Krooninen sairaus

tiivistelmä

Samanaikainen chemoradiation 5-fluorourasiilin (5-FU) on laajalti hyväksytty syövän hoitoon. Kuitenkin vuorovaikutukset säteilyn ja 5-FU jää epäselväksi. Täällä arvioimme vaikutus paikallisen säteilytyksen farmakokinetiikkaan 5-FU rotilla. Yhden osa säteilyä toimitettiin koko lantion aloilla Sprague-Dawley-rottia jälkeen tietokonetomografia-pohjainen suunnittelu. 5-FU: 100 mg /kg oli määrätty 24 tuntia säteilytyksen jälkeen. Korkean suorituskyvyn nestekromatografia järjestelmän käytettiin mittaamaan 5-FU veressä. Matriksimetalloproteinaasi-8: n (MMP-8): n estäjä I annettiin tutkia, onko vai ei RT modulaatio 5-FU farmakokineettiset parametrit voitaisiin estää. Verrattuna sham-säteilytetty valvontaa koko lantion säteilytys vähensi alueen alle aikakäyrän (AUC) 5-FU plasmassa ja sitä vastoin kasvoi sapen kanssa säteilyn annosriippuvaisesti. Perustuu proteiini erilaisia ​​analyysi, määrä plasman MMP-8 lisääntyi koko lantion alueen sädehoitoa (2,8-kertainen 0,5 Gy ja 5,3-kertainen 2 Gy) verrattuna kontrolleihin. Esikäsittely MMP-8-estäjä päinvastaiseksi säteilyn vaikutusta AUC 5-FU plasmassa. Tuloksemme on ensin ilmoitettava, että paikallinen säteilytys moduloivat systeemistä farmakokinetiikkaa 5-FU stimuloimalla vapauttaa MMP-8. Farmakokinetiikkaa 5-FU samanaikaisessa chemoradiaiton hoito tulee uudelleen ja optimaalinen 5-FU annosta on arvioitava uudelleen, ja säätää tarvittaessa aikana CCRT.

Citation: Hsieh CH, Liu CY, Hsieh YJ, Tai HC, Wang LY, Tsai TH, et ai. (2011) matriksimetalloproteinaasi-8 välittää epäedullinen systeeminen vaikutus Local säteilyttäminen farmakokinetiikkatyöryhmä Anti-Cancer Drug 5-fluorourasiilia. PLoS ONE 6 (6): e21000. doi: 10,1371 /journal.pone.0021000

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 26 joulukuu 2010; Hyväksytty: 18 toukokuu 2011; Julkaistu: 09 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Hsieh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sädehoitoa (RT) on käyttää tehokkaana paikallinen hoitomuotoa estävän solujen lisääntymistä, aiheuttaa solukuoleman ja tukahduttaa kasvaimen kasvu [1]. Parantaa hoitotuloksia, kannalta sekä Paikallista ohjaus ja selviytymistä, samanaikaisen käytön kemoterapian aikana sädehoitoa (CCRT) on nyt tavanomaista hoitoa varten oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, erityisesti paikallisesti edennyt syöpiä. Niistä lääkkeitä käytetään parantamaan RT vaikutus, 5-fluorourasiili (5-FU) on yksi yleisimmin käytetty kemoterapeuttisten aineiden CCRT [2], [3], [4], [5].

aiemmin RT oli yksinomaan käytetään paikallisena hoito ja sen vaikutus arvioitiin paikallinen vaikutus mallin [6]. Kuitenkin kasvava näyttöä siitä, että säteilytys on suora DNA-vaurioita riippuvia vaikutuksia sekä lähettää signaaleja viereisiin soluihin. Reaktiot ei-säteilytettyjä soluja vastaa tuottamien signaalien viereisen säteilytettyjä soluja kutsutaan sivustakatsojavaikutus [7], [8]. Lisäksi pitkän kantaman vaikutuksista ilmenevät tai kudosten välillä on myös esitetty, ja kutsutaan abscopal, out-of-kentän tai kaukaisia ​​sivullinen vastauksista [9]. Useita molekyylejä rooleja sivullisten signalointi, joissa stressistä ja solu-solu signalointi, mutta mikään niistä on nimenomaan säteilyaltistuksen. Useat tutkimukset osoittavat, että muutokset plasman aineen tasoja vastaa säteilyä, kuten interleukiini-6 (IL-6) [10], IL-8 [11], transformoiva kasvutekijä-beeta 1 (TGF-β1) [12], tuumorinekroositekijä tekijä α (TNF-α) [13], reaktiivisen hapen [14] ja reaktiivisen typen lajit [15]. Silti ei ole vahvaa näyttöä syy-seuraussuhteiden Näiden molekyylien on säädetty. Viime aikoina olemme raportoitu, että vatsan säteilytys voisi merkittävästi moduloivat systeemistä farmakokinetiikkaa 5-FU 0,5 Gy, off-kohdealue kliinisessä käytännössä, ja 2 Gy, päivittäinen hoitoannos kohdistamaan hoidon kokeellisessa rottamallissa [16]. Lisäksi tulokset kliinisestä tutkimuksesta ilmeni, että peräsuolen syövän potilaille, joilla on alhaisempi AUC 5-FU aikana adjuvanttihoitoa oli alhaisemmat tautivapaan elinajan [17]. Yhdessä nämä linjat todisteet tukevat merkityksestä ja tarve etsiä välittäjiä vastuussa odottamaton vaikutus paikallisten RT on systeemistä farmakokinetiikkaa kemoterapeuttisten aineiden, kuten 5-FU. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet mahdollisia liukoinen välittäjäaineiden mukana vaikutus paikallinen koko lantion RT, maksan sparingin, farmakokinetiikkaan 5-FU rotilla.

