Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei-koodaavat RNA: t, jotka ovat kriittisiä säätelijöitä erilaisia ​​sairauksia. MicroRNA-20a (miR-20a) on aiemmin muuttunut merkittävästi useissa eri syövissä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme suhdetta miR-20a ja kehittämistä kohdunkaulan syövän qRT-PCR, huomasimme, että ilmentymistaso miR-20a oli merkitsevästi suurempi kohdunkaulan syövän potilailla kuin terveillä, poikkeavaan ilmaus miR -20a korreloi imusolmuke etäpesäke, histologisia laatu ja kasvaimen halkaisija. Sitten onnistunut vakaa anti-miR-20a kohdunkaulan syövän solulinjoissa lentiviruksen. Inhiboi miR-20a estetään kasvaimen etenemistä moduloimalla solusyklin, apoptoosin, ja etäpesäkkeiden in vitro ja in vivo. TIMP2 ja ATG7 voitiin varmentaa kohdistu suoraa miR-20a, käyttäen lusiferaasianalyysissä ja western blot. Nämä tulokset osoittavat, että miR-20a estää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion kohdunkaulan syöpäsolu kohdistamalla ATG7 ja TIMP2. Tuloksemme tukevat osallistumista miR-20a kohdunkaulan kasvainten synnyssä, erityisesti imusolmuke- etäpesäke. Ehdotamme, että miRNA voidaan käyttää terapeuttisena aineena kohdunkaulan syöpään.

Citation: Zhao S, Yao D, Chen J, Ding N, Ren F (2015) MiR-20a Edistää kohdunkaulan syövän leviämisen ja Metastasis in vitro ja in vivo. PLoS ONE 10 (3): e0120905. doi: 10,1371 /journal.pone.0120905

Academic Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 25 syyskuu 2014; Hyväksytty: 27 tammikuu 2015; Julkaistu: 24 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat tukevat tiedot tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Guangxi Natural Science Foundation (No.2011GXNSFA018184 ja 2013GXNSFBA019132), National Natural Science Foundation of China (No.81460398), ja tukee Guangxin Health Department (No.Z2013018). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on toiseksi yleisin syöpätyyppi naisilla kaikkialla maailmassa, joka on johtava syy syövän kuolema, jolloin noin 300000 kuolemantapausta vuodessa [1]. Useimmat kohdunkaulan syöpä potilaat saavat standardi sädehoitoa ja kemoterapiaa. Kuitenkin kliinisten tulosten vaihtelevat huomattavasti. Mukaan maailma oli noin 500000 uusia tapauksia vuosittain, 85% patologisen tyypit olivat okasolusyöpä. Vaikka irtosolunäyte seulonnan hyödyt paljon varhaisen havaitsemisen ja hoidon alussa viime vuosikymmeninä, kohdunkaulan syövän sairastuvuus ovat edelleen korkealla, ja siellä oli enemmän ja enemmän nuoria tapauksissa viime aikoina. Niin monet tutkijat omistautua löytää synnyssä ja tehokkaampia kasvaimen hoito. MikroRNA (miRNA) ovat pienet ei-koodaavat RNA: t noin 21-25 nukleotidin (nt) ja toimivat posttranskriptionaalisen sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen [2]. Nämä pienet molekyylit on havaittu säätelemään geenien erilaisten biologisten prosessien, kuten solujen lisääntyminen, kehitys, erilaistuminen, apoptoosi ja muut. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että muutokset miRNA synteesi ihmisen syövissä liittyvät usein kasvainten kehittymiseen, etenemisen ja etäpesäkkeiden [3]. Meidän kokeiluista hybridisoimalla paneelit vertasi microRNA ilmaisun profiilin normaalin kohdunkaulan kudosten ja kohdunkaulan levyepiteelikarsinoomia kudoksia, 89 miRNA tutkittiin, ja miR-20a oli sääteli merkittävästi. MiR-20a oli tiedossa kuuluvat miR-17-92 klusteri, joka on laajimmin tutkittu klusteri, joka on onkogeeninen toiminto [4]. Tässä tutkimuksessa keskitytään miR-20a, joka voisi olla lupaava lähtökohta kehittää tulevaisuuden miRNA-pohjainen kohdunkaulan syövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen linjaus

