Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

vyöliitos koostuvat transmembraanisen kadheriinit, jotka ovat vuorovaikutuksessa solun jossa p120ctn, SS-kateniinin ja α-kateniinin. p120ctn on tunnettua säätää solu-solu-adheesion lisäämällä kadheriinin vakautta, mutta vaikutukset muiden vyöliitos komponentteja solu-solu-adheesio ei ole verrattu p120ctn.

Menetelmät /Principal Ensimmäisen

osoittavat, että ehtyminen p120ctn pieniä häiritseviä RNA (siRNA) in DU145 eturauhassyövän ja MCF10A rinta- epiteelisolut pienentää ilmentymisen tasot vyöliitos proteiineja, E-kadheriinin, P-kadheriinin, ß-kateniinin ja α-kateniinin, ja indusoi menetys solu-solu-adheesion. p120ctn vaje solujen on myös lisääntynyt siirtonopeutta ja invaasio, mikä korreloi lisääntyneen Rap1 muttei Rac1 tai RhoA aktiivisuutta. Downregulation P-kadheriinin, β-kateniinin ja α-kateniinin, mutta ei E-kadheriinin indusoi menetys solu-solu-adheesion, lisääntynyt liikkuvuus ja parannettu invaasio samanlainen p120ctn ehtyminen. Kuitenkin vain p120ctn väheneminen johtaa vähenemiseen tasot muiden vyöliitos proteiineja.

Johtopäätökset /merkitys

tulokset osoittavat, että P-kadheriinin, mutta ei E-kadheriinin on tärkeää säilyttää adherens liittymissä DU145 ja MCF10A soluja, ja että ehtyminen tahansa kadheriinin liittyvien proteiinien, p120ctn, ß-kateniinin tai α-kateniinin, riittää häiritä vyöliitos vuonna DU145 soluista ja nostaa siirtolaisuuden ja syöpäsoluinvaasiota.

Citation: Kümper S, Ridley AJ (2010) p120ctn ja P-kadheriinin mutta ei E-kadheriinin säädellä solun liikkuvuus ja invaasiota DU145 eturauhassyöpäsolujen. PLoS ONE 5 (7): e11801. doi: 10,1371 /journal.pone.0011801

Editor: Robin Charles May, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 2. helmikuuta 2010 Hyväksytty: 29 Kesäkuu 2010; Julkaistu: 27 heinäkuu 2010

Copyright: © 2010 Kuemper, Ridley. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Cancer Research UK, Bettencourt-Schueller Foundation, ja Euroopan komission Framework 6 sopimuksen (LSHG-CT-2003-502935, MAIN). SK tukivat PhD stipendi Kings College London School of Biomedical ja Health Sciences. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aikana etäpesäke, syöpäsolut yleensä saavat mahdollisuuden siirtää ja tunkeutua kudoksiin säätelemällä niiden vuorovaikutusta muiden solujen kanssa ja niiden solun ulkopuolelle. Useat tutkimukset osoittavat, että muutokset solu-solu adheesion korreloi epiteelin kasvainprogression ja etäpesäkkeiden [1]. Syöpäsolut voivat hyökätä joko yksittäisinä soluina tai kollektiivisesti ryhmien soluihin [2], [3], [4]. Molemmat hyökkäystä liittyy häiriöitä epiteelin, joka vaatii yleensä heikkeneminen solu-solu kontakteja ja muutos solun muotoon. Kadheriineja ja catenins muodostavat vyöliitos, jotka ovat keskeisiä välittäjiä solu-soluadheesion. Expression of vyöliitos proteiinien usein vähentynyt kasvaimissa, ja käyttökuntoon toiminnallisten vyöliitos voi palauta invasiivisen fenotyypin syöpäsolut [5], [6], [7].

Klassisen kadheriinit (E-, ajoneu-, N- ja P-kadheriinin) ovat keskeinen transmembraaniproteiineja on vyöliitos monimutkainen ja välittävät Ca

2 +: sta riippuvainen homofiilisiä solujen väliset vuorovaikutukset. β-kateniinin ja plakoglobin /γ-kateniinin sitoutuvat kadheriinin solunsisäisiin poissulkevalla tavalla ja α-kateniinin puolestaan ​​sitoutuu P-kateniinin [8]. p120-kateniini (p120ctn) toisaalta sitoutuu eri alueella kadheriineja ß-kateniinin [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Koostumus proteiinien vyöliitos monimutkainen riippuu solutyypistä ja kadheriiniekspressiota. α-kateniinin tarjoaa tärkeän linkin vyöliitos ja aktiinisytoskeletonin. Sen vuorovaikutusta aktiinisäikeiden kuitenkin näyttää olevan toisensa poissulkevia sen sitoutumiseen P-kateniinin viittaa epäsuora yhteys liittymien välissä ja aktiinisytoskeletonin [15], [16].

p120ctn on todettu säännellä adherens risteys vakaus

in vitro

[17], [18], [19] ja

in vivo

[20], [21], [22]. Sen ehtyminen RNAi johtaa vähenemiseen vyöliitos proteiineja ja poistetaan solu- soluadheesiota [17], osittain lisäämällä kadheriinin endosytoosin ja hajoaminen [19], [23]. p120ctn vaikuttaa myös aktiivisuus pieniä GTPaaseja RhoA, Rac1 ja Cdc42 joissakin solutyypeissä [24], [25], [26], [27], joka on keskeinen rooli säätelyssä solun tukirangan dynamiikkaa, muodostuminen ja ylläpito adherens risteykset ja solujen vaeltamiseen [28], [29]. p120ctn voi siis yhdistää vyöliitos ja Rho GTPaasit.

