Krooninen sairaus

tiivistelmä

tulehduskipulääkkeet aktivoituva geeni-1 (NAG-1) indusoi steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden ja hänellä proapoptoottiset ja antitumorigenic toimintaa. Vaikka tolfenaamihappo (TA) indusoi apoptoosia pään ja kaulan alueen syöpäsoluja, suhde NAG-1 ja TA ei ole määritetty. Tässä tutkimuksessa tutkittiin apoptoosin induktion pään ja kaulan syöpäsolut käsitelty TA ja rooli NAG-1 ilmentymisen tässä induktioon. TA pienentää pään ja kaulan alueen syöpä solujen elinkelpoisuuden annoksesta riippuvaisella tavalla ja indusoi apoptoosin. Indusoitu apoptoosi yhtyä ilmentymisen NAG-1. Yli-ilmentymisen NAG-1 tehostaa apoptoottista vaikutusta TA, kun taas tukahduttaminen NAG-1 ilmentymisen Sirna heikennettyä TA indusoiman apoptoosin. TA merkittävästi esti kasvaimen muodostumisen arvioituna ksenograftimalleja, ja tämä tulos mukana induktion apoptoottisten solujen ja NAG-1 ilmentymisen kasvain kudosnäytteistä. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että TA indusoi apoptoosin kautta NAG-1 ilmentymisen pään ja kaulan okasolusyöpä, joka tarjoaa ylimääräisen mekanistinen selitys apoptoottisen aktiivisuuden TA.

Citation: Kang SU, Shin YS, Hwang HS, Baek SJ, Lee SH, Kim CH (2012) tolfenaamihappo indusoi apoptoosia ja kasvunestomenetelmää pään ja kaulan syöpä: osallistuminen NAG-1 Expression. PLoS ONE 7 (4): e34988. doi: 10,1371 /journal.pone.0034988

Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. tammikuuta 2012 Hyväksytty: 08 maaliskuu 2012; Julkaistu: 19 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Kang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Korea Research Foundation Grant (KRF-013-2009-1-E00015) ja CCRB kautta ”GRRC” projekti Gyeonggi lääninhallitus, Korea (GRRC Ajou-2011-A03). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

yli 500000 tapausta maailmanlaajuisesti ja korkea kuolleisuus, pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on kuudenneksi yleisin syöpä miehillä. Vaikka parantunut hoitoja, yleinen eloonjäämisaste on ollut 50% viimeisten 30 vuoden aikana [1]. Vaikka jotkut potilaat saavuttaa pitkän aikavälin selviytyminen, erityisesti diagnosoitu varhaisvaiheen tauti, useimmat potilaat, joilla tämä syöpä on edenneen taudin aikaan diagnoosi. Nämä potilaat ajaa riski uusiutuva sairaus, etäinen etäpesäkkeitä, tai toinen ensisijainen kasvaimia, ja on mediaanielossaolosta vain 6-8 kuukautta [2]

5 vuoden yleinen eloonjäämisaste potilaiden, joilla on edennyt HNSCC on noin 30%, mikä on olennaisesti muuttunut korko kirjattiin kaksi vuosikymmentä sitten huolimatta eri hoidon tutkimuksissa. Siksi ennaltaehkäisevät strategiat ovat toivottavia, ja paljon tutkimusta on tällä hetkellä omistettu kemopreventiossa että pyritään estämään HNSCC etenemisen varhaisessa vaiheessa. Kuitenkin joka kemopreventiivisten aineet ovat turvallisin ja tehokkain vastaan ​​HNSCC jää epäselväksi. On kliinistä merkitystä tutkia tehoa steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden (NSAID) kuten kemopreventiivisten aineina.

kemopreventiivisiä aineita on tärkeä rooli keskeyttämättä karsinogeenisia prosessi ja estämällä toistumisen syövän esiasteita. Tällä hetkellä, farmaseuttiset aineet, jotka on laajimmin tutkittu kemopreventiivisiä aineita ovat NSAID. NSAID on kliinisesti käytetty kemopreventiivisten aineina familiaalinen adenomatoottisen polypoosin, jossa toimintatapa ollessa syklo-2 (COX-2) [3], [4]. Kuitenkin chemopreventive ja antitumorigenic toiminta tulehduskipulääkkeiden on havaittu myös COX-2-vajaiden solujen, mikä osoittaa, että NSAID myös käyttää niiden syövänvastainen mekanismilla muu kuin COX-2 tukahduttaminen. Yksi tällainen mekanismi käsittää induktion NSAID-aktivoidun geeni-1 (NAG-1) [5].

