Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka gemsitabiinin on erittäin aktiivinen useissa syöpätyypeissä, luontainen ja hankittu lääkeresistenssi edelleen suuri haaste . Yli-ilmentymisen Bcl-2 on liittynyt gemsitabiinin vastarintaa. Tutkimuksen tavoitteena on selvittää, onko Gossypolin voi voittaa gemsitabiini vastus solulinjoissa korkean tason Bcl-2: n ilmentymisen yhdessä lääkehoidon. Tutkimuksemme osoittaa, että 10 johdetut solulinjat eri syövistä, korkea Bcl-2 perustason ilmentymistä havaittiin solulinjoja, jotka olivat resistenttejä gemsitabiinia (GEM-R). Lisäksi synergistinen vaikutus yhdistelmähoidon havaittiin gemsitabiini-resistenttejä (GEM-R) solulinjat, joilla on korkea Bcl-2: n ilmentymisen, mutta ei gemsitabiinin herkkä (GEM-S) solulinjat riippumatta Bcl-2: n ilmentymisen. Gossypolikonsentraatio hoito johti vähenemiseen anti-apoptoottisia geenejä, kuten Bcl-2 ja Bcl-XL ja ylössäätely pro-apoptoottisen geenin, Noxa. Lisäksi lisätään gossypolia gemsitabiiniannokseen vähensi ilmauksia Antiapoptoottisten geenejä verrattuna gemsitabiinin yksin. Geeniekspressioprofilointi in GEM-R ja GEM-S solulinjoissa viittaavat siihen, että anti-apoptoottiset geenit kuten Pakt ja PI3KR2 voi olla tärkeä rooli gemsitabiinin vastarintaa, kun taas pro-apoptoottinen Bcl-2 liittyvät geenit (Bad, kaspaasi-6 ja Calpain- 1) voi säädellä synergististä vuorovaikutusta yhdistelmähoitoa.

Citation: Wong FY, Liem N, Xie C, Yan FL, Wong WC, Wang L, et al. (2012) yhdistelmähoito Gossypolin paljastaa Synergism vastaan ​​Gemsitabiini Resistance syöpäsoluissa High BCL-2 Expression. PLoS ONE 7 (12): e50786. doi: 10,1371 /journal.pone.0050786

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 24 lokakuu 2012; Julkaistu: 04 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Wong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat avustus NMRC /TCR /001-NUH /2007 National Medical Research Council, Singapore. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

gemsitabiini (2 ’, 2’-difluorodeoxycytidine, dFdC) on pyrimidiini nukleosidianalogi deoksisytidiinin, joita käytetään yleisesti rintasyövän [1], ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, [2], haiman [3] ja munasarjasyöpä [ ,,,0],4]. Gemsitabiini saapuu soluun kautta erityinen nukleosidikuljettajan ja läpikäy solunsisäinen phospharylation muuntaa aktiivista lääkettä metaboliitteja. Kun solun sisällä, gemsitabiini fosforyloituu deoksisytidiinikinaasin kinaaseja, jotka sitten sisällyttää DNA inhiboimaan synteesiä ja solujen proliferaatiota, samalla kun edistetään apoptoosin syöpäsoluissa [5]. Yliekspressio anti-apoptoottiset geenit, kuten Bcl-2-perheen on kriittinen rooli resistenssin tavanomaisia ​​syöpähoitoihin [6], [7], [8]. Esimerkiksi

Yu et al

osoitti käänteinen korrelaatio Bcl-2: n ilmentymisen ja kemosensitiivisyys useita lääkkeitä kuten adriamysiini ja 5-fluorourasiili rintasyöpäsoluissa. [9].

In vitro

viljellyt solulinjat johdetut HCC kasvainten ilmentävät korkeita tasoja anti-apoptoottista Bcl-2 ja Bcl-xl havaittiin myös olevan resistenttejä paklitakselia [10]. Ylössäätöä Bcl-2-perheen on liitetty luontainen gemsitabiini resistenssin haiman ja keuhkosyövässä [11], [12]. Haimasyöpäsoluissa joka hankki lääkeresistenssin gemsitabiinin jälkeen jatkuvasti alttiina gemsitabiinin oli säätely ylöspäin antiapoptoottinen geenejä, kuten Bcl-xl ja Mcl-1 [13]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että kohonnut Bcl-2-perheen voi olla tärkeä rooli kehitettäessä gemsitabiinin resistenssin kemoterapian aikana.

