäen 5 ug /ml aktinomysiini D; mRNA puoliintumisaika mitattiin Real Time RT-PCR, mRNA ilmaisu normalisoitiin GAPDH. (B) 3′-terminaalisten osien EfnA2, EphA2 ja EphA4 3’UTRs kloonattiin pGL3-promoottorin vektoriin ja transfektoitiin HeLa-soluja. 30 tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin ja tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus mitattiin. Normalisoinnin Renilla lusiferaasiplasmidin (PRL) kotransfektoitiin. (C) 24 tuntia transfektion jälkeen tietyn Hur RNAi oligonukleotidi HeLa-solut transfektoitiin pGL3 promoottorikonstrukteja, kuten on kuvattu (B), ja 48 tuntia myöhemmin tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus mitattiin, ja normalisoitiin ko-transfektoitiin PRL plasmidi.

varmistamiseksi edelleen, että havaitut vaikutukset välittyvät

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT sekvenssit kanna että 3′-terminaalisten osien EfnA2, EphA2, ja EphA4 3’UTRs, pGL3P toimittaja plasmideja nämä sekvenssit (mukaan lukien Hur sitoutumiskohdat) alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi-cDNA transfektoitiin HeLa-soluja. Normalisoinnin, PRL vektori, joka sisältää

Renilla

lusiferaasi-cDNA: ta kotransfektoitiin. pGL3P konstruktioita sisältävä EfnA2, EphA2 tai EphA4 3′-terminaalisten sekvenssien tuotti merkittävästi vähemmän tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuutta kuin pGL3P vektori ilman 3’UTR insertit, vahvistaa epävakautta toiminnon 3′-terminaalisten osien näiden 3’UTRs (Fig. 7b). Sen jälkeen knock-down Hurin tietyn RNAi oligo tätä epävakautta voi osittain pelastettu, mikä edelleen viittaa epävakautta toiminnon Hur proteiinin (kuvio. 7c). Knock-down Hurin kanssa RNAi oligo kohdistaminen eri alueella Hur mRNA osoitti vertailukelpoisia tuloksia (tuloksia ei ole esitetty). Off-tavoite vaikutuksia jätettiin transfektoimalla pGL3P vektori ilman Hur sitoutumiskohdista.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa käytimme bioinformatiikan /molekyylibiologian lähestymistapa seuloa 3’UTRs transkriptien Ef reseptoreihin ja efriini ligandien luulotellun

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT jaksoryhmittymät ja luonnehtia niiden biologinen toiminto.

Osoitamme, että useat Ef /efriini 3’UTRs, vaikka esillä merkittäviä eroavaisuuksia paralogeihin vuonna jotka liittyvät pituuteen ja sekvenssin sisältävät evoluutiossa konservoituneen motiivin klustereita koostuu päällekkäisten CPEs, ARE, ja Hur sitoutumiskohtia. Havaitsimme HUR ja useat muut proteiinit osallistuvat mRNA ajonvakautusjärjestelmä vuorovaikutuksena kumppaneita näiden klustereita. Vaihtaminen hiiriltä ihmisen syöpäsolu rivit, olemme myös saanut todisteita siitä, että ilmentyminen Ef /Efrii- on posttranscriptionally säännellään vuorovaikutus konservoituneen sekvenssin klustereita ja Hur, mikä viittaa yhteyden misregulation on Ef /efriini ilmentymistä syöpää ja yli-ilmentyminen Hur.

Euroopan 3’untranslated alueet selostukset hiiren Ef reseptorien ja efriini ligandien

tunnusmerkki jäsenten Ef /efriini perheitä on niiden laajentaminen numerot aikana kehitys, joka johtuu useiden päällekkäisten tapahtumat [19]. Vastaavat koodaavat alueet ja eksoni /introni-rajat ovat erittäin konservoituneita ortologeja ja paralogues, joka heijastuu tarpeeton toimintoja, Ef /Efrii- voi täyttää ja kyky Ef reseptorien vuorovaikutuksessa useiden Efrii-. Lisäksi 3’UTRs Eph /efriini ortologeja ovat erittäin konservoituneita ihmisen ja hiiren välillä (jopa 80%), mikä osoittaa voimakasta valinnan paine ja ehkä säilyttäminen erillisten ekspression profiileja. Sen sijaan 3’UTRs on Ef /efriini paralogues osoittaa korkean rakenteellisen eroavuus, joka voi olla käytössä Ephs /Efrii- hankkia erilaisia ​​ekspressioprofiileja (matkapuhelin- tai subsellulaarisista), kuten on ehdotettu muille säilyneitä paralogues [26].