Vaikutukset p120ctn solujen muuttoliikettä ja invaasiota vaihtelevat solutyypin, määritysolosuhteissa ja tyypit kadheriineja ilmaistuna [30], [31], [32] . Ei ole selvää, missä määrin vaikutuksia p120ctn välittyvät vyöliitos tai Rho GTPaasit. Tilanteen korjaamiseksi olemme pudotti p120ctn in DU145 syöpäsolujen ja MCF10A nisäepiteelisoluissa, jotka molemmat on normaalisti vyöliitos sisältävä E-kadheriinin ja P-kadheriinin. Molemmissa solutyypeissä ehtyminen p120ctn johtaa häiriöitä solu-solu-kontaktien, downregulation vyöliitos proteiinien ja lisääntynyt solun liikkuvuus. Mielenkiintoista, knockdovvn p120ctn ei vaikuttanut aktiivisuuden tasoa Rho GTPaasit Rac1 ja RhoA vaan lisännyt aktiivisen Rap1. Ensimmäistä kertaa olemme pudotti kadheriineja sekä catenins ja osoittavat, että P-kadheriinin, β-kateniinin ja α-kateniinin mutta ei E-kadheriinin ehtyminen matkivat vaikutuksia p120ctn tukahduttaminen ja johtaa menetykseen solu-solu kontakteja ja tehostettu hyökkäys.

tulokset

vastustamisesta p120ctn ilmaisun johtaa downregulation solu-solu adheesioproteiinien ja häiriöitä solu-solu kontakteja

vaikutusten tutkiminen p120ctn solujen -solujen tarttumista, vertasimme vaikutuksia p120ctn ehtyminen kahdessa eri solulinjoja, jotka ovat vyöliitos, ihmisen eturauhassyövän solulinjaa DU145 ja ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen linja MCF10A. DU145 ja MCF10A solut muodostivat solu-solu-kontaktien ja ilmaistaan ​​sekä E- ja P-kadheriini, joka lokalisoitu solu-solu-kontaktien (Fig. 1A, B). DU145 ja MCF10A solut pääasiallisesti ilmentävät kaksi p120ctn isoformia, että joka perustuu niiden molekyylipainon, ennustetaan olevan isoformit 1 ja 3 [33] kanssa isoformin 3 (alempi kaista) ilmaistaan ​​hieman korkeampi (Fig. 1).

DU145 (A) ja MCF10A (B) transfektoitiin siRNA varten p120ctn (p120ctn (1), (2)), ohjaus siRNA tai transfektioreagenssin vain (mock). 72 tunnin jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin F-aktiini, p120ctn ja E-kadheriinin ja P-kadheriinin (vasemmanpuoleiset paneelit), tai lyysattiin ja analysoitiin immunoblottauksella varten osoitetun solu-adheesiomolekyylien ja p120ctn pudotus tehokkuus (oikea paneeli) . Mittaviivat = 25 pm. ERK käytettiin latauskontrollina varten immunobloteissa.

knockdovvn p120ctn kahdella eri siRNA: t in DU145 ja MCF10A solujen aiheuttama häiriö solu-solu-adheesion tuloksena on ”hajallaan” fenotyyppiä (Fig. 1, kuva 2). Lisäksi DU145 solut stabiilisti köyhdytetty p120ctn ei ollut vakaa vyöliitos (Fig. S1). Tämä fenotyyppi johtui spesifisesti p120ctn ehtymisestä, koska ilmentyminen shRNA vastustuskykyisten hiiri p120ctn (GFP-fuusio) pelastettu risteykseen muodostumista, määritettynä lokalisointi p120ctn ja E-kadheriinin (Fig. S1).

