Krooninen sairaus

tiivistelmä

18β-glykyrretiinihappoa (18β-GA) on bioaktiivinen komponentti lakritsi. Syövän vastaista aktiivisuutta 18β-GA on tutkittu monissa syövän tyypit, kun taas sen vaikutukset keuhkosyöpään edelleen suureksi osaksi tuntemattomia. Ensin osoitti, että 18β-GA ehkäistä tehokkaasti solujen lisääntymistä ja inhiboi ilmaisun sekä aktiivisuuden tromboksaani nopaliinisyntaasin (TxAS) ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin A549 ja NCI-H460. Lisäksi anto 18β-GA ei ollut mitään ylimääräisiä estävää vaikutusta lasku solujen lisääntymisen aiheuttamien transfektoimalla TxAS pieniä häiriöitä RNA (siRNA). Lisäksi, 18β-GA eivät estäneet solujen proliferaatiota ihmisen immortalisoitu keuhkoputken epiteelisoluissa 16HBE-T ja toisen NSCLC solulinja NCI-H23, jotka molemmat ilmaistaan ​​vähimmäistason TxAS verrattuna A549 ja NCI-H460. Kuitenkin, 18β-GA poistettiin parantamiseksi soluproliferaation indusoitu transfektiolla NCI-H23, jossa pCMV6-TxAS plasmidi. Lisäksi tutkimuksessa todettiin, että aktivointi sekä ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) 1/2 ja syklinen adenosiinimonofosfaatti vaste-elementti sitova proteiini (CREB) aiheuttama TxAS cDNA transfektiolla voitaisiin kokonaan estää 18β-GA. Kaikkiaan olemme rajattuja, että estämällä TxAS ja sen aloitti ERK /CREB signalointi, 18β-GA tukahduttaa NSCLC-solujen lisääntymisen. Tutkimuksemme on korostanut merkitystä 18β-GA suhteessa ehkäisyyn ja hoitoon NSCLC.

Citation: Huang R-Y, Chu Y-L, Huang Q-C, Chen X-M, Jiang Z-B, Zhang X, et al. (2014) 18β-glykyrretiinihappoa vaimentaa Cell Proliferation estämällä Tromboksaani syntaasin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 9 (4): e93690. doi: 10,1371 /journal.pone.0093690

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 3. joulukuuta 2013 Hyväksytty 9 maaliskuuta 2014; Julkaistu: 02 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant tuki : Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81302799), Kiina Postdoctoral Science Foundation (nro 2013M531838) ja 2012 Erinomainen nuori tutkija säätiö Guangzhou University of Chinese Medicine (nro KAB111133K08). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

yrttejä käytetään perinteisessä lääkkeet tarjoavat runsaasti säiliö talteen biologisesti aktiivisia yhdisteitä. Esimerkiksi lakritsi on usein käytetty itämaisen lääketieteen tuhansia vuosia, ja sen tärkein bioaktiivisen komponentin glysyrritsiinihapon hallussaan erilaiset biologiset, farmakologiset, ja lääkkeiden toimintoja, jotka ovat samanlaisia ​​kuin retinoidien ja steroidien [1]. Glysyrritsiinihapon on hydrolysoida helposti 18β-GA ihmiskehoon, ja aiheuttaa sitä tulehdusta, anti-virus ja jopa syöpälääkkeen vaikutuksia [2] – [4]. Vaikka chemopreventive potentiaali 18β-GA on dokumentoitu useissa syöpäsolujen, kuten ihmisen munasarjan epiteelin syöpä, rintasyöpä ja glioblastooma [5] – [7], tiedetään vähän vaikutuksia 18β-GA keuhkojen kasvaimen kasvun .

