Krooninen sairaus

tiivistelmä

MicroRNA (MIR) -150 on raportoitu dramaattisesti vaimentua ihmisen epiteelin munasarjasyöpä (EOC) kudoksiin ja potilaiden seerumin verrattuna normaaleihin kontrolleihin. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia kliinistä merkitystä ja molekyylitason mekanismeja miR-150 EOC. Esillä olevassa tutkimuksessa, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että miR-150 oli merkittävästi vaimentua ihmisen EOC kudoksissa verrattuna normaaliin kudosnäytteistä. Sitten osoitimme merkittävä yhdistysten miR-150 downregulation aggressiivisten kliinis piirteitä EOC potilaalla, joista korkea kliinisessä vaiheessa ja patologiset lajittelemaan ja lyhyempi yleinen ja etenemisestä vapaan eloon jäämisestä. Vielä tärkeämpää on, monimuuttujamenetelmin tunnistettu miR-150 ilmaisu itsenäisenä ennustetekijöiden biomarkkereiden in EOC. Sen jälkeen, lusiferaasireportteri- analyysit osoittivat, että sinkki Finger E-Box Sidonta Homeobox 1 (ZEB1), keskeinen säätelijä epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), oli välittömänä kohteena miR-150 EOC-soluissa. Lisäksi olemme havainneet, että ektooppinen ekspressio miR-150 voi tehokkaasti estää soluproliferaatiota, invaasio ja metastaasi, jonka ilmentymisen estämiseksi ZEB1. Lisäksi olemme myös havaittu merkittävästi negatiivinen korrelaatio miR-150 ja ZEB1 mRNA: n ekspression EOC kudoksissa (rs = -0,45, P 0,001). Johtopäätöksenä nämä havainnot tarjoavat vakuuttavia todisteita siitä, että poikkeava ilmentyminen miR-150 voi olla rooli syövän etenemiseen ja ennusteeseen potilailla, joilla on EOC. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että miR-150 voi toimia tuumorisuppressorina ja moduloivat EOC solujen lisääntymistä, ja invaasio suoraan ja negatiivisesti säätelevä ZEB1, mikä uudelleen ilmentymisen miR-150 voi olla mahdollisia terapeuttisia strategia EOC.

Citation: Jin M, Yang Z, Ye W, Xu H, Hua X (2014) MicroRNA-150 ennustaa myönteinen ennuste potilailla, joilla epiteelikasvaimet munasarjasyöpä, ja estää Cell ja metastaasit tukahduttamalla Transkription represso ZEB1. PLoS ONE 9 (8): e103965. doi: 10,1371 /journal.pone.0103965

Editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Tutkimuskeskus, Saudi-Arabia

vastaanotettu: toukokuu 25, 2014; Hyväksytty: 09 heinäkuu 2014; Julkaistu: 04 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Jin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Natural Science Foundation of Shanghai Municipal Health Bureau (nro 20114y079); Medicine and Engineering Foundationin Shanghai Jiaotong yliopisto (nro YG2011MS33). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) edustaa viidenneksi tappava gynecologic maligniteetti ja peräisin munasarjojen pinnasta, sisällyttäminen kystat munasarja- parenchyma tai läheiseltä distaalisen munanjohtimen epiteelin [1]. Koska on olemassa muutamia tehokkaita biomarkkereita ja hoitoja, EOC on aggressiivinen tauti joka aiheuttaa arviolta 125000 kuolemia kaikkialla maailmassa vuosittain [2]. Viiden vuoden eloonjääminen sairastavien potilaiden EOC on kriittisesti riippuvainen kliinisessä vaiheessa on potilaan diagnoosin; jos diagnosoidaan ja hoidetaan samalla paikallinen (vaiheet I ja II), 5 vuoden eloonjäämisluvut voi nousta yli 90% [3]. Kuitenkin useimmat EOC potilaat ovat diagnosoitu tauti on edennyt pitkälle (vaiheet III ja IV), jossa 5 vuoden pysyvyys on vain 30~40% [4]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kliininen tulos EOC potilailla voi olla huomattavasti suurempi varhaisen diagnoosin kuitenkaan tällä hetkellä ole non-invasiivinen menetelmä pystyy havaitsemaan EOC varhaisessa vaiheessa. Kun otetaan huomioon tämä skenaario, kehittää uusia ja tehokkaita diagnostisia ja prognostisia molekyylitason biomarkkereita EOC tarvitaan.

