Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

β-lapatsoni (β-kierros), on tiedetty aiheuttavan NQO1-dependnet kuolema syöpäsoluissa ja herkistää syöpäsolut säteilylle (IR). Olemme tutkineet mekanismeista säteilylle herkäksi aiheuttama β-kierros.

Menetelmät /Principal Havainnot

β-kierroksen tehostettu vaikutus IR aiheuttaa klonogeeniset solujen NQO1

+ – MDA- MB-231-solujen mutta ei NQO1

– MDA-MB-231-soluja. β-kierros aiheutti apoptoosin ainoastaan ​​NQO1

+ soluja eikä NQO1

– soluja ja se lisääntyi merkittävästi IR-aiheuttaman apoptoosin ainoastaan ​​NQO1

+ soluja. Yhdistetty hoito NQO1

+ solujen aiheuttamaa ROS sukupolvi, laukeaa ER stressiä ja stimuloi aktivointi ERK ja JNK. Esto ROS sukupolven NAC tehokkaasti vaimennettu aktivoinnin ERK ja JNK, induktio ER stressiä, ja myöhemmät apoptoosin. Tärkeää on, esto ERK lakkautetaan ROS sukupolvi ja ER stressiä, kun taas esto JNK ei, mikä osoittaa, että positiivinen palaute asetuksen välillä ERK aktivointi ja ROS sukupolvi laukaisee ER stressin aiheuttaman yhdistettynä hoitoon. Lisäksi ehkäisy ER stressin täysin tukossa yhdistelmähoito aiheuttaman JNK aktivaation ja myöhemmät apoptoottisen solukuoleman. Lisäksi, yhdistetty hoito tehokkaasti indusoi mitokondrioiden translokaatio katkaistun Bax, häiritsi mitokondrion kalvon potentiaalia, ja tumaansiirtymiseen AIF, jotka kaikki on tehokkaasti estetty JNK-inhibiittori. Caspases 3, 8 ja 9 aktivoitiin yhdistelmähoito mutta estämällä näiden kaspaasien ei kumonnut apoptoosiin osoittaa kaspaasin aktivaatio ollut vähäinen rooli apoptoosin.

Johtopäätökset /merkitys

β- lap aiheuttaa NQO1 riippuvan säteilylle herkäksi syöpäsoluja. Kun NQO1

+ soluja käsitellään yhdistelmällä IR- ja β-kierros, positiivista palautetta sääntelyn välillä ERK ja ROS johtaa ER stressiä aiheuttavat JNK aktivointi ja mitokondrioiden translokaation katkaistun Bax. Pienenemisestä mitokondrion kalvon johtaa translokaatio vaihtoehtoisten ja apoptoosin.

Citation: Park M-T, Song M-J, Lee H, Oh E-T, Choi B-H, Jeong S-Y, et al. (2011) β-lapatsoni lisää merkittävästi vaikutus ionisoivan säteilyn Syy Mitokondrioiden Apoptosis kautta JNK Activation syöpäsoluissa. PLoS ONE 6 (10): e25976. doi: 10,1371 /journal.pone.0025976

Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 1. kesäkuuta, 2011; Hyväksytty: 14 syyskuu 2011; Julkaistu: 06 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Park et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Korea Health 21 R 0,05. (B) Soluja käsiteltiin 2 uM β-kierros ja sitten altistettiin kasvaville annoksia IR 30 min käsittelyn jälkeen β-kierros. 14 päivän jälkeen solut pisteytettiin pesäkkeiden muodostumista. Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM. (C) Soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros varten ilmoitettu kertaa. Prosenttiosuus solujen osa-G1-DNA-pitoisuus määritettiin virtaussytometrialla. Tulokset kolmen erillisen kokeen ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM.