keuhkosyöpä on hallitsematon poikkeavien solujen kasvua kudoksissa keuhkoihin. Yli 1,5 miljoonaa kuolemantapausta maailmanlaajuisesti ovat Keuhkosyöpä, jotka ylittävät ne mistä tahansa muiden pahanlaatuisten kasvainten [6]. Monista alatyyppejä, NSCLC osuus 80% kaikista keuhkosyöpää [8]. Till viime aikoina ei ollut tyydyttävää terapeuttista strategioita hallintaan NSCLC. TxAS on havaittu olevan yli-ilmentynyt NSCLC yksilöitä, verrattuna normaaliin keuhkojen kudoksiin [9] – [11]. Syövän kudoksissa, TxAS sijaitsee alavirtaan syklo (COX) -2, ja se voi syntetisoida tromboksaani (Tx) A2 päässä prostaglandiini (PG) -H2, joka muunnetaan Coxs arakidonihaposta (AA) [12]. Biologinen puoliintumisaika TxA2 on noin 30 s in in vitro malleissa, joten TxA2 nopeasti ja ei-entsymaattisesti ei-aktiiviseen muotoon TxB2 vesiliuoksessa [12], [13]. Siten TxA2 toimii paracrine /autokriinisella hormoni voimakkaiden vaikutusten trombosyyttiaggregaation, verisuonten supistumista, kasvainsoluproliferaation ja invaasiota [12], [14]. Vaikutukset TxA2 välittyvät vuorovaikutus sen spesifisen reseptorin, tromboksaani-reseptori (TP), joka on jäsen G-proteiiniin kytketty solun pinnan reseptoreita, [12], [13]. Kuluneiden 5 vuotta, TxAS ja siihen liittyvät TP on tutkittu laajasti syöpätutkimukseen. Myönteistä roolia TxAS ja TP kasvaimen patologia on siis näytetty toteen, ja niiden inhibiittorit /antagonisteja on ehdotettu olevan lupaava syöpälääkkeiden [10], [15]. Äskettäin on raportoitu, että sekä TxAS ja sen alkupään COX-2 ohjataan TP, ja TxAS pystyy edistää keuhkosyövän kasvua tämän automaattisen sääntelyyn palautetta silmukka [16]. Kiehtovan, ihmisen endoteelisolujen, vaikutukset TP agonistin voidaan jäljitellä 18β-GA kanssa saman ajankulun ja tehokkuus [17], mielikuvan kyseessä 18β-GA ja molekyylitason TxAS.

Niinpä ovat tutkineet mahdollisia an-syövän vaikutusta 18β-GA NSCLC soluissa. Me raportoimme tässä, että 18β-GA voisi tukahduttaa soluproliferaatiota ja aiheuttaa apoptoosia NSCLC soluihin ainakin osittain estäen TxAS ilmaisun ja toimintaa. Tällaisia ​​vaikutuksia voidaan odottaa olevan huomattava kliinistä merkitystä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja kemikaalien

Ihmisen keuhkon adenokarsinooman solulinjoja NCI-H23, NCI-H460 ja A549 sekä kuolemattomiksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen line 16HBE-T hankittiin American Type Culture Collection (Rockville, MD). Sekä NCI-H23 ja 16HBE-T-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), ja NCI-H460 ja A549-soluja viljeltiin RPMI 1640-väliaine. Kaikki solut pidettiin elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO 2 37 ° C: ssa.

18β-GA ja arakidonihapon ostettiin Sigma-Aldrich, ja sisplatiinin toimitti ALADDIN Chemical Co., Ltd (Shanghai, Kiina).

Soluproliferaatiomääritys

solut ympättiin 5000 solua kuoppaa kohti 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin yön yli. Kun oikea hoitoa, elävien solujen lukumäärä kvantitoitiin osoitetuissa aikapisteissä, käyttäen MTS-määritys, joka suoritettiin neljänä rinnakkaisena, ohjeiden mukaisesti ja valmistajan (Promega, Madison, WI). Absorbanssi määritettiin käyttämällä mikro-levynlukijalla aallonpituudella 492 nm.

Virtaussytometrinen analyysi

Solut ympättiin 1 x 10

5 solua /10 ml 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin yön yli. Elävien solujen kerättiin ja pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä. solut värjättiin anneksiini V: fluoreseiini-väriaineen ja propidiumjodidilla (PI) huoneenlämpötilassa pimeässä 15 minuuttia. Solut sen jälkeen suspendoidaan 400 ui anneksiini-sitomispuskuria (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Värjätyt solut pidettiin jäissä ja analysoitiin Beckman Flow Solumittauslaitteet.

Entsyymi-immunomääritys (EIA) määritys

TxAS aktiivisuutta tarkkailtiin määrittämällä tasolla tromboksaani B2 (TxB2), stabiili tuote ei-entsymaattista nesteytystä TxA2 [12]. A549 ja NCI-H460-soluja ympättiin samalla tiheys 1 x 10

5 solua /10 ml väliainetta 6-kuoppaiselle viljelylevylle. Viljelmän supernatantti kerättiin ja sentrifugoitiin sen jälkeen asianmukaista hoitoa. TxB2 havaittiin peroksidaasi-leimatun TxB2 konjugaatteja käyttäen entsyymi-immunomääritys mukainen pakkaus valmistajan ohjeiden (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).