lupamenettely ja konduktanssi tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean Guangxi Medical University. Tutkimus toteutettiin noudattaen vahvistettuja periaatteita Helsingin julistuksen. Tiedot kerättiin anonyymisti. Sanallinen suostumus saatiin kaikkien aineiden todisti, ja muodollisesti jokaiseen kyselyyn. Kirjallinen lupa käyttää näytteiden tutkimustarkoituksiin saatiin kaikille potilaille ennen leikkausta. Eläinkoe ​​suoritettiin tiukasti mukaisesti Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals Yhdysvaltain National Institutes of Health, ja tutkimussuunnitelman hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden Guangxi Medical University.

Potilaat ja näytteet

kohdunkaulan kudosnäytteitä kerättiin osaston Gynekologiasairauksien onkologian Toimikunta Kasvain sairaalan Guangxi Medical University vuosien 2010 ja 2011. Kahdeksankymmentä kohdunkaulan syöpä näytteitä kansainvälinen liitto Gynecology and Obstetrics (FIGO ) stageⅠ-ⅱA saatiin potilailta, joille tehtiin kirurginen hoito. Kaksikymmentä näytteitä stageⅡB-Ⅳ oli saanut kohdunkaulan koepala. Kaikki näytteet olivat okasolusyöpä. Ei edellistä paikallista tai systeemistä hoitoa oli suoritettu näiden potilaiden ennen leikkausta tai biopsia. LNM vahvistettiin potilailla vaiheen Ⅰ-ⅡA jota käytimme toiminnan ensimmäistä käsittelyä. Mediaani-ikä potilailla oli 49 vuotta, ja sen alue 25-69 vuotta. Normaali kohdunkaulan epiteelin kerättiin 120 potilasta, joilla oli kohdunpoisto hyvänlaatuisen taudin. Keskimääräinen ikä verrokeilla oli 45 vuotta, vaihdellen 33-57 vuotta. Kudokset jäädytettiin nestetypessä heti kirurgisen poiston jälkeen ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

RNA uutettiin jäädytetty kohdunkaulan syövän kudoksissa, normaali kohdunkaulan epiteelin kudosten ja kohdunkaulan syövän soluihin käyttäen miRcut miRNA eristyspakkausta (Tiangen, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käänteisen transkription reaktiot suoritettiin käyttäen MiraMasTM Kit (Bioo tieteellinen, USA), joka sisältää poly (A) polymeraasi, jota käytetään polyadenylointiin miRNA. qRT-PCR suoritettiin käyttäen standardia SYBR Green PCR -kittiä (Takara, Japani) kantavassa alukkeet syntetisoitiin (Shanghai GenePharma, Kiina) seuraavasti: miR-20a välittää aluke: TAC GAT AAA GTG CTT ATA GTG CAG GTA G. U6 eteenpäin pohjamaali: ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT. Universal käänteisaluketta: GTC CTT GGT GCC CGA GTG. 20 ui PCR-seos koostui 12,5 ui SYBR Green SuperMix, 3,5 ui RNaasi-vapaata vettä, 1 ui eteenpäin-alukkeita, 1 ui reverse-alukkeita, ja 2 ui käänteistranskriptio tuote. Reaktio-olosuhteet olivat 40 monistussykliä 95 ° C: ssa 3 min, 95 ° C: ssa 12 s, ja 62 ° C: ssa 50 s käyttäen BIO-chromo4 (Bio-Rad, USA) määrälliset Real-Time PCR System. U6 käytettiin viitteinä miRNA. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena. Vertaileva kynnyssyklin (CT) menetelmää-kertainen muutos (2-ΔΔCT) käytettiin analysoimaan suhteelliset muutokset.

Cell Culture

CC solulinjat SiHa-, HCC94, C33A ja CaSki saatiin Keski laboratorio Affiliated Kasvain sairaalan Guangxi Medical University. Nämä solut pidettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa oli 5% CO2: RPMI-1640, 10% naudan sikiön seerumia.