Analysoimme vaikutus β-kierros IR aiheuttama klonogeeniset kuoleman NQO1

– MDA-MB-231 ja NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja. Solut altistettiin eri annoksille IR: n läsnä tai poissa ollessa 2 uM β-kierros ja klonogeenisten eloonjääminen määritettiin kuten on esitetty kuviossa. 1B. Säteily eloonjäämiskäyriä yhdistelmähoito normalisoitiin varten kuolemaan β-kierroksen yksin. Säteily selviytyminen käyrä yhdistettynä hoidon IR ja β-kierros oli identtinen NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja. Toisaalta, säteily selviytymisen käyrä yhdistettyjen hoitoon NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen oli huomattavasti jyrkempi erityisesti alemman säteilyannoksia kuin IR hoito yksinään aiheuttivat merkittäviä lasku olkapää selviytymisen käyrä. Vähentäminen lapa osoitti, että β-kierroksen esti korjaus subletaaleille säteilyn vahinkoja NQO1

+ soluissa, mutta ei NQO1

– soluja.

Tutkimme yhdistetty vaikutus IR ja β-kierros on apoptoottinen solukuolema NQO1

– MDA-MB-231 ja NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja. Soluja käsiteltiin 10 Gy IR yksinään, 2 uM β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros varten eripituisia aikoja, ja apoptoottista solukuolemaa arvioitiin. Vaikka apoptoosin NQO1

+ – MDA-MB-231-soluissa indusoiman IR yksinään oli noin 13 ja 14%: iin 24 ja 48 tuntia, vastaavasti, β-lap yksin aiheuttama apoptoosin noin 18 ja 40%: ssa soluista 24 ja 48 h, vastaavasti (Fig. 1 C). Yhdistetty hoito IR ja β-kierroksen huomattavasti lisääntynyt apoptoottisen solukuoleman NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen; noin 58 ja 87% soluista oli apoptoottisia 24 ja 48 tuntia, vastaavasti. Päinvastoin, vuonna NQO1

– MDA-MB-231-solujen, ei merkittävää apoptoosia jälkeistä käsittelemällä IR tai β-kierroksen yksin tai jopa yhdistelmä IR- ja β-kierros, todennäköisesti johtuu NQO1 puutos ja mutantti muoto p53 ilmaistu NQO1

– MDA-MB-231-solujen [13].

Yhdistetty käsittely IR ja β-kierros merkittävästi indusoi ROS sukupolvi NQO1

+ – MDA-MB -231 solut

Tutkimme osallistumista ROS yhdistetyssä hoidossa aiheuttaman apoptoottisen solukuoleman NQO1

– MDA-MB-231 ja NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja. Ensin mitataan ROS DCF värjäystä. Verrattuna yksittäisiin hoidon IR tai β-kierros, yhdistelmähoito aiheutti huomattavasti enemmän kasvua ROS tasot 3 h NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen mutta ei NQO1

– MDA-MB-231 (Fig. 2A). Olemme edelleen vahvisti ROS sukupolvi yhdistetyn hoidon IR ja β-kierros käyttäen toista ROS havaitseminen väriaine, dihydroethidium (DHE). Kuten kuvassa 2B, havaitsimme selvästi lisääntynyt ROS sukupolven NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen mutta ei NQO1

– MDA-MB-231-solujen jälkeen yhdistettynä hoidon IR ja β-kierros . Sen määrittämiseksi, oliko solunsisäisten ROS tasoilla liittyi suoraan apoptoottisen solukuoleman, esikäsittelimme NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen kanssa antioksidantin NAC ennen altistamalla solut IR ja β-kierros. Kuten kuviossa 2C on esitetty, esikäsittely NAC vähensi merkittävästi apoptoottisen solukuoleman aiheuttama yhdistettynä hoidon IR ja β-kierros. Lisäksi esikäsittely NAC tehokkaasti vaimensi klonogeeniset solukuoleman aiheuttama yhdistelmähoito IR ja β-kierros (Fig. 2D). Nämä havainnot viittaavat siihen, että induktio ROS kriittisesti edistää apoptoottista ja klonogeeniset solukuoleman aiheuttama yhdistettynä käsittely IR ja β-kierros NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja.