Transient transfektiot

Solut ympättiin samalla tiheydellä 1 x 10

5 solua /10 ml väliainetta 6-kuoppaiselle viljelylevylle. 10 nM TxAS siRNA ja muiden kuin kohde-siRNA (kontrolli) transfektoitiin A549 ja NCI-H460, kun taas 2 ug vapautunut pCMV6 (kontrolli) tai pCMV6-TxAS plasmidi transfektoitiin NCI-H23, tuella Lipofectamine 2000 reagenssien (Invitrogen , Carlsbad, CA, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden (Origene tekniikat, Rockville, MD). Laajuus spesifisen geenin pudotus tai yli-ilmentyminen havaittiin reaaliaikainen PCR-kokeessa.

sekvenssi TxAS siRNA on rGrUrArArCrUrUrUrArCrCrArArCrArGrArArUrGrGrCrGTC. Edellytykset siRNA transfektioiden ovat seuraavista: soluja kasvatettiin tiheyteen 70% standardin väliaineessa. Poistamisen jälkeen väliaineen, soluja inkuboitiin DMEM (ilman antibiootteja), joka sisältää esisekoitetaan siRNA (10 nM) ja 7,5 ui Lipofectamine 2000 reagenssia, ja inkuboitiin edelleen 72 tuntia.

käänteistranskriptaasia (RT) -PCR ja reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

RT-PCR ja reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [16]. Seuraavat geenispesifistä aluketta sekvenssejä käytettiin: 5′-AATAAGAACCGAGACGAACT-3 ’(sense) ja 5′-GGCTTGCACCCAGTAGAG-3′ (antisense) ihmisen TxAS; 5’-GGAAATCGTGCGTGACATT-3 ’(sense) ja 5′-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3’ (antisense) ihmisen β-aktiini. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen CFX96 Touch Deep Well ™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Inc. Berkeley, CA). Taitteen määräysvallan muutos ilmaus TxAS mRNA laskettiin 2

-ΔΔCT menetelmällä.

Western Blot analyysi

Yhteensä proteiinia (20 ug) erotettiin 7% SDS polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja suoritettiin western blot-analyysi käyttäen pisimmällä kemiluminesenssiosoitusta järjestelmä (Bio-Rad Laboratories). Western-blotit hiiren monoklonaalinen vasta-aine TxAS (Origene tekniikat), vuohen polyklonaalinen vasta-aine β-aktiini (Santa Cruz Biotechnology), ja kanin polyklonaalisia vasta-aineita GAPDH, PARP, koko ja fosforyloitu ERK1 /2 sekä kokonais- ja fosforyloitu CREB (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Tasapuolisen Proteiinilisäyksen, kalvot riisuttu ja sitten tutkittiin anti-GAPDH tai anti-β-aktiini-aineita.

TILASTOANALYYSI

Data on esitetty keskiarvoina ± SD vähintään kolme riippumatonta kokeissa. Studentin t-testiä käytettiin vertailuissa kahden ryhmän välillä, samalla kun Yksisuuntainen ANOVA seurasi Dunnettin testi tehtiin vertaamaan eroja enemmän kuin kaksi ryhmää. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 11.6 tilasto-ohjelmalla (SPSS, Chicago, IL). Kahden pyrstö P arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä kaikissa kokeissa.

Tulokset

18β-GA tukahdutetaan solujen lisääntymistä indusoimalla apoptoosin

Sekä A549 ja NCI-H460 ovat NSCLC solulinjat. Entinen kuuluu adenokarsinooma, ja jälkimmäinen on suuri keuhkosyövän solulinjassa. Arviointi elävien solujen lukumäärä MTS-määritys osoitti, että 24 h hoito 18β-GA tukahdutetaan solujen proliferaatiota molemmissa solulinjoissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1A). Aiemmat in vitro -tutkimus osoitti, että IC

50 arvo 18β-GA inhiboimiseksi keuhkosyöpäsolua kasvu oli 145,3 uM [18]. Kuten kuviossa 1A ja 1B, 18β-GA 160 uM vähensi elinkelpoisten solujen prosentuaalinen noin 40,5 ± 10,5% A549 ja 38,3 ± 4,6% NCI-H460 (p 0,01 vastaavasti). Kun soluja käsiteltiin 320 uM 18β-GA, enemmän inhiboivia vaikutuksia soluproliferaatioon osoitettiin, koska elinkelpoisten solujen prosentuaalinen oli alle 30% verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (p 0,001). Siksi vaikutti siltä, ​​että 160 uM 18β-GA oli optimaalinen pitoisuus saavuttaa merkittävä suppressio soluproliferaation NSCLC soluissa.

A ja B, MTS kokeet osoittivat, että 18β-GA inhiboi soluproliferaatiota A549 ja NCI -H460 soluja annoksesta riippuvaisella tavalla. Lisäksi, 18β-GA lisääntynyt sytotoksisuus kemoterapeuttisen aineen sisplatiinin. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta tehdään kolmena kappaleena. * P 0,05, ** p 0,01. C, Western blot-analyysi osoitti, että lisääntynyt pilkotaan PARP (85 kDa) ja laski täyspitkä PARP (116 kDa), A549 ja NCI-H460-soluissa, joita käsiteltiin 18β-GA. GAPDH (37 kDa) toimi lastaus ohjaus. D, virtaussytometrinen analyysi apoptoosin. Prosenttiosuus soluja aikaisin tai myöhään apoptoosin annetaan oikeassa alakulmassa ja oikeassa yläkulmassa neljännesten, vastaavasti. Luvut ovat edustavana valitaan kolmen erillisen kokeen.

