Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

epiteelikasvaimet kohteeseen mesenkymaalitransitioon (EMT) aiheuttama hypoksia on yksi kriittinen syistä hoidon epäonnistumisen erilaisissa ihmisen syövissä. NF-KB on tiiviisti mukana etenemistä EMT. Verrattuna HIF-1α, korrelaatio NF-KB ja EMT aikana hypoksiaa on vähemmän tutkittu, ja vaikka ilmiö havaittiin aikaisemmin, molekyylitason mekanismit jäi epäselväksi.

Menetelmät /Principal Havainnot

Täällä raportoimme että hypoksian tai yliekspressio hypoksia-indusoituva tekijä-1α (HIF-1α) edistää EMT haiman syöpäsoluja. On molekyyli- tai farmakologinen esto NF-KB, hypoksinen solut takaisin ilmentyminen E-kadheriinin, menetti ilmaus N-kadheriinin ja heikennettyjä niiden erittäin invasiivisia ja lääkkeille vastustuskykyisiä fenotyypin. Esittelyssä pcDNA3.0 /HIF-1α osaksi haimasyövän soluja happiolosuhteissa kohonnut NF-KB: n aktiivisuutta, phenocopying EMT vaikutuksia, joita hypoksia. Kääntäen, estäen kohonnut NF-KB-aktiivisuutta tässä tilanteessa vaimennetaan EMT fenotyyppi.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tulokset viittaavat siihen, että hypoksian tai yliekspressio HIF-1α indusoi EMT, joka on pitkälti riippuvainen NF-KB haiman syöpäsoluja.

Citation: Cheng ZX, Sun B, Wang SJ, Gao Y, Zhang yM, Zhou HX, et al. (2011) Nuclear Factor-KB-riippuvaa epiteelisolujen ja mesenkymaalitransitioon indusoima HIF-1α Aktivointi haimasyöpäsoluissa Hypoksisissa toimitusehdot. PLoS ONE 6 (8): e23752. doi: 10,1371 /journal.pone.0023752

Toimittaja: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2011; Julkaistu: 22 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Cheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta New Century Support Foundation for Elitist Kiinan opetusministeriö (NCET-07-0248), tieteellinen säätiö Tunnettuja Nuorten Heilongjiangin maakunnassa, Kiina (JC200717), tieteellistä ja teknologista Project Heilongjiangin maakunnassa Kiinassa (GC09C407-2), ja National Natural Tiedesäätiö of China (30571808, 30872987). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

haimasyöpä, joka on yksi kaikkein aggressiivinen ja tappava syöpä maailmanlaajuisesti, on erittäin vastustuskykyinen kemoterapiaa [1]. Vaikka systeeminen gemsitabiinihoito, nykyinen ensilinjan hoitoon pitkälle haimasyövän tarjoaa vain vähän hyötyä johtuen luontaisen tai hankittu chemoresistance [2], [3]. Edelleen, viimeaikaiset kliiniset tutkimukset osoittavat, että vain 12%: lla potilaista, joilla on edennyt haimasyöpä vasteen gemsitabiiniannokseen [4]. Huono vaste viittaa siihen, että haimasyövän joko nopeasti kehittyy tai on gemsitabiinin chemoresistance. Mekanismeja, joilla chemoresistance syntyy haimasyövän ei tunneta; siten ymmärtää paremmin, miten vastus syntyy ja mitä molekyyli- muutokset aiheuttavat tai korreloi vastus on todennäköisesti johtaa uusia terapeuttisia strategioita haimasyövän.

Hypoksia on ympäristön ärsyke, joka on keskeinen rooli kehityksen ja syövän etenemiseen . Kasvainten hypoksia tai lauseke HIF-1 (hypoksia-indusoituva tekijä-1) on yhdistetty aggressiiviseen fenotyyppi, joka korreloi huono vaste kemoterapiaa ja huonompaan eloonjäämisaste syöpäpotilaiden [5], [6]. HIF-1 on heterodimeerinen proteiini, joka koostuu HIF-1β, joka on konstitutiivisesti alayksikkö, ja HIF-1α, happea herkkä indusoituva alayksikköön. Under happiolosuhteissa, HIF-1α proteiini hydroksyloituu perheen hapen vaikutuksesta prolyyli hydroksylaasien (PHD1-3); Kohteena sitä polyubiquitination jonka proteiinikompleksi, joka sisältää von Hippel-Lindaun proteiini (pVHL) ja sitten hajoaminen. Hypoksisissa olosuhteissa, prolyyli hydroksylaaseja inaktivoituvat, ja HIF-1α hajoaminen on estetty; Tämä mahdollistaa HIF-1α kerätä ja yhdistää HIF-1β toimivaksi transkriptio monimutkainen joka laukaisee transkriptio lukuisia hypoksia-indusoituva geeni [7].

