Krooninen sairaus

tiivistelmä

Focal tarttuvuus asentaminen ja purkaminen ovat välttämättömiä solujen vaeltamiseen ja syövän invaasio, mutta niiden yksityiskohtainen molekyylitason mekanismeja säätelemällä näitä prosesseja on vielä selvittämättä. Fosfatidyyli fosfaatti kinaasi tyypin Iγ (PIPKIγ) sitoutuu Talin ja tarvitaan fokaalisen adheesion muodostumista EGF-stimuloidut solut, mutta sen rooli säätelyssä polttovälin tarttuvuus dynamiikkaa ja syövän invaasio ymmärretään huonosti. Osoitamme tässä, että yliekspressio PIPKIγ edistetään fokaalisen adheesion muodostumista, kun taas solut, jotka ilmentävät joko PIPKIγ

K188,200R tai PIPKIγ

D316K, kaksi kinaasi-kuollutta mutantteja, oli paljon vähemmän paikallisia tarttumista kuin ilmentävät WT PIPKIγ CHO-K1 solut ja HCT116 paksusuolen syöpäsoluja. Lisäksi yliekspressio PIPKIγ, mutta ei PIPKIγ

K188,200R, johti lisääntymiseen sekä polttovälin tarttuvuus kokoamista ja purkamista hinnat. Ehtyminen PIPKIγ käyttämällä shRNA esti voimakkaasti muodostumiseen paikallisessa tarttumisessa in HCT116-soluissa. Yliekspressio PIPKIγ

K188,200R tai ehtyminen PIPKIγ vähensi vahvuus HCT116-soluadheesion fibronektiinireseptorin ja esti invasiivisia kapasiteetin HCT116-solujen. PIPKIγ ehtyminen pienentää PIP

2 tasoilla -40% valvonta- ja PIP

3 huomaamaton tasoa, ja se esti vinkuliini paikallistamiseksi keskeiselle kiinnikkeistä. Yhdessä PIPKIγ säätelee positiivisesti polttovälin tarttuvuus dynamiikkaa ja syövän invaasio, luultavasti kautta PIP

2-välitteisen vinkuliini aktivoitumisen.

Citation: Wu Z, Li X, Sunkara M, Spearman H, Morris AJ, Huang C (2011) PIPKIγ säätelee Focal Adhesion Dynamics ja Colon Cancer Cell Invasion. PLoS ONE 6 (9): e24775. doi: 10,1371 /journal.pone.0024775

Editor: Maddy Parsons, Kings College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 17 elokuu 2011; Julkaistu: 12 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat Markey Cancer Centerin Käynnistä-rahastolle (University of Kentucky) (Cai Huang) ja osittain Migration Consortium avustus (NIH GM64346) (Ken Jacobson, University of North Carolina-Chapel Hill). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Focal kiinnikkeistä (FA, jota kutsutaan myös soluväliainekonstruktissa kiinnikkeistä) ovat tietyn tyyppisiä suuria makromolekyyliyhdisteiden kokoonpanoja vatsanpuoleiselle solujen pinnalla, toimii sekä mekaanisten koneiden ja sääntelyn signalointi napojen [1], [2]. Ajallinen ja paikallinen sääntely fokaalisen adheesion kokoonpano /purkaminen tarvitaan solujen vaeltamiseen [3]. Aikana solujen vaeltamiseen, orastava paikallisia tarttumista (kutsutaan myös polttovälin kompleksit) on muodostettu vakauttaa lamellipodioihin edessä solujen samalla kun paikallisessa tarttumisessa liuotetaan at takareunat solujen [4], [5].

Focal tarttuvuus asentaminen ja purkaminen ovat myös osallisina syövän invaasio, edellytys etäpesäke. DRR (Down-säätelemä munuaissyövän) kumppaniaan aktiini ja mikrotubuleiksi ja stimuloi gliooman invaasio edistämällä fokaalisen adheesion purkaminen [6]. Aktiini ristisidoksia proteiini filamiini tukahduttaa polttovälin tarttuvuus purkaminen ja rinta syöpäsoluinvaasiota [7]. Rho /Rock signalointi edistää kasvainsolun muuttoliikettä ja invaasiota säätelemällä polttovälin tarttuvuus dynamics kautta caveolin-1 fosforylaatio [8]. FAK edistää myös polttovälin tarttuvuus purkaminen ja syövän invaasio [9], [10], [11]. Fokaalisen adheesion dynamiikka ja signalointireittejä, jotka säätelevät tätä prosessia voitaisiin näin ollen houkutteleva kohde syövän hoidossa.

