Krooninen sairaus

tiivistelmä

Transforming kasvutekijä-SS1 ( TGF-β1) on monitoiminen sytokiini, joka on mukana erilaisissa patofysiologisiin prosesseissa, kuten syövän etenemiseen ja fibroottisten häiriöiden. Tässä osoitamme, että käsittely TGF-β1 (5 ng /ml) indusoi downregulation syklo-oksigenaasi-2 (COX-2), mikä vähentää synteesi prostaglandiini E2: n (PGE2), ihmisen keuhkosyövän A549-soluja. Solujen käsittely spesifisiä inhibiittoreita COX-2 tai PGE2-reseptorin johti kasvun inhibition, mikä osoittaa, että COX-2 /PGE2-reitin edistää proliferaatiota autokriinisellä tavalla. TGF-β1 hoidon aiheuttama kasvun esto, joka lievitti eksogeenisten PGE2. TGF-β1 on myös indusoi epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT), ilmiasuun muutos, jossa epiteelisolujen erilaistuvat fibroblastit. Lisäravinteen PGE2 tai PGE2 reseptorin EP4-agonisti PGE1-alkoholia, verrattuna EP1 /3-agonisti sulprostonia, inhiboi TGF-β1-indusoima fibronektiinin ja kollageenin I (soluväliaineen komponentteja). Eksogeeninen PGE2 tai PGE2 reseptoriagonistit myös tukahdutti aktiini remontin aiheuttama TGF-β1. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PGE2 on anti-fibroottisia vaikutus. Voimme päätellä, että TGF-β1 aiheuttama downregulation COX-2 /PGE2 signalointi on osallisena helpottamista fibroottisten EMT vasteen A549-solut.

Citation: Takai E, Tsukimoto M, Kojima S (2013) TGF-β1 Downregulates COX-2 Expression Johtavat Otto PGE2 Production in Human Lung Cancer A549 Cells, joka on mukana Fibroottiset vastaus TGF-β1. PLoS ONE 8 (10): e76346. doi: 10,1371 /journal.pone.0076346

Editor: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Biotekniikan keskus, Intia

vastaanotettu: toukokuu 23, 2013; Hyväksytty: 23 elokuu 2013; Julkaistu: 02 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Takai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Transforming kasvutekijä-SS1 (TGF-β1) löydettiin alun perin erittyvä proteiini, joka indusoi muutosta ja kasvua normaalien fibroblastien [1], ja se on nyt vakiintunut olla mukana erilaisissa fibroottisten häiriöiden, kuten keuhkojen ja maksan fibroosi [2-4]. Todellakin, TGF-β1 on monitoiminen sytokiini, joka säätelee erilaisia ​​fysiologisia prosesseja, kuten solun kasvua, erilaistumista ja kasvaimen kehittymisen. Se erittyy kasvaimen mikroympäristöihin monista syöpäsolujen ja toimii kasvaimen promoottori angiogeneesin indusoimiseksi, immuuni-paeta ja etäpesäkkeiden [5-7]. Keuhkofibroosi, kuten idiopaattinen keuhkofibroosi (IPF), on hyvin tiedetään liittyvän suurentunut riski sairastua keuhkosyöpään. Toisaalta, se on myös ehdotettu, että fibroosi keuhkojen kasvain on toissijainen ilmiö sen sijaan, että esiaste syövän, ja osoitettiin, että aste fibroosin korreloi syövän etenemisen ja ennusteen [8,9]. Kuitenkin mekanismit fibroosin kehittymiseen keuhkojen kasvain ei ymmärretä hyvin.

epiteelisoluissa, TGF-β1 indusoi fenotyypin muutosta kutsutaan epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT), joka on prosessi, jonka avulla epiteelisolujen erilaistuvat osaksi fibroblastien kaltaisia ​​mesenkyymisolujen. EMT on normaali fysiologinen prosessi välttämättömiä asianmukaisen embryogeneesiin ja kudoksen monogeneesin. Toisaalta, EMT on mukana myös haavan ja syövän etenemisen aikuisen kudoksissa [10,11]. Vaikka osuus EMT-johdettu fibroblastin kaltaisia ​​soluja fibroosi on ehdotettu [12,13], signalointi mekanismeista TGF-β1 aiheuttama biologisten tapahtumien syöpäsoluissa ei täysin tunneta.