(A) ja (B) Soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros varten ilmoitettu kertaa. 3 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin 10 uM H2DCF-DA, ja 4 uM DHE, vastaavasti, 30 minuuttia ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla. Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM. (C) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 24 h läsnä ollessa tai puuttuessa NAC (10 mM). 24 tunnin jälkeen solujen prosenttiosuus sub-G1-DNA-pitoisuus määritettiin virtaussytometrialla. Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM. (D) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin yhdistelmällä IR (2 Gy) ja β-kierros (2 uM) läsnä ollessa tai poissa ollessa NAC (10 mM). Solujen annettiin kasvaa 10-14 päivä ja värjättiin 0,5% kristalliviolettia, ja pisteytettiin pesäkkeiden muodostumista. Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM. * Merkittävä ero solujen läsnä tai poissa NAC jälkeen yhdistettynä hoidon IR ja β-kierros, p 0,05.

β-kierros yhdessä IR nopeasti aktivoi ERK ja JNK, johtava ja apoptoottisen solukuoleman

paljastaa mahdollisen osallistumisen MAPK että apoptoottisen solukuoleman aiheuttama yhdistettynä käsittely IR ja β-kierros, tutkimme tasot aktivoituja muotoja MAPK vuonna NQO1

– MDA-MB-231 ja NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen Western blot -analyysillä käyttäen anti-fosfo-vasta-aineita. Kuten kuviossa 3A, vuonna NQO1

– MDA-MB-231-solujen, IR yksinään hieman lisääntynyt fosforylaatioon ERK ja JNK taas β-kierroksen yksin aiheutti vain vähän muutoksia tasojen fosforyloidun ERK ja JNK. Vaikutus yhdistetyn hoidon oli samanlainen IR yksinään. Fosforylaatio p38 MAPK NQO1

– MDA-MB-231-soluissa oli negatiivinen jälkeen joko yhden tai yhdistettynä hoitoihin IR ja β-kierros. Kuitenkin NQO

+ – MDA-MB-231-solujen, yhdistelmähoito johti nopeaan ylössäätöä fosforyloidun ERK ja JNK verrattuna hoidon IR yksinään tai β-kierroksen yksin (Fig. 3A). ERK aktivointi ilmeni 0,5 tuntia, ja pysyi koholla 3 h kuluttua yhdistelmähoito. Lisäksi, JNK aktivointi alkoi nousta 0,5 h, mutta pieneni 2 h kuluttua yhdistettynä hoidon NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja. Yhteenlaskettu solujen tasot ERK ja JNK pysyi vakiona. IR hoito lisäsi fosforylaatioon p38 MAPK, kun taas β-kierroksen käsittely ei aiheuttanut muutosta fosforylaatioon p38 MAPK. Fosforylaation taso p38 MAPK jälkeen yhdistelmähoito oli pienempi kuin hoidon jälkeen IR yksinään, mikä osoittaa, β-kierros tukahdutetaan IR-indusoidun aktivaation p38 MAPK NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja (Fig. 3A). Tutkia suhdetta aktivointi MAPK ja apoptoottisen solukuoleman, esikäsittelimme NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen SP600125, PD98059 tai SB203580, inhibiittorit JNK, MEK /ERK, ja p38 MAPK, vastaavasti, ennen käsittelyä IR ja β-kierros. Kuten on esitetty kuviossa 3B, PD98059 ja SP600125 vähensi tehokkaasti apoptoottisen solukuoleman aiheuttama yhdistetty käsittely 56%: sta 24% ja 13%, vastaavasti, kun taas SB203580 oli tehoton. Tutkimiseksi edelleen osallistumisesta ERK ja JNK2 että apoptoottisen solukuoleman aiheuttama yhdistettynä käsittely IR ja β-kierros, esikäsittelimme NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen siRNA: t kohdistamista ERK ja JNK2. Vastaa tuloksia, jotka saatiin farmakologisesta estäjien, spesifinen esto ERK ja JNK2 siRNA: illa lähes kokonaan poisti apoptoottisen solukuoleman aiheuttama yhdistetyn hoidon (Fig. 3C). Nämä tulokset osoittavat, että ERK ja JNK toimivat tärkeänä välittäjinä apoptoottisen solukuoleman aiheuttama yhdistettynä käsittely IR ja β-kierros NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja.