Tulokset

Plasma farmakokineettisten parametrien 5-FU: n ja koko lantion alueen sädehoitoa

Jos haluat varmistaa, että paikallinen RT moduloitu systeemistä farmakokinetiikkaa 5-FU, loimme kokeellisessa mallissa käyttäen CT-pohjainen suunnittelu ja lantion alueen sädehoitoa rotilla, ja sisällytti sen farmakokineettisessä määritysjärjestelmä. Kiehtovan, huomasimme, että lantion säteilytys vähensi huomattavasti AUC 5-FU rotilla 17,6% 0,5 Gy (

P

= 0,019) ja 21,5% 2 Gy (

P

= 0,008 ) (Fig. 1A). Erityisen kiinnostavia, säteilyn 2 Gy rotan koko lantio simuloitu päivittäinen hoito annos ihmiselle, kun taas pienten säteilyannosten (0,5 Gy) simuloitu annos talletetaan antelias, off-kohdealue kliinisessä työssä. Kuten on esitetty taulukossa 1, lantion alueen sädehoito laski merkittävästi keskimääräinen viipymäaika (MRT), ja sen sijaan, lisääntynyt puhdistuma-arvo on 5-FU verrattuna ei-säteilytetty valvontaa. Ei ollut merkittävää eroa arvojen puoliintumisaika (T

1/2), havaittu plasman (Cmax) tai jakautumistilavuus vakaassa tilassa (Vss) puitteissa testattiin ryhmissä.

poikittaisakseli esittää aika minuutteina ja pystysuora akseli edustaa pitoisuus on 5-FU. (A) Plasma. (B) Bile. Jokaisen ryhmän kerättiin kuusi rottaa.

Bile farmakokineettiset parametrit 5-FU: n ja koko lantion alueen sädehoitoa

Huomasimme, että lantion säteilytys selvästi AUC 5- FU sappeen rotilla 25,1% 0,5 Gy ja 30,6% 2 Gy (Fig. 1 B). Lantion säteilytys merkittävästi vähentynyt Cmax ja puhdistuma-arvo, ja sen sijaan kasvoi MRT ja Vss 5-FU, verrattuna ei-säteilytetty valvontaa. Kohteisiin, 2-Gy Säteilytyksen vähentynyt Cmax ja sen sijaan kasvoi MRT (

P

= 0,008) ja Vss (

P

= 0,015) ja 5-FU siinä määrin suurempi kuin on 0,5-Gy ryhmä. Ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa 0,5-Gy ja kontrolliryhmien Cmax ja Vss. Lisäksi merkittävää eroa T

1/2 Todettiin kolmesta ryhmästä (taulukko 2).

Maksan toiminta jälkeen RT tai 5-FU hoidossa

Seerumi pitoisuuksia alaniiniaminotransferaasin (ALAT) pitoisuudet olivat ole merkittävää eroa 5-FU-käsitelty, 2Gy saaneista, 0,5 Gy seurasi 5-FU-käsiteltyjen ja 2 Gy seurasi 5-FU-käsiteltyjen ja kontrolliryhmien (Fig. 2 ).

seerumin alaniiniaminotransferaasin (ALAT) tasot eivät olleet merkittävästi erilaiset kaikkien testattujen ryhmien. N = 5 kussakin ryhmässä.

Sytokiinit reagoida RT tai 5-FU plasmassa

verrattuna kontrolliryhmään, ei ollut merkittäviä eroja RT 2Gy yksin , 5-FU yksin, RT 0,5 Gy seurasi 5-FU ja RT 2 Gy seurasi 5-FU ryhmässä tasojen transformoivan kasvutekijä-beeta 1 (TGF-β1) ja tuumorinekroositekijä α (TNF-α) ( Fig. 3A ja 3B).