NAG-1 identifioitiin indometasiini (COX-inhibiittori) aiheuttaman geenikirjaston [5]. NAG-1 on transformoivan kasvutekijä-beeta (TGF-β) superperheen, ja tunnetaan myös makrofagin inhiboiva sytokiini-1 (MIC-1), kasvu erilaistumistekijä 15 (GDF15), ja eturauhasen johdetut tekijä (PDF) [6], [7], [8]. Puhdistettu rekombinantti-NAG-1 kykenee estämään lipopolysakkaridin indusoimaa tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α) tuotantoa makrofageissa, mikä viittaa siihen, että NAG-1 toimii autokriinisellä säätelymolekyyli [9].

In vitro

ja

in vivo

, NAG-1 on antituumorigeenistä ja proapoptoottisiin toiminta riippumaton COX esto [5], [10]. Tulehduskipulääkkeiden ja useat antitumorigenic yhdisteitä chemopreventive toimintaa, kuten resveratroli, genistein, katekiinit, ja peroksisomiproliferaattoriaktivoidun reseptori

γ

ligandeja, säätelevät NAG-1 ilmentymisen prostaglandiini-riippumattomalla tavalla [11], [12] [13], [14], [15].

Tähän asti, suhde, jos sellainen on, välinen NAG-1 ja TA HNSCC ei ole tutkittu. Pro-apoptoottista aktiivisuutta NAG-1 voi antaa molekyylitason selittää chemopreventive agentti, TA välittämä antitumorigenesis.

Tässä tutkimuksessa selvitimme sääntely NAG-1 ilmentymisen aikana TA aiheuttaman apoptoosin HNSCC soluissa . NAG-1 Sirna (siRNA) -välitteisen esto NAG-1 ilmentymisen heikennettyjä TA indusoiman apoptoosin. Lisäksi

in vivo

antitumorigenic aktiivisuutta TA hiirillä tutkittiin arvioida käytön TA kuin chemopreventive agentti HNSCC. Tiedot viittaavat siihen, että induktio NAG-1 voi tarjota uudella mekanismilla ymmärtämiseksi alavirran efektoreja TA aiheuttaman apoptoosin HNSCC.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

neljä perustettu ihmisen pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja – KB (suullinen tasyöpäsolulinja), SCCQLL1 (suullinen tasyöpäsolulinja), HN3 (kurkunpään syöpä solulinja), ja Fadu (a hypopharyngeal tasyöpäsolulinja) – saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia ja penisilliiniä-streptomysiiniä 100 U /ml (GIBCO, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2 ja 95% ilmaa. TA, diklofenaakki, sulindaakkisulfidi, indometasiini, ja piroksikaami (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) liuotettiin HÖYRYKARKAISTUT vedessä varastossa ratkaisu

in vitro

tutkimuksissa. Sillä vaikutuksen tutkimiseksi TA normaaleissa soluissa, käytimme HaCaT-solut (normaali keratinosyytit), joka saatiin Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea).

Soluproliferaatiomääritys

Solujen elinkelpoisuus oli testattiin käyttämällä määritystä, joka perustuu muuntaminen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyyli-tetratsoliumbromidia (MTT; Sigma Aldrich). MTT-liuosta lisättiin 40 ui solususpensiota 4 tuntia. Kolmen pesun jälkeen fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, pH 7,4), liukenematon formatsaani liuotettiin 100 ul: aan dimetyylisulfoksidia. Optinen tiheys (OD) mitattiin jokaisesta viljelmästä ja mikrolevynlukijaa käyttäen (Bio-Tek, Winooski, VT) 540 nm: ssä. OD kontrolli solut katsottiin 100% elinkelpoisuus.

Terminal deoksinukleotidyylitransferaasilla välittämää dUTP-biotiini nick end merkinnät (tunel) määritys

DNA pirstoutuminen analysoitiin

in situ

solukuolemaa havaitseminen kit (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Sveitsi) mukaan valmistajan ohjeiden. Värjätyt solut analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa).