DU145 ( A, C, D) ja MCF10A (B, C) solut transfektoitiin siRNA: illa ja p120ctn (p120ctn (1), (2)), siRNA E-kadheriinin (E-kadheriinin), ohjaus siRNA (kontrolli) tai transfektion reagenssia vain (mock). Jälkeen 56 h, solut seurattiin aikaväli mikroskopia, hankkia kuva joka 10 minuutin ajan 16 h. Tyypillisiä esimerkkejä vaihe-kontrastin kuvia solujen elokuvista (vasemmanpuoleiset paneelit) ja muuttoliike raidat (oikea paneeli, alkupiste jokaisen solun piirretään risteyksessä x- ja y-akselit) on esitetty ohjaus-transfektoidut ja p120ctn vaje DU145 (A) ja MCF10A soluissa (B). Mittaviivat = 50 pm. (C, D) Migration nopeudet kuvattu laatikko ja hiuksenhienosti tontteja osoittaa mediaani, kvartiiliväli (laatikot) ja korkein ja alhaisin arvo (viikset). (C) Migration nopeuksilla DU145 ja MCF10A soluja. (D) Migration nopeudet DU145 valvonnan solujen pesäkkeitä verrattuna yksittäisiä soluja. Tiedot ovat peräisin kolmesta eri kokeita, kukin toteutettu kahtena, analysoimalla 15 solua per kenttä (~90 solua yhteensä). *** P 0,001, verrattuna kontrolliin ja määritetään Studentin t-testiä.

Sekä E-kadheriinin ja P-kadheriinin sekä β- ja α-kateniinin oli vaimentua in p120ctn vaje solut. Downregulation kadheriinien korreloi laajuus p120ctn ehtyminen: 72 tuntia transfektion jälkeen siRNA: iden kohdistaminen p120ctn, p120ctn tasot olivat alhaisemmat kuin 48 tuntia, ja E-kadheriinin tasot alenivat 72 tuntia kuin 48 tuntia (tietoja ei näytetty).

p120ctn-köyhdytettyä soluja ei kuitenkaan todennäköisesti ole tehty epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) kuin tasot EMT markkeri proteiinien, kuten vimentiinista ei lisääntynyt verrattuna ohjata-transfektoitujen DU145-solujen (tuloksia ei ole esitetty).

p120ctn säätelee migraation DU145 ja MCF10A solujen

Voit testata, onko migraatiota vaikuttivat p120ctn ehtyminen, solut seurattiin nopeutus mikroskopia yli 16 h (Fig. 2A, B) ja jäljitetään määrittää niiden siirtonopeutta. p120ctn-köyhdytettyä DU145 ja MCF10A solujen sekä siirtää nopeammin kuin kontrollisolut (Fig. 2, Elokuvat S1, S2, S3 ja S4). Sen sijaan, ehtyminen E-kadheriinin ei muuttanut solujen siirtonopeutta (Fig. 2C), vaikka sen ekspressiotaso aleni p120ctn pudotus (Fig. 1). Siirtymisen nopeus kontrollisolujen määritettiin soluista sijaittava solun pesäkkeet (Fig. 2C), mutta jotkut solujen populaation liikkui yhtenä soluja (elokuvat S1 ja S3). Kuitenkin, ei ollut eroa siirtymien nopeutta DU145 solujen pesäkkeet tai yksittäiset solut (Fig. 2D), sulje pois mahdollisuutta, että p120ctn vaje solujen siirtyivät nopeammin, koska ne olivat pääasiassa yksittäisiä soluja eikä pesäkkeitä.

Solun muuttoliike analysoitiin myös scratch-haavan määrityksiä konfluentteja muodostetuilla DU145 soluja. Useimmat p120ctn-köyhdytettyä vaeltaneet solut, kuten yksittäisten solujen haavaan, kun taas kontrollisolut liikkui arkki, säilyttää solu-solu-kontaktien (Fig. 3A, Elokuvat S5, S6). p120ctn-köyhdytettyä vaeltaneet solut nopeammin kuin kontrollisolut (kuvio. 3B). Kuitenkin p120ctn-köyhdytettyä solujen väheni pysyvyys (Fig. 3B), mikä osoittaa, että ne muuttavat suuntaa useammin. Näin ollen, vaikka kasvoi siirtonopeutta, haavan aika oli samanlainen ohjata-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 3C).

DU145-solut transfektoitiin siRNA: illa ja p120ctn (p120ctn (2) varten) ja ohjaukseen siRNA (kontrolli) . 56. h, yksisolukerroksena haavoittui pipetillä kärjestä solujen seurattiin aika-raukeavat mikroskopia, hankkia kuva joka 10 minuutin ajan 16 tuntia. (A) Phase-kontrasti kuvia solujen ensimmäisestä kehyksen kunkin elokuvan näkyvät ilman tai edustajan raitoja solujen (7 /kuva; seurataan 16 tuntia) päällekkäin (top kuvat). Lisäksi tyhjästä haavoja valvonnan solujen ja p120ctn-köyhdytettyä solut näkyvät 0 h ja 16 h jälkeen haavoittaen (alhaalla paneelit). Mittaviivat = 50 pm. (B) Migration nopeus (vasemmalla) ja pysyvyys (oikea; tilavuus /radan pituus) määritettiin. Migration nopeudet kuvattu laatikko ja hiuksenhienosti tontteja osoittaa mediaani, kvartiiliväli (laatikot) ja korkein ja alhaisin arvo (viikset). (C) pinta-ala solujen tyhjästä haavoja määritettiin faasikontrasti- kuvia otettu eri ajankohtina elokuvia. Tiedot ovat peräisin kolmesta eri kokeita, kukin suoritettiin kaksoiskappaleet, analysoimalla 15 solua per kenttä (~90 solua yhteensä). * P 0,05; *** P 0,001, verrattuna kontrolliin ja määritetään Studentin t-testiä.