Sisplatiini on osa tavanomaista hoitoa potilaille, joilla on keuhkosyöpä. Sen määrittämiseksi, sitä mahdollisuutta, että 18β-GA voi olla additiivinen vaikutus sisplatiinin tuumorin solujen proliferaatiota, sekä solulinjoja testattiin kasvatettiin kun läsnä oli 5 ug /ml sisplatiinia yksin tai 5 ug /ml sisplatiinia yhdessä 80 uM 18β-GA. Kun sisplatiinia yksin, elinkelpoisten solujen prosentuaalinen vasta laski 20,5 ± 6,8% A549 ja 38,7 ± 6,0% NCI-H460 kontrolliin verrattuna (p = 0,076 ja 0,041 vastaavasti kuviossa 1A ja 1B). Kuitenkin, kun yhdessä 80 uM 18β-GA, heillä oli synergistinen vaikutus molemmissa solulinjoissa. Molemmissa solulinjoissa, tukahduttaminen hinta, kun yhdistetään hoito oli alle 40% (p 0,01), samanlainen tehoa 160 uM 18β-GA yksin.

Vahvista tietojen noudatettava MTS määrityksiä ja onko solujen proliferaatio oli johtuu osittain apoptoosin lisääntyminen, halkaistut PARP mitattiin Western blottauksella käyttämällä kanin polyklonaalista PARP-vasta selvittää sekä täyspitkät ja katkaistun muotoja. Kuten kuviossa 1C, hoito 18β-GA 160 uM ja 320 uM laski tasot täyspitkän PARP ja nostivat pilkkoa-PARP. Tämä tulos edelleen tukee virtaussytometria-analyysi, joka käytettiin mittaamaan anneksiini-V merkintöjä fosfatidyyliseriiniin, kalvon fosfolipidiä paljaana pinnalla apoptoottisten solujen [19]. Seuraavat 24 h hoito 160 uM 18β-GA, solut värjättiin anneksiini-V-fluoreseiini-isotiosyanaatti ja PI. Kuten kuviossa 1D, osa solujen alussa apoptoosin, joka on merkitty PI-positiivisia soluja, oli merkitsevästi korkeampi 18β-GA-käsiteltyjen ryhmien (noin 3,5-kertainen A549, ja noin 3,9-kertainen NCI-H460, vastaavasti ; P 0,001). Lisäksi enemmän apoptoottisia soluja havaittiin hoidossa sisplatiinia yhdistettynä 18β-GA kuin hoito sisplatiinilla yksinään, mikä tukee edelleen, että 18β-GA on additiivinen vaikutus sisplatiinia.

18β-GA esti TxAS ilme ja toiminta

Aikaisemmat tutkimukset osallisena mahdollinen rooli TxAS patogeneesissä useita erityyppisiä syövän, mukaan lukien NSCLC [10], [16]. Siksi tutkittiin jos 18β-GA voi vaikuttaa TxAS ilmaisun ja toimintaa. Western blot-analyysi osoitti, että 18β-GA laski TxAS proteiinin taso on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2A ja 2B). Yhdenmukainen apoptoottista vaikutusta 18β-GA kuviossa 1, 12 h hoito 18β-GA 160 uM ja 320 uM laski jyrkästi tasolle TxAS. Lisäksi 18β-GA (160 uM) esti taso TxAS jo 3 h NCI-H460 ja 6 h A549 käsittelyn jälkeen. mRNA uutetaan myös soluista käsiteltiin 160 uM 18β-GA: ssa 6 tuntia, 12 tuntia ja 24 tuntia ja sen jälkeen suoritettiin reaaliaikainen PCR-kokeissa. Kuva 2C osoitti TxAS mRNA taso oli merkittävästi vähentynyt 18β-GA on ajasta riippuva tavalla, joka on sopusoinnussa tietoihin havaittiin Western blot -analyysillä.