(A) NQO1

– tai NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros varten ilmoitettu kertaa. Tulokset edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla. (B) ja (C) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 24 h läsnä ollessa tai puuttuessa PD98059 (30 pM ), SP600125 (30 uM), SB203580 (30 uM) tai siRNA kohdistaminen ERK1 /2 tai JNK2. Prosenttiosuus solujen osa-G1-DNA-pitoisuus määritettiin virtaussytometrialla. Tulokset kolmen erillisen kokeen ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM.

Positiivinen palaute sääntelyn välillä ROS ja ERK aiheuttama yhdistettynä käsittely IR ja β-kierros on välttämätöntä aktivointi JNK

Voit selvittää ROS sukupolvi on mukana aktivointiin ERK ja JNK yhdistetyn hoidon IR ja β-kierros, esikäsittelimme NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen kanssa antioksidantin NAC ennen hoidon IR ja β -lap. Kuten kuviossa 4A on esitetty, aktivointi ERK ja JNK yhdistetyn hoidon estyi täysin esikäsittely NAC. Olemme ensi tutkinut osuus ERK ja JNK ROS sukupolvi aiheuttaman kombinaatio. Käsittelimme NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen siRNA: t kohdistamista ERK ja JNK2 ennen hoidon IR ja β-kierros. Kuten kuviossa 4B, siRNA-välitteinen ERK knockdovvn esti tehokkaasti ROS sukupolvi, joka määritetään DCF, aiheuttama β-kierros yksin ja vielä suuremmassa määrin yhdistetty hoito, kun taas siRNA kohdistaminen JNK2 ei vaimentanut ROS sukupolvi.

(A) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 30 min läsnä ollessa tai puuttuessa NAC. Tulokset edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla. (B) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 3 h: n läsnä tai poissa ollessa siRNA kohdistaminen ERK1 /2 tai JNK2. 3 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin 10 uM H2DCF-DA 30 minuutin ajan ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla. Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM. (C) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 30 min läsnä ollessa tai puuttuessa PD98059 tai SP600125. Tulokset edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin.

edelleen pohtimaan mahdollisia ylikuuluminen välillä ERK ja JNK, me esikäsitellään NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen kanssa PD98059 tai SP600125. Kuten on esitetty kuviossa 4C, aktivointi ERK ja JNK yhdistetyn hoidon kumosi kokonaan esikäsittelemällä PD98059 ja SP600125, vastaavasti. Lisäksi PD98059 esti tehokkaasti yhdistelmä hoidon aiheuttaman JNK: n aktivaatiota, kun taas SP600125 ei vaimentanut aktivointi ERK, mikä osoittaa, että ERK on ylävirran aktivaattori JNK (Fig. 4C). Nämä tulokset osoittivat, että β-kierros yhdessä IR johtaa positiivista palautetta sääntelyn välillä ROS ja ERK aktivointi, jotka saattavat edistää JNK aktivointia.

ROS sukupolvi aiheuttama yhdistettynä käsittely IR ja β-kierros tarvitaan induktio ER stressin

tutkimme seuraavaksi yhdistettynä hoidon IR ja β-kierros indusoi ER stressiä NQO1