Monet molekyylien on osoitettu säätelevän fokaalisen adheesion dynamiikkaa. FAK säätelee fokaalisen adheesion vaihtuvuus [9], [12], luultavasti kautta Dynamin ja mikrotubulia riippuvaisen reitin [13]. Paksilliini, polttoväli tarttuvuus sovitin, myös moduloi polttovälin tarttuvuus dynamiikan JNK ja PAK-välitteisen fosforylaation [14], [15]. Talin aktivoi integriinit ja käynnistää fokaalisen adheesion muodostumisen [16], [17], [18], kun taas pilkkominen Talin mukaan calpain välittää fokaalisen adheesion purkamista [19]. Calpain katkaisee myös FAK ja paksilliini muuntamaan fokaalisen adheesion dynamiikka [20], [21]. Olemme osoittaneet, että Smurf1-välitteinen ubikitinaation ja taliini pään domeenin, joka on yksi kahdesta pilkkoutumistuotteet, on tärkeä rooli fokaalisen adheesion purkaminen ja solumigraatio [22]. ACF7, mikroputkeen ja rihmamaisia ​​aktiini sitovan proteiinin, säätelee fokaalisen adheesion kokoonpano /purkaminen kautta ATPaasiaktiivisuus [23]. Kuitenkin mekanismeista, jotka säätelevät fokaalisen adheesion kokoonpano /purku ei ole täysin ymmärretty.

Fosfatidyyli fosfaatti-kinaasi tyypin I y (PIPKIγ) on entsyymi, joka katalysoi ATP-riippuvainen fosforylaatio fosfatidyyli 4-fosfaatin (PI (4 ) P) tuottaa PI (4,5) P

2, joka säätelee erilaisia ​​biologisia prosesseja, kuten polttoväli kiinnikkeiden muodostumisen [24]. PIPKIγ on hyvin konservoitunut kinaasin katalyyttinen domeeni keskialueella [25]. Katalyyttisen domeenin sisällä, on alitoimialue kutsutaan aktivointi silmukka, joka määrittää sivuston fosforylaatio inositolin rengas substraatin. PIPKIγ voimakkaasti vuorovaikutuksessa Talin ja kilpailee Talin sitoutumisen kanssa β integriinin hännän [26], [27]. Se on paikallistaa vyöliitos epiteelisoluissa [28], [29]. On raportoitu, että PIPKIγ tarvitaan fokaalisen adheesion muodostumista vaeltavien solujen [30]. Kuitenkin tarkka roolit lipidikinaasiaktiivisuutta toimintaa PIPKIγ vuonna fokaalisen adheesion dynamiikkaa ei ole määritelty.

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet vaatimus lipidikinaasiaktiivisuutta aktiivisuutta PIPKIγ vuonna polttovälin tarttuvuus dynamiikan ja paksusuolen syövän invaasio . Tuloksemme tunnistaa keskeinen rooli PIPKIγ vuonna fokaalisen adheesion kokoonpano /purkaminen ja syövän invaasio.

Tulokset

PIPKIγ edistää fokaalisen adheesion muodostumista

tutkitaan mahdollista roolia PIPKIγ vuonna fokaalisen adheesion muodostumista, CHO-K1-solut transfektoitiin EGFP-PIPKIγ tai EGFP vektori, vastaavasti. Solut uudelleen maljattiin fibronektiinin, kiinnitettiin paraformaldehydillä, niitä inkuboitiin anti-paksilliini monoklonaalinen vasta-aine, ja sitten värjättiin Dylight 549 konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG. Paikallisessa tarttumisessa ovat rivissä reunoilla EGFP vektori-transfektoituja soluja, joilla on vain vähän paikallisessa tarttumisessa keskuksissa solujen, kun taas PIPKIγ ilmaisu dramaattisesti stimuloi fokaalisen adheesion muodostumista keskuksissa solujen (Fig. 1A). Yli-ilmentyminen PIPKIγ stimuloi kasvua fokaalisen adheesion numeroita (Fig. 1 B) ja kasvu oli pääasiassa myötävaikuttanut pieniä paikallisia tarttumista ( 3 um

2) (Fig. 1 C). Stimulaatio fokaalisen adheesion muodostumista PIPKIγ perustuu sen vuorovaikutukseen Talin, koska PIPKIγ

W647F, mutantti, joka on puutteellinen vuorovaikutus Talin, ei pystynyt edistämään fokaalisen adheesion muodostumista (Kuva. 1 A, B, C).

(A) TIRF kuvia CHO-K1 soluja, jotka ilmentävät EGFP, EGFP-PIPKIγ WT tai EGFP-PIPKIγ

W647F. -Solut transfektoitiin lyhytaikaisesti pEGFP-vektori, -PIPKIγ WT tai -PIPKIγ

W647F, ja värjätään sitten paksilliini. Mittakaava, 20 um. (B) ilmentäminen PIPKIγ muttei PIPKIγ

W647F aiheutti kasvu fokaalisen adheesion määrä (n = 15, virhepalkin = keskiarvo ± sem; Vector

vs

WT, P 0,001; WT

vs

W647F, P 0,001; Vector

vs

W647F, P 0,05). (C) alue jakautuminen paikallisessa tarttumisessa soluissa EGFP: tä ilmentämään, EGFP-PIPKIγ WT tai EGFP-PIPKIγ

W647F.