A ja B, Western blot analyysissä havaittiin, että 18β -GA esti proteiinin ilmentymistä TxAS (60 kDa) annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Aktiini (45 kDa) toimi lastaus ohjaus. Kuvio esitetty edustaa kolmen erillisen kokeen, ja tiheysmittaus varten bloteissa oikealla esitetty paneelissa fig.A ja alemman paneelin fig.B. * P 0,05 ja ** P 0,01 kontrolliin verrattuna. C, real-time PCR osoitti, että ilmentyminen TxAS mRNA voitaisiin vähentää 18β-GA aika-riippuvaisella tavalla. Dare ilmaistaan ​​kertaiseksi valvonnan, joka on laskettu 2

-ΔΔCT menetelmä tietojen perusteella havaita kolmen erillisen kokeen tehdään kolmena kappaleena. * P 0,05 ja ** P 0,01. D ja E, TxB2 EIA analyysit osoittivat vaikutuksia 18β-GA TxAS aktiivisuutta sekä A549- ja NCI-H460-solujen puuttuessa tai läsnä 0.4μM AA. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta tehdään kolmena kappaleena. ** P 0,01 verrattuna kontrolliin, # p 0,01 verrattuna AA hoitoon.

Lisäksi vaikutus 18β-GA TxAS aktiivisuus mitattiin sen jälkeen. Kuten edellä on mainittu, TxA2 on kemiallisesti epästabiili in vitro, TxAS aktiivisuus on siis seurataan määrittämällä tasolla TxB2, stabiilin tuotteen ei-entsymaattisen nesteytyksen TxA2 [16]. Sekä A549 ja NCI-H460-soluja käsiteltiin 160 pM 18β-GA: ssa 24 tuntia, ja viljelyalusta kerättiin suorittaa TxB2 EIA-määritys. Näissä kokeissa soluja käsiteltiin 0,4 uM AA, joka on esiaste TxA2 toimi positiiviset kontrollit, ja soluja käsiteltiin erityisten TxAS -estäjä furegrelate (1 mM) toimi ylimääräisiä tarkastuksia. Valittu annos nämä kemikaalit ovat verrattavissa pitoisuuksiin, joita käytetään in vitro-kokeissa on raportoitu muissa tutkimuksissa [16], [20]. Kuten kuviossa 2D ja 2E, molemmissa solulinjoissa, biosynteesi TxA2 merkittävästi tukahdutti 18β-GA puuttuessa tai läsnä AA. 0,4 uM AA indusoi TxB

2: n tuotannon 1,8-kertaiseksi A549-solut (p 0,01) ja 2,8-kertaisesti NCI-H460-soluja (p 0,01) verrattuna kontrolliin. Kuitenkin lisäämällä 160 uM 18β-GA merkittävästi heikennetty AA aiheuttama TxB

2 tuotanto lähes 91% A549 ja 89% NCI-H460 (p 0,001 vastaavasti). Tärkeää on, 18β-GA 160 uM on vastaava teho 1 mM furegrelate. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että 18β-GA pystyy kumoamaan TxAS aktiivisuutta NSCLC soluissa.

Yhdessä tietoja, että 18β-GA voisi merkittävästi estää sekä ilmaisun ja toiminnan TxAS merkitsee, että 18β-GA saattaa estää solun lisääntymistä estämällä TxAS toimintaa.

18β-GA ei ollut muita vaikutuksia soluproliferaatioon kun TxAS pudotettiin

tarkistaa mahdollisuus, että 18β-GA voi tukahduttaa solujen lisääntymistä estämällä TxAS, me pudotti TxAS ilmentymistä A549- ja NCI-H460-soluissa käyttämällä siRNA transfektio ja 160 uM 18β-GA lisättiin tämän jälkeen 24 tuntia. Muut kuin kohde-siRNA myös transfektoitiin molemmissa solulinjoissa palvelemaan ohjaus. Reaaliaikainen PCR osoitti, että ilmentyminen TxAS molemmissa solulinjoissa oli merkitsevästi tukahdutettiin 24 h transfektion TxAS-siRNA, jolla on lähes 90% suppression tehokkuutta (kuvio 3A). Transfektion tehokkuus vahvistettiin lisäksi Western blot -analyysillä (kuvio 3B). Lisäyksen jälkeen 160 uM 18β-GA vielä 24 h, MTS määritykset suoritettiin, ja tulokset osoittivat, että leviämisen hinnat A549-soluja käsiteltiin 18β-GA, TxAS-siRNA, ja yhdistelmä molemmat olivat 41,7 ± 1,7%, 38,3 ± 4,4% ja 35,4 ± 6,4% kontrollina (kuvio 3C). NCI-H460-soluissa, ne olivat 38,9 ± 3,7%, 31,1 ± 3,4% ja 28,4 ± 8,0% hallintalaitteiden, vastaavasti (kuvio 3D). Näyttää siltä, ​​että verrattuna TxAS-siRNA transfektion lisäanta- 18β-GA ei ollut merkittäviä ylimääräisiä vaikutuksia soluproliferaatioon.