(A) taso transformoiva kasvutekijä beeta 1 (TGF-β1) plasmassa. (B) taso tuumorinekroositekijä alfa (TNF-α) plasmassa. Jokaisen ryhmän kerättiin viisi rottaa.

muuttaminen liukoisen tekijät plasmassa aiheuttama koko lantion alueen sädehoitoa

arvioimiseksi muutoksia profiilia liukoisen tekijät mukana koko lantion alueen sädehoitoa, rotan plasmanäytteet kerättiin ja alistettiin sytokiinin vasta-array määritystä (Fig. 4). Verrattuna kontrolli (käsittelemätön) ryhmä (Fig. 4A) ja 5-FU yksin ryhmä (Fig. 4C), havaittavissa annoksesta riippuvaa muutosta plasman liukoisen tekijöitä olivat matriksimetalloproteinaasi-8 (MMP-8), monosyyttien kemoatrak- proteiini 1 (MCP-1), sytokiini-indusoitua neutrofiilien kemoattraktantti -1 (CINC-1) ja kudoksen estäjä metalloproteinaasi-1 (TIMP-1). Näistä tekijöistä vain lisääntyminen MMP-8 taso oli johdonmukainen kolmena kappaleena kokeita. Verrattuna kontrolliryhmiin, RT 2Gy yksinään voi lisätä MMP-8 tekijät 3.8 (Fig. 4B). Verrattuna 5-FU yksin ryhmä, plasman MMP-8 lisääntyi sekä RT 0,5 Gy seurasi 5-FU (Fig. 4D) ja RT 2 Gy seurasi 5-FU ryhmää (Fig. 4E) kanssa annoksesta riippuvaisella tavalla tekijät 2,8 ja 5,3, vastaavasti.

määrä matriksimetalloproteinaasi-8: n (MMP-8) kasvoi 0,5-Gy ja 2-Gy säteilytetty ryhmiä verrattuna kontrolliryhmään. Kartta, josta paikat sytokiinin vasta täplittäin proteiini siru näkyy ylös puolella kuvion. Dotted neliöt ilmaisevat sijainnin MMP-8. Jokainen sytokiini edustaa päällekkäisiä paikkoja paikoissa esitetty. Sytokiini-vasta-ainetta paneelit määritystä (A) hoitamattomaan verrokkiryhmään, (B) koko lantion säteilytys (RT) 2 Gy vain, (C) 5-fluorourasiili (5-FU) yksin, (D), RT 0,5 Gy seurasi 5- FU ja (E) RT 2 Gy jälkeen 5-FU. Sytokiini array kuva edustaa tuloksia yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta, jotka osoittavat samankaltaista ilmaisun.

Solunsisäinen 5-FU tasojen kanssa tai ilman rekombinantti-MMP-8: korkean suorituskyvyn nestekromatografia

tutkittiin rooli rekombinantti-MMP-8 pitoisuutta solun 5-FU: HepG2 (ihmisen maksan kasvain- soluissa, biokemialliset profiilit on tunnusomaista normaaleille hepatosyyttien) ilman säteilyn vastaanottamiseksi. Ei ollut merkittävää vaikutusta AUC 5-FU välinen yhdistelmä-MMP-8 plus 5-FU ja 5-FU yksin ryhmien (Fig. 5). Olemme havainneet, että rekombinantti-MMP-8, ei indusoi säteilytys, ei vaikuta pitoisuutta solun 5-FU maksasoluissa, matkien farmakokineettiset muutokset solutasolla.

Modulation of 5-FU farmakokineettiset by säteilytys purettiin MMP-8-estäjä

vieressä tutki rooli MMP-8 vaikutuksesta RT 5-FU farmakokinetiikkaa käyttämällä MMP-8-estäjä. Kumpikaan MMP-8-inhibiittorin tai sen ajoneuvo oli merkittävä vaikutus AUC 5-FU verrattuna kontrolleihin (Kuva. 6). Huomasimme, että esikäsittely MMP-8-estäjä vaimensi merkittävästi lasku AUC 5-FU aiheuttama lantion alueen sädehoitoa (AUC

säteilytys versus AUC

MMP-8-estäjä + säteilytys on 3305 vs. 3963 min ug /ml,

P

0,05). Lisäksi, vähentynyt MRT ja lisääntynyt puhdistuma-arvo aiheuttama säteilytyksen olivat täysin päinvastaiseksi käyttämällä MMP-8-estäjä (taulukko 3).

alue plasman konsentraatio-aikakäyrän (AUC) 5-FU: 100 mg /kg rotille kontrolliryhmässä ilman liuotinta, kontrolliryhmä liuottimella, koko lantion 2-Gy säteilytyksen liuottimella, ja koko lantion 2-Gy säteilytys liuottimen ja MMP-8-inhibiittori. Poikittaisakseli esittää aikaa minuutteina ja pystyakseli edustaa pitoisuutta 5-FU plasmassa. Jokaisen ryhmän kerättiin neljältä rotista.