PIPKIγ kinaasin aktiivisuutta tarvitaan stimulaatio fokaalisen adheesion muodostumisen

PI (4,5) P

2 sitoo Talin ja vahvistaa vuorovaikutusta Talin ja β integriinin häntää, stimuloiva integriini klustereiden [31]. PI (4,5) P

2 sitoo myös vinkuliini ja unmasks aktiini ja Talin sitoutumiskohdista vinkuliini edistäen fokaalisen adheesion muodostumisen [32]. Siksi PIPKIγ stimuloimaa PI (4,5) P

2 synteesi voisi olla olennaista edistää fokaalisen adheesion muodostumista. Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme mutatoitu kaksi lysiinijäännöstä, K188 ja K200, arginiini jäännökset ATP-sitoutumiskohdan ja PIPKIγ. Mutantti PIPKIγ

K188,200R ja WT puhdistettiin CHO-K1-soluissa ja kinaasi vaikutukset tutkittiin

in vitro

käyttämällä massaspektrometriaa kvantifioimiseksi tuotantoon PI (4,5) P

2 PI (4) P. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, mutaatio K188 ja K200 vähennetään kinaasiaktiivisuutta 95%. EGFP-tagged mutantti PIPKIγ

K188,200R ja WT PIPKIγ oli stabiilisti ilmaistu CHO-K1-soluissa ja niiden vaikutukset fokaalisen adheesion muodostumista tutkittiin jälkeen paksilliini värjäystä. Solut, jotka ilmentävät stabiilisti WT PIPKIγ muodostetaan paikallisia tarttumista reunoilla ja keskuksissa solujen, kun taas solut, jotka ilmentävät PIPKIγ

K188,200R, samanlainen vanhempien soluihin, hallussaan pieni paikallisessa tarttumisessa, joista suurin osa oli noin reunojen soluja, ja oli viasta leviää (Fig. 2B). Kvantitatiivinen analyysi osoitti, että PIPKIγ kasvoi paikallisessa tarttumisessa yli 2-kertainen, kun taas PIPKIγ

K188,200R ei merkittävästi edistää fokaalisen adheesion muodostumista (Kuva. 2C vanhempien vs PIPKIγ, P 0,001; vanhempien vs PIPKIγ

K188,200R, P 0,05). (D) Alue jakautuminen paikallisessa tarttumisessa että vanhempien soluissa ja soluissa, jotka ilmentävät PIPKIγ ja PIPKIγ

K188,200R.

varmistamiseksi edelleen vaatimus PIPKIγ toiminnan fokaalisen adheesion muodostumista, testasimme kapasiteettia toisen kinaasin kuolleiden mutantti, PIPKIγ

D316K [33], edistää fokaalisen adheesion muodostumista, kuten on kuvattu edellä. Kuten on esitetty kuviossa. S1, keskimääräinen fokaalisen adheesion määrä (per solu) soluissa, jotka ilmentävät PIPKIγ

D316K oli noin 45, joka on suunnilleen sama kuin soluissa, jotka ilmentävät EGFP vektorin (Fig. 1). Paikallisiin tarttumisiin soluissa, jotka ilmentävät PIPKIγ

D316K kertynyt reunoilla solujen harvoja paikallisessa tarttumisessa keskellä soluihin. Tämä tulos vahvistaa keskeistä roolia PIPKIγ toiminnan fokaalisen adheesion muodostumista.

aktiivisuus PIPKIγ on olennainen sen edistämiseksi fokaalisen adheesion dynamiikka

tutkia PIPKIγ lipidikinaasiaktiivisuutta aktiivisuutta tarvitaan fokaalisen adheesion dynamiikka, CHO-K1-soluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti EGFP-PIPKIγ tai -PIPKIγ

K188,200R transfektoitiin mDsRed-paksilliinin ja sitten maljattiin MatTek ruokia (lasi peitelasi alareunassa) esipäällystetty fibronektiinin kanssa (5 ug /ml a) ja kasvatettiin 3 tunnin ajan. TIRF kuvia mDsRed-paksilliini otettiin käyttäen Nikon TIRF mikroskoopilla ja lämpötila pidettiin 37 ° C: ssa käyttäen INU-TIZ-F1 mikroskooppi inkubointijärjestelmästä (Tokai Hit). Kuvat tallennettiin 1 minuutin välein 120 minuutin ajan. Focal tarttuvuus asentaminen ja purkaminen nopeusvakiot laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [22]. FA asentaminen ja purkaminen nopeusvakioista soluissa, jotka ilmentävät PIPKIγ

K188,200R olivat 0,083 ± 0,014 ja 0,072 ± 0,010 min

-1, vastaavasti, jotka ovat samanlaisia ​​kuin normaaleissa CHO-K1-soluissa, jotka raportoimme aikaisemmin [ ,,,0],22], kun taas FA kokoaminen ja purkaminen nopeusvakioista olivat 0.190 ± 0,019 ja 0,136 ± 0,014 min

-1, vastaavasti, soluissa, jotka ilmentävät WT PIPKIγ (Fig. 3). Tämä tulos osoittaa, että inositoli lipidi kinaasiaktiivisuutta PIPKIγ tarvitaan sen stimulaatio fokaalisen adheesion kokoamista ja purkamista.