vastustamisesta p120ctn ilmaisun lisäävästi Rap1 aktiviteetti

asetukseen Rho GTPaasina toiminnan p120ctn on aiemmin korreloi lisääntynyt solun liikkuvuus [25], [26]. Kuitenkaan mitään eroja tasojen aktiivisten RhoA, Rac1 tai Cdc42 välillä ei havaittu p120ctn vaje ja valvonta-transfektoidut DU145 soluja (Fig. 4A, B, tiedot Cdc42 ei ole esitetty). Koska p120ctn pudotus aiheutti menetys solu-solu-kontaktien ja GTPaasi Rap1 on aiemmin liittynyt vakauttaminen E-kadheriinin on solukalvon ja jotka voidaan ottaa käyttöön seuraavan E-kadheriinin vetäytymisen [34], tasoja aktiivista Rap1 analysoitiin. p120ctn-köyhdytettyä DU145-solut osoittivat lisääntynyttä tasoa Rap1 aktiivisuuden (Fig. 4A, B).

DU145-solut transfektoitiin siRNA: illa ja p120ctn (p120ctn (1), (2)), ohjaus siRNA (kontrolli) tai jossa transfektioreagenssin vain (mock). 72 tunnin kuluttua solut hajotettiin ja inkuboitiin GST-Rhotekin-RBD, GST-PAK1-PBD tai GST-RalGDS-RBD on glutationihelmiin kaatamaan aktiivinen RhoA, Rac1 ja Rap1 vastaavasti. Lysaatit mock-transfektoituja soluja inkuboitiin GTPyS esiladattavaa GTPaaseja käytettiin positiivisena kontrollina pulldown määrityksissä. (A) Esimerkki immunobloteilla varten GTPaasi aktiivisuuden määrityksissä. ERK tasoilla immunobloteilla käytettiin latauskontrollina. Ponceau värjäys Immunoblottien osoittaa tasot GST-fuusioproteiineja. (B) Kuvaajat osoittavat tiedot 3 (RhoA, Rac1) tai 4 (Rap1) itsenäisestä kokeesta ja tuloksia verrataan koko RhoA, Rac1, Cdc42 ja normalisoitiin valvontaa. Virhe palkit edustavat SEM. * P 0,05, verrattuna kontrolliin ja määritetään Studentin t-testiä.

kuluminen kadheriinit, SS-kateniinin tai α-kateniinin ei vaikuta ekspressiotasot muiden vyöliitos proteiineja

Koska p120ctn ehtyminen vähensi tasot vyöliitos proteiinien E-kadheriinin, P-kadheriinin, ß-kateniinin ja α-kateniinin (Fig. 1), tutkimme vaikutuksia heikentävien kunkin näiden proteiinien vyöliitos. DU145-solut transfektoitiin 2 tai 3 eri siRNA oligoja E-kadheriinin, P-kadheriinin, β-kateniinin, α-kateniinin ja p120ctn (Fig. 5A).

DU145-solut transfektoitiin ilmaistuilla siRNA: illa varten E-kadheriinin, P-kadheriinin, α-kateniinin ja β-kateniinin, tai ohjaus siRNA (kontrolli) tai transfektioreagenssi vain (mock). (A) 72 tunnin kuluttua solut hajotettiin ja proteiinin tasot merkitty proteiineja analysoitiin immunoblottauksella. Yhteensä ERK tai GAPDH-proteiinin tasot käytettiin latauskontrollina. (B) Kuvaajat osoittavat proteiinin tasot P-kadheriinin, E-kadheriinin, α-kateniinin ja p120ctn jälkeen, pudotus on esitetty proteiinit, kvantitoitiin Odyssey skannaus Immunoblottien (vasen) tai β-kateniinin pudotus, kvantitoitiin densitometrillä (oikealla), 4 itsenäisestä kokeesta. Tulokset on normalisoitu hallita. Pylväät edustavat SEM. *** P 0,001, ** p 0,01, * p 0,05, verrattuna kontrolliin ja määritetään Studentin t-testiä.

Expression tasot kutakin näistä proteiineista määritettiin sitten kvantifiointi Immunoblottien. Tasot P-kadheriinin, β-kateniinin, α-kateniinin ja p120ctn proteiineja ei vaikuttanut E-kadheriinin ehtyminen (Fig. 5A, B). Pudotus P-kadheriinin hieman alhaisempia E-kadheriinin, ß-kateniinin ja α-kateniinin, mutta ei p120ctn, mutta tämä oli vain havaittiin siRNA oligo (1), joka antoi vahvin ( 80%) väheneminen P-kadheriinin . Kaksi muuta oligot joka vähensi P-kadheriinin tasot -50% ei vaikuttanut tasoa muiden junktionaalinen proteiineja. ß-kateniinin tai α-kateniinin ehtyminen ei muuttanut tasoa muiden vyöliitos proteiineja merkittävästi (Fig. 5). Näin ollen on vain p120ctn ehtyminen, joka johtaa vähenemiseen tasojen kaikkien muiden solu-solu-adheesiomolekyylien (Fig. 5B).