MikroRNA (miRNA), kun uuden luokan pienten ei-koodaavan yksijuosteisen RNA: t, on äskettäin osoitettu säätelemään geenin ilmaisu transkription jälkeen läpi emäsparia täydentää sitoutumiskohdista 3′-UTR: n kohde-mRNA, mikä kohdistaa mRNA pilkkominen tai translaation repression [5]. Sitomalla niiden kohdegeenien, miRNA ovat osallisina erilaisiin biologisiin prosesseihin, mukaan lukien solun proliferaatiota, apoptoosin samoin kuin solujen erilaistumista [6]. Kasvava todistusaineisto on raportoitu, että miRNA voi olla olennainen rooli syöpäsolujen invaasiota ja etäpesäkkeiden. Erityisesti EOC, Yeh et ai. [7] osoitti downregulation miRNA-138 on erittäin invasiivisia soluja, ja sen toimintaa estäjänä solun muuttoliikkeen ja invaasiota; Wang et ai. [8] mukaan miR-182 voi toimia onkogeenisessä miRNA ja edistää syöpäsolujen kasvua, invaasio, ja chemoresistance kohdistamalla PDCD4 vuonna EOC soluissa; Wu et ai. [9] esitetään, että miR-145 voi moduloida EOC kasvua ja invaasiota tukahduttamalla p70S6K1 ja MUC1, joka toimii tuumorisuppressori. Nämä aiemmat tutkimukset alustavaan johtolankoja panokset tappio tai voitto tehtävä erityinen miRNA kasvaimien syntyyn ja syövän etenemistä EOC.

MiR-150, kromosomissa 19q13, on merkitty hematopoieettinen-erityinen miRNA in pahanlaatuinen lymfooma, ja on havaittu olevan merkittävästi vaimentua kasvainsoluissa verrattuna terveisiin soluihin [10]. Epänormaali ilmentyminen miR-150 on löydetty myös muita erilaisia ​​kiinteän kasvaimen kudokset, kuten keuhkosyöpä, mahalaukun syöpä, peräsuolen syöpä, kohdun limakalvon syöpä, EOC, ja haimasyövän [11] – [16]. Varsinkin, Vang et al. [14] mukaan miR-150 näkyy heikkoa ilmentymistä useimmissa ensisijainen EOC kudoksia; Shapira et ai. [15] myös, että miR-150 osoitti ainakin 10-kertaisesti alentunut ilmentyminen pre-kirurginen plasmanäytteet naisilta diagnosoitu EOC verrattuna plasmanäytteistä naisilta ilman tunnetun lantion massa (tervettä verrokkia). Nämä havainnot merkitsevät mahdollista roolia miR-150 ihmisen EOC, mikä sai meidät tunnistaa ja toiminnallisesti vahvistaa miR-150-liittyvä kliininen merkitys ja molekyylitason mekanismit EOC.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja Tissue näytteitä

Kliiniset näytteet saatiin Xinhua sairaala, Shanghai Jiaotong yliopiston lääketieteellisessä, Kiina. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Xinhua sairaala, Shanghai Jiaotong yliopiston lääketieteellisessä, Kiina.

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR, 100 EOC kudosnäytteitä ja 10 normaali munasarjojen dosnäytteistä snap-jäädytettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa leikkauksen jälkeen, joka suoritettiin laitoksella Naistenklinikka, Xinhua sairaala, Shanghai Jiaotong yliopiston lääketieteellisessä joulukuusta 2006 tammikuussa 2008. Kaikki 10 normaali munasarjojen kudokset saatiin naisia, joille tehtiin hysterectomies hyvänlaatuisen taudin. Kaikki EOC potilaita hoidettiin ilman leikkausta edeltävän sädehoito, kemoterapia tai hormonihoito. Kirurginen lavastus perustettiin mukaan International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) järjestelmä. Kliiniset piirteet 100 EOC potilasta yhteenveto taulukossa 1.

Säännölliset seurannat (alue: +2,08-119,06kuukausi, 62,86 kuukautta vuonna mediaani 62,66 kk keskiarvo) suoritettiin käsittelyn jälkeen kaikki 100 EOC rekisteröidyt potilaat nykyisessä tutkimuksessa, jossa niiden elinaika, kuolinaika ja viimeisimmän seurannan tallennetaan. Kokonaiselinaika (OS) määriteltiin aikaväli alkaen diagnoosi meidän keskeltä kuolinpäivästä tai viimeinen seurannan. Etenemisestä vapaa elinaika (PFS) määriteltiin aikaväli diagnoosista meidän keskus taudin etenemiseen, kuolema muusta syystä kuin etenemisen tai toinen ensisijainen syöpä.

Soluviljely

ihmisen munasarjan serous kystinen adenokarsinoomasolulinja OVCAR3 ja ihmisten serous papillaarisen kystinen adenokarsinoomasolulinja SKOV3 ostettiin American Tissue Type Collection (Manassas, VA). Molemmat solulinjat ovat sopivia transfektion isäntiä. Kaikki solut viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (GIBCO), kostutetussa ilmakehässä, 5% CO

2 37 ° C: ssa.