+ – MDA-MB-231-soluihin käyttämällä fosforylaatioon eIF2α ja CHOP ilme. Kuten kuviossa 5A, IR yksinään ei muuttanut fosforyloidun eIF2α (p-eIF2α) tasot ja CHOP ilmaisun, ja β-kierroksen yksin hieman lisääntynyt p-eIF2α ja CHOP ilme. Kuitenkin yhdistelmähoito selvästi indusoi p-eIF2α ja lisääntynyt CHOP ekspressiotaso (Kuva. 5A). Tutkimaan edelleen osallistumisesta ER stressin apoptoottisen solukuoleman aiheuttama yhdistelmähoito IR ja β-kierros, esikäsittelimme NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen Salubrinal (Sal), ER stressiä estäjä. Kuten kuviossa 5B on esitetty, Sal ehkäistä tehokkaasti yhdistelmä hoidon indusoimaa apoptoottista solukuolemaa. Nämä tulokset osoittavat, että ER stressi on merkittävä tekijä yhdistetyn hoidon aiheuttama apoptoottisen solukuoleman NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja.

(A) NQO1

+ – MDA-MB -231 soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros varten ilmoitettu kertaa. Solulysaatit altistettiin Western blot-analyysi. Tulokset edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla. (B) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 24 h läsnä ollessa tai puuttuessa Sal (10 uM). 24 tunnin jälkeen solujen prosenttiosuus sub-G1-DNA-pitoisuus määritettiin virtaussytometrialla. Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM. (C) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksinään β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 3 h: n läsnä tai poissa ollessa Sal (10 uM). 3 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin 10 uM H2DCF-DA 30 minuutin ajan ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla. Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM. (D) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 30 min läsnä ollessa tai puuttuessa NAC. Tulokset edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla. (E) ja (F) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 30 min läsnä ollessa tai puuttuessa Sal, SP600125 tai PD98059. Tulokset edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla.

tutkimme seuraavaksi suhde ROS: n syntyminen ja ER-stressi NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin yhdistelmällä IR ja β-kierros. Kuten kuviossa 5C esitetään, esikäsittely Sal ei vaimentanut ROS sukupolven aiheuttama yhdistelmähoito, kun taas esikäsittely NAC esti tehokkaasti fosforylaatiota eIF2α (Fig. 5D), mikä osoittaa, että ROS: n syntyminen indusoi yhdistetyn hoitoa tarvitaan induktioon ER stressiä.

ER stressin aiheuttama yhdistettynä käsittely IR ja β-kierros tarvitaan aktivointi JNK

analysoida suhdetta ER stressin ja MAPK (ERK ja JNK), me ensimmäinen tutkittiin, mikä vaikutus Sal aktivoinnista ERK ja JNK. Kuten on esitetty kuviossa 5E, esikäsittely Sal tehokkaasti esti JNK: n aktivaatiota aiheuttama yhdistelmähoito, mutta ei vaimentanut aktivointi ERK. Edelleen vahvistaa keskeistä asemaa MAPK induktioon ER stressiä, me esikäsitellään NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen kanssa PD98059 tai SP600125. Kuten on esitetty kuviossa 5F, yhdistetty hoito-indusoitua fosforylaatiota eIF2α estyi täysin PD98059, mutta ei SP600125. Nämä tulokset osoittavat, että ERK on ylävirran aktivaattori ER stressin vastaa JNK aktivoinnin vastauksena yhdistettynä hoidon IR ja β-kierros.

Yhdistetty käsittely IR ja β-kierros indusoi apoptoottista solukuolemaa läpi tumaansiirtymiseen AIF

Koska aktivaatio kaspaasi-reitin on tärkeä mekanismi, joka indusoi apoptoottista solukuolemaa [14], tutkimme osallistumista caspases apoptoottisessa vastauksena yhdistetty hoitoon NQO1