Gossypolin on polyfenoliyhdistepitoisuus eristettiin puuvillakasvin (

Gossypium Malvaceae

). Aluksi käytetään urosten hedelmällisyyteen-säätöainetta, viime aikoina on havaittu, että anti-tumorigeeniset ominaisuuksia erilaisia ​​syöpiä [14]. Gossypolikonsentraatio esiintyy kahdessa enantiomeerisessä muodossa, (+) ja (-), ja luonnossa esiintyvät gossypolia esiintyy raseemisena seoksena (+) ja (-) enantiomeerit. (-) Ja enantiomeeri gossypolia on todettu olevan enemmän voimakas sytotoksinen vaikutus kuin (+) enantiomeerillä tai raseeminen gossypolin. Gossypolikonsentraatio on BH3 jäljittelevää, joka estää funktion anti-apoptoottisten Bcl-2-proteiinien vuorovaikutusten kautta BH3: een sitoutumisen taskut Bcl-2 ja Bcl-XL-proteiinit [15]. Useissa in vitro tutkimuksissa on raportoitu, että Gossypolin voi estää solujen kasvua monenlaisia ​​syöpiä, kuten paksusuolen [16], eturauhas- [17], keuhko [18] ja rintojen kasvaimia [19]. PC-3 eturauhasen syöpäsolujen, gossypol indusoitua apoptoosia estämällä heterodimerisoitumisella Bcl-2 /Bcl-xl kompleksin [17]. Apoptoosin induktio kautta gossypolia havaittiin myös, että säätely alaspäin Antiapoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinien HT-29 paksusuolen syöpä ja krooninen lymfaattinen leukemia [16], [20]. Lisäksi, gossypol on kyky voittaa lääkeresistenssin muiden tavanomaisten kemoterapeuttisten lääkkeiden. Gossypoli on osoitettu tehokkaasti indusoida solukuoleman solunsalpaajaresistentti leukemian solulinjoja, jotka yliekspressoivat Bcl-2 ja Bcl-xl [21]. Se oli raportoitu, että Gossypolin voisi indusoi apoptoosia korkea hyötysuhde sisplatiinin kestävä pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja, jotka ilmentävät korkeita Bcl-xl. [22]. Cengiz E et ai. Havaittu että yhdistetty hoito gossypolia ja doketakselin voisi synergistisesti aiheuttaman apoptoosin in PC-3 eturauhassyöpäsolulinja [23]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen yhdistelmä gossypol muiden lääkkeiden kanssa, voivat tehostaa apoptoosin indusoimiseksi syövän hoidossa.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli (1) korreloi Bcl-2-proteiinin ilmentymisen gemsitabiinin vastus (GEM- R) mahalaukun, nenänielun ja rintasyövän solulinjoissa, (2) arvioi yhdistelmä gemsitabiinin ja gossypolia GEM-R syöpäsolun linjat korkea Bcl-2: n ilmentymisen ja (3) määritetään mekanismeja peruutettaessa gemsitabiinin vastarintaa Gossypoli.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja reagenssit

Nenänielun syöpä solulinjoja CNE1, CNE2, HONE1 olivat kaikki peräisin erilaistumaton Kiinan NPC kasvaimia, kun taas HK1 oli peräisin hyvin erilaistunut Kiinan NPC [24], [25]; rintasyövän solulinjat SKBR3, T47D, MCF-7 ja mahalaukun syövän solulinjat AGS, SNU1 hankittiin ATCC, USA; kun YCC16 saatiin Duke NUS, Singapore, Kaikkia solulinjoja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 ja pidettiin RPMI 1640-alustassa (Gibco, Grand Island, NY), joka sisälsi 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Gibco, Grand Island, NY) ja 1% penisilliiniä /streptomysiiniä (Gibco, Grand Island, NY). Mycoplasma tila solujen rutiininomaisesti testattiin käyttämällä MycoAlert ™ Mycoplasma Detection Kit (Lonza, ME, USA). Mycoplasma tilan kaikki solulinjoista suorittaa tässä tutkimuksessa olivat negatiivisia. Gossypolikonsentraatio (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ja gemsitabiinia (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) liuotettiin DMSO: hon pitoisuutena 10 mM ja niitä säilytettiin -20 ° C: ssa. AT-101 toimitti Ascenta Therapeutics ja valmistellaan 10 mM varastosta DMSO. Primaaristen vasta-aineiden, joka koostuu anti-kaspaasi-6, anti-Bcl-xl, anti-Bad, anti-Bak, anti-Bax, anti-Pakt, anti-PIK3R2, anti-kalpaiini-1 ja anti-Actin ostettiin Cell Signaling Technology (Cell Signaling, MA, USA). Ensisijainen anti-Noxa hankittiin Calbiochem (Merck, Saksa); ja anti-Bcl-2 ja anti-Mcl-1 hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Toissijainen vasta-aineita (anti-kani-IgG, HRP-Linked ja anti-hiiri-IgG, HRP-Linked) ostettiin Cell Signaling Technology (Cell Signaling, MA, USA).