A ja B tukahduttamalla tehoa siRNA on TxAS ilmentyminen paljastui todellinen -aika PCR: llä ja Western blot -analyysillä. Reaaliaikainen PCR tietoja havaittiin kolmesta itsenäisestä kokeesta tehdään kolmena kappaleena ja lasketaan 2

-ΔΔCT menetelmällä. Data esitetään kannen valvontaa, ** P 0,01. C ja D, MTS määritykset osoittivat, että TxAS-siRNA transfektion esti solujen lisääntymiseen A549 ja NCI-H460, ja antokertaa 18β-GA ollut vahvistava vaikutus. Data esitetään prosentteina ohjaus- ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta tehdään kolmena kappaleena. ** P 0,01.

On huomioitava, jolloin siRNA on TxAS merkittävästi vähentää solujen kasvua, mikä on linjassa tietojen kanssa havaittu edellisessä tutkimukset osoittavat, että erityiset TxAS -estäjä furegrelate voi merkittävästi estää solujen kasvua keuhkosyövän soluihin [11], [16]. Tukemiseksi tietomme, Cathcart MC et al osoittivat, että toinen TxAS -estäjä otsagreeli inhiboi soluproliferaatiota indusoimalla apoptoosin NSCLC-solujen [10], ja Moussa O et al osoittivat, että TxAS shRNA tukahdutetaan virtsarakon syövän solujen kasvua [19]. Lisäksi Nie D et ai havaittu, että eturauhaskasvainsolun motiliteettia lievitti inhibiittorit TxAS [21].

Vastustamisesta soluproliferaation 18β-GA liittyi TxAS asema

Tulokset havaittiin edellä tuettu että estäviä vaikutuksia 18β-GA saattaa johtua tukahduttaminen TxAS in NSCLC soluissa. Edelleen varmistamiseksi tätä mahdollisuutta, seuraavan kerran seulotaan sarjan keuhkojen solulinjojen ilmentyminen TxAS. RT-PCR kokeet osoittivat, että verrattuna A549 ja NCI-H460, kuolemattomaksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen linja 16HBE-T ja toisen NSCLC solulinjaa NCI-H23 ilmaisi vähimmäistason TxAS (kuvio 4A). Nämä kaksi solulinjaa käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla 18β-GA: ssa 24 tuntia, ja MTS-määritys suoritettiin havaita solujen lisääntymistä. Kuten kuviossa 4B ja 4C, 18β-GA jättänyt poistaa solujen lisääntymistä sekä 16HBE-T ja NCI-H23, vaikkakin hieman suuntaus tukahduttaminen. Tukahduttaminen nopeus annoksella 500 uM ei ollut enemmän kuin 20% valvonnan molemmissa solulinjoissa.

A vähimmäistason TxAS in 16HBE-T ja NCI-H23 ja yli-ilmentyminen TxAS vuonna A549 ja NCI-H460 paljastettiin RT-PCR: llä. Kuva näkyy edustaa kolmen erillisen kokeen. B ja C, MTS osoittivat, että vaikka oli heikko inhiboiva suuntaus, 18β-GA ei ohjata soluproliferaation 16HBE-T ja NCI-H23. Data esitetään prosentteina ohjaus- ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta tehdään kolmena kappaleena. D ja E, TxAS ekspressiota NCI-H23 oli yli-ilmentynyt transfektoimalla pCMV6-TxAS plasmidi. Reaaliaikainen PCR tietoja havaittiin kolmesta itsenäisestä kokeesta tehdään kolmena kappaleena ja lasketaan 2

-ΔΔCT menetelmällä. Data esitetään kannen valvontaa, ** P 0,01. F, MTS määritykset osoittivat, että solun proliferaation edistäminen transfektiolla pCMV6-TxAS kumottiin 18β-GA. Data esitetään prosentteina ohjaus- ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta tehdään kolmena kappaleena. ** P 0,01 verrattuna kontrolliin, # p 0,01 verrattuna pCMV6-TxAS transfektiota.

Koska NCI-H23, joka kuuluu adenokarsinooma, on NSCLC solulinjan vähimmäistasoa TxAS, me yli-ilmentynyt TxAS tässä solulinjassa transfektoimalla pCMV6-TxAS plasmidi. Vapautunut plasmidi transfektoitiin myös toimimaan kontrollina. Kuva 4D havainnollistaa että TxAS oli yli-ilmentynyt noin 8,2-kertainen kuin kontrolli kuluttua 24 h transfektion TxAS cDNA. Western blot-analyysi suoritettiin myös vahvistaa transfektion tehokkuus (kuvio 4E). Tämän jälkeen soluja käsiteltiin 160 uM 18β-GA vielä 24 tuntia. MTS kokeet osoittivat, että transfektio TxAS cDNA merkittävästi edistää soluproliferaatiota 181,4 ± 3,6% verrattuna kontrolliin (p 0,001), vaikutus kumottiin lisäämällä 18β-GA. Soluproliferatiivi- nopeus oli merkittävästi vähentynyt 18β-GA on 111,2 ± 2,2% valvonta, melkein jopa ohjaus- taso (kuvio 4F). Nämä havainnot tukevat, että vaikutus 18β-GA NSCLC liittyy muutos TxAS ilmaisun.