Muodosta vakaa anti-miR-20a kohdunkaulan syövän solulinjojen lentivirus-

lentivirusvektoreita kanssa miRNA jotka perustuivat miR-20a puitteissa rakennettiin jonka GeneChem Company (Shanghai, Kiina). Lyhyesti, kaksijuosteinen oligonukleotidi, joka koodaa anti-miRNA ja negatiivinen kontrolli saatettiin pariutumaan ja liitettiin linearisoituun eukaryoottisia Pfu-GW-009-vektoriin (GeneChem). Kaikki nämä vektorit varmistettiin sekvensoimalla. Rekombinaatiotapahtumia vektorit ja pakkauksen vektorit (pHelper 1,0 ja pHelper 2,0) (GeneChem) kotransfektoitiin 293T-soluihin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jossa Iipofectamine2000 (Invitrogen). Viljelmän supernatantit kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen, väkevöitiin. Kaikki lentivirusvektoreita ilmaistuna tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP), joka mahdollisti tittering ja mittaamalla niiden infektiotehokkuus infektoiduissa soluissa. Solut jaettiin kolmeen ryhmään sen mukaan tavoitteemme: a: ilman infektio viruksen (NC); b: infektio ohjaus viruksen (NC-LV); c: infektio anti-miR-20a virus (anti-miR-20a-LV).

Solubiologia funktio in vitro

Cellular elinkelpoisuuden määrityksessä.

mahdu solujen lisääntymistä mitattiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen, 1 x 10

4-solut ympättiin 96-kuoppaiselle mikrotiitterilevylle 24, 48, 72, ja 96 h, vastaavasti. Sitten soluja inkuboitiin 20 ui MTT: tä (5 mg /ml, pH = 7,4) 4 h 37 ° C: ssa ja 150 pl dimetyylisulfidia lisättiin liuottamaan kiteet 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Optinen tiheys (OD) mitattiin aallonpituudella 490 nm. Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa ja laskettiin käyttäen keskimääräisiä tuloksia, jota käytetään vetämään kasvukäyrät. Kasvun esto laskettiin seuraavasti: (AC-AT) /AC x 100% (AC = absorbanssi arvo NC ja AT = absorbanssi arvo koeryhmän).

Cell cycle määrityksessä. Solut kiinnitettiin 70% etanolilla 2 tuntia 4 ° C: ssa. PBS-pesun jälkeen solut käsiteltiin RNaasiA (50 ug /ml) ja värjättiin propidiumjodidilla (25 ug /ml) 30 min ajan 37 ° C: ssa. Näytteet analysoitiin käyttämällä virtaussytometriä ja jakelu solusyklin vaiheisiin määritettiin käyttämällä Modfit Software (BD Biosciences). Proliferatiivinen indeksi laskettiin prosenttiosuutena solujen S /G2 /M-vaiheessa.

Cell apoptoosimäärityksessä.

Solut kerättiin ja värjättiin anneksiini V-PE ja 7AAD käyttämällä anneksiini V-PE Kit (Beckman) mukaisesti valmistajan protokollan ja alistettiin virtaussytometria-analyysi.

invasiivinen ja migraatiokokeessa.

50000-soluja ympättiin transwell-insertin (Corning), jota oli täydennetty 1640 10% seerumia. Alapuoli siirtoaltaat täytettiin 1640 20% seerumia. Sillä sielunvaelluksesta määritystä, Matrige l (BD Biosciences) ympättiin transwell-insertin ja annettiin kasvaa konfluenteiksi ja 1 päivä. 50000 solua ympättiin siirtokuoppaan inserttejä täydennetty 1640 10% seerumia. Alapuoli siirtoaltaat täytettiin 1640 20% seerumia. 24 tunnin jälkeen, kalvot värjättiin hematoksyliini-eosiinilla, solut laskettiin alla fluoresenssimikroskoopilla. Tämä koe suoritettiin itsenäisesti kolme kertaa kaksoiskappaleet.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä.

noin 500 solua laitettiin tuoretta 6-kuoppalevyllä vielä 12 tuntia ja pidettiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS 2 viikkoa. Pesäkkeet kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla 20% metanolissa 15 minuutin ajan. Solut laskettiin alla fluoresenssimikroskoopilla. Tämä koe suoritettiin itsenäisesti kolme kertaa kaksoiskappaleet.