elinkykyyn ja lisääntymismääritykset

arvioimiseksi kemosensitiivisyys syöpäsoluja, solujen elinkyky mitattiin MTS (kolorimetrinen CellTiter 96 AQ

ueous One Solution Cell Proliferation Assay) (Promega, WI, USA). Solususpensiota viljeltiin 96-kuoppaisille, tasapohjaisille mikrotiitterilevyille konsentraatiolla 2 x 10

3 solua /kuoppaa kohti ja inkuboitiin yön yli. Lääkehoitojen suoritettiin seuraavasti: Gossypolin (0,1 uM -100 uM), gemsitabiini (0,001 uM-100gM) tai molempia lääkkeitä vaihtelee pitoisuuksina. Jokainen lääke testattiin kolmena kappaleena. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2: ssa 72 tuntia. Mikrotiitterilevyn kuoppiin, jotka sisältävät kasvainsolut, joilla ei ole lääkehoitojen käytettiin verrokkeina, ja kuoppiin, jotka sisältävät ainoastaan ​​täydellistä alustaa käytettiin tyhjä valvontaa epäspesifisen väriaineen vähentämiseen. Soluja inkuboitiin 72 tuntia ennen kuin lisättiin MTS-liuosta (1 mg /ml per kuoppa), ja absorbanssi luettiin 490 nm: ssä käyttäen spektrofotometristä mikrolevylukijaa (Bio-Rad, CA, USA). Prosentuaalinen solujen elävyyden eri lääkeainepitoisuudet laskettiin estoaste (absorbanssien keskiarvoa käsiteltyjen kuoppien /absorbanssien keskiarvoa Verrokkikuoppien) x 100%. IC

50 on laskettu GraphPad Prism v4.0 (GraphPad Software, Inc., CA, USA).

Combination Index Analyysi

vuorovaikutus gemsitabiini ja Gossypolin analysoitiin CalcuSyn- ohjelmisto (Biosoft, Cambridge, UK) kuten aiemmin raportoitu [26]. Lyhyesti, jatkuva pitoisuussuhde gemsitabiinin ja Gossypolin at 0,25-kertaiseksi, 0.5x, 1x, 2x, ja 4x käytettiin arvioimaan synergiaa yhdistelmähoitoon. Cl-arvot laskettiin tasojen kasvun esto (jae vaikuttaa) kunkin aineen erikseen ja yhdistelmänä gemsitabiinin kanssa gossypolin. Yhdistelmä indeksi laskettiin havainnollistaa synergian (CI 0,9), antagonismi (CI 1,1) ja additiivisesti (CI = 0,9-1,1).

Tilastot MTS-määritys Analysis

Annos askelin olivat log-transformoituja, jonka avulla yhtäläiset vaakasuoran välin datapisteille annosvastekäyrästä. Splinikäyrä on piirretty fit ura /LOWESS analyysi GraphPad Prism v4.0 ja pitoisuus johti 50% solukuolema määritettiin käyrän syntyy. IC

50 laskettiin antilogaritmisen saatu arvo. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe (SE) ainakin kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

Western Blot ja Protein Analysis

Solut käsiteltiin huumeiden pestiin jääkylmällä PBS: llä ja resuspendoitiin hajotukseen puskuria (CelLytic; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) läsnä ollessa proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche, Mannheim, Saksa). Lysaatit sonikoitiin, inkuboitiin jäillä 20 min ja sentrifugoitiin 14000 rpm 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä Bradford-määritystä (Bio-Rad, CA, USA). 20 ug proteiinia näytteet elektroforeettisesti erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja sähkön avulla PVDF-kalvolle (Immun-Blot PVDF; Bio-Rad, CA, USA). Membraanit blokattiin tunnin ajan huoneen lämpötilassa 5% rasvatonta kuivamaitoa (Bio-Rad, CA, USA) ja sen jälkeen inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Vastaavat ensisijainen vasta-aineita käytettiin seuraavasti: anti-Bcl-xl (Cell Signaling, MA, USA) on 1:1000 laimennus, anti-Bad (Cell Signaling, MA, USA) 1, 1000 laimennus, anti-Bak (Cell merkinannosta MA, USA) 1:1000 laimennus, anti-Bax (Cell signaling, MA, USA) 1:3000 laimennus, anti-kaspaasi-6 (Cell signaling, MA, USA) 1:1000 laimennus, anti-P1K3R2 (Cell merkinannosta MA, USA) 1:1000 laimennus, anti-Pakt (Cell signaling, MA, USA) on 1:1000 laimennus, anti-calpain-1 (Cell signaling, MA, USA) on 1:1000 laimennus, anti-Actin (kuormituksen valvonta; Cell Signaling, MA, USA) on 1:3000 laimennus, anti-Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 1:3000 laimennus, ja anti-Mcl-1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA ) at 1:3000 laimennus, ja anti-Noxa (Calbiochem, Merck, Saksa) 1:1000 laimennus. Kolmen pesun Tween 20 PBS: ssä, kalvoja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa vastaavien piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua anti-kani-anti-hiiri-vasta-aineita. Kalvot pestiin neljä kertaa PBS /Tween 20, ja signaalit visualisoitiin ECL-reagenssilla (AmershamTM ECL Plus Western Blotting Detection System, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), jota seurasi altistus kemiluminesenssin kalvo (Amersham HyperfilmTM ECL; GE Healthcare ; Buckinghamshire, UK). Immunoblot-analyysit toistettiin vähintään kahdesti kullekin proteiinille testataan.