(A) CHO-K1-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti PIPKIγ tai PIPKIγ

K188,200R transfektoitiin ohimenevästi jossa mDsRed-paksilliini. Solut maljattiin fibronektiinin ja dynamiikkaa paksilliini analysoitiin käyttäen nopeutus TIRF mikroskoopilla. Arrowheads viittaavat dynaaminen (ylempi paneeli) ja stabiili (alempi paneeli) polttovälin kiinnikkeistä. (B) Peittokuva 0 ja 24 min ”A”. (C) kvantifiointi polttopisteen tarttuvuus kokoaminen ja purkaminen nopeusvakioista soluissa, jotka ilmentävät PIPKIγ tai PIPKIγ

K188,200R. Kvantitatiivinen ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m. 50 paikallisessa tarttumisessa 10 solua. Assembly, WT vs K188,200R, P 0,00005; purkaminen, p 0,005.

Olennainen rooli PIPKIγ vuonna fokaalisen adheesion muodostumista koolonkarsinoomasoluissa

Focal kiinnikkeistä ovat sekaantuneet säätelemään syövän invaasio, kun taas rooli paikallisessa tarttumisessa paksusuolen syöpäsoluissa ei ole hyvin määritelty. Sen määrittämiseksi, aktiivisuuden PIPKIγ vaikuttaa fokaalisen adheesion muodostumista koolonkarsinoomasoluissa, HCT116-solut, jotka ilmentävät stabiilisti EGFP-PIPKIγ tai -PIPKIγ

K188,200R maljattiin fibronektiiniä ja värjättiin paksilliini. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, useimmat paikalliset tarttumiset sijaitsivat reuna-alueelle, ja HCT116-solut ilmentävät PIPKIγ

K188,200R oli paljon vähemmän paikallisia tarttumista kuin ilmentävät WT entsyymiä. Keskimääräinen fokaalisen adheesion määrä soluissa, jotka ilmentävät WT PIPKIγ oli 22,5 /solu, kun taas, että solut, jotka ilmentävät PIPKIγ

K188,200R oli 11,5 /solu, jotka molemmat oli vähemmän kuin mitä havaittiin CHO-K1-soluissa (kuvio. 4B) . Lisäksi PIPKIγ

K188,200R oli enemmän vaikutusta pienempi paikallisia tarttumista kuin suuremmat (Fig. 4C).

(A) TIRF kuvia CHO-K1 soluja, jotka ilmentävät PIPKIγ tai PIPKIγ

K188,200R. Solut, jotka stabiilisti ilmentävät EGFP-PIPKIγ WT tai -PIPKIγ

K188, 200R värjättiin paksilliini. Mittakaava, 20 um. (B) PIPKIγ

K188, 200R ei stimuloimaan lisääntymiseen fokaalisen adheesion määrä (n = 10, virhepalkin = keskiarvo ± SEM; pariksi t-testi, P 0,005). (C) alue jakautuminen paikallisessa tarttumisessa soluissa, jotka ilmentävät PIPKIγ ja PIPKIγ

K188,200R.

Sen testaamiseksi, onko PIPKIγ on välttämätöntä fokaalisen adheesion muodostumista HCT116-soluissa, HCT116-soluja infektoitiin yhdistelmä- Lentiviruksiin että ilmaista PIPKIγ shRNA tai shRNA ohjaus ja valittiin kanssa puromysiini. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, ilmaus PIPKIγ shRNA johti dramaattiseen vähenemiseen endogeeninen PIPKIγ tasoa HCT116-solujen. Sitten solut maljattiin fibronektiinin ja värjättiin paksilliini. Yllättäen PIPKIγ knockdown lähes lakkautetaan fokaalisen adheesion muodostumista HCT116-soluissa (kuvio. 5B). PIPKIγ ehtyminen pienentää polttovälin tarttuvuus määrää noin 74% (kuvio. 5C). Eroaa PIPKIγ

K188,200R, PIPKIγ shRNA oli enemmän vaikutusta suurempi paikallisia tarttumista kuin pienemmät (kuvio. 5D). Nämä tulokset osoittavat keskeinen rooli PIPKIγ vuonna fokaalisen adheesion muodostumista HCT116 koolonkarsinoomasoluissa. Tämä dramaattinen vaikutus PIPKIγ pudotus ei esiinny MDA-MB-231 ihmisen rintasyöpäsoluilla, jossa PIPKIγ pudotus vain osittain inhiboi fokaalisen adheesion muodostumista (tietoa ei esitetty).