In vivo kasvaimen leviämisen

Kaksikymmentä neljä 6 viikon ikäisiä painavat 19-21 g immuunivajaisiin beige /nude /xid nu /nu-naaraita hiiriä ostettiin Guangxi Medical University, ja ylläpidetään patogeenivapaissa olosuhteissa säteilytettyjen chow. Meidän kokeessa, 2 x 10

6 solua eri ryhmien 0,2 ml: ssa PBS: ää injektoitiin ihonalaisesti tavaratilaan 24 hiirtä, joka johtaa kasvaimen muodostumista eläintä kohti. 0,2 ml Kloorin oli vatsaonteloon ruiskutettiin ottaa loisteputki kuvia anestesian jälkeen kun halkaisija kasvain oli 2 cm. Piirrä kasvukäyrän. Kasvaimen kasvu seurattiin kasvaimen tilavuuden, joka laskettiin kuvatulla: Volume (mm

3) = leveys

2 (mm

2) x pituus (mm) /2.

Western blot

Soluproteiinit valmistettiin käyttäen soluhajotuspuskurin (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl, 2 mg /ml aprotiniinia, 5 mg /ml leupeptiiniä, 2 mg /ml pepstatiinia, 1 mM DTT: tä, 0,1% SDS ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia). Yhtä suuret määrät proteiinia (50 ug) erotettiin 10% SDS-PAGE ja sen jälkeen siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (NY, USA) elektroforeesin avulla. Membraanit blokattiin 5% BSA TBST: ssä (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl ja 0,05% Tween 20) 1 h, ja sitten inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (Santa Cruz), yli yön 4 ° C: ssa ennen myöhemmin inkubointi toisen vasta-aineen (BD) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Proteiini visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi reagenssia (Santa Cruz).

lusiferaasianalyysissä

miR-20a sitovat kohdat 3 ’UTR ATG7 /TIMP2 tai mutantti 3’ UTR kloonattiin pGL3 toimittaja sivektorissa (GeneChem). Reportterigeenin määritys, 100 nM miR-20a matkivat tai ohjata miRNA oli ko-transfektoitiin 0,1 ug ja pGL3-3’UTR villityypin tai mutantti-plasmidi-DNA: t SiHa-soluissa 96-kuoppaisilla levyillä käyttäen Lipofectamine 2000: Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin 48 tunnin transfektion jälkeen kuten aiemmin on kuvattu.

tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot prosessoitiin käyttäen PASW Statistics 16. Tulokset esitettiin keskiarvo ± SEM. käyttäen t testit 2-ryhmä vertailuja. Vaikka tulokset eivät näy normaalijakaumaa, päätimme analysoida dataa ei-parametriset menetelmät. (U-testi kahden ryhmän välillä ja Kruskal-Wallisin H testi kolme tai useampia ryhmiä).

P

arvo alle 0,05 katsotaan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

MiR-20a säädellään ylöspäin kohdunkaulan syövän

Käyttäen qRT- PCR-menetelmällä, miR-20a tasot havaittiin 100 kohdunkaulan syövän kudosten ja 120 normaali kohdunkaulan kudoksissa, sekä kohdunkaulan solulinjat. Niistä 100 potilaasta, joilla kohdunkaulansyöpä, tiedot, jotka ilmoitetaan kuvassa. 1A esittää miR-20a on ehdottomasti säädellään ylöspäin heikentynyt kudoksen mediaani 6,92, mikä viittaa siihen, että kasvu miR-20a oli yleinen tapahtuma kohdunkaulan syöpä. Potilaat, joilla sääteli ilmentyminen miR-20a taipumus olla LNM (

P

= 0,001) kuten kuvassa. 1B, lisäsivät kasvainten koot (

P

= 0,013, U-testi), pitkälle (

P

= 0,004, Kruskal-Wallisin H-testi), ja kehittyneet histologinen arvosana (

P

= 0,027, U-testi) kohdunkaulan syövän. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-20a saattaa olla ratkaiseva merkitys kohdunkaulan syövän etäpesäkkeiden ja etenemiseen.