RNA ja miRNA uuttamalla

mRNA määrän, yhteensä RNA: t solulinjoista ja kudoksista uutettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sillä miRNA kvantifiointiin, yhteensä miRNA uutettiin solulinjoista ja kudoksista käyttäen Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) mukaan valmistajan ohjeiden.

Quantitative real-time PCR

mRNA: ta ja miRNA kvantitatiivinen, kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-määritys suoritettiin vastaavasti havaita ekspressiotasot miR-150 ja ZEB1 solulinjoissa ja kudoksissa. Lyhyesti, 10 ug pieniä RNA: ta ja 20 ug kokonais-RNA: ta suoritettiin käänteistranskriptio. CDNA monistamiseen käytettiin kypsän miR-150, ZEB1 ja endogeenisen valvontaa, U6 ja β-aktiini, PCR: llä. PCR-alukkeet olivat seuraavat: miR-150 eteenpäin, 5′-CAG TAT TCT CTC CCA ACC CTT GTA-3 ’ja reverse 5′-AAT GGA TGA TCT CGT CAG TCT GTT-3′, U6 eteenpäin, 5’ ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3 ’ja reverse, 5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′; ZEB1 eteenpäin 5’-CAG GCA GAT GAA GCA GGA TG-3 ’ja reverse 5′-CAG CAG TGT CTT GTT GTT GTA G-3′; β-aktiini eteenpäin 5’-GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT-3 ’ja reverse 5′- AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3’. PCR-olosuhteet olivat: alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 3 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s, 62 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 30 s.

Real- PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) ABI 7300HT reaaliaikainen PCR-järjestelmää (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Standardikäyrät syntyy, ja suhteellinen määrä miR-150 tai ZEB1 normalisoitiin määrä U6 tai β-aktiini, vastaavasti. Suhteellinen kvantitointi kohdegeenin ilmentyminen arvioitiin käyttämällä 2

– △△ CT-menetelmällä.

Ekspressiovektorien ja solujen transfektio

pcDNA_6.2-GW /EmGFP-miR plasmidin -vektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jossa on spektinomysiinin resistenssigeenin käytettiin rakentamaan miR-150 yliekspressoivassa plasmidi. 62 emäsparin DNA-fragmentti, jossa vanhojen miR-150 tai negatiivinen kontrolli (NC) paritonta sekvenssi syntetisoitiin kemiallisesti ja lisätään tämän vektorin Shanghai Shenggong Biotech (Shanghai, Kiina).

EOC-solut kerättiin ja maljattiin 6-kuoppalevyillä 70-80% konfluenssiin yön yli ennen transfektiota. HSA-miR-150 vektoriin ja NC transfektoitiin Lipofec- tamin’ia 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jonka pitoisuus oli 100 nM 48 tuntia 37 ° C: ssa mukaan valmistajan ohjeiden.

ZEB1 siRNA ja solujen transfektio

ZEB1 siRNA (siRNA-ZEB1) ja ohjaamaan siRNA (siRNA-NC) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) ja transfektoitiin EOC soluihin aikana logaritmisen kasvuvaiheen käyttäen Lipofectamine 2000 liposomiin (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA), jonka pitoisuus oli 100 nM 48 tuntia 37 ° C: ssa mukaan valmistajan ohjeiden. Ilmentymisen taso ZEB1 havaittiin Western blot määrittää häiriön vaikutus ZEB1.

Western blot-analyysi

EOC solut otettiin talteen 72 h kuluttua lyhytaikaista transfektiota ja western blot -analyysi suoritettiin havaitsemiseksi ilmentymistasojen ZEB1 proteiinia. Solut hajotettiin käyttäen RIPA-puskuria (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS). Proteiinit erotettiin SDS-denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle. Suodattimet blokattiin PBS-Tween rasvatonta maitoa ja tutkittiin anti-ZEB1-vasta-ainetta (laimennus 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), tai koettimena anti-β-aktiini-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) . β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina normalisoimiseksi ehdokas geenejä. Membraanit pestiin ja niitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundäärisiä vasta-aineita. Proteiinin ekspressio arvioitiin parannettu kemiluminesenssin ja altistuminen kemiluminesenssi-kalvo (Pierce Biotechnology).

lusiferaasireporttiterilla määritys

3′-UTR ZEB1 mRNA kloonattiin ja liitettiin alavirtaan luciferse geenistä in pGL3 /sivektorissa (Promega, Madison, WI, USA). Mutantti 3′-UTR ZEB1 mRNA kloonattiin käyttäen villityypin 3′-UTR: ta templaattina ja insertoitiin pGL3 /lusiferaasi, kuten on kuvattu villityypin 3′-UTR. EOC-soluja viljeltiin 24-kuoppalevyillä ja ne transfektoitiin yhdessä miR-150 jäljittelee ja pGL3-ZEB1-wt tai pGL3-ZEB1-mut. 48 h transfektion jälkeen, EOC solut kerättiin ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Renilla lusiferaasiaktiivisuudet käytettiin sisäisenä kontrollina. Kokeet suoritettiin itsenäisesti kolmena kappaleena.