Syklo-oksigenaasi (COX ) on nopeutta rajoittava entsyymi prostanoidisynteesin. Vaikka COX-1 ilmentyy konstitutiivisesti, COX-2 on indusoituva, ja on hyvin tiedetään olevan osallisena tulehduksessa. Expression of COX-2 on kohonnut monissa tuumorikudoksissa, mukaan lukien keuhkosyöpä [14,15]. Prostaglandiini E2 (PGE2), joka on vallitseva prostaglandiini, vaikuttaa biologisesti kautta G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (so EP1-EP4) [16]. On raportoitu, että PGE2 on mukana kasvaimen kasvu, immunosuppressiota tai angiogeneesi [17-20]. On myös raportoitu, että COX-2-yli-ilmennetään monissa keuhkosyövässä, ja PGE2 on mukana leviämisen, resistenssi apoptoosia ja induktio T-sääntelyyn soluihin [21-24]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), yliekspressio tai aktivoimalla mutaatio kasvutekijän reseptorin (EGFR) johtaa poikkeavaan proliferaatioon tai muuttoliike. Näin ollen, EGFR on perustettu molekulaarinen merkkiaine ei-pienisoluisen keuhkosyövän, ja sitä käytetään laajasti ennustamiseen ennusteen tai hoidon valinta. COX-2, sekä EGFR, on mahdollinen molekyyli merkkiaine NSCLC [14].

Olemme hiljattain raportoitu, että hoito ihmisen NSCLC A549-solujen TGF-β1 indusoi EMT johtaa parantamiseen solumigraation [ ,,,0],25]. Esillä olevassa tutkimuksessa, paljastaa mekanismi TGF-β1 aiheuttama keuhkosyöpä etenemisen, tutkimme vaikutus TGF-β1 ekspressioon COX-2: A549-solut. Aiemmin on raportoitu, että TGF-β1 indusoi COX-2: n ilmentymisen aikana EMT-nisäepiteelisoluissa [26]. Toisin kuin asian nisäepiteelisoluissa, löysimme ensimmäistä kertaa, että TGF-β1 downregulates COX-2 ihmisen NSCLC A549-soluja. Osoitamme tässä, että tämä vaikutus liittyy kasvun estäminen ja helpottaminen fibroottisten EMT vasteen, mikä viittaa siihen, että COX-2 /PGE2 signalointi on tärkeää hallita solun prosessien A549-solut.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta

DMEM, ihmisen rekombinantti TGF-β1, SB431542, sykloheksimidin ja metyyliasetaatti ostettiin Wako Pure Chemical (Osaka, Japani). FBS hankittiin Biowest (Nuaille, Ranska). AH6809, L798106, L161982, sulprostonia, butaprost ja PGE1-alkoholi ostettiin Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). Prostaglandiini E2: n, aktinomysiini D ja anti-N-kadheriinin-vasta-aine hankittiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Spesifinen inhibiittori Smad3 (SIS3) ja NS-398 ostettiin Merck (Darmstadt, Saksa). Rodamiinifalloidiinia ostettiin Cytoskeleton, Inc. (Denver, CO, USA). Kaniinin polyklonaalista anti-COX-2-vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Kanin polyklonaalista suuren liikkuvuuden ryhmä laatikko 1 (HMGB1) vasta-aine hankittiin Abcam (Cambridge, UK). Kaniinin polyklonaalista anti-COX-1-vasta-aineen ja hiiren monoklonaalinen anti-aktiini-vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Hiiren monoklonaalinen anti-E-kadheriini-vasta-ainetta (klooni 36B5) hankittiin Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Hiiren monoklonaalinen anti-fibronektiini-vasta-aine hankittiin BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA).

Soluviljely

A549 ihmisen adenokarsinoomasoluja saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä (100 yksikköä /ml) ja streptomysiiniä (100 mg /ml) kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ilmassa 37 ° C: ssa.

immunoblottauksella

Solut hajotettiin PBS: ssä, joka sisälsi 10 mM HEPES-NaOH, pH 7,4, 1% Triton X100, 5 mM EDTA, 30 mM natriumpyrofosfaatti, 50 mM natriumfluoridi, 1 mM natriumortovanadaatti, 1,04 mM 4- (2-aminoetyyli) bentseenisulfonyyli fluoridi, 0,8 uM aprotiniinia, 21 uM leupeptiiniä, 36 uM bestatiinia, 15 uM pepstatiini A: ta ja 14 pM E-64, 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Lysaatit sentrifugoitiin 10000 x g 15 min. Poistamisen jälkeen solujätteen, proteiinipitoisuus kussakin näytteessä määritettiin käyttämällä Bio-Rad Protein Assay -kittiä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Yhtä suuret määrät proteiinia, lysaatti liuotettiin 2 x näytepuskuria (50% glyserolia, 2% SDS, 125 mM Tris, 10 mM DTT) ja keitettiin 10 minuuttia. Alikvootit sisältävät näytteet 6 ug proteiinia analysoitiin käyttämällä 7,5-15% SDS-PAGE ja vanteet siirrettiin PVDF-kalvolle. Blotit blokattiin yön yli TBST: ssä, jossa 1% BSA: ta, 5% rasvatonta maitoa 4 ° C: ssa, sitten niitä inkuboitiin kanin COX-2-vasta-ainetta (1: 1000), kanin COX-1-vasta-ainetta (1: 1000), kanin HMGB1 vasta-ainetta ( 1: 1000), hiiren aktiinin vasta-aineella (1: 1000), hiiren E-kadheriinin-vasta-ainetta (1: 1000), hiiren N-kadheriinin-vasta-ainetta (1: 1000) tai hiiren fibronektiinin vasta-ainetta (1: 1000) yli yön 4 ° C: ssa. Sen jälkeen kun on pesty TBST: llä, blotteja inkuboitiin vuohen HRP-konjugoitua anti-kani-IgG-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, Inc.) tai vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-aine-HRP: tä (Santa Cruz Biotechnology) 90 min ajan huoneen lämpötilassa. Blotit pestiin taas TBST: llä, ja erityiset proteiinit visualisoitiin käyttämällä ECL Western blotting tunnistus reagenssit (GE Healthcare) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Bändi intensiteetit kvantitoitiin densitometrisellä analyysin avulla ImageJ ohjelmistoa (National Institutes of Health).