+ – MDA-MB -231 soluja IR ja β-kierros. Kuten on esitetty kuviossa 6A, yhdistelmähoito johti aktivoinnit kaspaasi-8, -9 ja -3. Huomaa, että kaspaasi 9 ja 3 esiintyi ennen kaspaasi 8. IR tai β-kierroksen yksin ei aiheuttanut ilmeisiä aktivoinnit näiden kaspaasien. Sytokromi c vapautuu mitokondriot on raportoitu muodostaa kompleksin prokaspaasi-9 ja apoptoottisten proteaasi-aktivoiva tekijä-1 (Rahastolla-1), jolloin aktivointi prokaspaasi-9 [14]. Niinpä määritettiin myös yhdistettynä hoidon IR ja β-kierroksen indusoi vapauttamaan sytokromi C mitokondriot sytosoliin. Kuten kuviossa 6B, yhdistelmähoito tehokkaasti nosti tasoa sytokromi c sisällä sytosolifraktion 12 tuntia, kun taas IR tai β-kierroksen yksin ei. Sitten tutkittiin vaatimus kaspaasin yhdistetyn hoidon aiheuttaman apoptoosin avulla laajakirjoinen kaspaasiestäjä, z-VAD-fmk. Kuvio 6C osoittaa, että z-VAD-fmk esti tehokkaasti kaspaasien aktivaatio aiheuttaman yhdistelmähoito. Yllättäen kuitenkin, z-VAD-fmk vain osittain vähentää yhdistetyn hoidon indusoimaa apoptoottista solukuolemaa noin 51%: sta 42% (Fig. 6D). Nämä tulokset osoittavat, että apoptoottisen solukuoleman aiheuttama yhdistettynä hoidon IR ja β-kierros tapahtuu, vaikka kaspaasien aktivaatio estyy.

(A) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsitelty IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros varten ilmoitettu kertaa. Tulokset edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla. (B) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 12 tuntia. Sytosolisia fraktioita NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja valmistettiin ja alistettiin Western blot-analyysi. Tiedot edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa. Tulokset edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla. (C) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin yhdistelmällä IR ja β-kierros 12 tuntia, kun läsnä tai poissa ollessa z-VAD-fmk. Tulokset edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla. (D) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 24 h läsnä ollessa tai puuttuessa z-VAD-fmk (30 gM ). 24 tunnin jälkeen prosenttiosuus solujen osa-G1-DNA-pitoisuus määritettiin virtaussytometrialla. Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM. (E) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 24 tuntia. Nuclear fraktiot NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja valmistettiin ja alistettiin Western blot-analyysi. Tiedot edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa. (F) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros 24 tunnin läsnä tai poissa siRNA kohdistaminen AIF. 24 tunnin jälkeen prosenttiosuus solujen osa-G1-DNA-pitoisuus määritettiin virtaussytometrialla. Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM. (G) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsiteltiin yhdistelmällä IR ja β-kierros 24 h läsnä ollessa tai puuttuessa NAC, PD98059, Sal tai SP600125. Nuclear fraktiot valmistettiin ja alistettiin Western blot-analyysi. Tiedot edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa.

Koska AIF mitokondriot-lokalisoitu flavoproteiini, tiedetään olevan mukana induktioon kaspaasin riippumaton apoptoottisen solukuoleman [7], seuraavan kerran tutkittiin, AIF on rooli induktio solukuoleman yhdistettynä käsittely IR ja β-kierros. AIF vapautuu mitokondriot vastauksena solukuoleman ärsykkeille, tämän jälkeen siirtyy tumaan, jossa se saa aikaan DNA: n fragmentoituminen [7]. Subsellulaariset osoitti, että yhdistelmähoito dramaattisesti indusoi tumaansiirtymiseen AIF, kun taas IR tai β-kierroksen yksin aiheutti pieni nousu AIF tumassa (kuvio. 6E). Lisäksi siRNA-välitteinen AIF pudotus vähentää tehokkaasti yhdistelmähoidon aiheuttama apoptoottisen solukuoleman 55%: sta lähes ohjaus tasolle (Fig. 6F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että tumaansiirtymiseen AIF tarvitaan induktioon apoptoottisen solukuoleman yhdistettynä käsittely IR ja β-kierros.

määritellään tarkemmin roolit ROS, ERK, ER stressiä ja JNK tumaansiirtymiseen AIF jälkeen yhdistettynä hoidon IR ja β-kierros, esikäsittelimme NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen vastaavaan estäjien, NAC, PD98059, Sal tai SP600125, ja tutkia solunosasijaintia AIF. Kuten kuviossa 6G, ydinvoima translokaatiota AIF aiheuttama yhdistetty hoito oli täysin tukossa esikäsittelemällä NAC, PD98059, Sal tai SP600125. Nämä tulokset osoittavat, että ROS, ERK, ER stressiä ja JNK ovat ylävirtaan sijaitsevien aktivaattorien AIF-välitteisen solukuoleman aiheuttama yhdistettynä käsittely IR ja β-kierros.