In vitro solujen lisääntymisen määrityksessä

in vitro solujen lisääntymisen ja EOC transfektoitujen solujen HSA-miR-150 vektorin ja NC vektori määritettiin 24, 48 ja 72 h käyttämällä CellTiter 96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay -kittiä (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan protokollaa. Absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin käyttäen MQUANT Universal Microplate Spektrofotometri (BioTek, Winooski, VT). Tiedot esitetään keskiarvon rinnakkaisessa kokeessa.

In vitro invaasiomääritys

hyökkäys kyky EOC transfektoitujen solujen HSA-miR-150 vektori ja NC vektori testattiin Matrigel päällystetty solussa soluviljelykammioihin (8 um huokoskoko, Millipore, Billerica, MA, USA). EOC-solut transfektoitiin ja viljeltiin konfluenssiin tai lähellä ( 90%), konfluenssiin 24-kuoppaisilla levyillä. Sitten, EOC solut suspendoitiin uudelleen 200 ui seerumitonta 1640-alustassa pantiin yläkammioon insertin kanssa Matrigel. Medium 5% FBS lisättiin alakammioissa kuin kemoattraktantti. 24 tunnin inkubaation jälkeen solut jäljellä ylempi kalvo poistettiin huolellisesti. Solut, jotka olivat tunkeutuneet kalvon läpi manuaalisesti laskettiin 200 x suurennus kymmenestä eri alojen kukin suodatin. Kaikki kokeet tehtiin kolminkertaisina.

In vitro migraatiokokeessa

migraatio kyky EOC transfektoitujen solujen HSA-miR-150 vektori ja NC vektori testattiin Corning siirtokuoppaan lisätä kammioihin. Lyhyesti, 48 h transfektion jälkeen, EOC solut suspendoitiin uudelleen 200 ui seerumitonta 1640-alustassa pantiin yläkammioon insertin ilman Matrigel. Medium 5% FBS lisättiin alakammioissa kuin kemoattraktantti. 24 tunnin inkubaation jälkeen solut jäljellä ylempi kalvo poistettiin huolellisesti. Solut, jotka olivat vaeltaneet kalvon läpi manuaalisesti laskettiin 200 x suurennus kymmenestä eri alojen kukin suodatin. Kaikki kokeet tehtiin kolminkertaisina.

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.E. Vertailut ryhmien välillä suoritettiin käyttäen Kruskal- Wallisin testiä jatkuvien muuttujien ja χ

2 testi kategorisen muuttujia. Kaplan-Meier menetelmää käytettiin selviytymisen analyysin ja eroja selviytyminen arvioitiin käyttäen log-rank-testi. Monimuuttujafunktiokehitettiin eloonjääminen analyysi tehtiin kaikkien parametrien, jotka olivat merkittäviä yksiulotteista analyyseissä käytetty Cox regressiomallin. P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

alassäätely miR-150 ihmisen EOC kudoksissa

Expression taso miR-150 100 EOC kudosnäytteet ja 10 normaali munasarjojen kudosnäytteitä havaittiin qRT-PCR ja normalisoitiin RNU6B. Tämän seurauksena ilmentymistason miR-150 EOC kudoksissa oli merkittävästi pienempi kuin normaaleissa munasarjan kudoksissa (EOC vs. Normaali: 2,38 ± 0,80 vs. 3,83 ± 0,77, P 0,001, kuva 1). Mediaani (2,36) ja miR-150 ilmentymistä kaikissa EOC kudoksissa havaita qRT-PCR: llä käytettiin cutoff kohta luokitellaan 100 EOC potilaita miR-150-low (n = 58, 58,00%) ja miR-150- korkea (n = 42, 42,00%) ilmaisua ryhmissä.

tulokset osoittivat, että ilmentymistaso miR-150 EOC kudoksissa oli merkittävästi pienempi kuin normaaleissa munasarjan kudoksissa (EOC vs. normaali: 2,38 ± 0,80 vs. 3,83 ± 0,77, P 0,001).

alassäätely miR-150 kumppaniaan aggressiivinen syövän etenemiseen ihmisen EOC

Taulukko 1 osoitti yhdistysten eri ennusteeseen viittaavia muuttujien ja miR -150 ekspressiotasot kasvaimen yksilöitä EOC potilaista. EOC kudokset kehittyneitä kliinisessä vaiheessa (III~IV) useammin osoitti matalan miR-150 ilmaisun kuin ne, joilla on alhainen kliiniseen vaiheeseen (I~II, P = 0,005, taulukko 1). Lisäksi miR-150 ilmaisu näytteillä trendi joka korreloi patologinen arvosana (P = 0,02, taulukko 1). Huomasimme, että miR-150 oli poikkeuksellisesti vaimentua kasvainkudoksissa korkea patologinen asteen verrattuna heikosti patologinen laatu. Kuitenkin miR-150 ilmentyminen ei liittynyt muita ennusteeseen viittaavia muuttujia, kuten ikä, luokka, histologinen tyyppi ja jäljellä kasvain leikkauksen jälkeen (kaikki P 0,05).

alassäätely miR-150 kumppaniaan huonon ennusteen potilailla jossa EOCs

käyttöjärjestelmä ja PFS käyrät piirrettiin mukaan ilmentymistason miR-150 kasvaimen yksilöitä EOC potilaista Kaplan-Meier-menetelmällä. Kuten kuviossa 2 on esitetty, EOC potilailla, joilla on alhainen miR-150 ilmentyminen oli huomattavasti lyhyempi kokonaisuudessaan (P 0,001, kuvio 2A) ja etenemisestä vapaan (P 0,001, kuvio 2B) eloonjääneiden kuin ne, joilla on korkea miR-150 ilmentymisen teki.

epiteelikasvaimet munasarjasyöpää sairastavien potilaiden alhainen miR-150 ilmaisu oli huomattavasti lyhyempi yleinen (P 0,001) ja etenemisestä vapaan (P 0,001) selviytymisen kuin ne, joilla on korkea miR-150 ilme teki.

univariate analyysi Coxin suhteellisen vaarat malli tunnistettu kolme ennustetekijöitä: kliiniseen vaiheeseen, patologisia laatu ja miR-150 ilme. Toinen kliinis ominaisuuksia, kuten ikä, luokka, histologinen tyyppi ja jäljellä kasvain leikkauksen jälkeen, eivät olleet tilastollisesti merkitseviä ennustetekijöitä (taulukko 2). Monimuuttuja-analyysissä, että ennusteen tekijöiden kanssa Coxin suhteellisten riskien mallia vahvisti, että kliinisessä vaiheessa ja miR-150 ilmentyminen oli kaksi merkittävää itsenäistä ennustajia sekä käyttöjärjestelmän ja elinaikaan ilman taudin etenemistä EOC (taulukko 3).

miRNA-150 tavoitteita ZEB1 vuonna EOC kudoksissa

Voit selvittää, miten downregulation in miR-150 ilmaisu voisi edistää syövän etenemiseen, ehdokas kohdegeenien miR-150 kerättiin miRTarBase (Release 4.5: marraskuu 1, 2013. https://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/), joka on kertynyt yli viisikymmentätuhatta miRNA-kohde vuorovaikutukset (MTIs), jotka kerätään käsin kartoittamalla kirjallisuuden tai jälkeen data mining tekstin systemaattisesti suodattaa tutkimukseen liittyviä artikkeleita toiminnan tutkimuksessa miRNA [17], [18]. Nykyisessä tutkimuksessa olemme vain valittu ehdokas kohdegeeneissä joka todensi kokeellisesti reportterianalyysi, western blot ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR. Tämän seurauksena kolme geeniä, kuten MYB, EGR2 ja ZEB1, valittiin ehdokas kohdegeenien miR-150. Lisäksi RNAhybrid (versio 2.1, https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html) käytettiin laskettaessa pienin vapaa energia (MFE) duplex miRNA: mRNA [19]. Mirna hybridisoidaan tavoite energeettisesti optimaalisella tavalla. RNAhybrid on optimoitu näyttämään hybridisaatio 3’UTR kohdegeenien. Duplex miRNA: mRNA alhaisempi MFE on vakaampi kuin suuremmilla MFE. Tämän seurauksena MFE arvot miR-150: MYB, miR-150: EGR2 ja miR-150: ZEB1 olivat vastaavasti -11,51 kcal /mol, -14,30 kcal /mol ja -18,00 kcal /mol. Duplex miR-150: ZEB1 on paras MFE siksi päätimme ZEB1 ehdokkaaksi kohdegeenin Mir-150 on edelleen validointi kokeita.

Sen tarkistamiseksi ehdokas kohde HSA-asennuspalveli- 150, transfektoimme EOC soluja HSA-miR-150 vektori, negatiivinen vektori (NC), ja tyhjä elatusainekontrolli (mock), tässä järjestyksessä. 24 h transfektion jälkeen, Western blot-analyysi suoritettiin, ja tulokset kuviossa 3A~B osoitti, että täytäntöön ilmentyminen HSA-miR-150 johti huomattavaan vähenemiseen ekspressiotasot endogeenisen ZEB1 proteiinin verrattuna EOC-soluja, jotka on transfektoitu NC tai mock (SKOV3 ja OVCAR3 solu ryhmään: molemmat P 0,001). Lisäksi, lusiferaasireportterigeenin määritys suoritettiin kotransfektoimalla miR-150 ja lusiferaasireportteriplasmidi, joka sisälsi 3′-UTR ihmisen ZEB1. Mukaan miRTarBase (Release 4.5: 01 marraskuu 2013, https://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/), on yksi validoitu sitoutumiskohta ja kahden ennustetun sitoutumiskohdat miR-150 on ZEB1 3’UTR . Nykyisessä tutkimuksessa olemme vain analysoineet validoitu sitoutumiskohta kuten kuvassa 3D. Voit tarkistaa, onko suora vuorovaikutus on mukana välillä miR-150 ja sen tavoite onkogeeni ZEB1 teimme lusiferaasireportterista määrityksissä (kuvio 3E). Olemme havainneet, että kotransfektoimalla miR-150 yhdessä villityypin 3’UTR ZEB1 aiheutti merkittävän lusiferaasiaktiivisuuden pienenemiseen verrattuna kontrolleihin (kuvio 3F ja G).

(A) Expression tasot miR -150 in SKOV3- ja OVCAR3 solujen kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR 24 tunnin transfektion Mir-150 vektori. (B~C) ZEB1 proteiini SKOV3- ja OVCAR3 solujen Western blot 24 tunnin transfektion Mir-150 vektori. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. ”NC” tarkoittaa negatiivista kontrolli vektori. (D) miR-150 sitoutumiskohdat ZEB1 3′-UTR. (E) RNA sekvenssikohdistuksen osoittaa 3′-UTR ZEB1 mRNA sisältää täydentävä sivusto siemenen alueen miR-150. ZEB1 mut on mutantti, joissa on substituutioita komplementaarisen alueen negatiivisena kontrollina. (F ja G) Luciferase raportti analyysi suoritettiin vahvistaa miR-150 sitova tavoite. Lusiferaasiaktiivisuus havaittiin kotransfektion jälkeen pGL3-ZEB1-wt tai pGL3-ZEB1-mut, miR-150-vektori tai negatiivinen kontrolli vektorin (NC) osaksi SKOV3- ja OVCAR3 soluja.

asennuspalveli- 150 estää soluproliferaatiota EOC-solujen in vitro kohdentamalla ZEB1

vaikutuksen arvioimiseksi miR-150 pahanlaatuisiin fenotyyppejä EOC soluissa, transfektoimme siRNA-ZEB1 varta tukahduttaa endogeenisen ZEB1 ilme. Kuten on esitetty kuviossa 4, transfektio siRNA-ZEB1 voitaisiin tehokkaasti ilmentymisen inhiboimiseksi ZEB1 proteiinin sekä SKOV3 ja OVCAR3 solulinjoja (sekä P 0,001). Lisäksi havaitsimme, että täytäntöön ilmentyminen miR-150 esti merkittävästi solujen proliferaatiota SKOV3- ja OVCAR3 soluja, mutta tämä muutos oli palautunut transfektio siRNA-ZEB1. Kuten kuviossa 5 täytäntöön ilmaus miR-150 esti merkittävästi solujen lisääntymistä SKOV3- ja OVCAR3 transfektoitujen solujen siRNA-NC (molemmat P = 0,006, Kuvio 5A ja C), mutta ei tehdä niin SKOV3- ja OVCAR3 solut transfektoitu siRNA-ZEB1 (sekä P 0,05, kuvio 5B ja D).

Western blot -analyysi suoritettiin havaitsemiseksi ekspressiotasoja ZEB1 proteiinin siRNA-ZEB1 transfektoitujen, siRNA-NC transfektoitujen ja ei-transfektoitujen (tyhjä ) SKOV3 (A ja B) ja OVCAR3 (C ja D) soluja. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta.

(A ja B) kasvukäyrät SKOV3- ja OVCAR3 solut transfektoitiin siRNA-NC, ja SKOV3- ja OVCAR3 solut transfektoitiin siRNA-NC ja miR -150 vektori. (C ja D) kasvukäyrät SKOV3- ja OVCAR3 solut transfektoitiin siRNA-ZEB1, ja SKOV3- ja OVCAR3 solut transfektoitiin siRNA-ZEB1 ja miR-150-vektoriin.

MiR-150 inhiboi EOC solujen muuttoliike ja hyökkäys in vitro kohdentamalla ZEB1

edelleen tarkistaa, onko miR-150 esti solujen migraation ja invaasion EOC solulinjojen kohdistamalla ZEB1, myös pudotti ilmaus ZEB1 jota transfektoimalla siRNA-ZEB1 in sekä SKOV3- ja OVCAR3 soluja. Kuten kuviossa 6 täytäntöön ilmaus miR-150 esti merkitsevästi solujen muuttoliike ja hyökkäys SKOV3- ja OVCAR3 transfektoitujen solujen siRNA-NC (molemmat P = 0,01, kuva 6A ja C), mutta ei tehdä niin SKOV3 ja OVCAR3 solut, jotka on transfektoitu siRNA-ZEB1 (sekä P 0,05, kuvio 6B ja D).

(A ja C) Transwell migraatiokokeessa ja Matrigel invaasiomääritys ja EOC transfektoitujen solujen siRNA-NC, ja EOC-solut transfektoitiin siRNA-NC ja miR-150 vektori. (B ja D) Transwell migraatiokokeessa ja Matrigel invaasiomääritys ja EOC transfektoitujen solujen siRNA-ZEB1, ja EOC-solut transfektoitiin siRNA-ZEB1 ja miR-150-vektoriin.

Negatiivinen korrelaatio miR-150 ja ZEB1 mRNA: n ilmentymisen tasoja ihmisen EOC kudoksissa

jotta voitaisiin arvioida suhdetta miR-150 ja ZEB1 mRNA: n ekspression EOC kudoksissa, olemme edelleen havainneet ilmentymistasojen ZEB1 mRNA 100 EOC kudosnäytteet ja 10 normaalia munasarjakudoksen näytteistä qRT-PCR ja normalisoidaan p-aktiini. Kuten kuviossa 7A, ilmentymisen taso ZEB1 mRNA: n EOC kudoksissa oli merkittävästi suurempi kuin normaalissa munasarjakudoksessa (EOC vs. Normaali: 4,49 ± 1,52 vs. 2,41 ± 0,49, P 0,001, kuvio 7A). Enemmän kiinnostavaa, Spearman korrelaatio analyysi osoitti selvästi negatiivinen korrelaatio miR-150 ja ZEB1 mRNA: n ekspression EOC kudoksissa (rs = -0,45, P 0,001, kuvio 7B).

Expression taso ZEB1 mRNA EOC kudoksissa oli merkittävästi suurempi kuin normaalissa munasarjan kudoksissa (EOC vs. normaali: 4,49 ± 1,52 vs. 2,41 ± 0,49, P 0,001, A). Enemmän kiinnostavaa, Spearman korrelaatio analyysi osoitti selvästi negatiivinen korrelaatio miR-150 ja ZEB1 mRNA: n ekspression EOC kudoksissa (rs = -0,45, P 0,001, B).

Keskustelu

EOC on edelleen suuri gynekologiset ongelma pieni 5 vuoden pysyvyys ja uhkaa vakavasti ihmisten terveyttä takia etäisyyttä etäpesäkkeitä, vaikka rutiini leikkauksen ja kemoterapian. Kasvava todistusaineisto näyttää dysregulaatio eri miRNA vuonna EOC ja merkitse niiden olennainen rooli tuumorigeenisia prosesseissa, kuten solujen lisääntymisen, apoptoosin ja liikkuvuuteen. Siten paljastaen molekyylitason muutokset miRNA on ratkaiseva voittamiseksi tätä tappavaa tautia. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-150 on dramaattisesti vaimentua ihmisen EOC kudoksissa ja potilaiden seerumin verrattuna normaaleihin kontrolleihin [14], [15]. Kuitenkin roolit miR-150 taudin alkamisen ja etenemisen EOC ja downregulation miR-150 ilmentymisen tämä syöpä ovat vielä epäselviä. Nykyisessä tutkimuksessa olemme sidoksissa miR-150 kohteeseensa geeni ZEB1, ja osoittaneet sidokset säätelyssä pahanlaatuinen fenotyypit munasarjasyöpä soluja. Olemme vahvistaneet avainroolia miR-150 tuumorisuppressorina suoraan ja negatiivisesti kohdistaminen ZEB1 in EOC. Todisteet tästä on peräisin seuraavista lähteistä. Ensin vahvisti downregulation miR-150 EOC kudoksissa käyttämällä suurta kohortin EOC potilaiden, ja osoitti, että matalan miR-150 ilmentymisen taso oli paljon alhaisempi erittäin aggressiivinen EOC kudoksiin. Toiseksi downregulation miR-150 tunnistettiin itsenäisenä prognostinen merkkiaine kokonaismäärä ja etenemisestä vapaan jäänteitä potilaalla on EOC. Kolmanneksi yliekspressio miR-150 voi dramaattisesti estää soluproliferaatiota ja liikkuvuus munasarjasyövän solujen kasvua in vitro ja olennaisesti estää proteiinin ilmentymistä ZEB1. Forth, ZEB1 tunnistettiin välittömänä kohteena miR-150, ja knock-alas ZEB1 vuonna munasarjasyöpäsoluja voisi matkivat soluproliferaation inhibointi, muuttoliikettä ja invaasiota miR-150. Lisäksi löysimme merkittävästi negatiivinen korrelaatio miR-150 ja ZEB1 mRNA ilmaisun EOC kudoksissa.