Virtaussytometria havaitseminen apoptoosin

Apoptoosi havaittiin käyttämällä anneksiini V-fluoreseiini isotiosynaatti- (FITC) apoptoosin havaitsemiseen kit (BD Biosciences, Bedford, MA). Lyhyesti, solut maljattiin 6-kuoppaisille viljelylevyille ja inkuboitiin 0, 10, 20, ja 40 uM TA: ssa 24 tuntia. Solut otettiin talteen, pestiin PBS: llä ja värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (PI). Varhainen ja myöhäinen apoptoosin kvantitoitiin mukaan valmistajan ohjeiden. Apoptoosi todettiin käyttämällä FACS Canto järjestelmä (BD Biosciences, Bedford, MA), jossa eksitaatio ja emissio asetukset 488 ja 530 nm, vastaavasti.

mitokondrio kalvon potentiaali (MMP) määritys

MMP koskemattomien solujen mitattiin virtaussytometrialla lipofiilisen kationisen koetin 5,5 V, 6,6 V-tetrakloori-1,1 V 3,3 V-tetra ethylbenzimidazolcarbocyanine jodidia (JC-1, Molecular Probes, Eugene, OR). Viljelyväliaine poistetaan nopeasti kiinnittyneet KB-soluja, ja solut huuhdeltiin PBS: llä. Yksisoluiset kerrokset inkuboitiin DMEM ja 5 ug /ml JC-1 33 ° C: ssa 20 min. Solut pestiin tämän jälkeen kahdesti kylmällä PBS: llä ja trypsinoitiin. Sitten solupelletit suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PBS: ää. Muutos MMP mitattiin virtaussytometrialla (BD Biosciences) ja fluoresenssimikroskopiaa 72 tuntia säteilytyksen jälkeen.

Transfectiom NAG-1 cDNA: n ja RNA-interferenssi (RNAi) B

Kaikki transfektion kokeissa oli suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeita, kuten aiemmin on kuvattu [5]. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, väliaine poistettiin ja solut pestiin PBS: llä ja käsiteltiin joko TA tai ajoneuvon 24 tuntia. NAG-1-cDNA on aiemmin kuvattu [5]. siRNA valvonta- ja NAG-1 (sense CUCAGUUGUCCUGCCCUGUdTdT ja antisense ACAGGGCAGGACAACUGAGdTdT) ostettiin Invitrogen.

Western blot-analyysi

Solut pestiin kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin RIPA-puskuriin (Sigma-Aldrich) täydennetty PhosSTOP ja Complete Mini EDTA-vapaan (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Sveitsi). Proteiinien KB-soluja siirrettiin sähköllä Immobilon-P -kalvoille (Millipore, Bedford, MA). Detection tiettyjen proteiinien toteutettiin tehostetun kemiluminesenssin Western blotting kit mukaan valmistajan ohjeiden.

Animal tutkimus

KB-solut (1 x 10

6) suspendoidaan uudelleen PBS: ään annettiin ihonalaisesti alempaan-oikeaan kylkeen kunkin BALB /c nu /nu hiiri. Sen jälkeen 1 viikko, kun kasvaimet saavuttivat noin 100 mm halkaisijaltaan, hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään (n = 10 ryhmää kohti) ja hoito aloitettiin. Hoito aloitettiin seuraavana päivänä sen jälkeen, kun solun istutuksen joko injektoimalla intraperitoneaalisesti TA (25 mg /kg) päivässä (hoitoryhmissä) tai suolaliuosta pelkästään (kontrolliryhmä). Kasvaimet mitattiin liukuva paksuus kerran 2 päivää ja volyymit (mm

3) laskettiin kaavalla V = a × B

2 × 0.52, jossa A on suurin pinnallinen halkaisija ja B on pienin pinnallinen halkaisija [16]. Eläimet lopetettiin, ja kasvaimet kerättiin talteen ja punnittiin 17 päivää istutuksen jälkeen. Puolet kudoksesta oli snap-jäädytettiin nestemäisessä typessä ja käytettiin proteiinin uuttamalla. Toinen puoli kiinnitettiin yön yli neutraalissa puskuroidussa formaliinissa ja prosessoidaan rutiininomaisesti menetelmillä. Western blotting NAG-1 suoritettiin kasvaimen yksilöitä ja normaali pehmytkudoksen näytteitä. Tutkimus hyväksyi komitean Ethics eläinkokeissa on Ajou yliopiston School of Medicine.