epiteelikasvaimet kohteeseen mesenkymaalitransitioon (EMT) on prosessi, jossa kiinnittyneet epiteelisolujen muuntaa liikkuvia mesenkyymisolujen ja on välttämätöntä alkion kehitykseen. EMT on nyt tiedetään myös esiintyä erilaisissa sairauksissa, mukaan lukien etenemisen syövän [8]. Viime tutkimuksessa esitetään näyttöä siitä, mikä viittaa siihen, että maltillinen hypoksinen olosuhteet voivat laukaista, itsenäisenä tekijänä, EMT-ohjelman johtavan eri ihmisen syöpäsoluja lisäämään merkittävästi invasiivisuus [9]. Samaan aikaan jotkut tutkimukset kertoi myös, että NF-KB on tiiviisti mukana etenemistä EMT [10] – [13]. Tarkemmat tutkimukset erilaisiin näkökulmiin EMT ohjelmaa ovat paljastaneet sen osallistuminen enemmän kuin vain invaasiota ja etäpesäkkeiden; Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että fenotyypin EMT liittyy chemoresistance erilaisissa kiinteitä kasvaimia [14] – [17].

Nuclear factor-kappa B (NF-KB) edustaa perheen transkriptiotekijöiden, jotka moduloivat ilmentymisen geenejä monipuolisia toimintoja. Aktiivisuus NF-KB säätelee NF-KB estävä proteiini (IKB), joka sitoutuu ja sequesters NF-KB perheenjäsenet sytoplasmassa. Kun NF-KB-reitin aktivoituu, IKB-fosforyloituu IKB-kinaasin (IKK), joka fosforyloi IkB. Fosforyloitua IKB suoritetaan ubikitinaation ja proteasomin välittämän hajoamisen, mikä johtaa translokaatio NF-KB: n tumaan. NF-KB on kaikkialla läsnä transkriptiotekijä säätelevät monet ärsykkeet kuten hypoksia, sytokiinien ja kemoterapeuttiset lääkkeet, ja on viime aikoina tullut tavoitteeksi syöpään. NF-KB: n konstitutiivisesti aktivoitu useimmissa ihmisen haimasyövän soluja ja primaarikasvaimen yksilöitä, mutta ei normaalissa haiman kudoksista tai ei tuumorigeeninen solulinjoissa [18] – [20]. Eräät viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että hypoksia voi aktivoida NF-KB: n ja aiheuttaa vastus haimasyöpäsoluissa gemsitabiiniannokseen [21] – [23]. Aiemmin kerroimme, että käyttämällä dihydroartemisiniini tai Sirna (siRNA) inaktivoi NF-KB ja voimistaa antituumorivaikutusta gemsitabiinin on haimasyövän sekä in vitro että in vivo [24], [25].

Tässä tutkimuksessa etsittiin todisteita siitä, että haimasyövän soluja (PANC-1, BxPC3) hypoksisissa läpikäyvät prosessin EMT ja hankkia invasiivisia ja lääkkeille vastustuskykyisiä fenotyyppejä on NF-KB-riippuvaista. Tässä osoitimme, että hypoksian tai yliekspressio HIF-1α aktivoitua NF-KB ja edistetään EMT haiman syöpäsoluja. On molekyyli- tai farmakologinen esto NF-KB, hypoksinen solut takaisin ilmentyminen E-kadheriinin, menetti ilmaus N-kadheriinin ja heikennettyjä niiden erittäin invasiivisia ja lääkkeille vastustuskykyisiä fenotyypin. Esittelyssä pcDNA3.0 /HIF-1α osaksi haimasyövän soluja happiolosuhteissa kohonnut NF-KB: n aktiivisuutta, phenocopying EMT vaikutuksia, joita hypoksia. Kääntäen, estäen kohonnut NF-KB-aktiivisuutta tässä tilanteessa päinvastaiseksi EMT fenotyyppi. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että hypoksian tai yliekspressio HIF-1α aiheuttaa EMT, joka on pitkälti riippuvainen NF-KB haiman syöpäsoluja.

Tulokset

Hypoksia aiheuttaa morfologisia ja solujen biologisia muutoksia ominaisuus EMT haiman syöpäsoluissa

Yhteenvetona hapen niukkuuden vaikutuksilta kuin se esiintyy haimasyövän, olemme alttiina 55-60% subkonfluenteista haimasyövän soluja (PANC-1, BxPC-3) hypoksisissa olosuhteissa (1% O

2, 5% CO

2, ja 94% N

2) enintään 48 tuntia. Havaitsimme selkeitä eroja morfologia ja taipumus muodostaa solun pesiä tai klustereiden välistä haimasyöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa ja niiden normoxic kollegansa (95% ilmaa ja 5% CO

2). Normoxic solut osoittivat monikulmion ja mukulakivikadut levyiksi, osoitus epiteelin fenotyypin. Sen sijaan, hypoksia solut alkoivat menettää solujen yhteydet, sironnut soluklusterien ja hankkinut pitkänomainen, fusiform morfologia dendriittisten prosessien, sopusoinnussa mesenkymaalitransitioon (Fig. 1 B).