Gene Expression Array

Koko genomin ilmentymisen profilointi 2 syöpäsolulinjoista (CNE2 ja SNU1) suoritettiin käyttäen HumanHT-12 v4 koko genomin geenin ilmentymisen suora liuoshybridisaatiomääritysmenetelmä (Illumina, San Diego, USA). Kokonais-RNA: lla käsiteltyjen solujen lääkeaineen uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, USA) kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA-näytteet kvantitoitiin käyttäen ND-1000 spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, USA) ja arvioitu hajoaminen käyttäen Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, USA) ennen geenin ilmentymisen erilaisia ​​analyysi. Kokonais-RNA (500 ng) muutettiin cDNA: ksi, jonka jälkeen

in vitro

transkription synteesi biotiini-leimattu cRNA käyttäen IIumina® TotalPrep RNA Amplification Kit (Illumina, San Diego, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Leimattua cRNA suspendoitiin hybridisaation reagenssien ja hybridisoitiin HumanHT-12 v4 BeadChips 18 tuntia 58 ° C: ssa hybridisaatiouunissa. BeadChips pestiin, tukossa ja värjättiin valmistautua skannausta. Fluoresenssin intensiteetti kukin koetin skannattiin käyttäen Illumina BeadArray Reader. Kolmen erillisen kokeen tehtiin jokaisesta näytteestä.

Tilastollinen valinta Jälkikäsittely ilmentyvät eri Genes

Differentially ilmentävät geenejä välillä lääke hoitoryhmissä (gemsitabiini ja yhdistelmä gemsitabiinin ja gossypolin) kahdessa solulinjoja (CNE2 ja SNU1 vastaavasti) olivat perusteella: menetelmistä keskustellaan Wong et.al [27]. Kunkin geenin, yksisuuntainen ANOVA levitetään ensin testata mahdollisia eroja avulla kahden hoitoryhmän on merkitsevyystasolla 0,05. Jos nollahypoteesi hylätään, Dunnettin posthoc koe suoritettiin määritettiin erot minkä tahansa kahden vertailuja perhe-viisas virheprosentti 0,05. Vertailut ovat (i) kontrolli (ei käsittelyä) versus gemsitabiinihoidon ja (ii) kontrolli versus yhdistelmähoitoon. Geeni on merkitty ilmentyy differentiaalisesti (ylös- tai alaspäin-säännelty), jos vähintään 1 verrattuna havaitaan posthoc menettelyä. Luettelot ero geenien kustakin solulinjasta päällekkäin ja kartoitetaan Kegg reittejä kuten on aiemmin kuvattu DAVID tietokantaan [28]. EASE arvo 0,1 asetettiin määrittämään merkitystä geenin aikavälin rikastumisen DAVID annotaatio järjestelmässä. Geeni luettelo 14065 ja 11342 differentiaalisesti ilmentyvien geenien molemmista solulinjoista valittiin lisäarviointia.

Tulokset

herkkyys Cancer Cell Lines Gemsitabiinin Suhde Bcl-2 Expression

neljä nenänielun syövän solulinjat (NPC) käsiteltiin eri pitoisuuksilla gemsitabiinia (0,001-100 uM) arvioidaan kemosensitiivisyys gemsitabiinin. Oli monenlaisia ​​IC

50 gemsitabiinin herkkyys jolloin CNE2 todettiin olevan resistenttejä gemsitabiinin, IC

50 yli 100 uM (kuvio 1A) ja HK1 havaittiin olevan herkin gemsitabiinia. Sen tutkimiseksi, gemsitabiini vastustuskyky liittyy korkea ilmentymisen Bcl-2, tutkimme perustason ilmentymistä Bcl-2: n kaikki NPC solulinjoissa. Havaittiin, että solulinja, joka oli korkea Bcl-2: n ilmentymisen (CNE2, kuvio 1 B) oli resistentti gemsitabiinia. Yhdistyksen välillä gemsitabiini vastus ja Bcl-2: n ilmentymisen tutkittiin edelleen 3 rintasyövän solulinjoissa ja 3 mahasyövän solu Tasaisen, MCF-7 rintasyöpä solulinjassa ja YCC16 mahasyövän solulinja, joka oli korkea Bcl-2: n ilmentymisen olivat resistenttejä gemsitabiinin (kuvio 2 ja 3). Lukuun ottamatta SNU1, alhainen tai ei lainkaan ekspressiota Bcl-2 havaittiin solulinjoja, jotka olivat herkkiä gemsitabiinia.