PGE2 EIA

PGE2-tuotantoa soluista määritettiin entsyymi-immunomääritys (EIA) Kit (Cayman Chemical) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, PGE2, asetyylikoliiniesteraasin konjugaatin, hiiren monoklonaalinen anti-PGE2-vasta-aine, ja joko standardia tai näytettä lisättiin jokaiseen kuoppaan YVA päällystetty vuohen polyklonaalisen anti-hiiri-IgG. Kun oli inkuboitu 18 h 4 ° C: ssa, levy pestiin viisi kertaa poistaa kaikki sitoutumaton reagenssit. Ellmanin reagenssia lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan, ja kehitetty levy luettiin 405 nm: ssä, jossa on WALLAC ARVO SX -monileimalukijaa (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA).

Reaaliaikainen RT-PCR-

Kokonais-RNA eristettiin A549-soluja käyttäen Fast Pure RNA kit (Takara Bio). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: sta PrimeScript käänteistranskriptaasia (Takara Bio). CDNA: ta käytettiin templaattina reaaliaikainen PCR-analyysi: reaktiot suoritettiin Stratagene Mx3000P

® QPCR-järjestelmä (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA). Sekvenssit spesifisiä alukkeita ihmisen COX-2 olivat 5′-GAGAAAACTGCTCAACACCGGA-3 ’(sense) ja 5′-CACAACGTTCCAAAATCCCTTG-3′ (antisense), niille ihmisille COL1A1 olivat 5’-CACACGTCTCGGTCATGGTA-3 ’(sense) ja 5 ”- AAGAGGAAGGCCAAGTCGAG-3 ’(antisense). Glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) mRNA määritettiin positiivisena kontrollina. Kukin näyte analysoitiin 20 ui monistusreaktion seos, joka sisältää cDNA: ta, alukkeita (5 uM kutakin sense- ja antisense-alukkeet) ja 2x KAPA SYBR

® FAST qPCR Master Mix (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA). Vahvistusta Ohjelmassa 40 sykliä 95 ° C: ssa 3 s ja 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Fluoresoivat tuotteet havaittiin viimeisessä vaiheessa kunkin syklin. Saadut arvot olivat lineaarisella alueella standardikäyrän ja normalisoitiin GAPDH mRNA: n ilmentymisen.

Solusyklianalyysiä

solusyklin analysoitiin propidiumjodidi (PI) -värjäyksellä. A549-soluja käsiteltiin trypsiinillä ja ne kiinnitettiin 70% etanolissa 60 minuutin ajan jäillä. RNA poistettiin käsittelemällä RNaasi A: lla (0,34 mg /ml), sitten soluja inkuboitiin 50 mg /ml PI: ssa 30 minuuttia jäissä. Stained solut analysoitiin käyttäen FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), ja kymmenentuhatta solut arvioitiin. DNA-merkitty suhteellinen runsaus solun väestön G0 /G1, S ja G2 /M vaiheessa. Prosenttiosuudet solujen kunkin vaiheen solusyklin määritettiin tilastollinen analyysi käyttämällä Cell Quest -ohjelmistoa (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Proliferaatiomääritys

soluproliferaatiomäärityksissä olivat suoritettiin käyttäen bromideoksiuridiinia (BrdU) (kolorimetrinen) solujen lisääntymistä ELISA (Roche, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, A549-soluja ympättiin 96-kuoppalevyille ja käsitelty vehikkelillä tai reagenssien lopullisessa tilavuudessa 100 ul /kuoppa. Sen jälkeen, 10 ui BrdU-merkintöjä liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja inkubointia jatkettiin 2 h. Poistamisen jälkeen BrdU-merkintöjä liuosta, solut kuivattiin ja inkuboitiin kitin FixDenat liuos 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen, kun DNA: n denaturaatio, näytteitä inkuboitiin peroksidaasiin konjugoidulla anti-BrdU-vasta-ainetta 90 minuutin ajan. Sitoutumaton vasta pestiin pois ja 100 ui luminesenssi substraattia lisättiin. Luminesenssi kvantifioitiin käyttäen Wallac ARVO SX -monileimalukijaa.