(A) ilmentyminen PIPKIγ soluissa stabiilisti ilmentävät shRNA ohjaus ja PIPKIγ shRNA. (B) TIRF kuvia HCT116-solut, jotka ilmentävät stabiilisti ohjaus ja PIPKIγ shRNA. Solut infektoitiin lentiviruksen jotka kantavat ohjaus- tai PIPKIγ shRNA, valitaan puromysiini, ja värjättiin paksilliini. Mittakaava, 20 um. (C) PIPKIγ ehtyminen estivät fokaalisen adheesion muodostumista HCT116-soluissa. (N = 10, virhepalkin = keskiarvo ± sem; pariksi t-testi, P 0,0001) (D) Alue jakautuminen paikallisessa tarttumisessa soluissa, jotka ilmentävät ohjaus ja PIPKIγ shRNA.

PIPKIγ positiivisesti säätelee tarttuvuus vahvuus koolonkarsinoomasoluissa fibronektiiniin

tutkia aktiivisuuden PIPKIγ säätelee soluadheesion voimaa fibronektiinin, HCT116-solut, jotka ilmentävät stabiilisti EGFP-PIPKIγ tai -PIPKIγ

K188,200R värjättiin kalseiini-AM ja ympättiin 96-kuoppalevylle, joka oli etukäteen päällystetty erilaisilla pitoisuuksilla fibronektiinin. Kalseiinipitoiset fluoresenssi luettiin, ja sitten levy käännettiin ylösalaisin ja sentrifugoitiin 150 x g: ssä 5 min. Kalseiinipitoiset fluoresenssi luettiin uudelleen. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, solun tartuntalujuus ero ilmentävien solujen PIPKIγ

K188,200R ja WT ei ollut merkittävä korkeat pitoisuudet fibronektiinireseptorin. Kuitenkin pienillä pitoisuuksilla fibronektiinin, ekspressoivien solujen PIPKIγ

K188,200R oli huomattavasti pienempi adheesiolujuus kuin niillä, jotka ilmentävät WT. PIPKIγ Knockdown myös aiheutti merkittävän laskun soluadheesion vahvuus HCT116-soluissa (kuvio. 6B). Nämä tulokset osoittavat, että PIPKIγ toimintaa säätelee soluadheesiota vahvuus paksusuolen syöpäsoluissa.

(A) Expression of PIPKIγ

K188,200R esti HCT116-solut noudattamalla pieninä pitoisuuksina fibronektiinin. Solut, jotka ekspressoivat stabiilisti PIPKIγ tai PIPKIγ

K188,200R inkuboitiin kalseiini-AM ja maljattiin 96-kuoppaisen levyn päällystetty fibronektiinin kanssa sentrifugoimalla määrityksissä. (B) ehtyminen PIPKIγ esti HCT116-solut kiinni fibronektiiniin. Solut, jotka ilmentävät stabiilisti ohjaus ja PIPKIγ shRNA inkuboitiin kalseiini-AM ja maljattiin 96-kuoppaisen levyn päällystetty fibronektiinin kanssa sentrifugoimalla määrityksissä. F

a /F

0 = (fluoresenssi sentrifugoinnin jälkeen) Ö (fluoresenssi ennen sentrifugointia).

PIPKIγ on välttämätöntä invaasio, mutta ei muuttoa koolonkarsinoomasoluissa

on raportoitu, että PIPKIγ on rooli solujen vaeltamiseen. Testata, onko PIPKIγ säätelee migraatio HCT116-koolonsyöpäsoluja, käytimme ajan kulunut haavan paranemista määrityksissä tutkia migraation HCT116-soluja, jotka ilmentävät EGFP-PIPKIγ ja -PIPKIγ

K188,200R, vastaavasti, kun läsnä on HGF . Kuten on esitetty kuviossa. S2 A B, solut, jotka ilmentävät PIPKIγ

K188,200R siirtynyt hieman nopeammin kuin ilmentävät WT entsyymiä mitattuna time-lapse haavan paranemista määrityksissä. Myös ehtyminen PIPKIγ ei ollut merkittävää vaikutusta migraatio HCT116-solujen transwell määrityksissä (kuvio. S2 C B), PIPKIγ knockdown johti merkittävään vähenemiseen hyökkäyksen HCT116-solujen joko ilman tai läsnäollessa HGF. Pohjapinta ja HGF-stimuloidun invasiivisia valmiuksia HCT116-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti PIPKIγ

K188,200R ovat myös huomattavasti pienempiä kuin solut, jotka ilmentävät WT-entsyymiä (Fig. 7C ctrl vs PIPKIγ, p 0,01; ctrl HGF vs PIPKIγ HGF, p 0,01. (C) Expression of PIPKIγ

K188,200R esti hyökkäyksen HCT116-soluja. Solut, jotka stabiilisti ilmentävät EGFP-PIPKIγ tai -PIPKIγ

K188,200R testattiin invasiivisia kapasiteetin puuttuessa ja läsnä HGF. (D) kvantifiointi hyökkäystä HCT116-soluja, jotka ilmentävät stabiilisti EGFP-PIPKIγ tai -PIPKIγ

K188,200R. n = 3, virhepalkin = keskiarvo ± SEM; WT vs K188,200R, P 0,01; WT HGF vs K188,200R HGF, P ​​ 0,005.

