Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yhä useammat raportit ovat osoittaneet, että erilaiset MikroRNA osallistuvat kasvainten synnyssä ja syövän etenemiseen. Suoritimme tämän tutkimuksen tunnistaa uusia miRNA jotka saattavat olla mukana keuhkosyöpää ja tutkimus niiden toiminnot. Testasimme ilmentyminen 450 miRNA keuhkoissa kasvain kudosten ja viereisen ei-syöpä kudoksiin. Huomasimme, että miRNA-545 oli vähemmän runsaasti syövän keuhkojen kudoksiin kuin viereisen ei-syöpä kudoksiin. Meidän lisätutkimukset osoittivat, että miR-545 tukahdutetaan solujen lisääntymistä

in vitro

ja

in vivo

. Olemme myös havainneet, että miR-545 aiheutti solukierron pysähtyminen G0 /G1 vaiheeseen ja indusoi solujen apoptoosia keuhkosyöpäsoluissa kohdentamalla sykliini D1 ja CDK4 geenejä. Vaikutukset sykliini D1 ja CDK4 alas-säädellä miR-545 olivat samankaltaisia ​​kuin aiheuttama siRNA sykliini D1 ja CDK4: n ja yli-ilmentyminen sykliini D1 ja CDK4 voi lakkauttaa miR-545 inhiboivan solujen lisääntymisen. Lopuksi miR-545 tukahdutetaan solujen proliferaatiota estämällä ilmentymistä sykliini D1 ja CDK4. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy uutta tietoa roolista miR-545 kehittämisessä keuhkosyövän ja osoittavat potentiaalinen sovellus miR-545 syöpähoidossa.

Citation: Du B, Wang Z, Zhang X, Feng S Wang G, hän J, et al. (2014) MicroRNA-545 vaimentaa soluproliferaation kohdistaminen sykliini D1 ja CDK4 Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (2): e88022. doi: 10,1371 /journal.pone.0088022

Editor: Liang-Hu Qu, Sun Yat-sen University, Kiina

vastaanotettu: 12 elokuu 2013; Hyväksytty: 02 tammikuu 2014; Julkaistu: 05 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Du et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 30870535 ja 90913017), yhdistelmä projekti Guangdong ja opetusministeriö (nro 2009B090300080 ja 2011B090400478), käyttöön otettu Innovatiivinen R 0,05, kertamuutos 0,5) ja keuhkosyöpä kudoksiin verrattuna viereisen ei-syöpä keuhkojen kudoksiin (kuvio . S1, taulukko S1 ja S2).

vahvista ilmentymisen miR-545, testasimme miR-545 ilmentymisen toisessa 10 potilasta. Huomasimme, että miR-545 tasot keuhkosyöpää kudoksiin olivat alle 50% näistä vierekkäisissä ei-syöpä keuhko kudoksia 14 25 potilasta, kun taas miR-545 tasot keuhkosyöpää kudoksiin oli yli kaksi kertaa kuin viereisten ei- syöpä keuhkojen kudoksiin 2 25 potilasta (Fig. 1A). Analyysi useita sarjaa vertailukelpoisten syöpä- ja viereisen ei-syöpä keuhkokudokset osoitti, että miR-545 oli vähemmän runsaasti keuhkosyöpään kudosten kuin viereisen ei-syöpä kudoksiin (Fig. 1 B). Tämä viittaa siihen, että miR-545 on ali-ilmentynyt keuhkojen kasvaimet ja voi toimia kasvaimia estävä.

(a) Suhteellinen miR-545 ilmentyminen 25 pariksi keuhkosyövän kasvainkudoksissa ja viereisen ei-syöpä kudoksiin. (B) Expression of miR-545 keuhkosyöpä kudoksiin verrattuna viereisen ei-syöpä kudoksiin. 5S rRNA käytettiin sisäisenä kontrollina. Aineisto analysoitiin käyttämällä 2

-ΔΔCt menetelmällä. *, P 0,05 (Wilcoxonin testi).

miR-545 Estää Cell Proliferation in vitro ja in vivo

Tunnistaa miRNA, jotka saattavat olla mukana solujen lisääntymisen, käytimme CCK-8 kit tutkia elinkelpoisuuden A549-soluja transfektoitiin kunkin 31 miRNA. Huomasimme, että A549-soluja oli transfektoitu miR-545 oli pienin solujen elinkykyä (Fig. 2).