(A) Western blot -analyysi epiteelin merkki (E-kadheriinin) ja mesenkymaaliset markkereita (vimentiinin, N-kadheriinin) ja HIF-1α ja PANC-1, BxPC-3-soluilla normoxic (N) tai hypoksinen (H) olosuhteissa 48 tuntia. Edustaja blot kolmesta itsenäisestä kokeesta näytettiin. Histogrammi osoitti keskimääräisen tiheyden korjattuna latauskontrollina (β-aktiini). *,

p

0,05. (B) Faasikontrasti- analyysi (alkuperäinen suurennos, x 100) morfologisia muutoksia havaitaan haimasyövän soluja normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia. (C) Immuofluorescence värjäys E-kadheriinin ja vimentiinin in PANC-1, BxPC-3-soluilla normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia. Vihreä edustaa E-kadheriinin värjäys, kun taas punainen edustaa vimentiinista värjäystä. Blue signaali edustaa tuman DNA värjäyksen DAPI. (D) Solujen elinkelpoisuus arvioitiin Cell Counting Kit-8 määritystä ja käytetään laskettaessa elinkykyisyysindeksiä. PANC-1 ja BxPC-3-solut altistettiin gemsitabiinia (0 umol /l) ja 48 h perustason. *,

p

0,05. (E) lisääntyminen solujen mitattiin kristalliviolettia määrityksessä. Luvut valittiin edustavia kohtauksia kolmen erillisen kokeen. (F) Matrigel invaasiomääritys. Vasen, mikrovalokuvia solujen läpi kulkeneiden matrigeelin alle normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia (alkuperäinen suurennos, × 100). Oikea, kvantifiointi hyökkäystä. *,

p

0,05.

Vahvista onko haimasyöpäsoluissa koki EMT altistuvat hypoksia, myös määritelty ilmaus merkkiaineiden epiteelin ja mesenkymaalisten fenotyyppien Western blot-analyysi . Kuten on esitetty kuviossa. 1A, hypoksinen solut tehtiin ”kadheriinin kytkin” jolloin ne ilmenevät alentunut E-kadheriinin ilmentymisen ja lisäsi N-kadheriiniekspressiota. Lisäksi, ekspression HIF-1α, on tärkeä merkki hypoksian reitin, havaittiin voimakkaasti ilmaistiin hypoksisissa ehto 48 h (Fig. 1A). Immunofluoresenssivärjäyksen käytettiin edelleen vahvistaa EMT fenotyypin muutosten haimasyövän soluja hypoksinen kunnossa. On osoitettu, että ilmaisu E-kadheriinin vähentynyt ja ilmentymistä vimentiinista lisääntynyt verrattuna kuin normoxic soluissa (Fig. 1 C).

Syöpäsolut ovat läpikäyneet EMT on taipumusta suurempi lääkeresistenssin ja invasiivisuus . Sinänsä tarkastelimme näitä ominaisuuksia normoxic soluissa verrattuna hypoksinen solujen Cell Counting Kit-8 määritystä Kristalliviolettiliuos määritys ja Matrigel invaasiomääritys. Hätkähdyttäviä eroja havaittiin. Cell Counting Kit-8 määritystä käytettiin arvioimaan solujen elinkykyä korko. PANC-1 ja BxPC-3-solut altistettiin kaltevuus annosta gemsitabiinia (0-200 umol /l) 48 tuntia. Data on esitetty kuvassa. 1D, hoidetuilla pitoisuus gemsitabiinin suurempi kuin 100 nmol /l, hypoksisia solut osoittivat merkitsevästi korkeampi solujen elinkelpoisuus nopeudella kuin normoxic soluja. Nämä tulokset vahvistettiin edelleen Kristalliviolettiliuos määrityksellä (Fig. 1 E), kun soluja käsiteltiin gemsitabiinin (10 umol /l PANC-1 ja 500 nmol /L BxPC-3) hypoksisissa tai happiolosuhteissa 48 tuntia, hypoksinen solut osoittivat merkitsevästi korkeampi solujen elinkelpoisuus nopeammin kuin normoxic soluja. Matrigel invaasiomääritys käytettiin arvioitaessa solun invasiivisuus. Sekä PANC-1 ja BxPC-3-soluissa hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia helposti vaeltaneet läpi matrigeelin kammion suhteellisen suuri määrä, kun taas niiden normoxic kumppanit osoittivat selvä vähentäminen invaasiota (Fig. 1 F).