Tilastolliset analyysit

Jos tiedot olivat peräisin kolmesta itsenäisestä kokeesta, parametrit ilmaistiin keskiarvona ± SD. Vertailu keinot eri ryhmien tehtiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysi. Student-Newman-Keuls testiä käytettiin pareittaisesta vertailuja tulosten havaittiin olevan merkittävä toistuvien toimenpiteiden ANOVA. Tilastollinen merkittävyys päätellä osoitteessa

p

0,05.

Tulokset

induktio NAG-1 ja apoptoosin HNSCC soluissa eri tulehduskipulääkkeiden

tutkimiseksi vaikutukset NSAID kasvuun HNSCC solujen, neljä valittu HNSCC solulinjoja inkuboitiin vaihtelevilla pitoisuuksilla (0, 5, 10, 30, 50, 70, 100, 150, ja 200 uM) TA: ssa 16 tuntia ja solun elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Kuten on esitetty kuviossa. 1, eri NSAID vähentää solujen elävyys annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1A) ja TA vähensi elinkelpoisuuden HNSCC solulinjojen (Fig. 1 B). Erityisesti TA oli kaikkein indusoi sekä apoptoosin ja NAG-1 ilmentymisen (kuviot. 1 ja 2), ja valittiin lisätutkimuksia. Seuraavaksi tutkimaan myrkyllisiä vaikutuksia TA normaaleihin soluihin, suoritimme soluproleferaatiomäärityksessä in HaCaT soluissa (normaali keratinosyytit). HaCaT-soluja käsiteltiin TA 16 tuntia ilmoitettuina pitoisuuksina (0, 5, 10, 30, 50, 70, 100, 150, 200 uM). Suhteellinen elinkelpoisuus HaCaT-solujen tutkittiin käyttäen MTT-määritystä (Fig. 1 C). TA oli minimaalisesti sytotoksinen on HaCaT jopa 100 uM, mutta TA oli merkittävä sytotoksinen soluille on suurina pitoisuuksina.

tulokset lisääntymisen määritys. Solut maljattiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille 1000 solua /kuoppa lopullisessa tilavuudessa 100 ui elatusainetta ja annettiin kiinnittyä 2 päivää. Solut käsiteltiin sitten kerran vaihtelevilla annoksilla TA: ssa 24 tuntia. Soluproliferaatiota arvioitiin MTT-määritystä. Arvot edustavat keskiarvoa ± S.D. viidestä itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05; **

p

0,01, verrattuna kontrolliryhmään. (EN) KB pään ja kaulan alueen syöpä solulinja käsiteltiin tulehduskipulääkkeitä. (B) sytotoksisuus TA eri HNSCC soluihin. (C) sytotoksisuus TA normaaleilla keratinosyyttisolujen (HaCaT).

(A) NAG-1 indusoitiin NSAID seuraavassa järjestyksessä: TA, indometasiini, sulindaakkisulfidi, diklofenaakki, ja piroksikaami . Expression of NAG-1 mitattiin Western blot -analyysillä ja normalisoitiin taso-tubuliinin ilmaisu. (B) induktio NAG-1 ilmentymisen eri pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja TA. (C ja D) TA ja ajasta riippuvaisesti lisää NAG-1-proteiinin tasot KB-soluissa. KB-soluja käsiteltiin 0, 10, 30, ja 40 uM TA: ssa 24 tuntia. Expression of NAG-1 mitattiin Western blot -analyysillä ja α-tubuliinin käytettiin loading ohjaus. Saman kalvon haihdutettiin ja uudelleen tutkittiin pilkotun PARP ja pilkottiin kaspaasi-3-vasta-aine.