Keskustelu

Kun todiste käsite että paikalliset RT vaikuttaa systeemistä farmakokinetiikkaa kemoterapeuttisten käyttäen 5-FU mallina, me seuraava seulottiin mahdollisen liukoisen tekijät vastuussa tästä vaikutus, joka tunnistettiin MMP-8. MMP-8, joka tunnetaan myös nimellä kollagenaasi-2 tai neutrofiilien kollagenaasi, kuuluu sinkki-riippuvaisen interstitiaalinen kollagenaasi alaryhmä MMP perheen neutraalien proteinaasien [18]. Olemme osoittaneet, että MMP-8 hallussaan odottamaton bioaktiivisuus moduloinnissa farmakokinetiikkaan 5-FU.

Liuskatumaisia ​​neutrofiilien (PMN) ovat tärkein lähde MMP-8 ihmisillä ja hiirillä [19], [20]. MMP-8 on tallennettu rakeet PMN: ien ja vapautetaan, kun jyvästen häviämistä [21]. Fisher

et al

. [22] kertoi, että MMP-8-proteiinin tasot ihmisen ihon nousivat noin 4-kertainen 8 h kuluessa ja pysyivät koholla 24 tunnin kuluttua ultraviolettisäteilyn. Säteily hoito kasvain laakeri sivustoja indusoi tulehdusta säteilytetty alan ja rekrytoi T-lymfosyytit, neutrofiilit, lymfosyytit, makrofagit, plasma-solut ja dendriittisolut [18], [23], [24]. Lisäksi säteilytys indusoi up-geenien säätelystä tärkeimmistä proinflammatoristen kemokiinien [25]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme säteilyttää koko lantio rottia, jotka olisivat voineet toimittaa säteilyannos kiertävien neutrofiilien, kudosten ja luuytimen makrofaagit ja sisällä lantio. Yhdessä tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että lantion alueen sädehoito voivat stimuloida neutrofiilejä ja /tai muiden tulehdussolujen ontogeny, aiheuttaa tulehduksellinen stressiä ja parantaa eritystä MMP-8 (Fig. 4) sekä useita muita proinflammatoristen välittäjäaineiden. Lisäksi, useat tutkimukset osoittavat, että muutokset plasman aineen tasoja vastaa säteilyä, kuten TGF-β1 [12] ja TNF-α [13]. Lisäksi TGF-β voisi olla kohde 5-FU kautta c-Jun-NH2-terminaalinen kinaasi /aktivaattoriproteiini-1 aktivoitumista ihmisen fibroblasteissa [26]. Lisäksi TNF-α liittyy säätelyssä fluoropyrimidiinipohjaiseen aktivoivia entsyymejä, uridiinifosforylaasi (UPase), joka indusoi UPase geeniekspression mikä tehostaa 5-FU lisääntymistä estävä aktiivisuus [27]. Kuitenkin, nykyisen tutkimuksen tasot TGF-β1: n ja TNF-α eivät lisääntyneet RT pelkästään 5-FU yksin tai huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen 5-FU ryhmiä verrattuna kontrolliryhmään (Fig. 3A ja 3B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että MMP-8 näyttää olevan tärkeä rooli paikallisen RT aiheuttama modulaatio systeemisen 5-FU farmakokinetiikkaa mutta ei läpi näitä sytokiineja.

harty MW et ai. [28] kertoi, että polymorfonukleaarisista soluperäisissä MMP8 tärkeä rooli maksan korjaus niiden palautuva sappitietukos malli. Nykyinen tutkimus osoittaa, että hakemus lantion RT tai 5-FU eivät aiheuta vahinkoja maksan toimintaa. Täten vaste MMP-8 aiheuttama RT RT-PK ilmiöitä ei olisi prosessi tulehduksellisten tunkeutumisen maksan kuten vakava aiheuttamia sappitietukos. Sen lisäksi, ei ole olemassa eroja elinkelpoisuuden (tietoja ei näytetä), ja solunsisäisen 5-FU tasoilla (Fig. 5) 5-FU-käsiteltyjen HepG2 kanssa tai ilman rekombinantti-MMP-8. HepG2-soluja ylläpitää monia morfologiset ja biokemialliset ominaisuudet normaalissa hepatosyyttien, kuten erityksen useimpien plasmaproteiinien odotetaan maksasoluissa, mukaan lukien apolipoproteiini B [29]. Tuloksena viittaa siihen, että rekombinantti-MMP-8, ei indusoi säteilytys, ei vaikuta PK: 5-FU: maksan solujen ja ei ole merkittävää toksisuutta ihmisen hepatoblastooma peräisin oleva solulinja, HepG2. Yhdessä MMP-8 ei saa mukauttaa maksan toiminta.