Solulisääntyminen analysoitiin myös laskemalla solut. A549-soluja ympättiin 24-kuoppalevyille ja käsitelty TGF-β1 ja PGE2. Inkuboinnin jälkeen solut trypsinoitiin ja laskettiin käyttäen TC10

TM Automatisoitu solulaskijalla (Bio-Rad Laboratories).

Fluoresenssi kuvantamisen

F-aktiini värjäys, solut kiinnitettiin 4 % paraformaldehydillä 10 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja läpäiseviksi 0,5% Triton X-100: ssa 5 minuutin ajan jäillä. Kiinnitettyjä soluja inkuboitiin 100 nM rodamiinifalloidiinia 30 min huoneen lämpötilassa. Counterstaining Hoechstin 33258 (10 ug /ml) käytettiin tarkistaa sijainnin ja eheyden ytimeksi. Stained solut analysoitiin käyttämällä konfokaali laserskannaus mikroskooppi (TCS SP2, Leica, Mannheim, Saksa) varustettu HCX PLApo 63 x 1,32 NA öljy objektiivilinssi. Leica confocal ohjelmisto (TCS SP2, versio 2.6.1) käytettiin kuvan hankinta ja käsittely.

Cell migraatiokokeessa

Solun muuttoliikettä analysoitiin 24 hyvin TranswellTM levyille (6,5 mm halkaisija , 8 um huokoskoon polykarbonaattikalvon, Corning, Lowell, MA, USA). Ylempi osasto ympättiin A549-soluja (2 x 10

4 solut) pohjapinta viljelyalustassa. 24 tunnin kuluttua väliaine korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi TGF-β1. Ylempi kammio sisälsi 5% FBS: ää eikä 10%. Kun oli inkuboitu vielä 24 tunnin ajan, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ja inkuboitiin 50 ug /ml PI: ssa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Ei-siirretyn solujen yläpinnan kalvo poistettiin ja solut, jotka olivat vaeltaneet kalvon läpi alempaan pintaan laskettiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (BZ-9000; KEYENCE).

Tilastot

tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE. Tilastollinen merkitys eroja valvonnan ja muiden ryhmien laskettiin käyttäen Dunnettin testiä tai parittomia t-testin kanssa Instat version 3.0 tilastopaketista (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Kriteeri merkitystä asetettiin P 0.05.

Tulokset

TGF-β1 downregulates COX-2 ilmaisun ja PGE2-tuotantoon A549

Monissa syöpien, TGF-β1 erittyy kasvain microenvironment ja toimii kasvaimen promoottori. Tutkimaan TGF-β1 aiheuttama etenemiseen ihmisen keuhkosyöpä, me stimuloi ihmisen keuhkosyöpä A549-solujen TGF-β1. COX-2 on olennaisesti yli-ilmennetään A549-soluja standardeissa soluviljelyolosuhteissa. Yllättäen huomasimme, että ilmentyminen COX-2-proteiinin on dramaattisesti vähentynyt käsittelemällä 5 ng /ml TGF-β1 (kuvio 1A). Väheneminen COX-2-proteiinia 24 tuntia stimulaation jälkeen oli TGF-β1 annoksesta riippuvainen (kuvio 1 B). Toisaalta, ekspressio COX-1: A549-solut oli alhainen, ja ei ole muuttanut TGF-β1 hoitoa (kuvio 1A, B). TGF-β1 aktivoi TGF-β seriini /treoniini-kinaasi-reseptoreihin. Ligandin sitoutumisen jälkeen, TGF-β tyypin I reseptori (TßRI) ja tyypin II reseptori (TßRII) muodostavat tetrameerisen reseptorin heterocomplex, jotka johtavat fosforylaatio Smad proteiinien, pääasiassa alavirtaan efektorimolekyylien näille reseptoreille, kinaasin toimintaa sytoplasmisen verkkotunnus TßRI. Hoito TßRI estäjän SB431542 tai Smad3 estäjä SIS3 [27] tukossa COX-2 downregulation TGF-β1 (kuvio 1 C). Tulokset osoittavat, että TGF-β1-indusoidun downregulation COX-2 liittyy TGF-β-reseptoreihin ja Smad-signalointireitin.