PIPKIγ säätelee fokaalisen adheesion muodostumisen aktivoimalla vinkuliini PI (4,5) P

2

leikellä mekanismi, jolla PIPKIγ säätelee fokaalisen adheesion muodostumista, ryhdyimme analysoimaan tasot polyphosphoinositides vuonna HCT116-soluissa, jotka ilmentävät PIPKIγ shRNA tai shRNA hallinta käyttämällä massaspektrometriaa. Köyhtyminen PIPKIγ vuonna HCT116-soluissa ei ollut merkittävää vaikutusta tasoon PIP, mutta aiheutti merkittävä väheneminen PIP

2 tasoa (huomaa, että nämä menetelmät eivät pysty erottamaan asennon enantiomeerejä näiden lipidien joten on mahdollista, että PI (3,4) P

2 voivat vaikuttaa merkittävästi jäljellä tasot PIP

2 näissä soluissa). Mielenkiintoista, tueksi tämän ajatuksen knockdovvn PIPKIγ pienentää PIP

3 tasoa alle määritysrajan meidän määrityksen (Fig. 8). Nämä tulokset osoittavat, että PIPKIγ on keskeinen entsyymi, joka vastaa tuotannosta PI (4,5) P

2 ja PI (3,4,5) P

3 HCT116-soluissa.

Polyphosphoinositides soluista, jotka ekspressoivat stabiilisti shRNA ohjaus tai PIPKIγ shRNA uutettiin ja derivatisoitu käyttäen trimetyylisilyylidiatsometaania, ja sitten mitattiin käyttämällä massaspektrometriaa. N = 4, virhepalkin = keskiarvo ± SEM; PIP, P 0,05; PIP2, P = 0,0034; PIP3, P = 0,001.

Jos haluat nähdä, onko PI (3,4,5) P

3 on välttämätöntä fokaalisen adheesion muodostumista koolonkarsinoomasoluissa, HCT116-soluja käsiteltiin LY294002, joka on spesifinen inhibiittori fosfatidyyli 3-kinaasi, ja fokaalisen adheesion muodostuminen näissä soluissa tutkittiin jälkeen paksilliini värjäystä. LY294002 (20 uM) ei ollut merkittävää vaikutusta fokaalisen adheesion muodostumista (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä edellä havaintojen tämä havainto osoittaa, että PI (4,5) P

2, mutta ei PI (3,4,5) P

3, tarvitaan fokaalisen adheesion muodostumista.

PI (4,5) P

2 sitoo ja aktivoi vinkuliini ja on sekaantunut säätelyssä fokaalisen adheesion muodostumisen [32]. Jos PIPKIγ välittämää tuotanto PI (4,5) P

2 on välttämätöntä fokaalisen adheesion muodostumista HCT116-soluissa, ehtyminen PIPKIγ vähentäisi PI (4,5) P

2 tasoa ja estää vinkuliini välillä paikallistamiseksi ja polttoväli kiinnikkeistä. Tämän hypoteesin testaamiseksi, endogeeninen PIPKIγ-köyhdytettyä soluja infektoitiin retroviruksilla ekspressoivat kodoni modifioitua PIPKIγ (rescue) (Fig. 9A), ja solut värjättiin vinkuliinin. Vinkuliini harvoin lokalisoitu polttoväli kiinnikkeistä PIPKIγ-köyhdytettyä HCT116-soluissa, kun taas uudelleen ilmentäminen PIPKIγ in PIPKIγ vaje solujen johti dramaattiseen lisääntymiseen fokaalisen adheesion-lokalisoitu vinkuliini (Fig. 9B). Kvantitatiivinen analyysi osoitti, että PIPKIγ pelastus palauttaa fokaalisen adheesion muodostumista PIPKIγ-köyhdytettyä solut (Fig. 9C pariksi t-testi, P 0,0001) (D) Alue jakautuminen paikallisessa tarttumisessa in PIPKIγ-KD-soluihin ja KD soluja, jotka ilmentävät pelastus PIPKIγ.

keskustelu

lisäksi palvelevat esiasteena muiden toisiolähettien, PI (4,5) P

2 itse sitoo monet solun tukirangan ja polttovälin tarttuvuus proteiineja ja uskotaan olevan keskeinen säätelijä fokaalisen adheesion dynamiikka [ ,,,0],34]. PI (4,5) P