V: MiR-20a mitattiin qRT-PCR. Tiedot esitettiin log10 kertamuutosta. Mann-Whitney koe suoritettiin tutkia eroa normaalin valvonnan ja kohdunkaulan syövän potilaille, Kruskal-Wallisin H testiä käytettiin määrittämään niiden erot vaiheet I-IV kohdunkaulan syövän potilaille. B: Vertasimme ilmaus potilaiden välillä, joilla oli lymp etäpesäke tai samassa vaiheessa. C: Ilmaisu tasot miR-20a havaittiin qRT-PCR: kohdunkaulan syövän solulinjoissa (SiHa-, HCC94, C33A ja CaSki).

P

-arvo 0,05 katsottiin merkitseväksi.

Lisäksi ekspressiotasot miR-20a havaittiin qRT-PCR: kohdunkaulan syövän solulinjoissa (SiHa-, HCC94, C33A ja CaSki) (Fig. 1 C), joka oli korkein SiHa solulinjassa.

miR-20a helpottaa Kohdunkaulan syövän kasvua ja metastaasin in vitro

panevat merkille korrelaatio sääteli miR-20a tasoa ja kohdunkaulan syövän etenemiseen, tutkimme vaikutus miR-20a kasvuun, muuttoliike ja hyökkäys kyvyt kohdunkaulasyövän solulinjoissa. SiHa solulinja infektoitiin joko anti-miR-20a tai ohjaus lentivirus ja luoda vakaa anti-miR-20a SiHa solulinjassa (kuvio. 2A). Verrattuna ilmaus kontrolliryhmän, miR-20a merkittävästi alas-säädellä SiHa solulinjassa infektion jälkeen anti-miR-20a-LV (Fig. 2B). Solut jaettiin kolmeen ryhmään sen mukaan tavoitteemme: a: ilman infektio viruksen (NC); b: infektio ohjaus viruksen (NC-LV); c: infektio anti-miR-20a-virus (anti-miR-20a-LV).

: GFP merkinnät virtaussytometria analyysi osoitti, että prosenttia GFP-positiivisten solut olivat noin 97% vakaa lentivirus-tartunnan SiHa solulinjassa. B: MiR-20a oli alempi ilmaistu vakaa anti-miR-20a SiHa solulinja taas ilmentymistaso miR-20a oli edelleen erittäin korkea infektoiduissa soluissa negatiivinen kontrolli.

Seuraavaksi solujen kasvua ominaisuudet, solusyklin, klooni muodostumista, solujen vaeltamiseen, tarttuvuus, soluinvaasiota kokeet suoritettiin. Kasvukäyrät osoitti, että infektio anti-miR-20a kohdunkaulan syövän solulinja kasvu hidastui (kuvio. 3A). Virtaussytometria osoitti, että keskimäärin G1 ajan solujen anti-miR-20a-LV-ryhmä on 69,6%, kun taas vastaava kontrolliryhmässä oli 55%, se on vähentää leviämisen aikana solujen (Fig. 3B). Apoptotic nostettiin ja saavutti eroja tilastollisen merkittävyyden kussakin ryhmässä (

P

0,001) (Kuva. 3C). Migration, tarttuvuus kyky invaasion kohdunkaulan syövän solujen havaittiin myös, miR-20a voisi helpottaa etäpesäke (

P

0,01) (Fig. 3d ja 3E). Pesäkkeiden muodostuminen määrä kahteen ryhmään, ei ollut merkitsevää eroa (

P

0,05) (Fig. 3F). Kuten odotettua, alas-ilmentyminen miR-20a huomattavasti tukahdutetaan solujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota kykyjä.

V: Down-säännelty miR-20a esti merkittävästi proliferaatiota in SiHa soluissa MTT: llä. B: Cell cycle määritetty PI värjäys virtaussytometrialla. C: Cell apoptoosin havaita anneksiini V-PE yhdistetty merkintöjä virtaussytometrialla, Apoptotic nostettiin ja saavutti eroja tilastollisen merkittävyyden kussakin ryhmässä. D, E edustaa tulokset soluinvaasiota ja siirtymät kalvon kanssa tai ilman matrigeelin, joka osoitti, että anti-miR-20a vähensi solujen vaeltamiseen ja invaasion kyky. F: Siirtokunta yhdisteiden muodostumista näistä kolmesta ryhmästä ei ollut merkittävää eroa.