(A) Expression of COX-2-proteiinin havaittiin immunoblottauksella, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Käsittely TGF-β1 (5 ng /ml), tukahdutti ilmentymisen COX-2, mutta ei COX-1: A549-solut. HMGB1 mitattiin latauskontrollina. (B) annos-riippuvainen downregulation COX-2: TGF-β1. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun TGF-β1 stimulaatio (1-10 ng /ml), ilmentyminen COX-2: n ja COX-1 havaittiin. (C) SB431542 (10 uM) tai SIS3 (30 uM) esti TGF-β1-indusoidun COX-2 downregulation. Soluja esikäsiteltiin 60 min inhibiittorin kanssa, ja sitten inkuboitiin kanssa tai ilman TGF-β1 (5 ng /ml) 24 tuntia. (D) TGF-β1 tukahdutetaan COX-2: n tuotannon A549-soluja. Soluja käsiteltiin TGF-β1 (1-10 ng /ml) tai NS-398 (50 uM) 24 tunnin ajan, sitten PGE2: n pitoisuus viljelyalustassa mitattiin EIA, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kukin arvo on keskiarvo ± SE (n = 4). Merkittäviä eroja osoitti ryhmien ja kontrolliryhmän on merkitty ** (P 0,01).

COX entsyymit muuntavat arakidonihapon prostaglandiini H2, joka on edelleen jalostetaan eri prostaglandiineja, mukaan lukien PGE2 , hallitseva prostaglandiini keuhkojen [28,29]. Arvioida PGE2-tuotantoon A549-soluja, mittasimme solunulkoisen PGE2: n pitoisuus viljelyväliaineessa käyttämällä entsyymi-immunomääritys. Kuten kuviossa 1D, solunulkoisen PGE2: n pitoisuus väheni käsittelemällä TGF-β1: ssa 24 tuntia. Selektiivinen inhibiittori COX-2, NS-398, poistaa kokonaan PGE2 elatusaineesta, ilmaisee, että tuotanto PGE2 A549-solut riippuu pääasiassa funktiona COX-2. Nämä tulokset osoittavat, että TGF-β1 stimulaatio voimakkaasti estää ilmentymisen COX-2 ja johtaa vähenemiseen PGE2-tuotantoon A549-solut.

tukahduttaminen COX-2: n ilmentymisen TGF-β1 välittyy transkription tukahduttaminen

vieressä tutkineet mekanismi TGF-β1 aiheuttama COX-2 downregulation in A549-soluja. COX-2-proteiinin ilmentymisen voisi vaikuttaa proteiinien hajoaminen, muuntunut mRNA vakautta ja muuttunut transkriptio korko. Käyttäen reaaliaikaista RT-PCR-analyysillä, tutkimme ilmaus COX-2: n mRNA upon TGF-β1 käsittely 0,5-3 tuntia. Kuten kuviossa 2A on esitetty, COX-2: n mRNA oli laski nopeasti ja saavutti noin 50% ohjausyksikön 30 min stimulaation jälkeen. Tämä tulos osoittaa, että väheneminen COX-2-proteiinin jälkeen TGF-β1 stimulaatio on pääasiassa seurausta laskua COX-2: n mRNA. Sen tutkimiseksi, onko TGF-β1 vaikuttaa COX-2: n mRNA vakautta solut esikäsiteltiin transkription estäjän actinomycin D ennen TGF-β1 stimulaatiota. Sitten, COX-2 mRNA-tasolla tutkittiin reaaliaikaisen RT-PCR. Kontrollisoluja käsiteltiin aktinomysiini D yksinään oli merkittävä väheneminen COX-2: n mRNA. Käsittely TGF-β1 ei vaikuttanut COX-2 mRNA: n stabiilisuuteen, koska hajoaminen oli sama kuin havaittu kontrolli-soluissa (kuvio 2B). Lisäksi tutkimme COX-2-proteiinin vakaus käyttäen inhibiittorin sykloheksimidin (CHX). Soluja käsiteltiin CHX tai CHX plus TGF-β1, ja sitten COX-2-proteiinin tason tutkittiin immunoblottauksella. Kuten kuviossa 2C on esitetty, COX-2-proteiinin on vähentynyt kontrolli käsitellyissä soluissa CHX yksin ja TGF-β1 ei vaikuttanut COX-2-proteiinin stabiilisuus. Nämä tulokset osoittavat, että TGF-β1 ei vaikuta COX-2-proteiinin hajoamista ja mRNA: n stabiilisuuteen, vaan toimii transkriptionaalisella tasolla.