(A) IC

50 gemsitabiinin ja nenänielun syövän solulinjat. Mean IC

50 ± keskivirhe (SE) on vähintään kaksi erillistä koetta suoritettiin kolminkertaisina. Soluja käsiteltiin gemsitabiinin 72 tuntia ja proliferaatiota arvioitiin käyttäen MTS-määritystä. (B) immunoblot-Bcl-2 perustason ilmentymistä nenänielun syöpäsolulinjoissa.

(A) IC

50 gemsitabiinin rintasyövän solulinjoissa. Mean IC

50 ± keskivirhe (SE) on vähintään kaksi erillistä koetta suoritettiin kolminkertaisina. Soluja käsiteltiin gemsitabiinin 72 tuntia ja proliferaatiota arvioitiin käyttäen MTS-määritystä. (B) immunoblot-Bcl-2 perustason ilmentyminen rintasyöpäsolulinjoissa.

(A) IC

50 gemsitabiinin syöpään solulinjoja. Mean IC

50 ± keskivirhe (SE) on vähintään kaksi erillistä koetta suoritettiin kolminkertaisina. Soluja käsiteltiin gemsitabiinin 72 tuntia ja proliferaatiota arvioitiin käyttäen MTS-määritystä. (B) immunoblot-Bcl-2 perustason ilmentymistä mahasyövässä solulinjoissa.

Samanlaisia ​​Drug Response to Cancer Cell Lines välillä gossypol ja AT101

kolme mahasyövän solulinjoissa (AGS, YCC16 ja SNU1) käsiteltiin gossypol ja AT101 määrittää niiden IC

50, vastaavasti. Kuten odotettua, (-) – Gossypolin oli voimakkaampi kuin raseeminen Gossypolin mutta oli yleensä alle 10fold erot IC

50 molempien lääkkeiden mahalaukun solulinjoissa. Kaikki seuraavat in vitro tutkimukset suoritettiin käyttäen raseemista gossypol (taulukko 1) oli vähän eroa solusytotoksisuus joko huumeiden. Gossypolikonsentraatio havaittiin kohtalaista aktiivisuutta kaikissa kymmenessä solulinjoissa (kuvio 4). Toisin kuin gemsitabiini ei ollut selvää yhteyttä tason välinen Bcl-2 ilmentyminen solulinjoissa IC

50 lääkkeen.

Nenänielun (n = 4), rinta (n = 3) ja mahalaukun (n = 3) syöpäsolulinjoissa testattiin niiden herkkyys gossypol. Mean IC

50 ± keskivirhe (SE) on vähintään kaksi erillistä koetta suoritettiin kolminkertaisina. Soluja käsiteltiin Gossypolin 72 tuntia ja proliferaatiota arvioitiin käyttäen MTS-määritystä.

Tehostemateriaalit Lääkeaineinteraktiot välillä gossypol ja Gemsitabiinin Gemsitabiini-vastus (GEM-R) Cell Line High Bcl-2 Expression

Voit selvittää mahdolliset synergia vuorovaikutusta gossypolin ja gemsitabiinin, yhdistelmä lääkehoidon tehtiin kaikissa 10 syöpäsolun linjat. Lukuun ottamatta SNU1 synergia havaittiin solulinjoja, jotka oli korkea Bcl-2: n ilmentymisen, mutta ei solulinjoissa, jotka ekspressoivat alhainen Bcl-2 (taulukko 2, kuvio S1). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että on olemassa suuntaus, jonka mukaan gemsitabiinin resistenttejä solulinjoja, jotka ilmaisivat korkeaa Bcl-2 synergisyyteen yhdistämistä lääkehoidot gemsitabiinin ja gossypolin.

purku Gemsitabiini Resistance by gossypol oli liittyvä säätely ylöspäin Noxa ja Down-regulation of Bcl-2 ja Bcl-xL

Tutkiakseen taustalla molekyylitason mekanismeja synergistisen vuorovaikutuksen gossypolin ja gemsitabiinin, tutkimme muutokset proapoptootti- ja anti- apoptoottisten proteiinien korkean Bcl-2: n ilmentymisen GEM-R solulinjoissa (YCC16, CNE2 ja MCF7). Kuten kuviossa 5 on esitetty, anti-apoptoottiset proteiinit (Bcl-2 ja /tai Bcl-xl) oli säädelty kaikissa Bcl-2 yliekspressoivassa GEM-R solulinjoissa gemsitabiinihoidon. Sitä vastoin hoito gossypol johti alas-säätely anti-apoptoottisten proteiinien (Bcl-2 ja /tai Bcl-xl) ja ylössäätöä proapoptootti- proteiinia, (Noxa ja Mcl-1

s) ( kuvio 5). Kokonaismäärän vähentymiseen Bcl-2: n ilmentymisen havaittiin myös kaikissa GEM-R solulinjoja käsiteltiin Gossypolin tai yhdistetyn lääkehoitoa. Kuitenkin alas-säätely Bcl-xl havaittiin myös MCF-7, kun solut käsiteltiin joko Gossypolin tai yhdistetyn lääkehoitoa. Nostamalla pilkkominen proapoptoottisten Mcl-1