2 sitoutuu vinkuliini paljastamaan Talin-sitoutumiskohtia vinkuliini [32]; se sitoo myös Talin näin vakauttaa Talin-integriini vuorovaikutusta [35]. PIPKIγ ajatellaan olevan entsyymi, joka tuottaa PI (4,5) P

2 tilallisesti ja ajallisesti varten fokaalisen adheesion muodostumisen aikana solujen vaeltamiseen [27], [34]. Toisaalta, PI (4,5) P

2 ei ole havaittu paikallisia tarttumista ja rooli PIPKIγ säätelyssä fokaalisen adheesion dynamiikka on kiistanalainen [36]. PIPKIγ on osoitettu vaaditaan fokaalisen adheesion muodostumisen aikana EGF-stimuloidun solumigraatio [30], vaikka se on myös raportoitu, että ilmentyminen PIPKIγ aiheutti solun pyöristystä ja fokaalisen adheesion purkaminen [26].

Osoitamme täällä, että ilmentyminen PIPKIγ alhaisilla tasoilla CHO-K1-soluissa stimuloi fokaalisen adheesion muodostumista (Kuva. 1), kun taas kinaasi-kuollut mutantteja, PIPKIγ

K188,200R ja PIPKIγ

D316K onnistunut edistämään fokaalisen adheesion muodostumista (Kuva . 2, kuva. 4 ja Fig. S1). Lisäksi PIPKIγ knockdown lähes kokonaan poisti fokaalisen adheesion muodostumista HCT116 koolonkarsinoomasoluissa (Fig. 5). Lisäksi ilmaus PIPKIγ edistetään polttovälin tarttuvuus kokoonpano ja purkaminen hinnat, kun taas PIPKIγ

K188,200R ei voinut tehdä niin (Fig. 3). Nämä tulokset tunnistaa keskeinen rooli PIPKIγ säätelyssä polttovälin tarttuvuus dynamiikkaa.

Vaikka suoraa näyttöä ei ole, PI (4,5) P

2 on hyvin osallisena säätelyssä integriinin aktivaation. PI (4,5) P

2 sitoo Talin ja estää sen itsensä esto (head-tail vuorovaikutus) mikä edistää sen vaikutuksen β integriini hännän [35]. Se stimuloi myös integriinin klustereiden [31]. Lisääntyminen sekä Talin-integriini vuorovaikutusta ja integriinin klustereiden pitäisi stimuloida integriinin aktivaation. Olemme havainneet, että HCT116-solut, jotka ilmentävät PIPKIγ

K188,200R on huomattavasti pienempi adheesiolujuus kuin niillä, jotka ilmentävät WT, ja ehtyminen PIPKIγ mukaan shRNA aiheutti myös merkittävän vähenemisen soluadheesion vahvuus HCT116-soluissa (kuvio. 6), viittaa siihen, että PIPKIγ voi moduloida integriinin aktivaation paksusuolen syöpäsoluissa.

on raportoitu, että PIPKIγ tarvitaan EGF-stimuloidun migraation MDA-MB-231 ihmisen rinta- syöpäsolujen ja HeLa ihmisen munasarjasyövän solujen [30] , [37]. Kuitenkin tuloksemme tässä osoittavat, että kumpikaan ilmentävät PIPKIγ

K188,200R, kinaasi-kuollut mutantti, eikä ehtyminen PIPKIγ estävät muuttoa HCT116-soluja (kuvio. S2). MDA-MB-231 ja HeLa-solut vaeltavat paljon nopeammin kuin HCT116-soluissa, mikä viittaa siihen, että PIPKIγ on välttämätöntä nopeasti liikkuvia soluja, mutta ei hitaasti vaeltavien solujen kuten HCT116-soluissa. Tätä tukee myös julkaisemattomia seurauksena PIPKIγ

K188,200R dramaattisesti estää migraation kloonin A-solujen, nopeasti liikkuvan koolonisyöpäsolulinja.

Toisaalta, PIPKIγ näyttää vaaditaan hyökkäys molempien lyhytvaikutteinen (kuten MDA-MB-231) ja hitaasti hyökkääviä (kuten HCT116) syöpäsoluja. Ehtyminen PIPKIγ on osoitettu estävän EGF-stimuloidun hyökkäys MDA-MB-231-solujen [37], ja joko ilmentävät PIPKIγ

K188,200R tai ehtyminen PIPKIγ estää hyökkäys HCT116-solut (Fig. 7). Nämä tulokset osoittavat keskeinen rooli PIPKIγ säätelyssä syövän invaasio.