(A) aika-riippuvainen väheneminen COX-2 mRNA: n ekspressio käsittelemällä TGF -β1 (5 ng /ml). COX-2: n mRNA tasoa mitattiin reaaliaikaisella RT-PCR kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. (B) Soluja esikäsiteltiin aktinomysiini D (5 ug /ml) 1 tunnin ajan ja inkuboitiin kanssa tai ilman TGF-β1 (5 ng /ml) osoitetut ajat. TGF-β1 ei vaikuttanut laskua COX-2: n mRNA aktinomysiini D. COX-2: n ilmentymisen tasot normalisoitiin GAPDH ekspressiotasot ja ne ilmaistaan ​​prosentteina, että ei-käsitellyissä soluissa (kontrolli). Kukin arvo on keskiarvo ± SE (n = 3). (C) Soluja inkuboitiin CHX (50 ug /ml) tai CHX sekä TGF-β1 (5 ng /ml) osoitetut ajat ja COX-2-proteiinin ekspressio havaittiin immunoblottauksella. TGF-β1 ei vaikuttanut laskua COX-2-proteiinin CHX. Bändi intensiteetit kvantitoitiin ja COX-2 /aktiini-arvot ilmaistaan ​​suhteessa kuin kontrolli. Kukin arvo on keskiarvo ± SE (n = 4).

alassäätely COX-2 liittyy TGF-β1 aiheuttama kasvun esto A549-solut

merkityksen selvittämiseksi TGF-β1 aiheuttama COX-2 downregulation, tutkimme seuraavaksi, mitä rooleja COX-2 ja PGE2 pelata biologisten toimintojen A549-solut. PGE2 aktivoi EP reseptoreita, jotka luokitellaan 4 alatyyppeihin; GQ-proteiiniin EP1, Gi-proteiiniin EP3, Gs-proteiiniin EP2 ja EP4. Nämä EP-reseptorit on liitetty leviämisen eri syöpäsolujen [22,30-32]. Lisäksi ehdotettiin, että PGE2 ja EP-reseptorit ovat mukana leviämisen NSCLC-solujen [33]. Olemme tutkineet osallistumista COX-2 /PGE2 solusyklin A549-solut. Käsittely COX-2-estäjä NS-398 3 päivän pienensi S vaiheen ja lisäystä G0 /G1 vaiheessa (kuvio 3A). Kuten on esitetty kuviossa 3B, EP1 /2-antagonisti AH6809, EP3 antagonisti L798106 tai EP4-antagonistin L161982 myös merkittävästi vähentynyt suhde S-vaiheessa olevien solujen. Olemme edelleen tutki solujen lisääntymistä käyttämällä BrdU määritystä; sisällyttäminen BrdU osoittaa DNA-synteesin aikana solujen lisääntymistä. Hoito näillä EP antagonisteilla tukahdutettiin BrdU A549-soluissa (kuvio 3C). Analysoimme myös ilmentymisen EP reseptorien A549-soluja RT-PCR: llä, ja varmisti kaikki 4-reseptorin alatyyppejä (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että konstitutiivinen tuotanto PGE2, ainakin jossain määrin, edistää proliferaatiota A549-solujen kautta EP-reseptorien tavanomaisissa viljelyolosuhteissa.

(A) A549-soluja inkuboitiin NS-398 (50 uM) 3 päivää ja solusyklin analysoitiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Hoito NS-398 vähensi suhde S-vaiheen soluja. Kukin arvo on keskiarvo ± SE (n = 3). (B) Soluja käsiteltiin AH6809 (30 uM), L798106 (30 uM) tai L161982 (30 uM) ja 3 päivää, sitten solusyklin analysoitiin ja prosenttiosuus S-vaiheeseen laskettiin. Kukin arvo on keskiarvo ± SE (n = 5-7) (C) Käsittely AH6809 (30 uM), L798106 (30 uM) tai L161982 (30 uM) ja 3 päivää tukahdutti leviämisen A549-solut. Soluproliferaatiota tutkittiin BrdU määrityksellä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. BrdU-tasot ilmaistu suhteessa, että ei-käsitellyissä soluissa (kontrolli). Kukin arvo on keskiarvo ± SE (n = 6). Merkittäviä eroja osoitti ryhmien ja kontrolliryhmän on merkitty * (P 0,05) ja ** (P 0,01).