S ilmentymistä kaikissa Bcl-2 yliekspressoivassa GEM-R solulinjoissa havaittiin jälkeen yhdistetyn lääkehoitoa. Kuitenkin ilmauksia Bax ja Bak pysyi ennallaan jälkeen lääkehoitoa. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että gossypolikonsentraatio käänteinen gemsitabiinin vastus liittyy alas-säätely anti-apoptoottisten proteiinien (Bcl-2 ja /tai Bcl-xl) ja ylössäätöä proapoptootti- proteiinit (Noxa ja Mcl-1

S).

immunobloteista apoptoottisen proteiinin ilmaisujen gemsitabiinin resistenttejä solulinjoja (GEM-R) potilasta hoidettiin yhdistelmällä gossypolia ja gemsitabiinin 48 tuntia. Esitetyt tulokset edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

Merkittävät muutokset Apoptotic Pathway Osaltaan Differential vastaus gemsitabiini ja Gossypolin

Koko genomin ilmentymisen profilointi tehtiin SNU1 (GEM- S) ja CNE2 (GEM-R) arvioida vaihtoehtoisia mekanismeja niiden erot huumeiden vastauksena gemsitabiini yksin ja gemsitabiinin /gossypolin yhdistelmä (kuvio 6). Kaikkiaan 2702 geenit ilmentyvät differentiaalisesti esi- ja jälkikäsittely näytteitä ja kartoitettiin 61 rikastettua biologisten prosessien avulla Kegg reitin analyysiä. Merkittävin biologisia prosesseja säätelevät näiden geenien kuuluvat silmukointiyksikkövälitteiseen, solusykliä, pyrimidiini aineenvaihduntaa, p53 signalointi ja apoptoottisten reittien (ks tukevat tiedot; taulukko S1). Gemsitabiinihoidon pääasiassa johti ylössäätöä näiden hoitovaste geenien CNE2 (GEM-R), mutta alas-asetuksen SNU1 (GEM-S) (kuvio 6), mikä viittaa siihen, että ylössäätöä näistä geeneistä liittyy p53 ja apoptoottisten reittien voivat edistää gemsitabiini vastus. Lisäksi lähes puolet näistä hoitovasteen geenit säädellä vähentävästi CNE2 (GEM-R) käsittelyn jälkeen gossypol ja gemsitabiinin kanssa vähäisiä muutoksia havaittiin SNU1 (GEM-S).

Heatmap of 2702 merkittäviä differentiaalisesti ilmaistuna geenejä gemsitabiinin kestävä, GEM-R ja gemsitabiinin herkkä, GEM-S gemsitabiiniryhmässä yksinään (Gem) tai yhdessä gossypolin (Gem + GOS) suhteessa käsittelemättömän sovitetun kontrolli solulinjoissa. Ilmaisu tasot kunkin geenin ovat korkeammat ja alhaisemmat kuin kontrolli on kuvattu punainen ja vihreä, vastaavasti.

Vähentynyt Anti- ja Pro-apoptoottisten Gene ilmaisujen GEM-R ja GEM-S Cell Lines kun Gossypoli yhdistettiin gemsitabiinihoidon

edelleen arvioimista geenejä, jotka saattavat olla vastuussa gemsitabiini herkkyyttä ja synergian yhdistettyihin gemsitabiinihoidon ja gossypolin, päätimme keskittyä vain apoptoosiin liittyvien geenien Kegg koulutusjakson, jotka olivat eri tavalla moduloitujen käsittelyn jälkeen gemsitabiinin yksin ja jälkeen yhdistetyn hoidon. Havaitsimme 65 geenejä (31 anti-apoptoosin ja 34 pro-apoptoosi) apoptoottisessa reitin, joita on huomattavasti säännelty CNE2 (GEM-R), ja 49 geenit (23 anti-apoptoosin ja 26 pro-apoptoosi), joita on huomattavasti säännellään SNU1 (GEM-S) (katso tukevat tiedot; taulukko S2).