Toinen tärkeä kysymys on samankaltainen, mutta vähäisempi vaikutus pieniannoksisen RT 5-FU farmakokinetiikkaa (Fig. 1). Body jakelu pieniannoksisen RT (0,5 Gy, esimerkiksi) kliinisessä käytännössä muuttuu suuresti antelias kehittyneitä sädehoidon tekniikoita ja säännöt, kuten intensiteetti-moduloitua sädehoito, kierteiset tomotherapy, nopea kaari sädehoito, volumetrinen moduloidaan kaari hoidon ja muiden mukaan, verrattuna perinteisiin RT. Samalla hyväksyä edut kohdistaminen kasvaimia ja säästävät kriittisten elinten käyttämällä näitä kehittyneitä tekniikoita [30], [31], että yksi edelleen varovaisesti antelias pieniannoksinen säteilytys voisi tuottaa odottamattomia tai ei-toivottuja biologisia vaikutuksia. Kliinisesti, me aiemmin havaittu, että pienen annoksen, off-tavoite säteily toimitetaan erittäin konforminen tomotherapy voi aiheuttaa vakavia myrkyllisyys kriittisten elinten ympärille tavoitteita, kuten keuhkoihin, ja aiheuttaa sädepneumoniitista [32]. Silti, lääketieteellinen yhteisö ei ole kattavaa ymmärrystä biologisista vaikutuksista antelias, pieniannoksisen RT. Toivottavasti tämä tutkimus lisää tietämystä näistä vaikutuksista ja antaa kokeellinen malli ymmärtää biologisia vaikutuksia antelias pieniannoksinen RT aikakaudella erittäin conformal RT.

80% 5-FU on catabolyzed maksan kautta dihydropyrimidiinidehydrogenaasin (DPD) reitti tuottaa myrkyllisiä 5-fluori-5,6-dihydro-urasiili, kun taas anaboliset reitin kautta orotaatti bosyylitransferaasi, tuottaa aktiiviset metaboliitit, kuten 5-fluoriuridiinin-5′-monofosfaatti, 5-fluoriuridiinia, ja 5-fluori-2′-deoksiuridiini [33], [34]. Yleinen toksisuus oli kaksi kertaa korkeampi potilailla, joilla on syvällinen DPD puutteet ( 45% keskiarvosta DPD aktiivisuuden ohjaus väestöstä) verrattuna potilaisiin, joilla on kohtalainen DPD puutteet (välillä 45% ja 70% keskiarvosta DPD aktiivisuuden ohjaus väestöstä), ilmoituksen mukaan Milano ja coauthors [35]. Koska 10%: sta 20%: 5-FU erittyy muuttumattomana virtsaan [36], munuaisten toimintahäiriö, plasman 5-FU nondialysis päivinä on huomattavasti korkeampi kuin Dialyysipäivinä ja tämä saattaa johtua poistaminen joitakin tekijöitä plasmasta hemodialyysissä, jotka estävät DPD aktiivisuutta [37]. Lisäksi 5-FU on suhteellisen kapea terapeuttinen indeksi, vahva korrelaatio on kuvattu altistumisen 5-FU ja sekä hematologisia ja ruoansulatuskanavan toksisuutta [38]. Jos siis maksan tai munuaisten putoaa säteilytetty tilavuus, [16] DPD, nopeutta rajoittava vaihe kataboliaa 5-FU [39], voi vaikuttaa säteily vahinkoa maksan tai munuaisten. Kuitenkin nykyisessä tutkimuksessa, maksa ja munuaiset eivät kuulu koko lantion säteilykentän (Fig. 7). Lisäksi ALAT eivät olleet merkittävästi erilaiset välillä ohjaus, 5-FU-käsitelty, tai lantion RT ryhmiä tai ilman 5-FU. (Fig. 2) Näin ollen vaikutus rekisteröintiveron AUC 5-FU totesi tässä tutkimuksessa ei saa aiheuttaa suora modulaatioon maksan toimintaa RT tai 5-FU.

Kallon marginaali asetettiin yläosassa kahdenvälistä suoliluun harjun koko lantiokenttään. Tavanomainen sädehoito käyttää tuottamaan säteilyannos kautta etu-taka-(AP) ja PA-portaaleja.

verrattuna kontrolliryhmään, koko lantion alueen sädehoito laski AUC 5-FU: n plasman tilastollisesti merkittävä taso (Fig. 1A). Sen sijaan, säteilytys AUC lisääntyi 5-FU sappeen merkittävästi (Fig. 1 B). Sen mukana väheneminen MRT ja Puhdistuman lisääntyminen arvo plasmassa, mutta kasvu MRT ja vähentämiseen välys arvon sappeen. Osalta farmakokinetiikkaa, tämä viittaa siihen, että lantion säteilytys voisi helpottaa erittymistä 5-FU.