Näin ollen, TGF-β1-indusoidun downregulation COX-2: voisi vaikuttaa leviämisen A549-solut. Stimulaation TGF-β1 myös vähentynyt S-vaiheeseen ja lisätä G0 /G1 vaiheeseen A549-solut (kuvio 4A). Tämä solukierron pysähtymisen havaittiin 3 päivää hoidon jälkeen, kun A549-solut voidaan ilmentävät vähemmän COX-2. Itse asiassa, TGF-β1 aiheuttama väheneminen S-vaiheessa olevien solujen yleensä kumotaan eksogeeninen PGE2 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4B). Jotta voitaisiin edelleen tutkia vaikutusta TGF-β1 proliferaatioon A549-solut, mittasimme solujen lisääntymisen avulla BrdU-määritystä. Olemme vahvisti, että BrdU väheni TGF-β1 stimulaatiota 3 päivää, ja tämä TGF-β1-indusoidun suppression BrdU osittain vaimenee, kun läsnä on PGE2 (kuvio 4C). Olemme myös havainneet, että TGF-β1 ei vaikuttanut ekspressiokuviota EP-reseptorin alatyyppien A549-soluja (tietoja ei esitetty). Nämä tulokset tukevat sitä ajatusta, että TGF-β1-indusoidun COX-2 downregulation liittyy suppression leviämisen A549-solut. Itse asiassa solujen määrä näytteissä käsitelty TGF-β1 ja 3 päivää väheni verrattuna tapaukseen, jossa ei-käsiteltyjä soluja, ja lisäksi PGE2: n lisääntynyt solujen määrä TGF-β1-käsiteltyjen solujen (kuvio 4D). Siten tulokset viittaavat siihen, että TGF-β1 aiheuttama kasvun esto A549-solut on osittain välittävät downregulation COX-2. Koska solujen kasvun pysähtymisen at G0 /1 vaihe on välttämätön solujen erilaistumiseen, TGF-β1 aiheuttama kasvun esto A549-solut saattaa liittyä EMT aiheuttama TGF-β1 A549-soluissa.

(A) A549-soluja käsiteltiin TGF-β1 (5 ng /ml) osoitetut ajat ja solusyklin analysoitiin. Hoito TGF-β1 vähentynyt suhde S-vaiheen soluja. (B-D) Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun oli inkuboitu kanssa tai ilman TGF-β1 (5 ng /ml), solut on täydennetty PGE2 (10, 25 uM), ja inkuboitiin vielä 2 päivää. Proliferaatiota tutkittiin solusyklin analyysillä (B), BrdU-määritys (C) ja solujen laskenta (D), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. PGE2 kumotaan TGF-β1 aiheuttama kasvun esto. Kukin arvo on keskiarvo ± SE (n = 3-5). Merkittäviä eroja osoitti ryhmien ja kontrolliryhmän on merkitty * (P 0,05) ja ** (P 0,01).

alassäätely COX-2 nopeuttaa TGF-β1 aiheuttama fibroottisia EMT vaste

TGF-β1 on hyvin tiedetään olevan voimakas induktori EMT, joka on fenotyypin muutos, joka liittyy erilaistumiseen epiteelisolujen fibroblastit kaltaisia ​​soluja. Tässä prosessissa EMT, epiteelin markkeriproteiinien, kuten E-kadheriinin, ovat kadonneet ja mesenkymaaliset proteiineja, mukaan lukien N-kadheriinin ja fibronektiinin, ovat upregulated. Varmistimme väheneminen E-kadheriinin ja lisäys N-kadheriinin 48 h jälkeen TGF-β1 stimulaatiota. Samaan aikaan, ilmaisu fibronektiinin nostettiin (kuvio 5A). Tutkia osallistumista COX-2 downregulation näissä TGF-β1 aiheuttama EMT vasteita, solut kostimuloiduissa TGF-β1 ja PGE2. Kuten kuviossa 5B on esitetty, PGE2 (25 uM) ei ollut vaikutusta menetys E-kadheriinin tai ylössäätely N-kadheriinin aiheuttama TGF-β1. Toisaalta, TGF-β1-induced upregulation fibronektiinin inhiboitui merkittävästi eksogeenisen PGE2. PGE2 tukahdutti TGF-β1 aiheuttama fibronektiinin ekspressiota annoksina jopa 5-10 uM (kuvio 5C). Seuraavaksi tutkimme myös vaikutusta EP reseptoriagonistien fibronektiinin ilme. Hoito EP2 reseptoriagonisti butaprost tai EP4-reseptoriagonisti PGE1-OH esti kasvua fibronektiinin aiheuttama TGF-β1, kun taas EP1 /3 reseptoriagonisti sulprostonia ollut mitään vaikutusta (kuvio 5D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että EP2 ja EP4-reseptoreihin välittävät estävä vaikutus PGE2 on TGF-β1-indusoidun fibronektiinin ekspressiota.

(A) A549-soluja käsiteltiin TGF-β1 (5 ng /ml) osoitetut ajat ja ilmentyminen E-kadheriinin, N-kadheriinin ja fibronektiiniä havaittiin immunoblottauksella. (B) Neljäkymmentä kahdeksan tuntia inkuboinnin jälkeen TGF-β1 (5 ng /ml) ja PGE2 (25 uM), ilmentymisen E-kadheriinin, N-kadheriinin ja fibronektiiniä arvioitiin. (C) Soluja inkuboitiin TGF-β1 (5 ng /ml) ja PGE2 (5-25 uM) 48 tunnin ajan ja ilmaisu fibronektiinin tutkittiin. PGE2 tukahdutti fibronektiini induktion TGF-β1. (D) Soluja käsiteltiin TGF-β1 (5 ng /ml) ja ajoneuvon (metyyliasetaatti), sulprostoni, butaprost tai PGE1-OH (20 uM) 48 tunnin ajan ja ilmentyminen fibronektiinin arvioitiin. Käsittely butaprost tai PGE1-OH esti TGF-β1 aiheuttama lisäys fibronektiinin ilmaisua. HMGB1 havaittiin latauskontrollina. Bändi intensiteetit kvantitoitiin densitometrisesti ja ilmaistaan ​​suhteessa kuin kunkin valvontaa.