CNE2 (GEM-R), huomasimme, että suurin osa anti-apoptoottiset geenit olivat merkitsevästi sääteli kun soluja käsiteltiin gemsitabiinin (kuvio 7A). Toisaalta, useimmat näistä anti-apoptoottisia geenejä alassäädetty kun SNU1 (GEM-S), käsiteltiin gemsitabiinin yksinään (kuvio 7B). Havaittiin myös, että geeniekspressioiden enemmistön nämä anti-apoptoottiset geenit merkittävästi vähentynyt, kun Gossypolin lisättiin gemsitabiinin CNE2 (GEM-R) (kuvio 7A). Samoin anti-apoptoottisia geenejä, jotka vaimentua vuonna SNU1 (GEM-S) jälkeen gemsitabiinihoidon, havaittiin myös olevan enää joutuisi vaimentua, kun soluja käsiteltiin yhdistelmähoidolla (kuvio 7B). Joukossa oli kuitenkin myös enemmän anti-apoptoptic geenejä, aluksi ylös-säädellään gemsitabiini mutta oli vaimentua vuonna CNE2 (GEM-R) (11 geenit) jälkeen yhdistelmä gossypolia ja gemsitabiinin verrattuna SNU1 (4 geenejä) (kuvio 7A ja B ).

suhteellinen log

2 kertainen muutos antiapoptooppinen geenin klusterin (A-B) ja pro-apoptoottinen geenin klusterin (C-D), gemsitabiiniryhmässä yksinään (Gem) ja yhdistettynä kanssa gossypoli (Gem + GOS). Vain geenejä, joita on huomattavasti ilmennetty eri kontrollista käsittelemättömän ryhmän edustettuna kuvaajan. Kaikki arvot y-akselilla verrattiin käsittelemättömiin kontrolleihin vastaavien solulinjoissa. Arvot nollan yläpuolella osoitti geenejä, jotka säädellään ylöspäin sen ilme. Arvot alle nollan osoitti geenejä, jotka alassäädetty ilmaisumuodoltaan ja päästöarvot nollan ilmoittanut mitään muutosta geenien ilmentyminen. Log

2 tasot liittyvät geenit normalisoitiin käsittelemätön näyte.

Variantit suuntaus vähentynyt pro-apoptoottisten geenien ilmaisuja havaittiin molemmissa solulinjoissa käsiteltiin yhdistelmällä lääkehoidon verrattuna solulinjoja gemsitabiiniryhmässä yksinään (kuvio 7C ja D). Huolimatta laski proapoptoottisten geeniekspressiota, oli enemmän pro-apoptoottisten geenien CNE2 (GEM-R) (15/29 geenejä), joka pysyi sääteli jälkeen yhdistelmähoito (kuvio 7C), verrattuna SNU1 (GEM -S) (4/12 geenit) samassa hoidossa (kuvio 7D). On huomattava, että vain geenin ilmentymistä NFKBIA havaittiin olevan ajan reglated in SNU1 (GEM-S), kun yhdistelmähoito verrattuna sen geenin ilmentymisen aikana gemsitabiinihoidon (kuvio 7D).

validointi antiapoptooppinen Gene Cluster in GEM-R ja Pro-apoptoottisten Gene Cluster in GEM-S

validoimiseksi klusterin anti ja proapoptoottisten geenien CNE2 (GEM-R) ja SNU1 (GEM-S ) solulinjat kuviossa 7 on esitetty, olemme tutkineet 5 valittu geenien Kegg apoptoosireittiä, joilla voi olla tärkeä rooli apoptoosin vasteena gemsitabiinin ja gossypolikonsentraatio hoitoa (kuvio 8). Samanlainen geeniekspression määritystä, anti-apoptoottiset PIK3R2 ja Pakt proteiinin ekspressio havaittiin olevan säädelty kun CNE2 (GEM-R) solulinja käsiteltiin gemsitabiinin kanssa vähentää proteiinin tason havaittiin vain Pakt, kun soluja käsiteltiin yhdistelmähoito (kuva 9). Gemsitabiini käsiteltiin SNU1 (GEM-S) solulinja oli minimaaliset muutokset PIK3R2 ja Pakt proteiinin ilmentymisen verrattuna käsittelemättömiin soluihin, mutta yhdistelmä hoidon SNU1 (GEM-S) solulinja johti merkittävästi vähentää PIK3R2 ja Pakt proteiinin ilmentymistä (kuvio 9 ).

Havaitsimme, että siellä oli pieni kasvu proteiinin ilmentymistä proapoptootti- geenejä, BAD, CASP6 ja CAPN1 jälkeen gemsitabiinihoidon molemmissa CNE2 (GEM-R) ja SNU1 (GEM- S) solulinja (kuvio 9). BAD, CASP6 ja CAPN1 todettiin vaimentua aikana yhdistelmän käyttöä GEM-S solulinjassa, mutta ei GEM-R solulinjassa (kuvio 9). Nämä havainnot yhtyy havaintojen kuviossa 5, ja viittaavat siihen, että vaihtoehtoiset Bcl-2 polkuja, jotka liittyvät AKT, PI3K, BAD, CASP6 ja CAPN1 voi auttaa selittämään ero vastauksena gemsitabiinin ja synergisiä vaikutuksia hoidossa yhdistelmähoito Gemsitabiinin ja gossypolin.