A549 elinkelpoisuus mitattiin CCK-8 72 tuntia transfektion jälkeen kuhunkin miRNA. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. NC, ei-kohde-ohjaus; *, P 0,05; **, P 0,01 (Studentin t-testi).

Varmista, että miR-545 voi estää solujen lisääntymistä, me suorittaneet solunelinkykyisyysmääritys kolme solulinjojen. A549 ja H460-soluja, jotka on transfektoitu miR-545 jäljittelee osoitti pienempi solujen elinkyvyn kuin transfektoitu ei-kohde-ohjaus (Fig. 3A ja 3B); kuitenkin, HFL1 keuhkojen fibroblastit transfektoitiin miR-545 estäjä osoitti tehokkaampi soluproliferaatiota verrattuna transfektoitu kontrollina estäjän (Fig. 3C).

Transfektio miR-545 jäljittelee tukahduttaa elinkelpoisuutta (a ) A549-soluja ja (b) H460-soluja. (C) transfektion miR-545 estäjä lisää elinkelpoisuutta HFL1 soluja. (D) Kasvaimen kuvia paljaan hiiren ksenograftimallissa. (E) määrä ja (f) painot kasvaimia nude hiiren ksenograftimallissa. Tiedot esitetään keskiarvoina ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. *, P 0,05; **, P 0,01 (Studentin t-testi).

seuraavaksi käytettiin -tuumoriksenografti hiirimallissa testata vaikutusta miR-545 kasvaimen etenemiseen. A549-soluja, jotka on esikäsitelty miR-545 jäljittelee tai ei-kohde-ohjaus ja myöhemmin injektoitiin kateenkorvattomiin nude-hiiriin. Tuumorin tilavuus hiirillä, jotka saivat solut esikäsiteltiin miR-545 jäljittelee oli merkitsevästi (P ​​ 0,05) pienempi kuin hiirillä, jotka saivat käsiteltyjen solujen ei-kohde-ohjaus. Nämä erot tilavuuden ja painon havaittiin kasvainten korjattu hiiriltä lopetettiin päivänä 48 (Fig. 3d, 3E ja 3F). Tulokset osoittavat, että miR-545 voidaan merkittävästi estää keuhkosyöpäsolua kasvua nude hiiren ksenograftimallissa.

miR-545 indusoi solukierron pysähtymisen klo G0 /G1-vaiheen

edu määritys paljasti, että molemmat A549 ja H460-solut transfektoitu miR-545 matkii sisällytetty vähemmän edu kuin transfektoitu ei-kohde ohjaus (Fig. 4A-C). Sen sijaan, HFL1 transfektoitujen solujen miR-545-estäjän yhdistetty enemmän edu kuin transfektoitu ohjaus inhibiittorin (Fig. 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-545 voivat estää DNA-synteesiä. Edelleen koetin sääntelymekanismi (t) miR-545, teimme solusyklin määrityksessä. Suurempi osuus A549 ja H460 transfektoitu miR-545 jäljittelee olivat G0 /G1 vaiheeseen verrattuna transfektoitu ei-kohde ohjaus (Kuva. 4E ja 4F). Sitä vastoin pienempi osa HFL1 soluja transfektoitiin miR-545-estäjän olivat G0 /G1 vaiheeseen verrattuna transfektoitu kontrollina anti-miRNA-estäjä (Fig. 4G). Nämä tulokset osoittavat, että miR-545 pidätystä solusyklin G0 /G1 vaiheeseen, estäen siten DNA-synteesiä ja solujen lisääntymistä. Lisäksi olemme havainneet, että miR-545 indusoi apoptoosia ja kuoleman A549 ja H460-soluissa (kuvio. 4H ja 4I).