Yhdessä tietomme osoittavat muutoksia morfologiassa, kasvumalli, proteiinin ilmentyminen, lääkeresistenssin ja invaasio tukevat käsitystä, että hypoksia johtaa EMT haiman syöpäsoluja.

haimasyöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa näytteille kohonnut NF-KB aktiviteetti

Jotkut tutkimukset ovat aiemmin osoittaneet, että hypoksia johtaa NF-KB: n [19], [20]. Niinpä pyrittiin määrittämään, onko EMT havaittu haimasyöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa johtui kohonneen NF-KB: n aktiivisuutta. Ensinnäkin dokumentoitu, että NF-KB: n p65-proteiinien ja NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus todellakin kasvanut hypoksisiin haiman syöpäsoluissa verrattuna normoxic vastaan, koska määritettiin Western blot -analyysillä ja EMSA. Samaan aikaan, HIF-1α analysoitiin myös Western blot -analyysillä (kuvio. 2A). PANC-1 ja BxPC-3-soluja inkuboitiin hypoksisissa olosuhteissa eri aikoja (24 h, 48 h, 72 h). Jokaisen merkitty itämisaika, solut kerättiin, ja kokonaan tai ydin- proteiinit uutettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 2A ja B, NF-KB p65 proteiinien ja NF-KB: n DNA: ta sitovan aktiivisuuden korotettiin 24 tuntia aloittamisen jälkeen hypoksia ja ylläpitää korkeaa tasoa. Spesifisyys geeli-siirtynyt bändejä EMSA dokumentoitiin kylmä kilpailu kokeita, joissa ylimäärä kylmää villin tyypin mutta ei kylmä mutantti KB koetin kumottu signaalit siirretään bändejä.

PANC-1 ja BxPC- 3-soluja viljeltiin normoxic (N) tai hypoksisissa olosuhteissa (H) eri aikoja (24 h, 48 h, 72 h). Jokaisen merkitty itämisaika, solut kerättiin. Tumauutteita ja kokonaisproteiinin uutteet valmistettiin. (A) NF-KB: n p65: n ja HIF-1α analysoitiin Western blot-analyysillä vastaavista soluhomogenaattia. Histogrammi osoitti keskimääräisen tiheyden korjattuna latauskontrollina (β-aktiini). *,

p

0,05. (B) EMSA NF-KB: n DNA-sitoutumisaktiivisuutta vastaavilla tumaekstraktien. Kilpaileva määritys vahvisti spesifisyyden NF-KB: n sitoutumisen DNA (katso materiaalit ja menetelmät lisätietoja). Oikea kaksi kaistaa, paino-, villityypin; m, mutantti. (C) VEGF analysoitiin Western blot-analyysillä vastaavista soluhomogenaattia. Histogrammi osoitti keskimääräisen tiheyden korjattuna latauskontrollina (β-aktiini). *,

p

0,05. (D) Western blot analyysi. Effects of NF-KB-p65 siRNA VEGF ilmentymisen PANC-1 ja BxPC-3-solujen hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia. Histogrammi osoitti keskimääräisen tiheyden korjattuna latauskontrollina (β-aktiini). *,

p

0,05.

Samalla HIF-1α analysoitiin myös Western blot-analyysi. Kuten on osoitettu Western blottauksella (kuvio. 2A), HIF-1α-proteiinin tasot haimasyövän soluja säädellään ylöspäin aikana hypoksiaa. Kasvu HIF-1α-proteiinin taso oli mahdollisesti johtuu proteiinin stabiilisuuteen vaikutukset kuin aikaisemmin tutkittu [7]. Koska ilmentymisen HIF-1α kohdegeenin VEGF, kasvutekijä, joka voi edistää EMT, välittyy NF-KB: n, myös onko hypoksia stimuloi VEGF ilmentymistä. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, Western blottaus osoitti, että VEGF-proteiinin ilmentyminen kasvoi merkittävästi 24 h hypoksia ja ylläpidetään korkealla tasolla. Sitä vastoin säätely ylöspäin VEGF tukahdutettiin hiljentäminen NF-KB: n p65: n ilmentymisen hypoksinen haimasyövän soluja käyttäen NF-KB: n p65-spesifinen siRNA, kun taas mitään vaikutusta ei havaittu soluissa, jotka oli transfektoitu ohjaus siRNA (Fig. 2D) .