Koska samanaikainen käyttö kemoterapeuttisten yhdessä lokalisoitu konforminen RT parantaa kliinistä hoitotuloksia yhä useamman maligniteettien [2 ], [3], [4], [5], tuloksemme osoittavat, että sekä paikallinen kohde-in ja antelias kohde-off säteilytys voivat vaikuttaa 5-FU farmakokinetiikkaa, ja tarjoaa syy harkitsee säätö kemoterapeuttisten hallinnon aikana RT kurssi. Vaikutus paikallinen RT on systeemistä farmakokinetiikkaa solunsalpaajalääkeaineiden tai muiden lääkkeiden selvästi tarvitsee lisää kliinistä arviointia.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit ja reagenssit

5-FU ja korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) -laadun metanolia hankittiin Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA) ja Tedia Company, Inc. (Fairfield, OH, USA), vastaavasti. Milli-Q-puhdistettua vettä (Millipore, Bedford, MA, USA) käytettiin liuokset ja liikkuvia faaseja.

Eläimet ja näytteenvalmistus

Aikuisille, Sprague-Dawley-rottia (300 ± 20 g ruumiinpainoa) toimittivat Laboratory Animal Center National Yang-Ming University (Taipei, Taiwan). Heidän majoitettiin tietyssä patogeenittomassa ympäristö ja oli vapaa pääsy ruokaan (Laboratory Rodent Diet 5001, PMI Nutrition International, LLC, MO, USA) ja vettä. Kaikki koe-eläin kirurgia menettelyjä tarkistettiin ja hyväksyttiin eläimen eettinen komitea Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwan (MMH-AS-98011).

Rotat nukutettiin uretaanilla 1 g /ml ja α-kloraloosia 0,1 g /ml (1 ml /kg vatsaonteloon), ja ne immobilisoidaan aluksella olevien tietokonetomografia simulointiin koko lantion alalla. Kallon marginaali asetettiin yläosassa kahdenvälisen suoliluun crests koko lantiokenttään (Fig. 7). Tavanomainen sädehoito käyttää tuottamaan säteilyannos kautta etu-taka-(AP) ja PA-portaaleja. Kaikkia eläimiä satunnaistettiin kontrolliryhmään, 2-Gy yksin, 5-FU yksin, 0,5-Gy seurasi 5-FU, ja 2-Gy seurasi 5-FU ryhmiä. Jokaisen ryhmän kerättiin kuusi rottaa.

allometriseen skaalaus säteilyannokset (0,5 ja 2 Gy) ihmisen ja rotilla, vastaavasti, on tärkeä näkökohta tutkimuksessa. Syynä käyttöön 0,5 ja 2 Gy rotille oli simuloida asiaa annosalueella päivittäiseen hoitoon ihmisen ylävartalon, turvallisuuden ja toimivuuden, kuten aiemmin on raportoitu [16]. Lyhyesti, ei ollut suoraa vertailua allometriseen skaalauksen avulla koko lantion alueen sädehoitoa. Tästä huolimatta allometriseen skaalaus kuolettava annos (LD50) (Gy) koko kehon säteilytys ihmisille ja rotille on 4 Gy ja 6,75 Gy vastaavasti [40]. Koska tämä ero on kohtalainen, päätimme käyttää 0,5 ja 2 Gy rotilla simuloimaan merkittävällä annosalueella päivittäiseen hoitoon ihmisen rintakehää.

Ambre

et al

. [41] tutkivat poistaminen 5-FU: n ja sen metaboliittien jälkeen, suonensisäisen 5-FU: 15 ja 150 mg /kg rotille. Tulokset, että tutkimuksessa todettiin, että kyllästyminen kataboliareitti tapahtunut sen jälkeen suuremman annoksen. Jarugula

et al

. [42] osoitti, että annosnormalisoitu ala (AUC) oli huomattavasti suurempi, kun oli annettu 100 mg /kg (keskiarvo ± keskihajonta, SD, 1,14 ± 0,55 mg · h /l /mg) kuin jälkeen 50 mg /kg (keskiarvo ± SD, 0,50 ± 0,16 mg · h /L /mg) tai 10 mg /kg (keskiarvo ± SD, 0,43 ± 0,11 mg · h /L /mg). Niinpä päätimme 100 mg /kg käyttökelpoisena 5-FU annosta rotilla tutkimista varten 5-FU farmakokineettisiä parametreja, jotka perustuvat aiempien raporttien [16], [41], [42].

Kaksikymmentä tuntia sen jälkeen, kun RT, rotille annettiin 100 mg /kg 5-FU: 2 ml: ssa normaalia suolaliuosta laskimoinfuusiona reisilaskimoon yli 2 minuutin aikana [42]. 150 ul: n verinäyte kaulasuonesta kanssa fraktionkerääjän mukaan ohjelmoidun aikataulun 5, 15, 30, 45, ja 60 min, ja 1,5, 2, 2,5 ja 3 h lääkkeen antamisen jälkeen. Verinäytteitä sentrifugoitiin välittömästi 3300 x

g

10 minuuttia. Saatu plasma (50 ui) lisättiin 1 ml: aan etyyliasetaattia puhtaaseen putkeen, vorteksoitiin 5 minuuttia, ja sentrifugoitiin 5900 x

g

10 min. Sentrifugoinnin jälkeen ylempi orgaaninen kerros, joka sisältää etyyliasetaattia siirrettiin uuteen putkeen ja haihdutetaan kuiviin virtaavassa typessä. Kuivattu jäännös liuotettiin uudelleen 50 ui Milli-Q-vettä (Millipore). 20 ul: n alikvootti liuosta injektoitiin korkean erotuskyvyn nestekromatografia-ultravioletti (HPLC-UV) havaitsemisjärjestelmä.

Korkean suorituskyvyn nestekromatografia

Kromatografinen analyysi suoritettiin Model LC -20AT HPLC-järjestelmä (Shimadzu, Tokio, Japani) oli varustettu malli SPD-20A aallonpituuden UV-detektori, SIL-20AC autosamplerista, ja LC Solution tietojenkäsittelyjärjestelmän. LiChroCART RP-18e sarake (Purospher, 250 mm, 5 pm, Merck, Darmstadt, Saksa), jonka LiChroCART 4-4 Suojakolonnia käytettiin erottamiseen. Liikkuva faasi koostui 10 uM kaliumfosfaatti-metanoli (99:1, v /v, pH 4,5 säädettiin 85%: ista fosforihappoa) ja virtausnopeus Liikkuva faasi oli 1 ml /min. Detektointiaallonpituuden oli asetettu 266 nm: ssä. Näissä olosuhteissa, retentioaika 5-FU oli 5,4 min. Lineaarisuuden kalibrointikäyrien osoitettiin hyvä määrityksen kertoimet (

r

2) saatu regressiolinjan. Hyvä lineaarisuus saavutettiin yli alueella 0,01-5 mikrog /ml, jossa kaikki korrelaatiokertoimet yli 0,998. Kaikki näytteet juuri valmistettu, kuten standardiliuokset, samasta kantaliuosta (5 mg /ml). 0,01-ug /ml määritysrajan määriteltiin alhaisin konsentraatio kalibrointikäyrän, joka voitaisiin mitata rutiininomaisesti hyväksyttävällä harhaa ja suhteellinen SD. Yleinen keskiarvo tarkkuuden, määritellään suhteellinen SD, vaihteli 0,2% ja 11,0%. Analyyttinen tarkkuus ilmaistiin prosentteina ero keskiarvon havaitut arvot verrattuna tunnettuihin pitoisuudet vaihtelevat välillä -10,0%: sta 14,0%. Elpyminen tulokset pitoisuuksilla 0,1-10 mikrog /ml olivat 92,0% -94,0%

arviointi maksan toimintaa

pitoisuudet plasmassa alaniiniaminotransferaasin (ALT) mitattiin tarkistaa vaikutuksen eri yksityiskohdista maksan toiminta tavallisella kolorimetrisellä menetelmällä käyttämällä Synchron LX20 spektrofotometrillä (Beckman Coulter) ja valmistajan toimittamia reagensseja.

Serum sytokiinianalyysi

plasmatasot sytokiinien (transformoiva kasvutekijä beeta 1 (TGF-β1) ja tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α)) on saatu hiiren verinäytteistä analysoitiin entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) (R & D Systems) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

sytokiini-vasta-array

Rottaplasmanäytteet näytteet analysoitiin käyttäen sytokiiniä vasta-aineen array (RayBio® hiirisytokiini Antibody Arrays II, RayBiotech, Inc., Norcross, Ga.), mukaisesti valmistajan ohjeiden ja kuten aiemmin on kuvattu [43] voidaan havaita mahdolliset välittäjäaineiden 5-FU-RT vuorovaikutusta. Tämä erityisesti array samanaikaisesti havaitsee 34 hiiren sytokiineja. (Fig. 4) Lyhyesti, sytokiinin joukko kalvoja blokattiin 2 ml: lla 1 × estopuskuria 30 minuuttia ja inkuboitiin sitten 1 ml plasmaa näytteestä huoneen lämpötilassa 1-2 tuntia. Näytteet dekantoitiin sitten jokaiseen säiliöön, ja kalvot pestiin kolme kertaa 2 ml: lla l x pesupuskuria I, jota seurasi kaksi pesua 2 ml l x pesupuskuria II huoneenlämpötilassa ravistellen. Sitten kalvoja inkuboitiin 1:250 laimennettiin biotiinikonjugoitu primaaristen vasta-aineiden huoneenlämmössä 1-2 h ja pestiin kuten edellä on kuvattu, ennen inkuboinnin 1:1000 laimennettiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua streptavidiinia. Inkuboinnin jälkeen HRP-konjugoitua streptavidiinia 30-60 min, kalvot pestiin perusteellisesti ja altistettiin peroksidia alustaan ​​(havaitseminen puskurit C ja D, RayBiotech, Inc.) 5 min pimeässä ennen kuvantamisen. Kalvot sitten altistettiin röntgenfilmille (Kodak X-OMAT AR-kalvo) huoneenlämmössä 1 minuutin ajan. Signaalin voimakkuudet analysoitiin Fuji Film Multi mittari V2.1. Biotiinikonjugoitu IgG toimi positiivisena kontrollina kuusi paikkoja, jossa sitä käytettiin tunnistamaan kalvon suunta ja normalisoida tulokset eri kalvoja, jotka olivat verrattuna. Kunkin paikalla, netto optinen tiheys määritettiin vähentämällä taustan optinen tiheys kokonaismäärästä raaka optinen tiheys ja optinen tiheys kunkin sytokiinin edusti prosenttiosuutena positiivisen kontrollin.