MiR-20a Lisäykset kasvaimen kasvua in vivo

Perustuen havaittuun pienenee muuttavien, invasiivisia ja proliferatiivinen käyttäytymistä SiHa- infektoiduissa soluissa anti-miR-20a-LV, tutkimme seuraavaksi roolia miR-20a in vivo. Me ihon alle ympätty paljaisiin hiiriin yhtä paljon (1 x 10

6 solua per hiiri) ja SiHa solujen pakotettu ilmentyminen miR-20a tai NC, Kasvaimen esiintymistiheys arvioitiin joka viides päivä, ja kasvaimet esiintyi kaikissa hiirissä. Tulokset osoittivat, että lentivirusta välittämä anti-miR-20a voi merkittävästi tukahduttaa kasvun kohdunkaulasyövän nude-hiirissä (Fig. 4).

V: Ihmisen kohdunkaulan syöpä malli subkutaanisesti nude-hiiriin perustettiin. Lopussa kokeen, kasvaintilavuudet mitattiin kiinnittää kasvukäyrän eri ryhmiin. Ihon alle tuumorin mallin ulottuvuus kasvaimen koeryhmässä on pienempi kuin kontrolliryhmässä. Oli merkitsevä ero joukossa kunkin ryhmän (

P

0,01). B: Kuvia kasvaimia kussakin ryhmässä.

MiR-20a Suoraan tavoitteet ja Estää ATG7 ja TIMP2

ymmärtää, miten miR-20a helpottaa kohdunkaulan syövän kasvua ja etäpesäkkeiden, käytimme kolme algoritmit (Targetscan, Pictar ja Miranda) auttaa tunnistamaan miR-20a tavoitteet ihmisen kohdunkaulan syöpiä. Näistä kohdegeenien jotka ennustivat kaikki kolme algoritmeja (Kuva. 5A), autophagy liittyvä proteiini 7 (ATG7) ja kudosten estäjät metalloproteinaasi 2 (TIMP2) herätti huomiota heti kun ne ovat sekaantuneet kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeitä. Kloonasimme ATG7 ja TIMP2 3′-UTR osaksi lusiferaasireportteri- vektori. Lusiferaasianalyysi paljasti, että miR-20a suoraan sidottu ATG7 ja TIMP2 3′-UTR: n, ja jolla se vähensi huomattavasti lusiferaasiaktiivisuudet (Fig. 5B). Kuitenkin mutaatio oletetun miR-20a sivustoja 3′-UTR ATG7 ja TIMP2 kumotaan lusiferaasin vastata miR-20a. Suoraan vaikutuksen arvioimiseksi miR-20a ATG7 ja TIMP2 ilmaisun, suoritimme western blot-analyysi. Kuten nähdään Fig. 5C, knockdovvn miR-20a kautta infektio anti-miR-20a-LV, SiHa- soluissa lisäsi ATG7 ja TIMP2 proteiinin tasot. Yhdessä nämä tulokset osoittavat ATG7 ja TIMP2 ovat suoria alavirtaan tavoitteita miR-20a SiHa- soluissa. Edellä esitetyt tulokset sai meidät tutkimaan, miR-20a estää kohdunkaulan syövän kasvua ja etäpesäkkeiden kautta tukahduttaa ATG7 ja TIMP2 ilme.

V: Arvioitu välillisiä pariutuminen kohdealueen ja miRNA mukaan Targetscan, Pictar ja Miranda. B: Lusiferaasiaktiivisuutta näkyy merkittävä lasku seuraava miR-20a täytäntöön ilmentymisen verrattuna negatiivinen kontrolliryhmä. C: Western blot analyysit osoittivat knockdovvn miR-20a kautta infektio anti-miR-20a-LV, SiHa- soluissa lisäsi ATG7 ja TIMP2 proteiinin tasot.