ERK /CREB signalointi oli mukana 18β-GA vaikutukset

Aiemmissa tutkimuksissa olemme osoittivat, että aktivointi sekä ERK ja CREB voi estää TxAS estäjiä tai TP-antagonistit, ja aktivointi CREB vaimennetaan tiettyjä ERK-inhibiittoria [11], [16]. TxAS /ERK /CREB reitin käsitellään myös muissa tutkimuksissa tehty keuhkosyövän malli [22], [23]. Näin ollen lopullinen sarja Western blotting suoritettiin kokeita tutkia, ERK /CREB reitin oli mukana kasvaimen suppression vaikutusta 18β-GA. Kuten kuviossa 5A on esitetty, solut, jotka on transfektoitu pCMV6-TxAS esitti korkeampaa fosforyloidun ERK1 /2 (p-ERK1 /2) ja fosforyloitua CREB (p-CREB), vaikutukset olivat merkittävästi heikennetty käsittelemällä 160 uM 18β- GA. Tulos on linjassa tietoihin noudatettava MTS määritykset (kuvio 4F). Lisäksi määritimme vaikutukset 18β-GA ERK /CREB aktivaatio A549 ja NCI-H460, jotka molemmat esittävät korkeita TxAS kuten kuvassa 4A. Kuvio 5B osoitti, että alas-säätely TxAS siRNA tukossa ERK1 /2 fosforylaatio A549 ja H460-soluissa. Johdonmukaisesti, 160 uM 18β-GA tehokkaasti tukahdutti korkea p-ERK ja p-CREB näissä kahdessa solulinjassa. Muuttaminen ei ollut havaittavissa koskien ilmaus koko ERK tai koko CREB kaikissa testatuissa solulinjoissa.

, Western blotting kokeet osoittivat, että aktivoituminen ERK1 /2 (42/44 kDa) ja CREB (43 kDa) aiheuttama pCMV6-TxAS transfektio voitaisiin poistettiin 18β-GA NCI-H23-soluista. Kuvio esitetty edustaa kolmen erillisen kokeen, ja tiheysmittaus varten blotteja osoitettiin oikeassa paneelissa. * P 0,05 ** p 0,01 verrattuna kontrolliin; # P 0,05 ja ## p 0,01 verrattuna 18β-GA hoito transfektoiduissa soluissa vapautunut plasmidilla. B, tukahduttaminen ERK1 /2 ja CREB aktivaatio TxAS-siRNA ja 18β-GA A549 ja NCI-H460 paljastui Western blot-analyysi. Näissä kokeissa yhteensä ERK1 /2 (42/44 kDa), yhteensä CREB (43 kDa) ja Actin (45 kDa) toimi lastaus valvontaa. Monoklonaalinen vasta-aine, joka voidaan havaita endogeenisten tasojen p-CREB, ja fosforyloidun muodon CREB-sukua oleva proteiini aktivoiva transkriptiotekijä-1 (p-ATF-1) on käytetty nykyisessä tutkimuksessa. Kuvio esitetty edustaa kolmen erillisen kokeen, ja tiheysmittaus varten blotteja osoitettiin oikeassa paneelissa. * P 0,05 kontrolliin verrattuna.

Keskustelu

Yhtenä yrttejä käytetään usein itämaisen lääketieteen alhainen myrkyllisyys, lakritsi on Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) hyväksyi ravintolisä käytetään monissa tuotteissa. Kuten edellä todettiin, glysyrritsiinihapon on suuri bioaktiivisen komponentin, ja se on helposti hydrolysoidaan olla 18β-GA ihmisen kehon käyttämään erilaisia ​​vaikutuksia, mukaan lukien syövän vastaista aktiivisuutta [1] – [4]. Tämä tutkimus osoitti kasvainta estävä vaikutus 18β-GA NSCLC soluissa, ja TxAS havaittiin olevan osallisena tämän vaikutuksen.

aluksi osoitti, että 18β-GA annoksesta riippuvaa laskua solujen lisääntymistä in NSCLC soluissa A549 ja NCI-H460. ID50 on 18β-GA HepG2-soluissa oli 80 uM [24], kun taas meidän mallissa annos 160 uM laski solujen lisääntymisen korko alle 50% valvonnan, joka on yhdenmukainen aiemman raportin osoittaa, että IC