(a) Edu sisällyttäminen A549 mitattiin konfokaali laser mikroskoopilla. Transfektion miR-545 estää DNA-synteesiä (b) A549-soluja ja (c) H460-soluja. (D) transfektio HFL1 solujen miR-545-estäjän lisää DNA-synteesiä. Transfektion miR-545 lisää solujen prosenttiosuus G0 /G1 vaiheeseen (e) A549-soluja ja (f) H460-soluja (g) transfektio HFL1 solujen miR-545 vähentää solujen prosenttiosuus G0 /G1 vaiheeseen . miR-545 indusoi apoptoosia (h) A549 ja (i) H460-soluissa. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. NC, ei-kohde miRNA ohjaus; *, P 0,05; **, P 0,01 (Studentin t-testi).

miR-545 Suoraan tavoitteet sykliini D1 ja CDK4: n

Käytimme Targetscan ohjelmisto ennustaa mahdollisia kohteita on miR-545 . Satojen ennusti tavoitteita, päätimme CASP8AP2, DDX58, sykliini D1, MMM, CDK4 ja PRKCE kuten oletetun tavoitteita, koska ne saattavat olla mukana solusyklin tai apoptoosin. Kloonasimme 3’UTRs näiden geenien osaksi pmirGlo plasmidiin ja tutki miR-545 voi estää näiden geenien ilmentymistä, jonka lusiferaasimääritystä. Lusiferaasimääritystä osoitti, että miR-545 jäljittelee inhiboi kahden toimittaja konstruktit, jotka sisälsivät 3’UTR joko sykliini D1 tai CDK4: n (Fig. 5A). Lisäksi testata onko sykliini D1 ja CDK4 ovat kohdistu suoraa miR-545, me mutatoitunut ennustettu sitoutumiskohta miR-545 on 3’UTRs Molempien geenien. Olemme havainneet, että miR-545 ei inhiboi toimittaja konstruktit, jotka sisälsivät mutantti 3’UTRs (Fig. 5B).

(a) miR-545 inhiboi lusiferaasin sisältävä 3’UTR sykliini D1 tai CDK4 geeni. pmirGlo plasmidit, jotka sisältävät villin tyypin (WT) 3’UTRs ja CASP8AP2, DDX58, sykliini D1, MAF, CDK4, tai PRKCE geeni kotransfektoitiin A549-soluja ohjaus- miRNA tai miR-545. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin 48 h transfektion jälkeen. Normalisoitu suhde lusiferaasiaktiivisuudeksi laskettiin (Rluc

miR-545 /Luc

miR-545) /(Rluc

NC /Luc

NC). (B) miR-545 ei inhiboi lusiferaasin konstrukteja, jotka sisältävät mutatoidut (Mut) 3’UTR sykliini D1 tai CDK4-geeni. (C) runsaus sykliini D1 ja CDK4 proteiinit analysoitiin A549, H460, ja HFL1 solujen western blottauksella transfektion jälkeen hoitojen. (D) tasot sykliini D1 ja CDK4 proteiinit kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 (Studentin t-testi).

tarkasteltiin myös ilmaus endogeenisen sykliini D1 ja CDK4 geenit sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Huomasimme, että miR-545 alensi CDK4 mRNA A549-soluja, mutta ei vaikuta tasoon sykliini D1 mRNA (kuva. S2). Olemme kuitenkin havaittu, että A549 ja H460-solut transfektoitu miR-545 oli alhaisempi sekä sykliini D1 ja CDK4 proteiineja kuin transfektoitu ei-kohde ohjaus (Kuva. 5C ja 5D). Lisäksi HFL1 transfektoitujen solujen miR-545 estäjä oli korkeampi sekä sykliini D1 ja CDK4 proteiineja kuin transfektoitu NC estäjien (Fig. 5C ja 5D).

miR-545 esti syövän leviämisen mukaan kohdistaminen sykliini D1 ja CDK4

sen tutkimiseksi, onko miR-545 inhiboi solujen elinkelpoisuus kohdistamalla sykliini D1 ja CDK4: n, käytimme siRNA: t ekspression inhiboimiseen sykliini D1 ja CDK4: n geenit; tulokset olivat samanlaisia ​​kuin edellä on kuvattu miR-545. Esimerkiksi, käyttämällä siRNA: iden vaientaa joko sykliini D1 tai CDK4: n vähensi elinkelpoisuutta A549-solut (Fig. 6A). SiRNA-välitteinen tukahduttaminen sykliini D1 ja CDK4 geenien aiheuttamaa solusyklin pysähtyminen G0 /G1 vaiheeseen (Fig. 6B), esti edu sisällyttäminen (Fig. 6C ja 6D) ja indusoi apoptoosia A549-solut (Fig. 6E). Lisäksi yliekspressio sykliini D1 ja /tai CDK4 geenit voivat merkittävästi kumota miR-545 inhiboivan vaikutuksen A549 solun kasvua (Fig. 6F). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että sykliini D1 ja CDK4 geenit ovat kohdistu suoraa miR-545.

(a) miR-545 matkii ja siRNA esti A549 solujen elinkelpoisuuden 72 tuntia transfektion jälkeen. (B) solusyklin pidätettiin G0 /G1 vaiheeseen transfektion jälkeen A549-solujen miR-545 ja siRNA kohdistaminen sykliini D1 ja CDK4. miR-545 ja siRNA aiheuttama DNA-synteesin estoa määritettynä edu sisällyttämällä määritys käyttäen (c) konfokaali laser mikroskopian ja (d) virtaussytometria. (E) ali sykliini D1 ja CDK4 indusoi solujen apoptoosia A549-soluja. (F) yli-ilmentyminen sykliini D1 ja CDK4 poistetaan aiheuttama esto miR-545. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. Studentin t-testiä käytettiin (a) – (e); yksisuuntainen ANOVA käytettiin (f).

Keskustelu

tutkimus osoittaa, että miR-545 on ali-ilmentynyt keuhkosyövän kasvaimia, ja miR-545 on raportoitu olevan ali-ilmentynyt in mahakarsinoo- [23]. Lisäksi miR-545 estää proliferaatiota keuhkosyövän solujen sekä

in vitro

ja

in vivo

. Nämä tulokset osoittavat miR-545 voisi toimia tuumorisuppressori keuhkosyöpään.

tutkimus paljastaa, että sykliini D1 ja CDK4 geenit ovat kohdistu suoraa miR-545. miR-545 estää sykliini D1 ja CDK4 geeniekspression tunnustamalla sekvenssit niiden 3’UTRs. Lisäksi yli-ilmentyminen sykliini D1 ja CDK4 voi kumota proliferaation esto aiheuttamaa miR-545 jäljittelee. Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-545 inhiboi solujen proliferaatiota suoraan kohdistuksen sykliini D1 ja CDK4. Aiemmat tutkimukset raportoivat, että ilmaus sykliini D1 ja CDK4 ihmisen keuhkosyöpä kudoksia on huomattavasti suurempi kuin normaalissa keuhkojen kudoksissa [7], [8]. Tuloksemme osoittavat, että yli-ilmentyminen sykliini D1 ja CDK4 keuhkosyövän kudoksissa voi osittain johtua ali miR-545.

Lopuksi miRNA profilointi tulokset osoittavat, että miR-545 on yhtä runsaasti ihmisen keuhkosyövän kudosten kuin viereisissä ei-syöpä keuhkojen kudoksia. miR-545 estää proliferaatiota keuhkosyöpään solujen tukahduttaa ilmaus sykliini D1 ja CDK4 geenejä. Ymmärryksen lisääntyessä miR-545 säätelyhäiriötä keuhkojen syöpäsoluja edistää ymmärrystämme molekyylitason mekanismeja vastuussa keuhkosyöpään. Lisäksi miR-545 voisi olla potentiaalinen kohde keuhkosyövän terapeuttiseen hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Saimme kirjallinen suostumus kaikilta potilailta, ja kaikki pöytäkirjat hyväksynyt Institutional Review Board ensimmäisen Affiliated sairaala Guangzhou Medical College. Kaikki ihmisen materiaaleja käytettiin mukaisesti politiikan Institutional Review Board. Eläin Tutkimuksen hyväksyi ehdotuksen Institutional Animal Care ja käyttö komitean Guangzhou Institutes of biolääketieteen ja terveyden (IACUC 2012010). Kaikki koetoimenpiteet joissa eläimet tehtiin mukaisesti Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals ja tehtiin mukaan institutionaalisten eettisiä ohjeita eläinkokeista.

Solulinjat

Ihmisen keuhko syöpäsolun linjat A549 (ATCC) ja NCI-H460 (H460, ATCC) saatiin tri Duanqing Pei Lab Guangzhoun Institutes of biolääketieteen ja terveyden ja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (1640, GIBCO, NY, USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Hyclone, UT, USA). Normaali keuhko fibroblastisolulinjassa HFL1 hankittiin Kiinan tiedeakatemia Cell Bank of Type Culture Collection (CBTCCCAS, Shanghai, Kiina) ja viljeltiin F-12K keskipitkän (Jinuo, Hangzhou, Kiina) täydennettynä 10% FBS. Kaikki solut viljeltiin kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Kudosnäytteiden Saatiin keuhkosyöpä Potilaat,

Sekä syöpä- ja viereisen ei-syöpä keuhkojen kudosnäytteistä saatiin Guangzhou Institute of Respiratory Disease, joka liittyy ensimmäisen Affiliated sairaala Guangzhou Medical University (Guangzhou, Kiina). Kirurgisesti poistettu näytteitä säilytettiin nestemäisessä typessä käyttöön asti. Asiaa ominaisuudet tutkittu aiheita on esitetty taulukossa S3.

Transfektio

Kaikki siRNA: t, miRNA jäljittelee, ja miRNA inhibiittorit ostettiin Guangzhou RiboBio (RiboBio, Guangzhou, Kiina) ja transfektoitiin -soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life Technologies, CA, USA) valmistajan suosittelemia. Solut transfektoitiin miRNA jäljittelee ja inhibiittorit pitoisuutena 50 nM. Sekvenssit siRNA: iden ovat seuraavat: si-sykliini D1 mielessä, 5′-UGG AAU AGC UUC UGG AAU UdTdT-3 ’, antisense, 3′-dTdAA CCU UAU CGA AGA CCU UAA-5′; si-CDK4 mielessä 5’-CAG CCG AAA CGA UCA AGG AdTdT-3 ’, antisense, 3′-dTdTG UCG GCU UUG CUA GUU CCU-5’.

proliferaatiomääritystä

solujen lisääntyminen mitattiin käyttäen Cell Counting Kit 8 reagenssia (CCK-8, Dojindo, Kyushu, Japani) tai CellTiter-Glo-reagenssia (Promega, WI, USA) mukaan valmistajan ohjeiden.

edu proliferaatiomääritystä

Sisällytetään tymidiinianalogi 5-etynyyli-2′-deoksiuridiinia (edu) DNA: han aikana DNA: n replikaation voidaan käyttää mittaamaan solujen käynnissä DNA: n replikaatio. Solujen prosenttiosuus sisältää Edu arvioitiin käyttämällä Cell-Light edu kuvantamisen havaitsemiseksi sarja sarjan valmistajan ohjeiden (RiboBio, Guangzhou, Kiina).

Cell Cycle määritys

Solut kerättiin 72 tunnin kuluttua transfektio ja kiinteä yön yli 70% jääkylmää etanolia. Kiinnityksen jälkeen solut käsiteltiin 500 ng /ul RNaasi A: lla 30 minuutin ajan ja sen jälkeen värjättiin 50 ng /ul propidiumjodidia (PI) 20 minuutin ajan. Solut kvantitoitiin käyttäen fluoresenssia soluerottelua (FACS, BD, NJ, USA), ja tiedot analysoitiin FlowJo ohjelmisto (Puu Star, OR, USA).

solukuoleman määritys

Solun apoptoosia analyysi suoritettiin PE anneksiini V apoptosis Detection Kit I (BD, NJ, USA) valmistajan protokollan, ja solut analysoitiin FACS: ää käyttäen (BD, NJ, USA).

RNA uuttaminen ja qRT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin solulinjoista ja kudosnäytteitä käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen Life Technologies, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Synteesi cDNA käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega, WI, USA) suoritettiin kuten valmistaja ehdottaa, ja satunnaisia ​​alukkeita (Takara, Shiga, Japani) käytettiin mRNA. QRT-PCR-analyysit suoritettiin käyttämällä SYBR Green RealMasterMix kit (Tiangen, Peking, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käänteistranskriptio ja qRT-PCR miRNA suoritettiin käyttäen Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Primer Set (RiboBio, Guangzhou, Kiina). Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmä [24]. Seuraavia alukkeita käytettiin analyysiin: sykliini D1 forward-aluke, 5′-CAA ATG GAG CTG CTC CTG GTG-3 ’, käänteinen aluke, 5′-CTT CGA TCT GCT CCT GGC AGG-3′; CDK4 forward-aluke, 5’-TGC CAA TTG CAT CGT TCA CCG AG-3 ’, käänteinen aluke, 5′-TGC CCA ACT GGT CGG CTT CA-3′; aktiini forward-aluke, 5’-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3 ’, käänteinen aluke, 5′- GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′; ja 5S rRNA eteenpäin aluketta, 5’-ACG GCC ATA CCA CCC TGA AC-3 ’, käänteinen aluke, 5′-GGC GGT CTC CCA TCC AAG TA-3’.

Plasmidin Hakemisto Rakentaminen

Euroopan 3’UTRs sykliini D1 ja CDK4: n geenit kloonattiin pmirGlo plasmidiin (Promega, WI, USA) välillä

Xho

I ja

Xba

I -kohdat käyttäen seuraavia alukkeita: sykliini D1 villityypin 3’UTR forward-aluke, 5′-ATA TCT CGA GCA GGT GCT CCC CTG ACA GTC CCT-3 ’, reverse-aluke, 5′-TAA TCT AGA TGG AAA CAT GCC GGT TAC ATG TTG GT-3′; CDK4 villityypin 3’UTR forward-aluke, 5’-ATA TCT CGA GGC AAT GGA GTG GCT GCC ATG GAA-3 ’, käänteinen aluke, 5′-TAA TCT AGA TTG ACA CAG AGT CTT GCT CTG TTG CCC A-3’ .

pmirGlo sisältävät plasmidit mutatoitunut sykliini D1 tai CDK4 3’UTR rakennettiin käyttäen KOD-plus -mutageneesitarvikkeissa (Toyobo, Osaka, Japani) mukaan valmistajan ohjeiden.

avoimet lukeminen runko ekspressiovektoreiden pReceiver_M02_cyclin D1, pReceiver_M02_CDK4, ja ohjaus- vektorin pReceiver_M02 ostettiin FulenGen Corporation (GeneCopoeia, MD, USA). Kaikki Lisätään tai mutatoituja sekvenssit varmistettiin sekvensoimalla.

Dual-Luciferase Assay

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille 1 päivä ennen transfektiota. Mirna jäljittelee (50 nM) ja plasmidi (5 ng /pl) transfektoida A549-solut. 48 h transfektion jälkeen, lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-Glo lusiferaasianalyysissä Kit (Promega, WI, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Western-blottaus

Solut otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen SDS-puskurissa (Beyotime, Shanghai, Kiina) valmistamiseksi kokonaisproteiinista otteita. Lyhyesti, kokonais-proteiinin uute erotettiin 12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja siirrettiin Immobilon-P siirto polyvinylideenifluoridia (Millipore, MA, USA). Kaivoa inkuboitiin huoneen lämpötilassa 5% naudan seerumin albumiinia (BSA), joka valmistettiin TBS-T-puskurissa 2 tunnin ajan. Kaivoa inkuboitiin primääristen vasta-ainetta laimennettuna 1:1,000 1% BSA: ta 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavana päivänä, kalvo inkuboitiin toissijaisen piparjuuriperoksidaasi (HRP) -konjugoitu vasta-ainetta laimennettuna 1:5,000 1% BSA: ta 4 ° C: ssa 6 h. Kalvo visualisoitiin inkuboinnin jälkeen HRP-substraattia (BeyoECL plus A /B, Beyotime, Shanghai, Kiina). Vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa olivat anti-sykliini D1 (sc-8396, Santa Cruz, CA, USA), anti-CDK4 (sc-260, Santa Cruz, CA, USA), anti-β-aktiini (A2066, Sigma, MO, USA), HRP-konjugoitua anti-hiiri-IgG (sc-2005, Santa Cruz, CA, USA), ja HRP-konjugoitua anti-kani-IgG: tä (sc-2004, Santa Cruz, CA, USA).

tuumoriksenografteja

6 h transfektion jälkeen miR-545 jäljittelee tai ohjata miRNA, A549-solut kerättiin ja suspendoitiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen pitoisuutena 1 x 10

6 solua /ml ja ruiskutetaan kummallakin puolella posterior kylkeen saman BALB /c, joilta puuttuu kateenkorva nude-hiirissä (5-6 viikkoa ikäisiä) ja 100 ui solususpensiota. Kasvaimen kasvu mitattiin 4 päivän välein. Kasvaimen tilavuus (V) seurattiin mittaamalla pituus (L) ja leveys (W) kasvaimen mittaharpilla ja laskettiin käyttäen kaavaa V = (L x W

2) /2 [25].

tilastollinen analyysi

tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD). P 0,05 pidettiin merkittävänä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 16.0 ohjelmistoa (Chicago, IL). Studentin t-testiä käytettiin analysoimaan merkitystä kahden ryhmän välillä. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin testaamaan merkitys joukossa enemmän kuin kaksi ryhmää. Analyysi miRNA ilmentymisen kliinisestä näytteestä suoritettiin käyttäen Wilcoxonin testi.

tukeminen Information

Kuva S1.

Mirna ilmentyminen keuhkosyövän kudoksiin ja viereisen ei-syöpä kudoksiin. Ilmaukset miRNA mitataan qRT-PCR. 5S rRNA käytettiin sisäisenä kontrollina. Heatmap edustaa yli-ilmentymisen (punainen) ja ali (vihreä) ja miRNA. Puuttuvat tiedot esitetään harmaalla värillä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0088022.s001

(TIF) B Kuva S2.

sykliini D1 ja CDK4 mRNA: t mitattiin qRT-PCR. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 (Studentin t-testi).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0088022.s002

(TIF) B Taulukko S1.

ilmentyminen miRNA keuhkosyövässä kudosta ja ei-syöpä keuhkojen kudoksia.

doi: 10,1371 /journal.pone.0088022.s003

(DOC) B Taulukko S2.

suhteellinen ilmentyminen 450 miRNA.

doi: 10,1371 /journal.pone.0088022.s004

(XLS) B Taulukko S3.

ominaisuudet kliinisen keuhkosyöpäpotilaiden.

doi: 10,1371 /journal.pone.0088022.s005

(DOC) B

Kiitokset

Olemme kiitollisia Dr. Pei Duaquing lahjasta A549 ja H460 solulinjoissa.