NF-KB: n aktiivisuuden haimasyöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa sovittelee EMT

Todettuaan, että hypoksia johtaa kohonnut NF-KB-aktiivisuuden haimasyöpäsoluissa, tutkimme seuraavaksi mahdollisuuksia NF-KB: n vaimentamiseksi mesenkymaaliset ominaisuudet hypoksisia soluja. Tämä tavoitteenaan, käytimme sekä molekyyli- ja farmakologinen keinoja estämällä NF-KB: n näissä hypoksisiin soluissa ja sitten verrataan tuloksena fenotyypin ohjaus käsiteltyjä soluja. Molecular esto toteutettiin siRNA ja säätelevät vaimentaen p65-alayksikköä NF-KB. Käytimme myös kaupallisesti saatavilla IKK estäjä BAY 11-7082 farmakologisesti estää NF-KB: n aktiivisuutta. NF-KB: n aktiivisuutta joko NF-KB p65 siRNA tai BAY 11-7082 hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia johti muutokseen proteiiniekspressiossa ominaista lisääntynyt E-kadheriinin ja vähentää N-kadheriiniekspressiota määritettynä Western blot-analyysi (Fig. 3A), yhdenmukaisia ​​palautumisesta epiteeliosaan fenotyyppi. Tärkeää on, NF-KB joko NF-KB p65 siRNA tai BAY 11-7082 johti heikkenee huomattavasti invasiivisuus hypoksisten solujen verrattuna kontrollikäsitellyt solujen Matrigel invaasiomääritys hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia (Fig. 3B) . Kun soluja käsiteltiin gemsitabiinin (10 umol /l PANC-1 ja 500 nmol /L BxPC-3) ja 48 h NF-KB: n aktiivisuutta joko NF-KB: n p65: n siRNA tai IKK estäjä hypoksisissa olosuhteissa, ne osoittivat myös merkittävästi alempi elinkelpoisuus nopeudella kuin niiden valvontaa Kristalliviolettiliuos määrityksessä (Fig. 3C) ja Cell Counting Kit-8 määritystä (Fig. 3d). Näistä muutoksista huolimatta proteiiniekspressiossa, invasiivisuus ja lääkeresistenssin johtuvan NF-KB: n saarto, emme noudata mitään syvällisiä muutoksia morfologiassa tai kasvutavat haimasyövän soluja hypoksisissa olosuhteissa, havainto, että tämä vaikuttaa NF-KB-riippumaton biokemiallisia tapahtumia että myös myötävaikuttaa EMT fenotyyppi hypoksisiin haiman syöpäsoluja.

(A) Western blot-analyysi. Effects of NF-KB: n p65: n siRNA ja IKK-inhibiittorin BAY 11-7082 on N-kadheriinin ja E-kadheriinin ilmentymisen PANC-1 ja BxPC-3-solujen hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia. Histogrammi osoitti keskimääräisen tiheyden korjattuna latauskontrollina (β-aktiini). *,

p

0,05. (B) Matrigeliä invaasio määritykset. Vasen, mikrovalokuvia jälkeen soluja käsiteltiin NF-KB p65 siRNA tai BAY 11-7082 (10 mikromol /l) tai sopiva verrokkeihin nähden. Alkuperäinen suurennus, × 100. Oikea, kvantifiointi invaasiomääritys. *,

p

0,05. (C) lisääntyminen solujen mitattiin Kristalliviolettiliuos määrityksessä. Luvut valittiin edustavia kohtauksia kolmen erillisen kokeen. (D) Solujen elinkelpoisuus arvioitiin Cell Counting Kit-8 määritystä ja käytetään laskettaessa elinkykyisyysindeksiä. *,

p

0,05.

haimasyöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa näytteille NF-KB-riippuvaista säätelyä Twist, transkription sääntelyviranomaisten EMT-ohjelman

geeniekspression ohjelma, joka välittää EMT säädellään yhden tai useamman transkription tekijöitä, kuten Twist, Zeb1, Zeb2, ja Snail [26]. Nämä transkriptiotekijät vaikuttavat ilmaus kadheriinit ja metalloproteinaasien muun proteiinit, jotka osallistuvat EMT. Että nämä transkriptiotekijät ovat transkriptionaalisesti indusoi ylävirtaan signalointireittejä, kuten NF-KB: n [26], sai meidät tarkkailemaan ero ilmentymistä haimasyövän soluja hypoksisissa olosuhteissa verrattuna happiolosuhteissa Western blot -analyysillä. Hypoksinen haimasyöpäsoluissa osoittivat merkittävää voimistumista Twist, Etana, Zeb1, ja Zeb2 verrattuna normoxic soluihin (Fig. 4A). Farmakologinen esto IKK mukaan BAY 11-7082 vuonna hypoksinen soluissa johti annosriippuvaisen laskun Twist ilmaisun mutta ei merkittäviä muutoksia Zeb1, Zeb2 tai Snail lauseke, päätelmä indicts kasvavaan tilaa NF-KB koska etiologinen biokemiallisten voima taustalla Twist yli-ilmentymisen haimasyöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa (Fig. 4B). Nämä havainnot osoittavat, että täydennetty ilmaus Twist, jota esiintyy ympäristössä haimasyöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa välittyy kohonnut NF-KB: n aktiivisuutta.