50 arvo 18β-GA oli 145,3 uM on erittäin mahdollisesti metastaattinen keuhkosyöpä solulinja PGCL3 [18]. 80 uM 18β-GA yhdistelmänä sisplatiinin tuotti merkittävän kasvaimen estävästi, huolimatta 18β-GA yksin 80 pM ollut tehokasta tehokkuus tappaa syöpäsoluja. Tämä tulos viittaa siihen, synergistisen vaikutuksen 18β-GA kemoterapeuttisen aineen. A549 osoitti suurempi vastustuskyky sisplatiinin verrattuna NCI-H460-soluissa, mikä on sopusoinnussa muista tutkimuksista osoittavat, että A549 on vastustuskykyisempi sisplatiinia kuin jotkut muut solulinjat [25], [26]. Western blot-analyysi edelleen esitetty lisääntynyt pilkotaan-PARP alenemisen kanssa täyspitkän PARP käsitellyissä soluissa 18β-GA annoksilla 160 uM ja 320 uM. Siten muutos yhteensä elävien solujen määrä 24 h käsittelyn jälkeen 18β-GA huomattava, MTS kokeita voidaan katsoa johtuvan lisääntyneen apoptoosin, mikä on vahvistettu data havaittu virtaussytometrisella analyysillä. Yhdessä näyttää siltä, ​​että 18β-GA on lupaava syöpälääke sovellettavaksi NSCLC ehkäisyyn ja hoitoon.

on tutkinut molekyylitason mekanismeja, joilla 18β-GA saa aikaan tuumoria estävä vaikutus NSCLC soluissa. Nojalla katalysoi muodostumista TxA2 joka toimii kautta reseptorin TP, TxAS on osoitettu olevan mahdollinen rooli syövän fenotyypin [10], [11], [14] – [16]. Tärkeää on, TxAS ja sen tuote TxA2 havaittiin yliekspressoituvan keuhkosyöpä kudoksissa, verrattuna normaaliin keuhkojen kudoksiin [9] – [11], [27]. Aiempi raportti osoittaa, että 18β-GA on vastaava teho on TP agonistina ihmisen endoteelisoluissa [17] johti meidät kysymään TxAS oli mukana 18β-GA vaikutuksia NSCLC. Tämä hypoteesi myös valaisee tosiasia, että glysyrritsiinihappopiikin edeltäjä 18β-GA toimii osittain estämällä COX-2 [28], jossa säädetään PGH2 varten TxAS katalysoivan TxA2 muodostumisen [12], [29]. Yhdessä tulokset 24 tunnin hoito 18β-GA annosriippuvaisesti tukahdutetaan solujen proliferaatiota ja indusoi apoptoosin määrä pieneni TxAS 12 h hoito 18β-GA viittaa siihen, että 18β-GA aiheuttama inhibitio TxAS on ylävirran sattuessa kasvun hidastumisen ja apoptoosin NSCLC, joka tukee lisäksi seuraavan kerran kurssin kokeita. Lisäksi mRNA: n tasot TxAS voitaisiin vähentää 18β-GA aika-riippuvaisella tavalla, mikä tarkoittaa, että 18β-GA esti TxAS ilmentymisen transkription tasolla. Lisäksi TxAS aktiivisuus, heijastuu TxB2 tasolla erittyy elatusaineeseen, oli dramaattisesti estettiin 18β-GA. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TxAS voisi olla ratkaiseva molekyylitasolla 18β-GA vaikutus NSCLC-soluja. Transfektiolla TxAS-siRNA, soluproliferatiivisen kyky sekä A549 ja NCI-H460 estettiin tehokkaasti, mikä tukee positiivista roolia TxAS keuhkosyövässä [10], [11], [16]. Tärkeää on, että lisäanta- 18β-GA ei ollut lisäaineen vaikutuksia TxAS-siRNA transfektiota. Näiden tulosten vahvistamiseksi, seuloimme sarja keuhkojen solulinjojen ekspression määrittämiseksi TxAS. NSCLC on mikä tahansa epiteelin keuhkosyöpään muu kuin pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC), joten käytetty 16HBE-T, joka on immortalisoitu ihmisen keuhkoputken epiteelisolulinja, joka toimii kontrollina ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat. Mukaisesti muista tutkimuksista [9] – [11], TxAS tason todettiin olevan minimaalinen 16HBE-T, kun se oli yli-ilmentynyt NSCLC soluissa A549 ja NCI-H460. Toinen NSCLC solulinjaa NCI-H23 ilmaisi vähimmäistason TxAS, joten se sopii malliksi transfektioon TxAS cDNA. Kuten odotettua, 18β-GA jättänyt estää tehokkaasti solujen lisääntymistä 16HBE-T ja NCI-H23. Kävi ilmi, että eri vaikutukset 18β-GA kaikissa näissä solulinjoissa johtuivat ero TxAS ilmaisun.