Suppression of p120ctn, P-kadheriinin, β-kateniinin ja α-kateniinin mutta ei E-kadheriinin johtaa häiriöitä solu-solu kontakteja ja parantaa syöpäsoluinvaasiota

Koska downregulation p120ctn johti menetykseen solu-solu risteyksissä ja lisäys solujen siirtonopeutta, vaikutukset heikentävien muiden vyöliitos proteiinien solu-solu-adheesion ja solun liikkuvuus tutkittiin. Knockdown E-kadheriinin, P-kadheriinin, ß-kateniinin ja α-kateniinin RNAi oli erittäin tehokas sisällä pesäkkeistä ja yhden soluissa havaittuna immunofluoresenssilla, mutta ei havaittavasti vaikuta p120ctn tasoilla (Fig. 6).

(A) DU145-solut transfektoitiin ilmaistuilla siRNA: t E-kadheriinin, P-kadheriinin, β-kateniinin, α-kateniinin, ohjaus siRNA (kontrolli) tai transfektioreagenssin vain (mock). 72 tunnin jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin P-kadheriinin, E-kadheriinin, β-kateniinin, α-kateniinin ja p120ctn korreloivan pudotus fenotyyppejä ekspression kanssa tippuu alas proteiineja. Mittaviivat = 25 um.

pudotus P-kadheriinin, β-kateniinin ja α-kateniinin kunkin 2 eri siRNA: iden (tai 3 P-kadheriinin) johti häiriöitä solu-solu- yhteystiedot, samanlainen p120ctn ehtyminen (Fig. 6, Fig. S2, Fig. S3). Erityisesti, kaikki kolme siRNA: t 1, 2 ja 3 suunnattu P-kadheriinin aiheuttaman yhden solu-solu-kontaktien, vaikka ne vähensi P-kadheriinin tasot eri määriä (Fig. 5, Fig. 6, Fig. S3). Sen sijaan, pudotus E-kadheriinin in DU145-solut eivät indusoi menetys solu-solu-kontaktien (Fig. 2C, Fig. 6, Fig. 7).

DU145-solut transfektoitiin ilmaistuilla siRNA: illa varten E-kadheriinin, P-kadheriinin, β-kateniinin, α-kateniinin ja p120ctn, joissa ohjaus siRNA (kontrolli) tai transfektioreagenssi vain (mock). 56 h transfektion jälkeen, solut seurattiin aika-raukeavat mikroskopia, hankkimalla vaihe-kontrastin kuvan joka 10 minuutin ajan 16 tuntia. Edustavia esimerkkejä vaihekontrasti kuvien alussa ja muuttoliike kappaleita kuluttua 16 h on esitetty. Mittaviivat = 25 pm. (B) Migration nopeus määritettiin käyttämällä ImageJ Software. Analyysi siirtonopeutta on kuvattu laatikon ja hiuksenhienosti tontteja osoittaa mediaani, kvartiiliväli (laatikot) ja korkein ja alhaisin arvo (viikset). Tiedot ovat vähintään 50 solua kolmesta eri kokeesta. *** P 0,001, verrattuna kontrolliin ja määritetään Studentin t-testiä.

Solut köyhdytettyä jokaisen vyöliitos proteiinia seurattiin välillä timelapse elokuvia määrittää niiden siirtonopeutta (Fig. 7). Kuten p120ctn ehtyminen, knockdovvn P-kadheriinin, β-kateniinin ja α-kateniinin lisännyt solujen siirtonopeutta, samanlainen saadut tulokset p120ctn ehtyminen, kun taas E-kadheriinin ehtyminen ei muuttanut siirtonopeutta (Fig. 7). Vastaavasti P-kadheriinin mutta ei E-kadheriinin ehtyminen MCF10A soluissa johti häiriöitä solu-solu kontakteja ja lisääntynyt siirtonopeutta (Fig. 8).

(A) MCF10A transfektoitiin ilmoitetuilla siRNA: t E -cadherin, P-kadheriinin tai ohjaus siRNA (kontrolli). 72 tunnin jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin F-aktiini ja p120ctn. Mittaviivat = 25 pm. (B) 56 h transfektion jälkeen, solut seurattiin aika-raukeavat mikroskopia, hankkimalla vaihe-kontrastin kuvan joka 10 minuutin ajan 16 tuntia. Migration nopeus määritettiin käyttämällä ImageJ Software. Analyysi siirtonopeutta on kuvattu laatikon ja hiuksenhienosti tontteja osoittaa mediaani, kvartiiliväli (laatikot) ja korkein ja alhaisin arvo (viikset). Tiedot ovat vähintään 50 solua kolmesta eri kokeesta. *** P 0,001, verrattuna kontrolliin ja määritetään Studentin t-testiä.