tutkia suhdetta NSAID-indusoitua apoptoosia ja NAG-1 ilmentymisen, HNSCC soluja käsiteltiin eri pitoisuudet NSAID ja proteiinin tasot NAG-1 mitattiin Western blot-analyysi. Kuten on esitetty kuviossa. 2, eri NSAID indusoi ilmentymistä NAG-1-proteiinin KB-soluissa (kuvio. 2A) ja TA indusoima NAG-1 eri HNSCC soluissa (Fig. 2B). TA myös indusoima NAG-1 proteiinia annoksen ja ajasta riippuvia tavat (kuviot. 2C ja 2D). Kun soluja käsiteltiin 40 uM TA eri aikoina, induktio NAG-1-proteiinin havaittiin sen jälkeen, kun 3 h KB-soluissa (kuvio. 2D). Saman kalvon haihdutettiin ja uudelleen koestettiin lohkaistaan ​​poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) ja pilkottiin kaspaasi-3, joka myös indusoi TA (kuviot. 2C ja 2D). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että TA-indusoidun apoptoottisen solukuoleman ja solujen kasvua pidätyksen HNSCC solulinjoissa on todennäköisesti välittävät ilmentymistä pro-apoptoottista proteiinia, NAG-1. Sen määrittämiseksi, onko TA-solukuolema oli apoptoosin, suoritimme fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS), jossa anneksiini-V /PI-värjäyksen ja TUNEL-määritystä. Kuten on esitetty kuviossa. 3, anneksiini V-FITC-positiiviset solut kasvoivat myös TA käsittely KB-soluissa (kuvio. 3A) ja TUNEL-positiivisia soluja TA kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla (0, 10, 20, ja 40 uM) in KB solut (Fig. 3B). MMP voidaan käyttää indeksinä mitokondrioiden huokosten aukon, joka on osoitus mitokondrioiden. Kvantitatiivinen analyysi punaisen ja vihreän fluoresoivan signaaleja solunsisäisestä JC-1 väriaine heijastaa aste mitokondriovaurioita. Siksi tutkimme vaikutus TA MMP että KB soluissa onko menetys MMP voisi olla rooli TA aiheuttaman apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa. 3C, korkea MMP pidettiin kontrollisoluissa, kuten on esitetty pääasiassa punaisen fluoresenssin JC-1 väriaine. Kuitenkin, TA-hoito lisäsi vihreä solun fluoresenssi osoittaa menetys MMP ja mitokondriovaurioita (Fig. 3C).

(A) havaitsemiseen virtaussytometrialla apoptoottisten solujen, solut maljattiin 6-kuoppaisille viljelylevyille ja inkuboitiin 0, 10, 20, 30 ja 40 uM TA: ssa 24 tuntia. Solut otettiin talteen ja pestiin PBS: llä ja sitten värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (PI). Varhainen ja myöhäinen apoptoosin kvantitoitiin. Tiedot ovat keskiarvoja saatiin kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta ja palkit kuvaavat standardipoikkeamat. (B) Tulokset TUNEL analyysi. Apoptoosin KB-soluissa määritettiin TUNEL menetelmällä käyttämällä in situ solussa havaitseminen pakki. -Soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla TA: ssa 24 tuntia. TUNEL värjäys lisääntyi apoptoottisen solukuoleman. Vasen, 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI); keski, TUNEL; oikea, yhdistää. Mittakaavapalkki tarkoittaa 50 pm. (C) vaikutus TA mitokondrioiden apoptoottisen reitin. Levittämisen jälkeen 10, 20, 30, ja 40 uM TA: ssa 24 tuntia, JC-1 fluoresenssin siirtynyt puna-oranssi ja vihreä, mikä osoittaa depolarisaation mitokondrion kalvon potentiaali (MMP). MMP muutos mitattiin objektiivisesti käyttäen virtaussytometrialla. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001 verrattuna kontrolliryhmään.

yliekspressio ja tukahduttaminen NAG-1 edistää ja vaimentaa TA: n indusoiman apoptoosin, vastaavasti

Seuraavaksi yritimme selventää merkitystä NAG-1 up-sääntelyn TA aiheuttaman apoptoosin. Ihmisen NAG-1 cDNA transfektoitiin KB soluihin. NAG-1 yliekspressio aiheutti lisääntynyt kaspaasi-3 pilkkominen ja halkaistut PARP, ja hoito KB /NAG-1 40 uM TA entisestään sekä pilkotun kaspaasi-3 ja halkaistut PARP verrattuna TA hoidettuun kontrolliryhmään soluja (Fig. 4A). Lisäämisen ohella kaspaasi-3, KB /NAG-1-soluissa merkittävästi lisääntynyt tyypillisiä morfologisia ominaisuuksia apoptoosin, mukaan lukien anneksiini V-positiivisia ja TUNEL-positiivisia solujen värjäytymisen, kontrollisoluihin verrattuna. Tämä vaikutus lisää edelleen TA hoitoon (Fig. 4B ja 4C). Sitten tutki tukahduttaminen NAG-1 ilmentymisen pystyi mukauttamaan TA indusoiman apoptoosin. KB-soluja transfektoitiin joko NAG-1 siRNA tai ohjaus siRNA käsiteltiin kanssa tai ilman 30 uM TA: ssa 24 tuntia. Immunoblot-analyysi osoitti, että transfektio siRNA vastaan ​​NAG-1 tukahdutetaan ilmentyminen NAG-1, lohkaista PARP ja pilkottiin kaspaasi-3: n läsnä ollessa TA, verrattuna ohjata transfektoiduissa soluissa (kuvio. 5A). Näissä olosuhteissa, TA-välitteinen anneksiini V-positiivisia ja TUNEL-positiivisia soluja vaimensi merkittävästi soluissa, jotka on transfektoitu NAG-1 siRNA (kuviot. 5B ja 5C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että NAG-1 on tärkeä rooli apoptoosin ja että esto NAG-1 in KB-soluissa vaikuttaa TA indusoiman apoptoosin. Lisäksi nämä tulokset viittaavat siihen, että TA-indusoidun NAG-1 up-regulation voi olla yksi taustalla olevien mekanismien, jotka edistävät TA: n indusoiman apoptoosin.