(A) Western blot analyysi lähtötilanteen ilmentymisen EMT-välittävien transkriptio tekijät: Twist, Snail, Zeb1, ja Zeb2 haimasyövän soluja normoxic (N) versus hypoksinen (H) edellytykset 48 tuntia. Histogrammi osoitti keskimääräisen tiheyden korjattuna latauskontrollina (β-aktiini). *,

p

0,05. (B) Western blot-analyysi. Annoksesta riippuvaa vaikutukset 48-h altistuminen IKK estäjän BAY 11-7082 ekspressioon Twist, Etana, Zeb1, ja Zeb2 hypoksisissa olosuhteissa. Edustaja blot kolmesta itsenäisestä kokeesta näytettiin. Histogrammi osoitti keskimääräisen tiheyden korjattuna latauskontrollina (β-aktiini).

yli-ilmentyminen HIF-1α haimasyövän soluja happiolosuhteissa indusoi EMT NF-KB-riippuvaisella tavalla

Viimeaikaiset raportit ovat luoneet etiologinen yhteys HIF-1α ilmaisun tukahduttamisesta E-kadheriinin ja hankkiminen mesenkymaalisten fenotyypin [27]. Niinpä arveltu, että EMT, että haimasyövän soluja tehdään vasteena HIF-1α ilmaisu tapahtuu, ainakin osittain, koska HIF-1α-välitteisen NF-KB-reitin kautta. Ensin ohimenevästi käyttöön pcDNA3.0 /HIF-1α osaksi PANC-1 mukaisesti happiolosuhteissa (HIF-1α

+ /N) käyttäen LipofectamineTM 2000. katsoo HIF-1α oli lähes havaitsematon PANC-1 alla happiolosuhteissa transdusoitiin ohjaus tyhjän vektorin (pcDNA3.0 /N), HIF-1α tasot HIF-1α

+ /N soluja verrattavissa solujen hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia (Kuva. 5A). Seuraavaksi vahvisti, että NF-KB toimintaa tosiasiallisesti kasvuun näissä HIF-1α

+ /N soluja kuin pcDNA3.0 /N soluja. Todellakin, HIF-1α

+ /N solut osoittivat kohonneen NF-KB: n aktiivisuus määritettiin Western blot -analyysillä ja EMSA (Fig. 5A ja B).

(A) Western blot -analyysi NF-KB p65 ja HIF-1α ilmentymistä PANC-1-soluissa hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia (H /48 h), PANC-1-solut transdusoitiin pcDNA3.0 tyhjän vektorin (pcDNA3.0 /N) ja pcDNA3.0 /HIF-1α (HIF-1α

+ /N) mukaisesti happiolosuhteissa 48 tuntia. Histogrammi osoitti keskimääräisen tiheyden korjattuna latauskontrollina (β-aktiini). *,

p

0,05. (B) EMSAs NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus H /48 h, HIF-1α

+ /N, ja pcDNA3.0 /N PANC-1-soluja. Oikea kaksi kaistaa, kylmä kilpailu EMSA.

Todettuaan, että HIF-1α

+ /N solut ilmeinen kohonnut NF-KB: n aktiivisuutta, me seuraavaksi arvioidaan näiden solujen todisteita EMT. Verrattuna pcDNA3.0 /N-soluissa, HIF-1α

+ /N solut osoittivat kasvua N-kadheriinin ilmentymisen ja tukahduttaminen E-kadheriinin mukaisesti happiolosuhteissa 48 h määritettynä Western blot-analyysillä (kuvio. 6A) . Immunofluoresenssivärjäyksen käytettiin edelleen vahvistaa EMT aiheuttamien HIF-1α alle happiolosuhteissa, ilmaus E-kadheriinin vähentynyt ja vimentiinista lisääntyivät HIF-1α

+ /N soluja verrattuna pcDNA3.0 /N soluja normoxic olosuhteissa 48 h (Fig. 6B). Tämä kadheriinin kytkin liittyi myös lisääntynyt Twist, Snail, Zeb1, ja Zeb2 ilme (Fig. 6A), havainnot, jotka muistuttavat niitä havaittiin haiman syöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa (Fig. 4A). Rooli NF-KB moduloinnissa näissä proteiinin ilmentyminen muuttuu ilmentää toisaalta vaikutuksista NF-KB: HIF-1α

+ /N solujen altistumisesta IKK estäjä BAY 11-7082 (0-10 umol /L), joka kumosi kadheriinin kytkentä ilmiö sekä vähennetään ilmaus Twist annoksesta riippuvaa, mutta ei merkittäviä muutoksia Zeb1, Zeb2 tai Snail ilmentymistä (Fig. 6C). Invasion ja gemsitabiinin vastus HIF-1α

+ /N solua ja sen riippuvuus kohonnut NF-KB aktiivisuus arvioitiin Matrigel invaasiomääritys, Kristalliviolettiliuos määritys ja Cell Counting Kit-8 määrityksessä. Esimerkiksi, invasiivisuus HIF-1α