Perustuen muutokset solu-solu adheesion ja siirtonopeutta havaitut vaikutukset p120ctn, E-kadheriinin, P-kadheriinin, β- ja α-kateniinin on invaasio kautta Matrigelillä tutkittiin. Knockdovvn p120ctn kahdella eri siRNA nousi hyökkäyksen kautta matrigeelin taas E-kadheriinin ehtyminen ei vaikuttanut invaasiota (Fig. 9A, B). Pudotus P-kadheriinin toisaalta johtanut kasvuun invaasio samanlainen p120ctn ehtyminen (Fig. 9). Ehtyminen β-kateniinin sekä α-kateniinin indusoi kasvua invaasio samanlainen p120ctn ja P-kadheriinin. Sulkea pois mahdollisuutta, että erot solujen määrä pohjalle Matrigel-päällystetty siirtoaltaat johtui muuttunut solujen proliferaatiota, solut laskettiin 48 tuntia sen jälkeen, kun ne oli transfektoitu siRNA: t. Ei muutoksia solujen määrä verrattuna kontrolliin siRNA-transfektoiduissa soluissa havaittiin (Fig. 9C). Lopuksi knockdovvn P-kadheriinin, β-kateniinin ja α-kateniinin mutta ei E-kadheriinin indusoi häiriöitä solu-solu kontakteja ja kasvu syöpäsolujen maahanmuutto- ja invaasio samanlainen knockdovvn p120ctn.

DU145-solut transfektoitiin ilmaistuilla siRNA: t ja p120ctn, P-kadheriinin, E-kadheriinin, α-kateniinin ja β-kateniinin, jossa ohjaus siRNA (kontrolli) tai transfektioreagenssia vain (mock). Jälkeen 55 h-solut ympättiin Transwell kalvon insertit sisältävät kerros Matrigel. FCS käytettiin kemoattraktantti in alaosaan. Kokeet lopetettiin 17 h kiinnittämällä soluja pohjalle kalvon inserttien avulla kristalliviolettia. Kuvia kahdeksan eri näkökenttien hankittiin ja solujen kaikki kuvat laskettiin ja analysoitiin. (A) Kuvaajat osoittavat dataa kolmen erillisen kokeen, kukin suoritettiin kolmena kappaleena. Tulokset on normalisoitu hallita. Pylväät edustavat SEM. ** P 0,01, * p 0,05, verrattuna kontrolliin, määritettiin Studentin t-testillä. (B) edustaja kuvia solujen pohjassa Transwell kalvoja. Mittaviivat = 50 pm. (C) 48 h transfektion jälkeen solut laskettiin ja niitä verrattiin sicontrol. Käyrät osoittavat tiedot vähintään kolmen erillisen kokeen. Tulokset on normalisoitu hallita. Pylväät edustavat SEM.

Keskustelu

p120ctn ilmaisun usein katoaa tai vaimentua useissa eri ihmisen syövistä [35] ja laski p120ctn tasolla korreloi kasvaimen [36], [37], [38], [39]. Olemme osoittaneet tässä, että ehtyminen p120ctn E-kadheriinin ja P-kadheriinin ilmentävien DU145 ja MCF10A solujen häiritsee solu-kontakteja ja lisää muuttoliikettä ja invaasion DU145 soluissa, mikä tukee mallia, jossa p120ctn toimii invaasio tai etäpesäke vaimentimen [48]. Nämä vaikutukset korreloi vähentynyt ilmentyminen vyöliitos proteiinien E-kadheriinin, P-kadheriinin, ß-kateniinin ja α-kateniinin. Kuitenkin vain downregulation P-kadheriinin ja ei E-kadheriinin kykeni indusoimaan samanlainen fenotyyppi p120ctn ehtyminen, joka osoittaa, että E-kadheriinin ei tarvitse säilyttää solu-solu-adheesion DU145 tai MCF10A soluja.

päinvastoin kuin tulokset, p120ctn on raportoitu vaaditaan hyökkäyksen E-kadheriinin-vajaiden solujen osittain vakauttaa mesenkymaaliset kadheriinien N-kadheriinin tai kadheriinin-11, joiden tiedetään invaasiota [32]. Toisaalta kollektiivinen hyökkäys E- ja P-kadheriinin ilmentäviä A431-solujen estyi, kun solu-solu kontakteja hajotettiin joko p120ctn Knockdown tai samanaikaista knockdovvn E-kadheriinin ja P-kadheriinin [35]. Näissä tutkimuksissa HGF tai EGF vastaavasti käytettiin kemoattraktantit invaasion ja muuttoliike määritykset, kun taas käytimme seerumin. Yksi mahdollisuus on, että p120ctn voitaisiin edistää erityisesti HGF /EGF muuttoliikkeelle tai invaasion, koska se on aiemmin kytketty HGF- tai EGF-indusoidun solun sironnan [40].

p120ctn on osoitettu stimuloivan Rac ja /tai Cdc42 aktiivisuutta ja /tai estävät RhoA aktiivisuutta soluissa puuttui E-kadheriinin, mukaan lukien fibroblastit ja syövän solulinjoissa [32], [41]. Sen sijaan havaitsimme, että DU145-solut, jotka ilmentävät P- ja E-kadheriinin, mutta ei N-kadheriinin, ehtyminen p120ctn ei vaikuta aktiivisuuteen RhoA ja Rac1. Samoin E-kadheriinin /P-kadheriinia ilmentävien A431-solut, p120ctn ehtyminen ei muuttanut RhoA /Rac1 toimintaa [31].

Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että vaikutukset p120ctn Rho GTPaasia toiminta solutyyppispesifiseen. Tämä voi johtua eroista koostumuksessa p120ctn komplekseja, esimerkiksi sisältävät kompleksit GEFs, joka voi aktivoida Rac1 /Cdc42 tai aukkoja säätelevät vaimentaen RhoA [26], [41]. Mielenkiintoista on, että MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen, aktivointi Rac mukaan p120ctn vaatii kadheriinin sitova [32], mikä viittaa siihen, että mesenkymaaliset kadheriineja voisi edistää erityisesti Rac toimintaa. Vaikka Rho GTPaasi-aktiivisuus ei vaikuttanut p120ctn, olemme huomanneet, että Rap1 aktiivisuus on lisääntynyt p120ctn-köyhdytettyä DU145-soluissa. Rap1 on tärkeä säätelijä solu-solu risteyksissä, ja aktivoidaan E-kadheriinin sitoutuminen [42], [43]. Häiriöt vyöliitos ekstrasellulaaristen kalsiumin ehtyminen indusoi myös kasvua Rap1 toimintaa [44]. Meidän tulokset p120ctn ehtyminen ovat yhdenmukaisia ​​hypoteesia, että endosytoosin E-kadheriinin lisää Rap1 toimintaa [44].

Yllättäen pudotus P-kadheriinin, β- ja α-kateniinin, mutta ei E-kadheriinin johdolla häiriöihin solu-solu kontakteja. Oletettavasti P-kadheriinin korvaavia E-kadheriinin ylläpitää solu-yhteydet, mutta ei E-kadheriinin ja P-kadheriinin. Tätä hypoteesia tukee tutkimuksia MDCK-soluissa, joissa on osoitettu, että E-kadheriinin on tärkeää vain perustamiseen, mutta ei ylläpito solu-solu kontakteja, kun taas α-kateniinin vaadittiin pitämään solu-kontaktien [45]. Lisäksi P-kadheriinin ehtyminen pelkkää raportoitu aiheuttavan menetys solu-solu-kontaktien ja downregulation E-kadheriinin tasot MCF10A soluihin [46], ja yli-ilmentyminen P-kadheriinin MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen vähentää solujen vaeltamiseen ja invaasio [47]. Syövän useimmat tutkimukset ovat keskittyneet välisestä E-kadheriinin downregulation ja lisääntynyt syövän aggressiivisuus ja invaasio, vaikka myös viitteitä siitä, että P-kadheriinin vaikuttaa syövän etenemiseen. Esimerkiksi P-kadheriinin tasot vaimentua aikana melanooman etenemisen [48] ja P-kadheriinin usein menetetään eturauhassyövissä [49]. Vuonna DU145-soluissa, havaitsimme, että P-kadheriinin ehtyminen indusoi menetys solu-solu-liittymissä vaikuttamatta merkittävästi tasot muiden vyöliitos proteiineja, mikä osoittaa, että se on merkittävä kadheriinin tarvitaan solu-solu-adheesio näissä soluissa.

knockdovvn β- ja α-kateniinin myös indusoi häiriöitä solu-solu kontakteja ja nostaa hyökkäystä, mutta ei muuttanut P-kadheriinin tai p120ctn proteiinin tasot. On mahdollista, että ne vaikuttavat lokalisaatio P-kadheriinin ja /tai p120ctn pikemminkin kuin tasossa. β- ja α-catenins on raportoitu vaikuttavan kadheriinin-välitteisen adheesion [15], [16], ja ehtyminen β-kateniinin E-kadheriinin-solulinjaan johti vähenemiseen hyökkäyksen [50], mutta toistaiseksi vähän tiedetään niiden roolit muuttoliikettä ja invaasiota. β-kateniinin on myös tärkeä rooli Wnt-signalointi ja syöpä solujen lisääntymistä, ajatellaan olevan riippumaton sen kadheriinin toiminta [51].

Tuloksemme osoittavat, että p120ctn säätelee ekspressiotasot p- ja α kateniinia sekä kadheriineja sisään DU145 soluissa. Koska olemme osoittaneet, että P-kadheriinin tasot ovat tärkeämpiä kuin E-kadheriinin ylläpitämisessä solu-soluadheesion DU145 ja MCF10A soluja, me olettaa, että lisääntynyt liikkuvuus ja invaasion vietämme seuraavaa p120ctn, ß-kateniinin tai α-kateniinin knockdown on johtuvat joko vähentynyt P-kadheriinin vakautta tai muutoksia sen lokalisoinnin.