Fibronektiini on osa ECM ja muuttaa fibronektiinin ekspressio liittyy sidekudossairauksien. Tutkimme lisäksi, onko TGF-β1 indusoi kollageeni I, joka on merkittävä ECM komponentti fibrotic kudoksissa [34-36]. COL1A1 (koodaa kollageeni I) transkripti taso oli kohonnut stimuloimalla TGF-β1 (5 ng /ml) ajan riippuvaisella tavalla (kuvio 6A). Tämä TGF-β1-indusoitua ilmentymistä COL1A1 lievitti lisäravinteen eksogeenisen PGE2 (kuvio 6B). Sekä PGE2, PGE1-OH voimakkaasti tukahdutti COL1A1 induktion TGF-β1, kun taas butaprost ja sulprostonia esillä ainoastaan ​​vaatimattomia tukahduttava vaikutus (kuvio 6C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että downregulation COX-2 ja PGE2-tuotantoa TGF-β1 on mukana ECM komponenttien tuotanto A549-soluissa.

(A) Soluja stimuloitiin TGF-β1 (5 ng /ml) että ilmoitettu ajat; Sitten kokonais-RNA uutettiin ja COL1A1-geenin ilmentymistä tutkittiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä. (B) Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun hoidon TGF-β1 (5 ng /ml) ja PGE2 (5-25 uM), COL1A1 geenin ilmentyminen tutkittiin. PGE2 kumotaan TGF-β1 aiheuttama COL1A1 geeniekspressiota. (C) Soluja käsiteltiin TGF-β1 (5 ng /ml) ja ajoneuvon (metyyliasetaatti), sulprostoni, butaprost tai PGE1-OH (20 uM) 24 tunnin ajan, ja COL1A1 mRNA-tasolla mitattiin. PGE1-OH tukahdutti COL1A1 induktion TGF-β1. COL1A1 geeniekspressiotasot normalisoitiin GAPDH ilmaisun ja ne on esitetty prosentteina, että TGF-β1-käsitellyt solut. Kukin arvo on keskiarvo ± SE (n = 3). Merkittävät erot ilmoitetaan ryhmien ja kontrolliryhmässä on merkitty ** (P 0,01).

TGF-β1 aiheuttama tukahduttaminen PGE2-tuotantoa on mukana aktiini remodeling vuonna A549-soluja

Tutkimme myös aktiini stressisäikeiden muodostumista, joka on pidetty tunnusmerkki fibroblastit sekä osana EMT. Kuten kuviossa 7A, TGF-β1 (5 ng /ml) silmiinpistävän indusoi aktiinin polymeroitumisen, kun taas aktiini stressi kuidut tuskin havaittiin PGE2-käsitellyissä soluissa. Käsittely butaprost tai PGE1-OH esti myös TGF-β1 aiheuttama aktiini stressisäikeiden muodostumista. Toisaalta, sulprostonia hieman tukahdutti aktiini polymerointi TGF-β1. Koska aktiini stressi kuidut liittyvät solun liikkuvuus, tutkimme myös solujen migraatiota Transwell määrityksessä. Kuten on esitetty kuviossa 7B, stimulaatio TGF-β1 lisääntynyt solumigraation 24 tunnin sisällä, kun taas määrä siirtynyt solujen väheni, kun läsnä on PGE2. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TGF-β1-indusoidun suppression PGE2-tuotantoa liittyy aktiini stressiä kuitujen muodostumista ja kulkeutumista A549-solut.

(A) A549-soluja inkuboitiin TGF-β1 (5 ng /ml) ja PGE2 (10 uM), ajoneuvo (metyyliasetaatti), sulprostoni, butaprost tai PGE1-OH (20 uM) 12 tuntia. Sitten F-aktiini värjättiin käyttäen rodamiinifalloidiinia (punainen) ja värjätyt solut analysoitiin käyttämällä konfokaalista laser-skannaus mikroskooppia x63 suurennuksella. TGF-β1 aiheuttama aktiini stressi kuidunmuodostukseen tukahdutettiin PGE2, butaprost tai PGE1-OH. Voit tarkistaa sijainnin ytimien solut värjättiin Hoechst33258 (sininen). (B) solumigraation tutkittiin Transwell määrityksellä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. A549-soluja käsiteltiin TGF-β1 (5 ng /ml) ja PGE2: n (10 uM) 24 tunnin ajan;