Aiemmat tutkimukset ovat keskittyneet roolista fokaalisen adheesion purkautumista säännellä syövän invaasio. DRR edistää gliooma invaasio edistämällä fokaalisen adheesion purkaminen [6]. Filamiini tukahduttaa rintasyövän soluinvaasiota estämällä polttovälin tarttuvuus purkaminen [7]. FAK edistää myös polttovälin tarttuvuus purkaminen ja syövän invaasio [9]. Kuitenkin meidän tulokset osoittavat, että sekä ilmentymistä PIPKIγ

K188,200R, kinaasi-kuolleet mutantti, ja ehtyminen PIPKIγ heikentää fokaalisen adheesion muodostumista, mukana esto hyökkäys HCT116 (Fig. 4, 5 ja 7). Lisäksi PIPKIγ stimuloi sekä fokaalisen adheesion kokoamista ja purkamista (Fig. 3), mikä viittaa siihen, että polttoväli tarttuvuus liikevaihdon, mikä edellyttää fokaalisen adheesion asentaminen ja purkaminen tilallisesti ja väliaikaisesti, säätelee hyökkäystä syöpäsoluja.

PIPKIγ on merkittävä entsyymi, joka ohjaa polyphosphoinositide aineenvaihduntaa HCT116-soluissa. PIPKIγ Knockdown johtaa huomattavaan vähenemiseen tasoa PI (4,5) P

2 ja laskee PI (3,4,5) P

3 tasoa vieläkin merkittävästi (Fig. 8). PI (3,4,5) P

3 on tärkeä rooli kasvainten synnyssä ja syövän etäpesäkkeiden. Kuitenkin PIPKIγ pudotus ei vaikuta aktivointi Akt, joka on merkittävä tavoite PI (3,4,5) P

3, ja HCT116-soluissa (tietoja ei ole esitetty), luultavasti koska Akt voidaan aktivoida PI (3, 4) P

2, joka ei vaikuta suoraan PIPKIγ.

esto PI 3-kinaasi käyttäen LY294002 ei vaikuta fokaalisen adheesion muodostumista HCT116-soluissa, mikä viittaa siihen, että PI (4,5) P

2 sijasta PI (3,4,5) P

3 vastaa PIPKIγ välittämän fokaalisen adheesion muodostumista. PI (4,5) P

2 edistää vinkuliini sitoutumisen Talin ja aktiini ja sen on osoitettu olevan olennainen fokaalisen adheesion muodostumisen [32]. Tuloksemme osoittavat, että PIPKIγ säätelee vinkuliini paikallistamisen niille keskuksille kiinnikkeistä HCT116-soluissa (kuvio. 9). Yhdessä se on erittäin todennäköistä, että PIPKIγ säätelee fokaalisen adheesion muodostumisen PI (4,5) P

2-välitteisen vinkuliini aktivoitumisen.

Syöpä hyökkäys on monimutkainen prosessi, joka vaatii alueellisen ja ajallisen säätely solujen -matriisi kiinnikkeistä, solu ulokkeita ja matriisi-hajoaminen [38]. PI (4,5) P

2 tuottaman PIPKIγ säätelee syövän invaasio moduloimalla soluadheesion dynamiikkaa. Vaikka PI (3,4,5) P

3 ei ole välttämätön fokaalisen adheesion muodostumista, se voi myös olla rooli muiden näkökohtien syövän invaasio, luultavasti aktivoimalla Ras [39].

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Anti-paksilliini vasta-aine (klooni 5H11) oli Milliporesta; Anti-PIPKIγ polyklonaalinen vasta-aine oli peräisin Cell Signaling Technology; Anti-tubuliinia vasta-aine ja pLKO1 lentivirukselle PIPKIγ shRNA (sekvenssi: CCG GGC AGT CCT ACA GGT TCA TCA ACT CGA GTT GAT GAA CCT GTA GGA CTG CTT TTT G) olivat Sigma; DyLight 549 konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG (H + L) oli Thermo Scientific; Fibronektiinillä ja rekombinantti HGF olivat Akron Biotech; Kasvutekijä vähennetään matrigeelin oli BD Bioscience; Plasmidi pEGFP-PIPKIγ oli lahja Dr. Mark Ginsberg (University of California-San Diego); Pfu Ultra oli Agilent Technologies; DNA-alukkeet syntetisoitiin Integrated DNA Technologies.

plasmidikonstruktion

Plasmidi pEGFP-PIPKIγ

W647F muodostettiin pfu Ultra-pohjainen PCR käyttäen pEGFP-PIPKIγ mallina ja 5′ GAT GAG AGG AGC TTT GTG TAC TCC CCG CTC-3 ’/5′- GAG CGG GGA GTA CAC AAA GCT CCT CTC ATC-3’ alukkeina. pEGFP-PIPKIγ

K188,200R ja pZZ-PIPKIγ

K188,200R luotiin PCR: llä käyttäen pEGFP-PIPKIγ ja pZZ-PIPKIγ [40] malleina, vastaavasti, ja peräkkäin 5′- GAC GAG TTC ATC ATC AGG ACC GTC ATG CAC-3 ’/5′-GTG CAT GAC GGT CCT GAT GAT GAA CTC GTC-3′ ja 5’-GTT CCT GCA GAG GCT GCT CCC TGG CTA C-3 ’/5’-GTA GCC AGG GAG CAG CCT CTG CAG GAA C-3 ’alukkeina.