KB /NAG-1 ja KB /vektori-soluja käsiteltiin 30 uM TA: ssa 24 tuntia, ja apoptoosi analysoitiin käyttämällä TUNEL-määritystä ja FACS anneksiini V-FITC /PI. (A) Western Blot. Yhtä suuret määrät solulysaateista (30 ug) erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE), siirrettiin nitroselluloosamembraanille, ja tutkittiin anti-NAG-1, PARP, pilkottiin kaspaasi-3, tai α-tubuliinin vasta-aine. (B ja C), apoptoosi KB-soluissa määritettiin TUNEL-menetelmällä ja FACS anneksiiniV-FITC /PI, kuten on kuvattu kuviossa. 3. Tiedot ovat keskiarvoja saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta ja palkit kuvaavat standardipoikkeamat. Mittakaavapalkki tarkoittaa 50 um.

KB-soluja, jotka on transfektoitu joko osoitti NAG-1 siRNA tai negatiivisen kontrollin siRNA käsiteltiin kanssa tai ilman 30 uM TA: ssa 24 tuntia. Apoptoosi analysoitiin TUNEL määrityksen ja FACS kanssa anneksiiniV-FITC /PI. (A) Western Blot. Yhtä suuret määrät solulysaateista (30 ug) erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosamembraanille, ja tutkittiin anti-NAG-1, PARP, pilkottiin kaspaasi-3, orαα-tubuliinia. (B ja C), apoptoosi KB-soluissa määritettiin TUNEL-menetelmällä ja FACS anneksiiniV-FITC /PI, kuten on kuvattu kuviossa. 3. Tiedot ovat keskiarvoja saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta ja palkit kuvaavat standardipoikkeamat. Mittakaavapalkki tarkoittaa 50 pm.

vaikutus TA kasvaimia aiheuttavan kyvyn ja apoptoosin BALB /c nu /nu -hiirten

Voit selvittää edellä mainitut tulokset näkyivät

in vivo

käytimme BALB /c nu /nu hiirille ja satunnaisesti jaettu tasan osaksi kontrolliryhmään ja hoito (25 mg /kg TA) ryhmässä, kun kasvaimen muodostumisen (noin 100 mm halkaisijaltaan). Kaikki hiiret selvisivät koko koeajan. Anto TA vaikutti merkittävästi kasvainten muodostumista ja kehittymistä (

p

0,05; kuviot. 6A ja 6B). Kuitenkin, ei ollut merkittävää eroa näiden kahden ryhmän välillä painon. TUNEL värjäys paljasti, että TA merkittävästi lisännyt Tunel positiivisten solujen (Fig. 6C). Tutkia tason NAG-1 kasvaimissa, Western blotting NAG-1 ekspressio kasvaimen yksilöitä BALB /c nu /nu-hiirissä suoritettiin. Vahva induktio

in vivo

NAG-1 ilmentymisen proteiineissa, jotka oli uutettu kasvaimia TA saaneilla hiirillä oli ilmeistä, vertailuryhmän hiiret. (Fig. 6D) Tiedot viittaavat siihen, että TA lisää ekspressiota NAG-1 kasvaimissa ja että indusoidun NAG-1 estää kasvainten koon.