Materiaalit ja menetelmät

siRNA

Kaikki siRNA: ita käytetään saatiin Dharmacon (Fisher Scientific UK, Loughborough, UK). Seuraavat ON-TARGET

plus

yhden oligoja käytettiin kohdistaminen p120ctn (CTNND1 (1) 5′-UAGCUGACCUCCUGACUAA-3 ’; (2) 5′-GGACCUUACUGAAGUUA-3′), E-kadheriinin (CDH1 (1 ) 5’-GGCCUGAAGUGACUCGUAAU-3 ’; (2) 5’GAGAACGCAUUGCCACAUA-3’), P-kadheriinin (CDH3 (1) 5’GUGACAACGUCUUCUACUA-3 ’; (2) 5′-GAGGGUGUCUUCGCUGUAG-3’, (3) 5 ”-GAAAUCGGCAACUUUAUAA-3 ’), β-kateniinin (CTNNB1 (1) 5′-GCGUUUGGCUGAACCAUCA-3′) ja α-kateniinin (CTNNA1 (1) 5’-GAUGGUAUCUUGAAGUUGA-3 ’; (2) 5′-GUGGAUAAGCUGAACAUUA-3 ”). Non-kohdistaminen siRNA käytettiin kontrollina kaikissa kokeissa (ON-KOHDE ohjaus # 1, 5’-UGGUUUACAUGUCGACUAA-3 ’).

Soluviljely ja transfektiot

DU145 eturauhassyövän solut kasvatettiin RPMI, jota oli täydennetty 10% FCS, 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. MCF10A nisäepiteelisoluissa kasvatettiin DMEM /F12, johon oli lisätty 5% hevosen seerumia, 100 IU /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 20 ng /ml EGF: ää, 0,5 ug /ml hydrokortisonia, 100 ng /ml koleratoksiinia ja 5 ug /ml insuliinia. Solut ympättiin 1,8 x 10

5 kaivoa kohti 24-kuoppalevyille ja kääntää transfektoitu siRNA (lopullinen pitoisuus 20 nM) antibiooteille väliaineessa käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Paisley, UK) mukaan valmistajan ohjeiden . Sen jälkeen 6-8 h, solut siirrostettiin 2 x 10

4 solua kuoppaa kohti (DU145) tai 10

4 solua kuoppaa kohti (MCF10A) immunofluoresens- ja time-lapse mikroskopia ja 1 x 10

5 kuoppaa kohti (24-kuoppaisella levyllä) ja immunoblottauksen ja scratch-haava määrityksissä. Luomiseen vakaa p120ctn-köyhdytettyä DU145 soluissa pSuperior vektori järjestelmän (Oligoengine, Seattle, WA) käytettiin. Sekvenssi shRNA oligo kohdistaminen ihmisen p120ctn suunniteltiin, kuten on kuvattu [52]. Vakaa solu-allas, joka sisältää shRNA valittiin väliaineessa, joka sisälsi 5 ug /ml puromysiiniä. Pelastus kokeissa hiiren p120ctn-GFP [26], joka ei ole herkkä shRNA kohdistaminen ihmisen p120ctn, transfektoitiin väliaikaisesti DU145-soluihin käyttämällä Amaxa nucleofection (Lonza, Köln, Saksa) mukaan valmistajan protokollan (www.lonzabio.com) .

immunoblottauksella

Soluja kasvatettiin noin 80%: n konfluenssiin pestiin kerran kylmällä PBS: llä ja lyysattiin joko kylmässä 2 x SDS-näytepuskuria (Invitrogen) suoraan ja homogenisoitiin 21 G neulalla tai hajotukseen -puskuria (50 mM Tris, pH 7,5, 1% Triton-X-100, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 2 mM EDTA, 10% glyserolia, 1 mM Na

3Vo

4, 25 mM NaF, täydellinen mini EDTA-vapaa proteaasinestäjä (Roche, Welwyn Garden City, Iso-Britannia), PhosSTOP fosfataasinestäjällä (Roche)) ja sitten kirkastettiin sentrifugoimalla. Lysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja alistettiin immunoblot-analyysillä. Sillä reprobing, PVDF-kalvoille inkuboitiin strippaus-puskurilla (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM β-merkaptoetanolia, 2% SDS) 20 minuutin ajan 65 ° C: ssa. Ensisijainen vasta-aineita käytettiin laimennoksena 1:1000: p120ctn (# 610134), E-kadheriinin (# 610182) hankittiin BD Biosciences (Oxford, UK), P-kadheriinin (# 05-916), Rac1 (# 05 -389) Upstate (Millipore, Watford, UK), β-kateniinin (# C2206), α-kateniinin (# C2081) Sigma-Aldrich (Dorset, UK), ERK (# sc-94), RhoA (# sc -418) Santa Cruz Biotechnology (Insight Biotechnology, Wembley, Yhdistynyt kuningaskunta) ja Rap1A /Rap1B (# 4938) Cell Signaling (New England Biolabs, Hitchin, Iso-Britannia).