Keskustelu

ryhmä on keskittynyt molekyylitason mekanismi kohdunkaulan okasolusyöpä kehitys viime vuosina, erityisesti antautumalla tutkimusta kasvun ja etäpesäkkeiden. Imusolmuke etäpesäke (LNM) on kaikkein tärkeä ennustetekijä potilaista vaiheen IB tai II A, viiden vuoden eloonjäämisaste potilaiden laskee dramaattisesti noin 80-95%: lla ilman imusolmukemetastaaseja noin 50-65% vuonna potilaille, joilla on positiivinen imusolmukkeet. Siksi, odotimme, että vapauttaminen MikroRNA voivat helpottaa kehittyneiden etenemistä kohdunkaulan okasolusyöpä. Zhang J, et al valottavat negatiivisen palautteen säätelyyn NF-KB /miR-130a /TNF-α /NF-KB kohdunkaulan syövän ja voi antaa käsityksen syövän synnyn kohdunkaulasyövän [5]. Wen SY, et al havaitsivat, että miR-506 ilmentyminen alassäädetty noin 80% kohdunkaulan syövän tutkitut näytteet ja korreloi käänteisesti ilmentymisen Ki-67 [6]. Niistä onkogeeniset miRNA, yksi parhaiten tunnettu on miR-17-92, polykistronisen miRNA klusteri, joka on nimetty OncomiR-1 [7]. Edeltäjä transkripti sisältää kuusi tandem kantasilmukan Hiusneularakenteet että lopulta saadaan kuusi kypsä miRNA: miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 ja miR-92-1 [8]. Erityisesti, miR-17-92 sijaitsee 13q31.3, alue monistettiin Monien hematopoieettisten maligniteettien ja kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien diffuusi B-solulymfooma, follikulaariset lymfoomat, Burkittin lymfoomat, ja keuhkokarsinooma [9].

Viimeaikaiset havainnot osoittavat, että nämä miRNA ovat integroituja komponentteja molekyylitasolla reittejä, jotka säätelevät kasvainten kehittymiseen ja kasvaimen ylläpito, vaikutukset miR-20a yli-ilmentymisen on tarkasteltu useita eläinmalleissa, ihmisen syöpien, ja soluviljelmissä sen kykyä säädellä useita solun prosesseja, jotka suosivat pahanlaatuisiksi [10-11]. Nämä tutkimukset kokonaisuutena paljasti, että miR-20a toiminnot pleiotropically aikana sekä normaalin kehityksen ja pahanlaatuisiksi edistämään proliferaatiota, estävän erilaistuminen, lisätä angiogeneesi, ja ylläpitää solujen eloonjäämistä. Kuitenkin mahdollinen tehtävä tämä mikroRNA ihmisen kohdunkaulan okasolusyöpä eteneminen on muutamia raportteja. Tässä tutkimuksessa, olemme kiinnostuneita mahdollista roolia miR-20a pahanlaatuinen etenemistä SiHa soluja.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että miR-20a oli usein säädelty vahvistavasti kudosnäytteet. Niinpä oletetaan, että miR-20a voi olla uusi kasvain onkogeeni miRNA ja sen sääntelyn purkaminen voi liittyä kehittynyt etenemistä ihmisen syövän. Seuraavaksi tutkimme funktio miR-20a SiHa- soluissa. Luodaan vakaa anti-miR-20a kohdunkaulan syövän solulinjoissa lentivirus ja edeltävät solun kasvuun ominaisuuksia, solusykliä, klooni muodostumista, solujen vaeltamiseen, tarttuvuus, ja invaasio kokeita. Malli alas-ilmaisi miR-20a kohdunkaulan syövän nude-hiirissä perustettiin myös joka tutkia mahdollisuuksia anti-miR-20a in vivo. Sitten huomasimme, että esti miR-20a esti kasvaimen etenemistä moduloimalla solusyklin, jakautumista, apoptoosia ja hyökkäystä. Kasvukäyrät osoitti, että infektio anti-miR-20a kohdunkaulan syövän solulinjan kasvu hidastui. Malli alas-ilmaisi miR-20a kohdunkaulan syövän nude-hiirissä on perustettu, tulokset osoittivat, että lentivirusta välittämä anti-miR-20a voi merkittävästi tukahduttaa kasvun kohdunkaulasyövän nude-hiirissä.