(A) BALB /c nu /nu-hiiret olivat satunnaisesti jaetaan kahteen yhtä suureen ryhmään (kontrolli ja 25 mg /kg) injektion jälkeen KB-soluja. Sen jälkeen, kun kasvaimen muodostumisen (noin 100 mm halkaisijaltaan), hoito aloitettiin ruiskuttamalla vatsaontelon sisäisesti joko TA (25 mg /kg) päivässä (hoitoryhmissä) tai yhtä suuri tilavuus suolaliuosta pelkästään (kontrolliryhmä). Eläimet tapettiin ja kasvaimet kerättiin ja punnittiin 17 päivää istutuksen jälkeen. (B) Graph tilavuuden ja painon kasvaimia. (C) TUNEL värjäys valvonta ja hoitoryhmissä. Mittakaavapalkki tarkoittaa 50 pm. (D) NAG-1 ilmentymisen istutettu KB kasvaimia. Induktio NAG-1 TA verrataan kullekin valvonta.

Keskustelu

tulehduskipulääkkeiden COX-riippuvaisen prostaglandiinien synteesiä, jotka välittävät inflammatorisia vasteita useissa kudoksissa [3], [ ,,,0],4], [5]. NSAID aiheuttaa myös solujen kasvun estäminen, apoptoosin, ja angiogeneesiä torjuvina; aktivointi reittejä mukana näissä vaikutuksia on kriittinen raportoitu antikarsinogeenisia toimintaa tulehduskipulääkkeiden ja niihin liittyvien COX-2-estäjät, kuten selekoksibi [17], [18], [19], [20], [21]. Laajat epidemiologiset tutkimukset roolin NSAID ehkäisyssä ja hoidossa paksusuolen syövän on osoittanut, että tulehduskipulääkkeiden käyttöön, kuten aspiriinia ja jotkut COX-2-estäjät, liittyy lasku ilmaantuvuus ja /tai kuolleisuus paksusuolen syöpä [22], [23], [24].

Äskettäin on raportoitu, että NSAID on muita tavoitteita lisäksi COX-2. He et ai [25]. raportoitu, että peroksisomi lisääntymistä aktivoiva reseptori delta (PPARö) on myös adenomatoottisen polypoosin coli (APC) -regulated tavoite tulehduskipulääkkeiden. Lisäksi NSAID aineenvaihduntatuotteet voi estää Nukleaaritekijä-KB (NF-KB) eloonjäämissignaalin kautta I KB kinaasi α (IκKα) esto [26]. Nämä viittaavat siihen, että NSAID estää kasvaimen kasvua kautta COX-riippuvainen ja riippumattaman polkuja.

TA on voimakas, hyvin siedetty NSAID alhaisella mahalaukun sivuvaikutus ja korkea terapeuttinen indeksi, verrattuna muihin NSAID [27] . Sillä antipyreettistä ja analgeettista toiminta osoituksena useissa eläinmalleissa ja on osoittanut lupaavia tuloksia pitkäaikaisessa hoidossa nivelrikko, nivelreuma, ja migreeni [27]. TA vaikuttaa myös apoptoosin peräsuolen syöpä solujen sekä etäpesäkkeiden ja tuumorigeneesiä haimasyövän malleissa [28] [29], [30].

erityisyys proteiini 1 (SP1) hajoaminen TA estää useat syöpäsolulinjoissa mukaan lukien haiman syöpäsoluja [28], [29]. Siten Sp1 voi olla toinen mahdollinen molekyylikohteena TA indusoiman apoptoosin. TA laski myös useita Sp-riippuvaisten geenien ja proteiinien, kuten verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF), VEGFR1, surviviini, sykliini D1, ja bcl-2, ja nämä vasteet osaltaan niiden syövän vastaista aktiivisuutta [31]. Äskettäin Kim et ai. osoitti, että COX-1 ja COX-2 proteiinit eivät muuttuneet TA ja että TA indusoi solujen kasvun estäminen tapahtui COX-riippumattomalla tavalla in KB HNSCC soluissa [32].