määritys solunsisäisen 5- FU tasojen kanssa tai ilman rekombinantti-MMP-8: korkean suorituskyvyn nestekromatografia

vaikutuksen tutkimiseksi MMP-8 normaalissa maksassa soluja, ihmisen hepatoblastooma johdettu solulinja, HepG2, käytettiin simuloimaan normaalit maksasolut meidän ylimääräisiä kokeita. Hoidon jälkeen 10 ug /ml rekombinantti-MMP-8 ja 50 uM 5-FU tai 50 uM 5-FU yksin, HepG2 (Human hepatosellulaarista karsinoomaa solulinja) solut kerättiin 10 minuutin välein, kunnes 60 min ja pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), mitä seurasi sentrifugointi 13000 rpm: ssä 5 min. Poimia solunsisäinen 5-FU, joka on uuttoliuosta, joka sisältää 0,1% Triton X-100 dimetyylisulfoksidiin lisättiin solupelletit, ja tämä suspensio vorteksoitiin ja sentrifugoitiin at13000 rpm: llä 5 minuutin ajan. Saatu liuos sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa asetonitriiliä proteiinia oli poistettu. Proteiini Sakat poistettiin sentrifugoimalla (13000 rpm 5 min), ja 20 ui: n erä supernatanttia suoritettiin korkean erotuskyvyn nestekromatografia-analyysi mainita ennen.

Sovittelija estäjä valmistelu ja kokeilla

MMP-8-inhibiittori I (Calbiochem, La Jolla, CA) annettiin rotille tutkia, onko vai ei RT modulaatio 5-FU farmakokineettiset parametrit voitaisiin estää. Lyhyesti, MMP-8-inhibiittori I liuotettiin PEG400 /etanoli [04:01 (v /v)] liuos, jolloin saatiin lopulliset pitoisuudet 5 mg /ml. Kaksi tuntia ennen säteilytystä, 10 mg /kg MMP-8-inhibiittori I infusoitiin rotan hännän laskimoon 2 minuutin aikana. Tämän jälkeen rotat nukutettiin uretaanilla 1 g /ml ja α-kloraloosia 0,1 g /ml (1 ml /kg vatsaonteloon), ja immobilisoitiin levylle tehdään tietokonetomografia simulointiin koko lantion alalla ja sai säteilytys, kuten aiemmin on kuvattu. Kaikkia eläimiä satunnaistettiin hallita ilman PEG400 /etanoli [04:01 (v /v)] liuos (0 Gy), ohjaus liuottimella (0 Gy), koko lantion säteilytys (2 Gy) liuottimella ja koko lantion säteilytys (2 Gy) MMP-8-estäjä ja liuotin ryhmiä, vastaavasti. Sen jälkeen, kun RT sham RT 20 tuntia, kaikki rotat saivat 5-FU: ta (100 mg /kg) injektion ja farmakokineettiset parametrit 5-FU analysoitiin. Jokaisen ryhmän kerättiin neljältä rotista.

Farmakokinetiikka ja tietojen analysointi

farmakokineettiset muuttujat, kuten AUC konsentraatio vastaan ​​aika, Terminaalinen eliminaatiovaihe t

1/2, Cmax, MRT, plasman kokonaispuhdistuma ja Vss laskettiin käyttäen farmakokinetiikkaa laskentaohjelmistoja WinNonlin Standard Edition Version 1.1 (Scientific Consulting, Apex, NC, USA) käyttäen osastomoduuleilla menetelmää.

Tilastolliset menetelmät

tulokset esitetään keskiarvoina ± standardipoikkeamat. Erot vakuutusmatemaattisen tuloksia ryhmien välillä laskettiin käyttäen yksisuuntaista varianssianalyysi (ANOVA), jossa post hoc monivertailuja. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen SPSS, versio 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).