Yhdistetty käsittely IR ja β-kierros indusoi mitokondrioiden translokaatio pilkottu Bax ja mitokondrioiden transmembraanisen mahdollisten

määrittämiseksi roolin mitokondrioiden väylän yhdistetyn hoidon aiheuttaman apoptoosin NQO1

+ – MDA-MB-231-solujen, ensin tutkittiin muutoksia Bcl-2 ja Bax ekspressiotasot, ja mitokondrion kalvon läpäisevä potentiaalia. Kuten kuviossa 7A, Bax tasot olivat merkittävästi pienentyneet vastauksena yhdistettynä hoidon IR ja β-kierros, mutta ei vastauksena yksittäisiin hoidon IR tai β-kierros. Ilmentymistasojen Bcl-2 pysyivät muuttumattomina yksittäisten tai yhdistetty hoito. On raportoitu, että Bax pilkotaan 21 kDa natiivi muoto 18 kDa fragmenttiin vastauksena kuoleman ärsykkeiden [15], [16]. Koska translokaatio 18 kDa pilkkoa Bax välillä sytosolista mitokondriot on raportoitu aiheuttavan laskuun mitokondrion transmembraanisen potentiaali ja vapautuivat proapoptogenic proteiinien mitokondrion [15], [16], me tutkimme, yhdistelmähoito aiheuttaa mitokondrioiden translokaatio katkaistun Bax . Kuten kuviossa 7B ja C, yhdistettiin hoidon IR ja β-kierros tehokkaammin nostivat 18 kDa pilkkoa Bax sisällä mitokondriofraktiosta kuin yksilöllistä IR tai β-kierros. Kuitenkin 18 kDa muoto Bax oli havaitsematon kokosolulysaateista jälkeen yhdistetyn hoidon (Fig. 7C). Koska katepsiini kaltainen proteaasi on ehdotettu olevan mukana nopea hajoaminen 18 kDa: n muotoon Bax sytosoliin [17], me esikäsitelty solut vaikutusta proteaasinestäjä MG132 tietää, miksi lohkaistaan ​​Bax puuttui kokosolulysaatissa jälkeen yhdistettynä käsittely IR ja β-kierros. Kuten on esitetty kuviossa 7D, kun soluja käsiteltiin yhdistelmällä IR ja β-kierros läsnä ollessa MG132, pilkkoa Bax havaittiin kokosolulysaatissa, mikä osoittaa, että pilkottu Bax hajoavat helposti sytosoliin jälkeen yhdistettynä hoidon IR ja β -lap. Siten 18 kDa: n muotoon Bax voi olla epävakaa sytosoliin mutta vakaa mitokondriofraktiosta jälkeen yhdistettynä hoidon IR ja β-kierros. Lisäksi kuten kuviossa 7E, yhdistelmähoito merkittävästi häirinneet mitokondrion kalvon läpäisevä potentiaali on ajasta riippuva tavalla, samaan aikaan havaitut muutokset Bax tasoilla. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmähoito aiheuttama solukuolema sisältää muutoksen mitokondrion transmembraani- potentiaalia välittävät solunsisäisiä uudelleenjako katkaistun Bax.

(A) NQO1

+ – MDA-MB-231-soluja käsitelty IR yksin, β-kierros yksinään tai yhdistelmänä IR ja β-kierros varten ilmoitettu kertaa. Solulysaatit altistettiin Western blot-analyysi. Tulokset edustavat Tyypillisessä kokeessa suoritettiin kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla.