Krooninen sairaus

tiivistelmä

Protein arginiini Deiminases (PAD) katalysoivat translaation jälkeinen muuntaminen peptidyyli -arginiinin peptidyyliseriiniproteaasin-Citrulline kalsiumista riippuva, ​​peruuttamaton reaktio. Todisteet on syntymässä, että PAD osansa syövän synnyssä. Voit selvittää syöpään liittyvän toiminnallisia vaikutuksia tyynyjä, suunnittelimme pienimolekyylinen PAD estäjä (kutsutaan Chor-amidiini- tai CI-amidiini), ja testattiin vaikutusta tämän lääkkeen solusyklin. Tiedot ovat peräisin kokeista koolonkarsinoomasoluissa osoittavat, että CI-amidiini aiheuttaa G1 pidätys, ja että tämä oli p53-riippuvainen. Erillisessä koesarjassa, huomasimme, että CI-amidiini aiheutti merkittävän kasvun microRNA-16 (miRNA-16), ja että tämä lisäys oli myös p53-riippuvaista. Koska miRNA-16 on otaksuttu tuumorisuppressori miRNA, ja muut ovat havainneet, että miRNA-16 hillitsee, me arveltu, että p53-riippuvaisen G1 pidätys liittyy PAD esto oli puolestaan ​​riippuvaisia ​​miRNA-16 ilme. Tulokset ovat yhdenmukaisia ​​tämän hypoteesin. Samoin löysimme G1 pidätys on ainakin osittain johtuen kyvystä CI-amidiinifunktionaalisen välittämää ilmentymistä miRNA-16 tukahduttaa sen ”G1 liittyvät tavoitteet: sykliinejä D1, D2, D3, E1, ja CDK6. Tutkimuksemme valotetaan osaksi mekanismeja, joilla PAD esto voi suojata tai hoitaa paksusuolensyöpä.

Citation: Cui X, Witalison EE, Chumanevich AP, Chumanevich AA, Poudyal D, Subramanian V, et al. (2013) induktio mikroRNA-16 koolonkarsinoomasoluissa proteiini arginiinideiminaasi esto Aiheuttaa p53-Dependent solusyklin pysähtymiseen. PLoS ONE 8 (1): e53791. doi: 10,1371 /journal.pone.0053791

Editor: Michel Simon, CNRS-Toulousen yliopisto, Ranska

vastaanotettu: 25 lokakuu 2012; Hyväksytty: 05 joulukuu 2012; Julkaistu: 07 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Cui et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat seuraavat avustukset: National Institutes of Health myöntää 5R01CA151304 on LJH ja PRT (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

säädeltyyn proteiinia arginiinideiminaasi (PAD) aktiivisuus on ehdotettu olevan rooli puhkeamisessa ja etenemisessä useiden ihmisten sairauksia, kuten syöpää [1]. Tyynyt ovat perhe entsyymejä, jotka muuntavat peptidyyli-arginiini peptidyyliseriiniproteaasin-Citrulline (Arg → Cit) [2], prosessi nimeltä ”citrullination”. Nisäkkäät koodata 5 isotsyymien yksittäisessä evoluutiossa säilyneitä geeniklusterin, joka ihmisillä sijaitsee kromosomissa 1 (1p35-36) [3]. Nisäkkäiden PAD perheenjäsenet, jotka on nimetty PAD 1-4 ja PAD6, ovat erittäin liittyviä entsyymejä sekä sisällä ja välillä yksittäisten lajien. Kohonneet PAD-entsyymien ja /tai sitrullinoitujen proteiineja löytyy useita kroonisia sairauksia, mukaan lukien koliitti ja paksusuolen syöpä [1], [4], [5], [6], [7]. Tässä valossa, me olemme kehittäneet estäjiä PAD, ja tietyn inhibiittorin, jota kutsutaan Kloori-amidiini (Cl-amidiini), on osoitettu olevan sytotoksisuuden syöpäsolulinjoja vastaan ​​[8], ja niitä voidaan käyttää estämään ja hoitamaan korkeaa paksusuolen syövän riskiä taudin, haavaisen koliitin hiirillä [4].

MikroRNA (miRNA) ovat evolutiivisesti konservoituneita, 20- 25 nukleotidin mittainen, ei-koodaavaa RNA: ita, jotka sitoutuvat kohteisiinsa osittaisella komplementaarisen sekvenssin tunnustamista. Tällaiset Sitoutuminen johtaa joko mRNA: n hajoamisen tai esto kääntämisen, ja siksi tukahdutti ilmaus miRNA tavoitteet [9]. Selkärankaisten genomit ennustetaan koodaavan jopa 1000 ainutlaatuinen miRNA [10], joiden ajatellaan säätelemään vähintään 30% geenien [11]. Siksi ei ole yllättävää, että miRNA on erilaisia ​​biologisia toimintoja, kuten solujen jakautumisen, erilaistumisen ja apoptoosin. Tätä varten, miRNA-16 on oletettu tuumorisuppressori miRNA, ja säätyy alas eri ihmisen syövissä, mukaan lukien paksusuolen syöpä [12], [13], [14], [15], [16], [ ,,,0],17], [18]. Yksi tunnustettu funktio miRNA-16 on se, että se ohjaa solusyklin ensisijaisesti G1 solusyklin Checkpoint [13], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [ ,,,0],25], [26]. Näin ollen, ilman miRNA-16, syöpäsolut voivat kasvaa hallitsemattomasti. Tässä mielessä se on hiljattain osoitettu, että esto PAD by CI-amidiini aiheuttaa induktion p21

WAF1, joka johtaa G1 solusyklin pysähtymisen koolonkarsinoomasoluissa [27]. Rakennus pois nämä tulokset, ymmärtää paremmin mekanismeja, joilla CI-amidiini aiheuttaa G1 solusyklin pysähtymiseen, osoitamme tässä, että läsnäollessa p53, G1 pidätyksen aiheuttama CI-amidiini- riippuu miRNA-16.

Methods

Cl-amidiini-

synteesi Cl-amidiini, on kuvattu aiemmin [28], [29]. Stock pitoisuudet Cl-amidiini- laimennettiin 1 x fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS) välittömästi ennen lisäämistä soluviljelmään.

Soluviljely

HCT 116 villityypin (WT) koolonsyöpäsoluja hankittiin American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). HCT 116 p53

– /- koolonkarsinoomasoluja olivat peräisin HCT 116 WT soluja, ja tarjoamia B. Vogelstein ja K. Kinzler. HCT 116 WT ja p53

– /- soluja viljeltiin McCoyn elatusainetta (ATCC, Manassas, VA) täydennettynä 10% vastasyntyneen vasikan seerumia (NBCS; GIBCO /Life Technologies, Grand Island, NY), 2 mM glutamiinia (Biofluids , Rockville, MD), penisilliiniä (10 U /ml, Biofluids) ja streptomysiiniä (10 ug /ml, Biofluids). LS-180 paksusuolen syöpäsoluja, ostettu ATCC: ltä, viljeltiin Dulbeccon Modified Eagles Medium (Hyclone, Logan, Utah), jota oli täydennetty 10% vastasyntyneen vasikan seerumia (NBCS); GIBCO /Life Technologies), 2 mM glutamiinia (Biofluids, Rockville, MD), penisilliiniä (10 U /ml, Biofluids) ja streptomysiiniä (10 ug /ml, Biofluids).

siRNA ja miRNA transfektio

PAD4 siRNA, 3 x 10

5-soluja kasvatettiin väliaineessa 6 kuoppalevyille 1 vrk ennen transfektiota. Käyttäen INTERFERin siRNA transfektio Regent (Plyplus, iLllkirch, Ranska), solut transfektoitiin 20 nmol /L scambled siRNA negatiivisena kontrollina tai PAD4 Trilencer-27 ihmisen siRNA (Origene, Rockville, MD). 24 tunnin transfektion jälkeen solut käsiteltiin western blot analyysi tehon arvioimiseksi tinkiä. Solusyklin tutkittiin 24 h transfektion. Anti-miR-16 ja miR-16-matkivat (Ambion, Austin, TX) transfektion, 3 x 10

5-soluja kasvatettiin elatusaineessa, 6-kuoppaisille levyille 1 päivä ennen transfektiota. Käyttäen INTERFERin siRNA transfektio Reagent, solut transfektoitiin 45 nmol /l salattujen siRNA negatiivisena kontrollina ja anti-miR-16 tai HSA-miR-16. 24 tunnin transfektion jälkeen solut kerättiin RNaasitonta EP putket. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol valtionhoitaja. RNA-pitoisuus määritettiin Nanodrop 2000. 10 ng kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi käyttäen TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kanssa microRNA spesifisten alukkeiden HSA-miR-16 ja pieni tumaproteiini RNU6B (U6) normalisoinnin. qPCR mittaus miRNA-16 ja U6 ilmaisu suoritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA Kokeet kanssa 7300 PCR Assay System. Suhteellinen kertainen muutos miRNA-16 tason käytettiin edustamaan suhteellinen runsaus miRNA-16 verrattuna U6 ilme. 24 tunnin transfektion anti-miR-16, Cl-amidiini (50 ug /ml) lisättiin ja korjattu solusyklin analyysi 0 h, 2 h, 8 h, ja 24 h. Solusyklin tutkittiin myös 24 h transfektion jälkeen miRNA-16 matkivat. Kaikki kokeelliset kontrollinäytteitä käsiteltiin yhtä pitoisuus ei-kohdistuksen ohjaus matkivat sekvenssi tai -estäjä negatiivinen kontrolli sekvenssin, käytettäväksi valvontaa ei-sekvenssi-spesifinen vaikutuksia miRNA kokeissa. Valetransfektoidun valvonta ei tuota mitään merkittävää vaikutusta johonkin parametreista analysoitu.

MicroRNA ilmaisu

Global miRNA ilme.

HCT 116 WT-solut ympättiin 1 x 10

6 solua /levy 6 kuoppalevyillä kolmena kappaleena. Viljelyn jälkeen 24 h, 25 ug /ml Cl-amidiini- lisättiin kuhunkin kuoppaan. Solut kerättiin 0, 12, ja 24 h erikseen RNaasitonta EP putket. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Ambion, Austin, TX). RNA-pitoisuus määritettiin Nanodrop 2000 (NanoDrop, Wilmington, DE). 100 ng RNA: HCT 116 WT soluja käytettiin NCounter miRNA Expression Assay v1.2 (Nanostring Technologies, Seattle, WA), joka sisälsi 800 miRNA: n noudattamalla valmistajan ohjeita.

miRNA-16 ilmentyminen.

solut ympättiin, altistettiin CI-amidiini, ja kerättiin samalla pisteitä kuin on kuvattu globaalin miRNA ilme. Sillä miRNA-16 havaitsemista, 10 ng kokonais-RNA: ta käytettiin reverse puhtaaksi cDNA käyttäen TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Bisystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden ja miRNA spesifisiä alukkeita HSA-miRNA-16 havaitsemiseen ja pieni tumaproteiinin RNU6B (U6) normalisoinnin (Applied Biosystems). qPCR mittaus miRNA-16 ja U6 ilmaisu suoritettiin käyttäen TaqMan miRNA Analyysit (Applied Bisystems) kanssa 7300 PCR Assay System (Applied Biosystems). Vertaileva kynnys (Ct) menetelmää käytettiin arvioimaan suhteellinen runsaus miR-16 verrattuna U6 ilme (kertamuutoksia suhteessa U6). Kaikki kokeelliset käsittelyt tehtiin kolmessa erässä; joka kerta kolme toistoa.

Western blot-analyysi

Western blotit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [30]. Käytetyt vasta-aineet ovat anti-p53 (EMD Millipore, Rockland MA, Mouse Monoclonal, cat # op43, 1:500), anti-p21

WAF1 /CIP1 (Sigma, kanin polyklonaalinen, cat # p1486, 1:1000), anti- -GAPDH (Cell Signaling, Kani Monoclonal, kissa # 2118, 1:1000), ja anti-PAD4 (Origene hiiri Monoclonal, kissa # TA504813, 1:2000). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri-anti-kaniini-vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Amersham. Molemmat sekundaariset vasta-aineet laimennettiin 1:2000. Western blot signaali havaittiin SuperSignal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Scientific, Rockford, IL) ja kehitettiin päälle Hyperfilm (GE Life Sciences, Piscataway, NJ).

Solusyklianalyysiä

1 × 10

6-soluja kasvaa 6-kuoppaisilla levyillä McCoyn 5A-väliaine 1 päivä ennen hoitoa ja sen jälkeen käsiteltiin 50 ug /ml Cl-amidiini- ja vastaavat ajat. Solut kerättiin ja kiinnitettiin jääkylmällä etanolilla. Pesun jälkeen 1 x fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), joka sisälsi 0,5% naudan seerumin albumiini kahdesti, soluja inkuboitiin DNA-värjäys, joka koostui propidiumjodidia (PI; 10 ug /ml) ja RNaasi (0,1 mg /ml) 30 min huoneen lämpötilassa pimeässä. Solujen osuus kussakin vaiheessa solusyklin määritettiin DNA-pitoisuuden värjättiin PI käyttäen BD-LSR-II flow-sytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA). Saatu tieto analysoitiin BD FACSDiva Software (BD Biosciences). Kukin käsittely toistettiin kolmessa erässä.

mRNA analyysi

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol reagenssia (Invitrogen, CA). Yksi ug kokonais-RNA toimi templaattina yksittäisen juosteen cDNA-synteesi in reaktio käyttämällä oligo (dT) alukkeita ja AMV-käänteistranskriptaasia (Promega Corp, WI) olosuhteissa valmistajan ilmoittama. PCR cDNA näytteitä suoritettiin näytteistä monistettiin 30 sykliä denaturointi 94 ° C: ssa 30 s, pariutuminen 50 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 s ja lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan . Sekvenssit Real Time PCR Käytetyt alukkeet olivat: CCND1 Eteenpäin 5′- CCC TCG GTG TCC TAC TTC AA-3 ’, CCND1 Reverse 5′-AGG AAG CGG TCC AGG TAG TT-3′; CCND2 Eteenpäin 5’- TGG GGA AGT TGA AGT GGA AC-3 ’, CCND2 Reverse 5′-ATC CAC GTC TGT GTT GGT GA-3′; CCND3 Forward 5’-TGA TTT CCT GGC CTT CAT TC-3 ’, CCND3 Reverse 5′-AGC TTC GAT CTG CTC CTG AG-3′; CCNE1 Eteenpäin 5’-ATC CTC CAA AGT TGC ACC AG-3 ’, CCNE1 Reverse 5′-AGG GGA CTT AAA CGC CAC TT-3′; CDK6 Eteenpäin 5’-CCG TGG ATC TCT GGA GTG TT-3 ’, CDK6 Reverse 5′-TCT CCT GGG AGT CCA ATC AC-3′; GAPDH Forward 5’- GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3 ’, GAPDH Reverse 5′-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3’ (Integrated DNA Technologies, Inc.). Reaaliaikainen PCR (qPCR) suoritettiin käyttäen 7300 Real-Time PCR Assay System (Applied Biosystems, CA) Power SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems, CA) ja alukkeet CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CDK6 ja GAPDH mukaan myyjän protokollaa. CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CDK6 geeniekspressio normalisoitiin GAPDH-geenin ilmentymistä. Kansi muutos geenien ilmentyminen on suhteessa vektori käsiteltiin (1 x PBS) solut kerättiin 24 tuntia.

Tilastot

Kun enemmän kuin kaksi ryhmää verrattiin, päätimme tilastollisia eroja käyttäen yksisuuntainen varianssianalyysi, jota seurasi Scheffen monivertailutestillä. Jos kaksi ryhmää verrattiin, käytettiin Studentin t-testiä. Maailmanlaajuisen miRNA analyysin kaikki data tuotiin NSolver Analysis Software v1.0 (Nanostring Technologies) ja normalisoitiin geometrinen keskiarvo 100 MikroRNA korkein ilme arvoja. Normalisoitu data tuotiin BRB-ArrayTools v4.1.0 analysoitavaksi. Ennen analyysiä, tietoja suodatettiin missä tahansa arvo alle 10 jätettiin pois ja kaikki microRNA puuttuvat 50% näytteistä jätettiin lähdössä 169 MikroRNA analysoitavaksi. Luokan vertailutesti hyödyntää Student T-testit verrata MikroRNA käsiteltyjen vs. käsittelemättömien solujen. Trend testejä käytetään lineaarista regressio mallinnusta määräsi kategorinen muuttujiin 0 h, 12 h ja 24 h. Benjamini-Hochberg menettelyä käytettiin laskemiseen vääriä löytö hinnat. P-arvon valittu merkitystä tässä tutkimuksessa oli 0.05.

Tulokset

CI-amidiini aiheuttaa p53-riippuvaisen G1 pidätys

tutkia toiminnallisen vaikutuksia PAD esto, ensin kysytään PAD estäjä, CI-amidiini, vaikuttaa solusyklin. Käyttämällä kahta riippumatonta p53 WT koolonsyöpäsolulinjoissa, olemme huomanneet, että Cl-amidiini aiheutti solusyklin pysähtymisen G1-vaiheessa (taulukot 1A ja B, kuviot S1A ja S1B). Koska vaikutus G1 vaiheeseen liittyi lisääntyminen p53 ja p21 (kuva S2), testasimme hypoteesin, että CI-amidiini aiheutti G1 pidätyksen kautta p53-välitteisen mekanismi. Tulokset ovat yhdenmukaisia ​​tämän hypoteesin. Toisin HCT 116 WT soluja, CI-amidiini- ei aiheuttanut G1 pidätys isogeenisiin HCT 116 p53

– /- solut (taulukko 1C; Kuva S1C). Sen vahvistamiseksi, että tämä pidätys ei johtunut off-kohde mekanismeja, me pudotti PAD4 siRNA (kuvio S3A), tutkittiin sitten solusyklin muutoksia. Yhdenmukainen ymmärtäen, että G1 solusyklin pidättäneet CI-amidiini- johtuu ainakin osittain sen kykyä vaimentaa PAD toimintaa, PAD4 knockdown aiheutti myös G1 solusyklin pysähtymiseen (taulukko 1D; kuvio S3B) HCT 116-soluissa. Solusyklin tutkittiin 24 tuntia transfektion jälkeen.

CI-amidiini aiheuttaa p53-riippuvaisen induktion miRNA-16

Olemme aiemmin osoittaneet, että PAD estäjä, CI-amidiini-, stimuloi apoptoosin tulehdussolujen ja hieman stimuloi apoptoosia HT-29 koolonin syöpäsolujen [4]. Samoin olemme vahvistaneet aikaisemmat tulokset Li et al. [27], että PAD4 knock-down ja CI-amidiinilla hoito aiheutti G1 solusyklin pysähtymisen p53-riippuvaisella tavalla (taulukko 1, kuviot S1 ja S2). Koska miRNA: n ovat nousseet keskeisiksi valvojat paksusuolen solujen lisääntymisen ja apoptoosin [31], tutkimme globaali miRNA ilmaisun muutoksia HCT 116 koolonkarsinoomasoluissa altistuvat Cl-amidiini-. Taulukossa 2 esitetään oli merkittävä positiivinen korrelaatio 11 miRNA, ja merkittävä negatiivinen korrelaatio 7 miRNA altistuksen jälkeen HCT 116 solujen CL-amidiini- 0 h, 12 h, ja 24 h. Perustuu käsitykseen, että miRNA-16 säätyy alas paksusuolen syöpä [18], ja miRNA-16 osoitettiin olevan miRNA joka oli kaikkein ajan säännelty (merkittävästi) by CI-amidiini (1,5-kertainen 12 h; 2 kertainen 24 h; taulukko 2), päätimme tutkia edelleen seuraukset ja mekanismit CI-amidiinifunktionaalisen välittämä miRNA-16 säätelyä ylöspäin. Vahvista miRNA-16 up-sääntelyn CI-amidiini, me toisti kokeen ja tutkittiin miRNA-16 aktivaation qRT-PCR. Yhdenmukainen globaali miRNA analyysin tuloksia, Kuvio 1A esittää, että oli yhä miRNA-16-ilmentymisen lisäämiseksi, kun HCT 116 solut altistettiin Cl-amidiini, jossa merkitsevyys on saavutettu sekä 12 h ja 24 h (p 0,05). Myös kasvu miRNA-16 yhä alttiille Cl-amidiini p53 WT LS-180 koolonisyöpäsolulinja; merkitys saavutetaan 24 tunnin (kuvio 1 B). Alempi kasvu miRNA-16 induktio on sopusoinnussa suhteellisen vaatimaton G1 solukierron pysähtymisen LS-180-soluissa (taulukko 1 B, kuvio S1B).

(A) HCT 116 WT-solut; (C) LS-180-soluja .; (C) HCT 116 p53

– /- solut. Solut altistettiin 25 ug /ml Cl-amidiini- varten osoitettuun kertaa (N = 9 levyä aikapistettä kohti). Suhteellinen endogeeninen miR-16 ekspressiotasot havaittiin qRT-PCR: llä käyttäen Taqman-alukkeita ja koettimia havaitsemaan kypsän miR-16 ja pieni ydin- RNA RNU6B (U6), sisäisen valvonnan. Suhteellinen miR-16 ekspressiotasot normalisoitiin keskiarvo ei-käsiteltyjen näytteiden (0 h). * Osoittaa merkittävä ero 0 hr ohjaus.

Koska p53 parantaa transkription jälkeisen kypsymisen miRNA-16 [32], ja CI-amidiinilla aiheuttaa induktion p53 (kuva S2), emme tutki, induktio miRNA-16 CI-amidiini- oli p53-riippuvainen. Kuvio 1C esittää CI-amidiini- voinut aiheuttaa kasvua miRNA-16 HCT 116 p53

– /- solut, mikä osoittaa miRNA-16 induktio oli todellakin p53-riippuvaista.

p53-riippuvaista G1 pidättäneet Cl-amidiini- säätelee miRNA-16

Koska havainto, että sekä G1 pidätyksen ja kasvu miRNA-16 CI-amidiini- oli p53-riippuvaista; että p53 parantaa kypsymisen miR-16 [32]; ja että muut ovat osoittaneet miRNA-16 aiheuttaa G1 pidätys [13], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], me arveltu että miRNA-16 on risteyksessä p53-riippuvaisen G1 pidätyksen aiheuttama PAD esto. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me pudotti miRNA-16 (kuvio S3C) HCT 116-soluissa, sen jälkeen altistuneet solut cl-amidiini-. Tulokset esitetään taulukossa 3A ja kuviossa S3D todellakin viittaavat siihen, että G1 pidätys aiheuttama Cl-amidiini- HCT 116 WT-solut on riippuvainen miRNA-16, koska ilman miRNA-16, Cl-amidiini- voinut aiheuttaa solusyklin pidätys. Näiden tulosten vahvistamiseksi, transfektoimme HCT 116 soluja miRNA-16 siRNA ja miRNA-16 matkivat. Kun oli inkuboitu 24 tuntia ilman transfektiota, transfektio miRNA-16 siRNA tai miR-16 matkivat, solut kerättiin ja solusyklin tutkittiin. Taulukossa 3B esittää miRNA-16 matkivat aiheutti G1 solusyklin pysähtymiseen, tukee oletusta, että induktio miRNA-16 CI-amidiini on keskeinen tapahtuma, joka johtaa G1 pidätykseen koolonkarsinoomasoluissa p53 WT tausta. Yhdessä voimme päätellä, että p53-riippuvaisen G1 pidätys on puolestaan ​​riippuvainen kyvystä PAD inhibition CI-amidiini- saattaa ajan säätelemään miRNA-16.

CI-amidiini- syiden downregulation of miRNA-16 tavoitteita mukana G1 pidätys

Olemme osoittaneet, että miRNA-16 on risteyksessä G1 pidätettiin koolonkarsinoomasoluissa by CI-amidiini-. Näin ollen kestä syytä tutkia vaikutuksia Cl-amidiinia on miRNA-16 tavoitteita, jotka ovat mukana G1 solusyklin pysähtymiseen. Tällaisia ​​tavoitteita ovat: sykliini D1 (CCND1) [13], [19], [33], [34], [35], [36], sykliini D2 (CCND2) [13], sykliini D3 (CCND3) [33] sykliini E1 (CCNE1) [13], [21], [24], [35], ja sykliini-riippuvaisen kinaasin-6 (CDK6) [35]. Tutkiessaan vaikutuksia Cl-amidiini- seuraavilla miRNA-16 tavoitteet, löysimme merkittävä lasku kaikissa päätepisteissä (kuva 2). Tämä on sopusoinnussa hypoteesin, että PAD esto CI-amidiini- aktivoi miRNA-16, joka puolestaan ​​säätää alas useiden geenien tiedetään osallistuvan G1 etenemiseen.

HCT 116-soluja käsiteltiin 1x PBS ( -) tai 25 ug /ml Cl-amidiini (+) 24 h. sitten RNA korjataan qPCR menetelmissä kuvatulla tavalla. CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, ja CDK6 geeniekspressio normalisoitiin GAPDH-geenin ilmentyminen. * Osoittaa merkitsevää eroa ohjauspaneelista (-) (p 0,05).

Keskustelu

PAD löydettiin ensin selkärankaisten 1980-luvun alussa sisällä orvaskeden vastasyntyneiden rottien [ ,,,0],37]. Sittemmin on käynyt yhä ilmeisemmäksi, että PAD toimintaa, jossa tuloksena proteiini citrullination, ajaa monet tulehdussairaudet ja syöpien, kuten koliitti ja paksusuolensyöpä [1], [4], [5], [6]. Näin ollen, kehittää hoitoja, joka perustuu PAD signalointi tukahduttaa tai estää paksusuolen syöpä, on tärkeää ymmärtää mekanismit. Olemme tunnistaneet, että esto tyynyjen meidän uusi pienmolekyylisalpaaja- (CI-amidiini) estää suuren paksusuolen syövän riskiä taudin, haavaisen koliitin, hiirillä [4]. Tässä olemme laajentaneet näiden tutkimusten, ja osoittivat, että Cl-amidiini aiheuttaa G1 solusyklin pysähtymisen paksusuolen syöpäsoluissa, että tämä vaikutus välittyy ajan ekspressiota sääteleviä oletetun paksusuolen syövän kasvaimia estävä microRNA, miRNA-16; ja että tämä tapahtuu vain, kun läsnä on tuumorisuppressoriproteiinia, p53. Vaikka emme ole vielä osoitettava, että CI-amidiini- estää paksusuolen syövän hiirillä, tulokset tässä leikellä mekanismeja, joilla PAD inhibition CI-amidiini- todennäköisesti estää paksusuolen syöpä. Koska tiiviin paksusuolen tulehdus ja paksusuolen syövän riskiä [38], [39], [40], [41], [42], edellisessä tutkimuksessa osoittaa, että CI-amidiini- tukahduttaa koliitti [4] ennustaa myös, että CI-amidiini- voidaan käyttää estämään ja /tai hoitamaan paksusuolen syöpä. Lisäksi tukahduttaa tulehduksen, esillä tutkimus osoittaa, että ylimääräinen mekanismi (vaimentamiseksi paksusuolen syövän CI-amidiini) kautta p53 ja miRNA-16 riippuvainen G1 solusyklin pysähtymisen koolonkarsinoomasoluissa. Tarkka perustelut solusyklin pidätyksen aiheuttama PAD eston välittämä kasvu miRNA-16 on kuitenkin vielä selvittämättä. Vaikka näimme lisääntyminen p21