+ /N soluihin Matrigel kammion oli merkittävästi suurempi kuin pcDNA3.0 /N soluja happiolosuhteissa 48 h (Fig. 6D). Vastaavasti, kun soluja käsiteltiin gemsitabiinin (10 umol /l) 48 tunnin ajan happiolosuhteissa, huomattavasti korkeampi solujen elinkelpoisuuden määrä oli osoitti HIF-1α

+ /N-soluissa verrattuna pcDNA3.0 /N-soluissa määritettynä kristallivioletti määritys (Fig. 6E) ja Cell Counting Kit-8 määritystä (Fig. 6F). Parannettu hyökkäys ja gemsitabiinin vastus HIF-1α

+ /N solut kumottu NF-KB saarto avulla altistumisen IKK estäjä BAY 11-7082 (10 mikromol /l) alle happiolosuhteissa 48 tuntia (kuvio . 6D, E ja F). Siten augmentation invasiivisuus ja gemsitabiinin resistenssin PANC-1, joka on tyypillistä hypoksia esiintyy seurauksena aktivaation NF-KB-reitin aiheuttama HIF-1α.

(A) Western blot -analyysi tasoja on esitetty proteiinien PANC-1-solut transdusoitiin pcDNA3.0 tyhjällä vektorilla (pcDNA3.0 /N) ja pcDNA3.0 /HIF-1α (HIF-1α

+ /N) mukaisesti happiolosuhteissa 48 tuntia. Histogrammi osoitti keskimääräisen tiheyden korjattuna latauskontrollina (β-aktiini). *,

p

0,05. (B) EMT fenotyyppi muuttuu varmistettiin Immuofluorescence mikroskoopilla värjäytymisen E-kadheriinin ja vimentiinista. Vihreä edustaa E-kadheriinin värjäys, kun taas punainen edustaa vimentiinista värjäystä. Blue signaali edustaa tuman DNA värjäyksen DAPI. (C) Western blot-analyysi. Annoksesta riippuvaa vaikutukset 48-tunnin altistuminen IKK estäjä BAY 11-7082 on ilmoitettu proteiineihin. Histogrammi osoitti keskimääräisen tiheyden korjattuna latauskontrollina (β-aktiini). (D) Matrigeliä invaasio määritykset. Vaikutukset 48-h BAY 11-7082 (10 mikromol /l) on hyökkäys PANC-1 soluja normoxic olosuhteissa. Vasen, mikrovalokuvia alkuperäinen suurennus x 100; Oikea, histogrammi havainnollistamaan invaasiomääritys tuloksia. *,

p

0,05. (E) Kristalliviolettiliuos määrityksessä. Vaikutukset 48-h BAY 11-7082 (10 mikromol /l) gemsitabiinin alttius PANC-1 soluja normoxic olosuhteissa. Luvut valittiin edustavia kohtauksia kolmen erillisen kokeen. (F) vaikutukset IKK estäjän gemsitabiinin herkkyyden PANC-1 soluilla happiolosuhteissa mitattiin myös Cell Counting Kit-8 määritystä ja käytetään laskettaessa elinkykyisyysindeksiä. *,

p

0,05.

Keskustelu

Viime vuosina on käynyt yhä selvemmäksi, että EMT pelaa tärkeä rooli etenemistä syövän ja on vastuussa myös resistenttejä fenotyypin syöpäsolujen tavanomaisia ​​kemoterapeuttisia [8]. Eri tekijät, kuten hypoksia, on nostettu syytteet pakottamisena Ilmiötä induktion Twist, Etana, Zeb1, ja Zeb2 riippuen solujen yhteyksissä [11], [26] – [28]. Niukkahappiseen microenvironment esiintyy yleisesti keskialueella kiinteiden kasvainten. Yhteys hypoksia ja EMT on aiemmin raportoitu, ja HIF-1α on pantu syytteeseen välittävinä tätä ilmiötä. Kuitenkin molekyyli esiliinan HIF-1α aiheuttama up sääntely näiden EMT aiheuttavia transkriptiotekijöiden ovat olleet pääosin määrittelemätön, vaikka todisteet tukevat kykyä HIF-1α suoraan indusoida Twist transkriptio on hiljattain kuvattu ihmisen alkion munuaissoluissa [27].