Näistä edistysaskeleista tiedon mukaan molekyylitason mekanismi TA antitumorigenesis in HNSCC ei ole selvä. On todennäköistä, että useita mekanismit ovat toiminnassa. Vaikutukset TA kasvuun KB ihmisen syöpäsoluja ja mekanismin taustalla vaikutukset olivat parhaillaan tutkittu.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että NSAID aiheuttaa NAG-1 ilmentymisen ja apoptoosin HNSCC soluissa, ja että TA on tehokkain NSAID testatuista. Vaikka apoptoosin induktio NSAID on havaittu useissa syöpäsolujen [10], [11], [33], [34], [35], erityisiä NSAID, joka aiheuttaa maksimaalisen induktion NAG-1 ilmentymisen riippuu syöpäsolun. Esimerkiksi sulindaakkisulfidilla on voimakkain NAG-1 indusoija kolorektaalisyövässä ja indometasiini on voimakkain in sivuonteloleikkauksiin syöpää [5], [10], [36] Erot liittyvät todennäköisesti monimutkainen sääntely NAG-1 ilmentymisen , johon kuuluu sekä transkription ja posttranskriptionaalisella mekanismeja. Lisäksi sen ilmentyminen näyttää olevan mukana cis- ja trans-toimivan promoottorin elementtejä, eri transkriptiotekijät, ja useita antitumorigenic aineet [37]. NAG-1 on myös alavirran kohde monipuolinen p53, ERG-1 ja AKT /GSK-3 kasvain tukahduttamalla reittejä [12], [13], [14], [38], [39], [40], [ ,,,0],41]. Täten mekanismi NAG-1 asetus riippuu solutyypistä ja tilan induktio. Lisätutkimukset induktion NAG-1 viinihapon HNSCC solut ovat tarpeen.

Tämä tiedot osoittavat, että NAG-1 on yksi tärkeimmistä sääntelyviranomaisten TA indusoiman apoptoosin. TA esti kasvua KB-soluja (Fig. 1). Korkeampi pitoisuus TA (100 uM) aiheutti yli 70% solukuolema, jossa solujen irtoamisesta ja pyöristetään ylöspäin 24 tunnin hoidon jälkeen.

Lisäksi TA aiheuttaman apoptoosin osoituksena lisääntynyt sub -G1 väestöstä, nukleosomaalisten pirstoutuminen (tuloksia ei ole esitetty), ja pilkottu PARP (Fig. 2), viittaa siihen, että apoptoosin edistää inhiboivia vaikutuksia TA elinkelpoisuuden KB-soluja. Nämä tulokset ovat yhtä mieltä aikaisempien raporttien kanssa, jotka TA indusoi PARP pilkkominen kolorektaalisyövässä soluissa [30] ja haiman syöpäsoluja [28].

mitokondriovaurioita ilmentyy aluksi hyperpolarointi, jonka jälkeen menetys mitokondrion kalvon potentiaalia ja vapauttamista proteiinien mitokondrion intermembrane tilaan, kuten sytokromi c. Suorat ja epäsuorat häiriön mitokondriot voivat aktivoida apoptoottisen reitin. TA merkittävästi indusoi menetyksen MMP (Fig. 3), mikä viittaa siihen, että mitokondriovaurioita on mukana TA: n indusoiman apoptoosin.

NAG-1 indusoitiin TA annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Kuva. 2), ja yliekspressio NAG-1 tehostaa apoptoottista vaikutusta TA (Fig. 4). Lisäksi siRNA-välitteisen knockdovvn NAG-1 heikennettyjä TA aiheuttaman apoptoosin (Fig. 5), mikä viittaa siihen, että NAG-1 ilmentyminen liittyy läheisesti apoptoosin.

in vivo

antikarsinogeenista aktiivisuus TA tutkittiin kateenkorvattomissa kantavissa nude KB solujen ksenograftit. Annoksella 25 mg /kg /vrk, TA merkitsevästi esti kasvaimen kasvua ja painon nousua TUNEL positiivista värjäytymistä soluissa (apoptoosin) tuumorisektioiden hoidettujen versus kontrolli eläimillä. Tähän liittyi lisääntynyt NAG-1 värjäytymisen kasvaimia käsiteltyjen hiirten (Fig. 6). Kliiniset tutkimukset TA kroonisen nivelreuman hoitoon on käytetty annoksia TA jopa 10 mg /kg /vrk, joka on vain 2,5 kertaa pienempi kuin annos, joka vaaditaan eston HNSCC kasvaimen kasvua ksenografti hiirimallissa. Nämä tulokset osoittavat, että TA on erittäin tehokas syöpälääke sekä

in vitro

ja

in vivo

malleja HNSCC, ja täydentää aiemmat tulokset [29], [31], [32]. Vaikutusmekanismi TA kuin kasvaimen kasvun estäjä johtuu osittain induktion NAG-1 ja NAG-1-liittyviä geenejä.

kytkös NAG-1 induktio ja TA paljasti tässä tutkimuksessa tarjoaa uuden molekyylimekanismin jotka saattavat edistää antituumorigeenistä toimintaa TA HNSCC.