WAF1 kanssa CI-amidiinin hoito (kuva S2), tämä ei näytä olevan ainoa tapahtuma, joka aiheuttaa G1 pidätyksen, koska meidän miRNA-16 näyttöä (miRNA-16 ablaation tyhjäksi G1 pidättäneet CI-amidiini-: taulukko 3, kuviot S3C ja S3D). Tätä varten miRNA-16 on tullut erityisen avaimen miRNA G1 solusyklin tarkistuspiste. miRNA-16 tavoitteet useita solusykliä sääntelyviranomaisten, kuten sykliini D1 (CCND1), sykliini D2 (CCND2), sykliini D3 (CCND3), sykliini E1 (CCNE1), sykliiniriippuvainen kinaasi-1 (cdk1), CDK6, cdc25a, ja ADP -ribosylation tekijä kaltainen proteiini 2 (ARL2) [13], [19], [21], [24], [26], [33], [34], [35], [36], [43], [44]. Kun otetaan huomioon selkeät roolit ajo etenemistä jakautuvien solujen kautta G1 vaiheessa, erityisesti CDK6, sykliini D ja sykliini E, kyky miRNA-16 kohdistaa tällaiset molekyylit on todennäköisin syy havaintomme (kuviot 2 ja 3) . Toinen erillinen koesarja ulkopuolelle nykyisen tutkimus koskee toiminnalliset vaikutukset muiden miRNA: n osoitettiin olevan ero ilmentymisen altistuksen jälkeen HCT 116 solujen CL-amidiini (taulukko 2).

esto PAD by CI-amidiini aktivoi p53, joka puolestaan ​​aktivoi miRNA-16. Aktivointi miRNA-16 aiheuttaa G1 solusyklin pysähtymiseen, oletettavasti kohdistamalla sykliinien D, E ja /tai CDK6.

Koska CI-amidiini on yleiseurooppalainen PAD estäjä [45], se on edelleen näytettävä joka PAD on avain induktioon G1 solusyklin pysähtymisen. Meidän havainto, että alas-säätely PAD4 kautta siRNA aiheuttaa verrattavissa G1 pidätys kuin Cl-amidiini (taulukot 1A ja 1D), osoittaa PAD4 on ainakin yksi tärkeimmistä PAD entsyymejä solusyklin etenemisen riippumaton muista PAD . Yhdenmukainen tämä havainto on sovittu, että PAD4 aktiivisuus on kohonnut paksusuolen adenokarsinooman [6]. Kuitenkin johtuen yleiseurooppalainen PAD aktiivisuus Cl-amidiini, emme voi sulkea pois vaikutusta muiden tyynyjä solusyklin etenemisen. Tämä pätee erityisesti PAD tiedetään ilmentyvän soluissa epiteelin /karsinooman alkuperää (joita käytetään tässä tutkimuksessa), mukaan lukien PAD1 [46], PAD2 [47] ja PAD3 [7].

havaintoon, että Cl-amidiini- aiheuttaa induktion p53 (kuvio S2) ja estää solujen kasvua in p53-riippuvaisella tavalla on yhdenmukainen muiden ryhmien kanssa [27], [48]. Mekanismit p53 induktion PAD esto on kuitenkin edelleen epäselvä. PAD4 voi säädellä geeniekspressiota katalysoivat translaation jälkeinen citrullination useita Arg tähteiden histoni substraatteja [49], [50]. PAD4 voidaan palvelukseen histones sen vuorovaikutus p53 [27]. Tämän seurauksena PAD4 saa rekrytoidaan promoottorit p53 kohdistettujen geenejä missä se citrullinates histonien ja tukahduttaa transkriptio p53-kohdennettuja geenejä. PAD4 voi myös citrullinate ei-histoni-proteiinien yhdistää p53 ja ovat osallisina karsinogeneesissä. Erityisesti, PAD4 voi citrullinate Inhibitor kasvun proteiinin 4 (ING4), estäen siten ING4 aktivaatiota p53 [51]. Tällaiset mekanismit tukevat päätelmää, että PAD esto CI-amidiini- aiheuttaa p53 induktio. Lopuksi tutkimme mahdollisuutta, että p53 voi olla sitrullinoitujen, johtaa sukupolven SDS-liukenemattomia aggregaatteja, samanlainen joukko syöpään liittyvän p53 mutaatioita [52]. Jos näin on, inhibition p53 citrullination (by CI-amidiini) lisäisi p53 tasolle estämällä tällä yhdistäminen fenotyypin.