MiR-150 on osoittautunut keskeinen miRNA osallinen kehityksen ja etenemisen eri ihmisen syöpäsairauksia. Esimerkiksi vähentynyt ilmentyminen miR-150 toimii anti-apoptoottisen tekijän ihmisen diffuusi mahasyövän ja Kortikotropiini erittävät aivolisäkkeen kasvaimet [20]; Injektio miR-150 transdusoimattomien hiiren lymfooma soluja immuunivajaisiin hiiriin voi tuottaa vähemmän kasvaimia kuin kontrolli-soluissa [21]; Pakotettu ilmentymä miR-150 voi estää kasvainsolujen kasvua in vitro ja estää kasvaimen kasvua eläinmalleissa suoraan downregulation DKC1 ja AKT2 vähentäminen fosforyloidun AKTser473 /4 ja kasvu tuumorisuppressoreilla kuten Bim ja p53, mikä telomeraasia aktivointi ja kuolemattomuus syöpäsolujen [22]; miR-150 ilmentymistä vähennetään ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja oli voimakkaasti yhteydessä kasvaimen vaiheesta, kasvaimen koon ja potilaiden eloonjäämisen merkittävästi heikkoa ilmentymistä myöhäisvaiheen, suurikokoiset ja huonon ennusteen kasvaimia todettiin [13]. Vähentynyt ilmentyminen miR-150 havaitaan myös ruokatorven okasolusyöpä ja osoitetaan olevan osaltaan pahanlaatuinen potentiaalia, kuten kasvain syvyys, imusolmuke etäpesäke, imusuonten invaasio, laskimoiden invaasio, kliininen lavastus, ja huono ennuste [23]. Nykyisessä tutkimuksessa, meidän tiedot ovat yhdenmukaisia ​​näiden aikaisempien julkaistut tutkimukset, jotka tarjoavat näyttöä muutoksia miR-150 ilmaisu edistävät kasvainten muodostumista. Olemme osoittaneet, että miR-150 oli toiminnallisesti mukana tukahduttamaan EOC solujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasio, jota tukevat sekä soluviljelmätutkimukset ja kliiniset tiedot. Soluviljelmässä kokeissa yli-ilmentyminen miR-150 johti vähenemiseen EOC solujen lisääntymisen ja solun liikkuvuus. Kliinisissä näytteissä, miR-150 oli dramaattisesti säädellä vähentävästi EOC kudoksista korkealla kliinisessä vaiheessa ja korkea patologisten asteen verrattuna EOC kudosten alhaisen kliinisessä vaiheessa ja matala patologinen laatu ja matala miR-150 ilmentyminen kasvaimissa oli yhteydessä huonoon selviytyminen potilailla, joilla on EOC.

Vielä tärkeämpää on, meidän tunnistaa miR-150 tavoitteena oli ZEB1, jäsen sinkkisormen proteiinien perhe [24] – [26]. ZEB1 on yksi transkription indusoijan menettelyssä epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) syövän epiteelin alkuperää, kuten rinta- syöpä, keuhkosyöpä, ruokatorven okasolusyöpä, mahasyöpä, haimasyöpä, kohdunkaulan syöpä, kohdun limakalvon syöpä ja eturauhasen syöpä [23], [27] – [31]. Erityisesti EOC, Chen et al. [32] kertoi, että vähen- tämisessä ZEB1 ilmaisu ekspressiovektorilla-pohjainen pieni hiusneula-RNA (shRNA) kohdistaminen ZEB1 (shZEB1) in EOC SKOV3- solut voitaisiin estää EMT of shZEB1-SKOV3- solujen ja lohko shZEB1-SKOV3 solun etäpesäke in vivo, mikä viittaa sen rooli parantamisessa EMT in EOC soluissa. He myös havaittu, että shRNA välittämää alassäätöä ZEB1 in SKOV3- soluissa voisi merkittävästi vähentää kasvaimen kasvua ksenograftin hiirillä. Tuloksemme tässä osoittivat muuttuminen miR-150 munasarjasyöpäsoluja johtaneet vastakkaisiin muutoksen ZEB1, korostamalla niiden negatiivisesti sääntelyä.