entisestään tunnettu siitä, ATG7 ja TIMP2 toiminnallisina kohteina miR-20a lusiferaasireportterigeenianalyysissä ja western blot -analyysillä, vastaavasti. Autophagy toimittaa sytoplasminen komponenttien lysosomeihin hajoamista ja kierrätyksen hajoamistuotteita, kuten aminohappoja, hiilihydraatteja ja lipidejä, joita käytettiin syntetisoimaan uusia proteiineja ja organellit tai metaboliittien tuottamaan energiaa [12]. Autophagy on läheisesti liittyy eukaryoottisten solukuolemaan ja apoptoosiin. Itse asiassa joissakin tapauksissa samat proteiinit ohjata sekä autophagy ja apoptoosin. Apoptoottista signalointi voi säädellä autophagy ja kääntäen autophagy voi säädellä apoptoosia. On ehdotettu, että ”autophagic solukuolema” on toinen tyyppi ”aktiivinen” ohjelmoidun kuoleman [13]. ATG7 on yksi master säätelijöinä autophagy prosessin, joka vastaa kaksi suurta reaktioita mukana autophagosome muodostumiseen ja rakkulan etenemisen [14]. Lisäksi on jo muodostettu, että Atg7 – /- hiirten kuolee yhden päivän syntymästä ja osoittavat vähensi poikasten koon vuoksi heikentynyt autophagy koulutusjakson [8]. Yoshihiro Inami, et al havaitsivat, että menetys Atg7 hiiren maksassa aiheuttaa maksasoluadenooman [15]. Avulla vahvistuksen tai menetä molekyylejä, olemme osoittaneet, että miR-20a oli kykenevät moduloimaan autophagy vaihtelevassa endogeenisen ATG7 ekspressiotasot, ja tämä vaikutus oli välittämä kautta miR-20a konsensussekvenssi sisälsi 3′-UTR geenin .

prosessin aikana kasvaimen invaasio, olennaiset vaiheet käsittävät hajoamista tyvikalvoissa ja remontin soluväliaineen (ECM) proteolyyttiset entsyymit, kuten matrix (MMP) asetuksen kudosten metalloproteinaasien estäjiä (TIMP ). MMP, erityisesti MMP-2 ja MMP-9, ovat keskeisiä entsyymejä tiedetään hajoavan komponentteja ympäröivän ECM aikana syövän eteneminen ja metastaasit [16]. Laskennallinen ennustaminen miRNAtarget sivustoja ehdotti TIMP2 ehkä kohteena miR-20a, joka varmistettiin western blot ja lusiferaasianalyysissä myös.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että miR-20a ilmentyminen voi olla liittyvä jossa pahanlaatuinen prosessi kohdunkaulan syövän, erityisesti invaasiota ja etäpesäkkeiden kohdentamalla ATG7 ja TIMP2. Laajamittainen ja pitkäaikaisen seurannan tutkimuksia tarvitaan vahvistamaan merkitys miR-20a kohdunkaulan syöpä. MiRNA voi olla houkutteleva kohde terapeuttiseen interventioon.

tukeminen Information

S1 Kuva. Vector kartta.

V: lentivirustartunnat Vector kartta; B pGL3 promoottorivektorin kartalla.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0120905.s001

(DOC)

S2 Kuva. Lentivirukselle Vector sekvensointi tuloksia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0120905.s002

(DOC) B S1 Dataset. Kohdegeenin sekvenssejä kemiallisen synteesin avulla.

Molemmin puolin koodaavat sekvenssit olivat Xbal-restriktioentsyymin leikkaus sivustoja, jotka on merkitty alueet olivat binging sivustoja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0120905.s003

(DOC)

S1 Taulukko. Välinen assosiaatio ilmaus miR-20a kanssa kliinis-potilailla, joilla on kohdunkaulan syöpä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0120905.s004

(DOC)

S2 Taulukko. OD-arvo infektion jälkeen (MTT).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0120905.s005

(DOC)

S3 Taulukko. Esto kasvun SiHa nude-hiirissä anti-miR-20a-LV.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0120905.s006

(DOC)