immunoblot-anti-apoptoottisten (Pakt ja PI3KR2) ja pro-apoptoottiset (BAD, CASP6 ja CAPN1) geenien GEM-R-solulinja ja GEM-S solulinjoissa. Soluja käsiteltiin gemsitabiinin ja yhdistettynä Gossypolin 48 tuntia. Esitetyt tulokset edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

Keskustelu

korkea Bcl-2: n ilmentymisen on korreloitu huonon kliinisen ennusteen syöpäpotilailla [29] sekä vastustuskykyä perinteisille kemoterapeuttisten [30]. Han et ai raportoi, että yli-ilmentyminen Bcl-2 on osoitettu merkittävästi liittyy vähentynyt herkkyys gemsitabiinihoidon, ja että sen ilmentymistä voidaan käyttää ennustajana tekijä tehoa gemsitabiinihoidon syöpäpotilailla [12]. In vitro tutkimuksissa paljastui myös suora korrelaatio korkean Bcl-2 solujen sisällön ja kestävyys gemsitabiinin haiman sinoomasolulinjoja [11]. Oli kuitenkin ristiriitaisia ​​raportti tarkkailemalla korrelaatiota Bcl-2 ja gemsitabiini herkkyyttä haimassa, eturauhasessa, keuhko- ja rintasyöpä [31].

Tutkimuksessamme havaitsimme, että nenänielun, rinta- ja mahasyövän solulinjoissa vastustuskykyinen gemsitabiinin oli korkeammat Bcl-2: n ilmentymisen, ja gemsitabiinihoidon johti ylössäätöä antiapoptoottisten Bcl-2 tai Bcl-xl. Nämä havainnot viittaavat siihen, että geeni-ilmentymisen anti-apoptoottisten Bcl-2 ja Bcl-xl on tärkeää gemsitabiinin vastus. Tämän tueksi havainnon, Schniewind ym löytyi merkittävä käänteinen korrelaatio Bcl-XL ilmaisun ja gemsitabiinin indusoi apoptoosin [32], ja että lisääntynyt Bcl-xl ilmaisun estää solujen apoptoosia kemoterapeuttisia lääkkeitä [33].

useat raportit olivat osoittaneet tehokkuutta gossypolia kohdentamisessa syöpäsoluihin korkean tason Bcl-2 ja sen perheenjäsenten, lisäämällä solujen apoptoosin, kun niitä käytetään yksinään [19] tai yhdistelmänä gemsitabiinin [34]. Macoska et al osoittivat synergististä vuorovaikutusta virtsarakon syövän solulinjoissa käsiteltiin gossypolikonsentraatio yhdistelmänä gemsitabiinin tai karboplatiini, mikä johtaa apoptoosin lisääntyminen kautta, vähentyneen ilmentämisen pro-selviytymisen Bcl-xl ja Mcl-1 ja lisääntyneen ekspression pro-apoptoottisten geenien [34]. Kuitenkin yksi pitäisi olla tietoinen, etteivät kaikki Bcl-2 yliekspressoivassa solulinjat voivat hyötyä yhdistämällä gossypolin kanssa gemsitabiinia. Tutkimuksessamme mahdollisia antagonistinen vaikutus gossylpol ja gemsitabiinin havaittiin SNU1, solulinjassa, joka oli korkea Bcl-2, mutta oli herkkä gemsitabiinin, mikä viittaa vaihtoehtoisten Bcl-2-polun gemsitabiinin vastauksena [35], [36] .

Havaitsimme, että GEM-R solulinjojen korkean Bcl-2 oli up-säänneltyjen proapoptoottisten Noxa ja alassäädetty Bcl-2 tai Bcl-xl ilme, kun hoidettiin joko gossypolin tai yhdessä gemsitabiinin (Kuva 5). On ehdotettu, että Gossypolin tavoitteet Bcl-xl estämällä anti-apoptoottista aktiivisuutta, joka suoraan johtaa ylössäätöä proapoptootti- Noxa ja Puma ilmaisun [37]. Aktivointi Noxa voisi myös johtaa BH3-motiivin riippuvainen lokalisointi mitokondrioita ja vuorovaikutusta anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen jäsentä, jolloin aktivointi apoptoosin [38]. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että säädelty proapoptoottisten geenejä sekä vähentynyt ilmentyminen Antiapoptoottisten geenit kykenivät lisäämään Gossypolin aiheuttaman apoptoosin useissa syöpäsolujen [39], [40]. Osoitimme myös, että Mcl-1

S suureni GEM-R-solulinja käsiteltiin Gossypolin tai yhdistelmähoito (kuva 5). Tämä havainto voidaan tukea Meng et al.