Edellinen tutkimus osoitti, että hypoksia johtaa NF-KB: n aktivoinnin jälkeen ja tällainen aktivaatio välittämä fosforylaatio IκBα on tyrosiinitähteiden [28]. NF-KB: n aktivaatio on kriittinen osa transkription vasteena hypoksialle. Tuloksemme tässä esitetyt osoittivat, että NF-KB: n aktivaatio on lisääntynyt hypoksisissa olosuhteissa sekä transfektoitiin ohimenevästi pcDNA3.0 /HIF-1α haimasyövän soluja happiolosuhteissa. Samaan aikaan kohonnut NF-KB-aktiivisuus hypoksiaolosuhteissa inhiboidaan IKK estäjä BAY-11-7082, joka voi estää fosforylaatiota ja hajoamista IκBα, ja estää translokaatiota p65 /p50. Sekä tiedot ja aiemmat tutkimukset osoittivat, että biokemiallisia reittejä johtaa NF-KB: n aktivoitumisen lähentyneet IKK monimutkainen hypoksisissa olosuhteissa. Äskettäin on raportoitu, että NF-KB: n transkriptionaalisesti indusoi HIF-1α ilmentyminen hiiren makrofageissa, maksassa ja aivoissa [29]. Olemme myös havainneet, että farmakologinen NF-KB: n, IKK-inhibiittori BAY-11-7082, johti vähentyneeseen HIF-1α ilmentymistä sekä PANC-1 ja BxPC-3-solujen hypoksisissa olosuhteissa (tuloksia ei ole esitetty). Nämä havainnot viittaavat siihen, että on olemassa biokemiallisia silmukan, jolloin HIF-1α aktivoi NF-KB: n ja päinvastoin. Keskeyttämättä tämän silmukan haiman syöpäsoluissa yhdessä tai useammassa monista biokemiallisten vaiheet, jotka viittaavat HIF-1α NF-KB on omiaan olla merkittävä vaikutus haimasyövän kasvua. Kuitenkin suhde HIF-1α ja NF-KB prosessissa kasvaimen kehitys on erityisen monimutkainen ja vaatii edelleen etsintä. Lisäksi olemme osoittaneet, että EMT ohjelman johtuvat hypoksian tai yli-ilmentymisen HIF-1α on largly ohjaa aktivaation klassisen NF-KB-reitin kautta. Tämä EMT ohjelma on ominaista vimentiinista ja N-kadheriiniekspressiota ja E-kadheriinin tukahduttaminen, silmiinpistävää morfologisia muutoksia, erittäin invasiivisia ja gemsitabiinin kestävä mesenkymaalisten fenotyypin.

Äskettäinen tutkimus osoitti, että ilmentyminen HIF-1α tavoite geeni VEGF, kasvutekijä, joka voi edistää EMT eturauhassyövässä [30]. Tässä tutkimuksessa tiedot osoittivat myös, että proteiinin ilmentymistä VEGF kasvoi merkittävästi haiman syöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa ja ylössäätöä VEGF, aiheuttama hypoksia, poistettiin NF-KB: n p65 siRNA. Olemme myös havainneet, että nämä solut inkuboidaan hypoksisissa olosuhteissa tai transfektoitu pcDNA3.0 /HIF-1α mukaisesti happiolosuhteissa näytteille kohonnut NF-KB: n aktiivisuuden estyminen, joka johtaa reversiossa kadheriinin kytkin, että epiteelin fenotyypin tyypillistä alennetaan invaasio ja lisääntynyt gemsitabiinin herkkyys, havainnot että syytöstä NF-KB pääasiallisena välittäjänä HIF-1α aiheuttama EMT ohjelmaa haimasyöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa.

Muut tutkimukset ovat aiemmin tunnistettu Zeb1, Zeb2, ja Snail keskeisinä säätelijöinä E-kadheriinin tukahduttaminen ja EMT haiman syöpäsoluissa [11], [31]. Ilmaisulla Twist ei havaittu alle happiolosuhteissa ja Twist-geeni on aktivoitu sen jälkeen, kun altistus hypoksialle viiden haimasyövän solulinjoissa [32]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että EMT aiheuttama hypoksia tai yliekspressio HIF-1α liittyi lisääntynyt Twist, Snail, Zeb1 tai Zeb2 ilme. Olemme myös havainneet, että farmakologinen esto IKK mukaan BAY 11-7082 vuonna hypoksinen soluissa johti annosriippuvaisen laskun Twist ilmaisun mutta ei merkittäviä muutoksia Zeb1, Zeb2 tai Snail ilmaisua, joka viittaa siihen, että tietty transkriptiotekijät säätelevät EMT riippuvat Matkapuhelinyhteydessä ja tiettyyn tilaan solujen. Tämä mesenkymaaliset muunnos voidaan suurelta osin vaimenevat estämällä NF-KB: n välityksellä joko molekyyli- tai farmakologisen lähestymistapoja, vaikka NF-KB saarto ei edistä täydellistä paluuta epiteeliosaan fenotyyppi, mistä on osoituksena ylläpito Snail, Zeb1 tai Zeb2 ilme edessä NF-KB p65 siRNA tai IKK esto. Tämä jälkimmäinen havainto viittaa olemassaolon NF-KB-riippumaton EMT säätelyreittejä haiman syöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa, jotka ovat vielä määrittelemättä.