Yhteenvetona koska on entistä ymmärtää, että PAD aktiivisuus (ja tuloksena citrullination) on keskeinen rooli kroonisissa sairauksissa, kuten tulehdussairaudet ja syöpä, on tärkeää ymmärtää paremmin mekanismeja. Hyvin vähän on tällä hetkellä tiedossa tässä suhteessa. Mitä tulee syövän, täällä olemme osoittaneet, että miRNA-16 on tärkeä rooli moduloivan G1 solusyklin Checkpoint aiheuttama PAD eston p53 WT koolonsyöpäsolulinjaa

in vitro

. Vaikka

in vivo

käännös epäselvää, saadaanko, nämä nykyiset kokeet valottaa osaksi mekanismia, jolla PAD esto meidän romaani PAD estäjä, CI-amidiini, toimii. Mekaanistetulle havainnot avaavat mahdollisuuden, että PAD inhibiittorit yksinään tai yhdessä p53 ja /tai miRNA-16 jäljittelee, voi olla tehoa kemopreventatiivisesti ja /tai hoitoon paksusuolen syövän.

tukeminen Information

Kuva S1.

Edustavia virtaussytometria-histogrammit on osoitettu paksusuolen syöpäsolulinjoissa. (A) Histogrammit ilmoitetuilla ajankohtina osoittaa CI-amidiini (50 ug /ml) indusoi G1 vaiheessa pidätyksen HCT 116-soluissa, jotka ovat p53 WT. (B) Histogrammit ilmoitetuilla ajankohtina osoittaa CI-amidiini (50 ug /ml) indusoi G1 vaiheessa pidätyksen LS-180-solut, jotka ovat p53 WT. (C) Histogrammit ilmoitetuilla ajankohtina osoittaa CI-amidiini (50 ug /ml) ei indusoi G1 vaiheen pysähtymisen HCT 116 p53

– /- solut, jotka ovat puutteellisia p53.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0053791.s001

(TIF) B Kuva S2.

CI-amidiini- aiheuttaa induktion p53 ja p21 HCT 116-soluissa, mutta ei HCT 116 p53

– /- solut. Solut altistettiin osoitettujen konsentraatioiden Cl-amidiini- 24 tuntia, sitten talteen western blot -analyysillä. Numerot alla bändit ovat GAPDH-oikaistu densitometrisesti arvoiltaan kontrolliryhmään (0 ug /ml Cl-amidiini).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0053791.s002

(TIF) B Kuva S3 .

(A, B). Kaatamalla PAD4 (A), G1 solusyklin pysähtymisen HCT 116-soluissa (B). (A) Western blot-analyysi osoittaa PAD4 Knockdown siRNA on PAD4. Numerot alla bändit ovat GAPDH-oikaistu densitometrisesti arvoiltaan salattu siRNA kontrolliryhmään. (B) edustaja solusyklin tonttien 24 tunnin kuluttua. transfektio joko salattu siRNA tai siRNA sen PAD4. (C, D). Sen jälkeen kaatamalla miR-16 (C), CI-amidiini (50 ug /ml) ei aiheuta G1 solusyklin pysähtymisen HCT 116-soluissa (D). (C) kvantifiointi miRNA-16 ilmentyminen Q-PCR: llä. * Osoittaa merkittävä väheneminen miRNA-16 lauseke 24 tunnin transfektion jälkeen verrattuna sekoitetun ohjaus siRNA. Huomaa, että CI-amidiini- ei vaikuttanut tehokkuuteen miRNA-16 knockdown. (D) edustaja virtaussytometristen histogrtams 24 tunnin kuluttua. transfektion anti-miR-16, sitten altistuminen Cl-amidiini (50 ug /ml) ilmoitettuina ajankohtina.

doi: 10,1371 /journal.pone.0053791.s003

(TIF)