Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Vaikka androgeenien köyhdytettyä kastraatio kestävä eturauhassyövän (CRPC), etäpesäkkeitä silti ilmaista ydin- androgeenireseptorin (AR) ja androgeenin säännelty geenejä. Olemme äskettäin raportoitu, että C-terminaalinen katkaistu konstitutiivisesti aktiivinen AR silmukointivariantit edistää CRPC kehitystä. Koska spesifisten vasta-aineiden havaitsemiseksi kaikki C-terminaaliset lyhennetyt AR vaihtoehdot eivät ole käytettävissä, tavoitteenamme oli kehittää lähestymistapa arvioida esiintyvyyttä ja toiminta AR varianttien eturauhassyövässä (PCA).

Menetelmät /Principal Havainnot

käyttäminen 2 vasta-aineita eri alueilla AR proteiinin (N- tai C-päässä), onnistuneesti osoitti AR variantti LuCaP 86,2 ksenograftin. Arvioidaan esiintyvyys AR variantteja ihmisen PCa kudoksessa, käytimme tätä menetelmää kudossiruina lukien 50 ensisijainen PCa ja 162 metastaattisen CRPC kudoksiin. RT-PCR: ää käytettiin varmistamaan AR variantteja. Havaitsimme merkittävä lasku ydin- C-terminaali AR värjäytymisen CRPC mutta ei eroa N- ja C-terminaalista AR tumavärjäystä perusterveydenhuollossa PCa. Ilmaus AR säädellä proteiineja PSA: n ja PSMA: n oli pieni vaikutus pieneneminen C-terminaalin värjäytymistä CRPC näytteissä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että on lisääntynyt yleisyydessä AR varianttien CRPC perustuu meidän kyky erotella ydin- AR ilmaisun käyttämällä N- ja C-terminaalista AR-vasta-aineita. Nämä havainnot validoitiin käyttäen RT-PCR. Tärkeää on, että menetys C-päätteen immunoreaktiivisuus ja tunnistaminen AR variantteja erilainen riippuen päällä etäpesäkkeiden samalla potilaalla.

Johtopäätökset

menestyksekkäästi kehittäneet uuden immunohistokemiallisella lähestymistapa, joka oli käytetty tarkastettaessa esiintyvyys AR variantit useita ensisijaisen PCa ja metastaattinen CRPC. Tuloksemme osoittivat tilannekuvan yleinen tiheä C-terminaaliset lyhennetyt AR silmukointivariantit ja paikkasidonnainen AR tappio CRPC, jotka voivat olla käyttökelpoisia kerrostamiselintä potilailla AR kohdennettuja terapeuttisten.

Citation: Zhang X, Morrissey C Sun S, Ketchandji M, Nelson PS, True LD, et al. (2011) androgeenireseptorin vaihtoehdot ovat yleisiä kastraatio Kestää eturauhassyöpäetäpesäkkeet. PLoS ONE 6 (11): e27970. doi: 10,1371 /journal.pone.0027970

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 29 lokakuu 2011; Julkaistu: 17 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus perustuu työhön tukee osittain jota PO1 National Institutes of Health avustus (PO1CA085859), Pacific Northwest Eturauhassyöpä SPORE avustus (P50CA097186), eturauhasen Syöpäsäätiön ja Richard M. Lucas Foundation. CM sai urakehitystä palkinnon Pacific Northwest Eturauhassyöpä SPORE avustus (P50CA097186). Tämä tutkimus on seurausta työn tukemana resursseja VA Puget Sound Health Care System, Seattle, Washington. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Metastasoitunut eturauhassyöpä (PCA), joka toistuu kastraation jälkeen tai androgeenien puute hoitoa (ADT), kutsutaan kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC), ennakoi huonon lopputuloksen suurella kuolleisuutta. Vaikka verenkierrossa androgeenien köyhdytetyn CRPC, kasvaimen etenemistä on usein samanaikainen kanssa kohonneet androgeenireseptorin (AR), aktivointi AR, ja ilmaus AR geenien. Kuitenkin kasvu AR ilmentymisen itsessään ei yleensä ole riittävä tarttumaan AR transkription ohjelman [1]. Erilaisia ​​mekanismeja on osoitettu johtavan AR transaktivaatiota ja kytke AR ohjelma kastraation jälkeen. Näitä ovat pysyvyys kasvaimensisäisiä androgeenien, kohdunulkoinen androgeenin synteesiä kasvaimen joko lisämunuaisen androgeenit tai kasvaimensisäisenä

de novo

synteesiä, ja tehostetun androgeenireseptorin kulkeutuminen kasvain liuenneen aineen kantaja orgaanisten anionien kuljettajaproteiini proteiinit [2] – [6] . Useita sytokiineja ja kasvutekijän väyliä on osoitettu pystyä aktivoimaan AR suoraan sitovaa tai cross-talk mekanismien [7] – [13]. Muutoksia AR yhteistyössä sääntelyviranomaiset voivat myös moduloida AR aktiivisuutta androgeenitason pienenevät [14] – [18]. Toiminnallisesti kukin näistä mekanismeista edistää AR aktivaatio CRPC edellyttää karboksyylipäätä alue kypsän proteiinin, joka sisältää ligandia sitovan domeenin (LBD).

Lisäksi johtavien mekanismien AR aktivaation CRPC, jotka edellyttävät ligandi, viimeaikaiset todisteet viittaavat olemassaolosta vaihtoehtoisesti liitettyjä muotoja AR-mRNA: iden, jotka koodaavat reseptoreita vailla LBD, mutta säilyttää kyky osallistua transkription koneet ja edistää sääntelyn tunnettujen — ja mahdollisesti uusia — sarjaa transkription tavoitteiden [19] – [26]. Paitsi, että nämä G terminaalisella katkaistulla AR variantteja konstitutiivisesti aktiivinen, mutta niiden rakenne ennustaa vastustusta terapeuttisten kuten AR-antagonisteina, jotka edellyttävät sitoutumista LBD aktiivisuuden. Tähän mennessä olemme ja muut ovat määrittäneet kolme AR silmukointivarianteista ihmisen kudosnäytteiden [22], [25] – [27]. AR-V1 koodaa silmukointivariantti, joka koostuu eksonien 1-3 ja päättyy kryptisen eksonissa (CE1), AR-V7 (myös nimeltään AR3) koodaa proteiinia, eksonit 1-3 ja päätelaitteen kryptinen eksoni (CE3), ja AR

v567es koodaa proteiinia, joka käsittää eksonit 1-4, ja koska runko-shift menettämisen vuoksi eksonien 5-7, eksonin 8 on lopetuskodonin syntyy sen jälkeen, kun ensimmäiset 10 aminohappoa tuloksena on lyhennetty exon8. [22], [25] – [27]. Muita AR silmukoitumisvariantit on havaittu ihmisen PCa solulinjoissa [21], [24], [26] – [28].

Useat tutkimukset arvioidaan ilmaus AR liitos muodostaa harvoihin prostatasyövistä viittaavat siihen, että AR vaihtoehdot ovat selvimmin havaittavissa CRPC verrattuna hormonia naiivi syöpiä, ja voi ilmetä johtuen selektiivisen paineen AR täsmähoitoihin [22], [25], [26]. Tuoreessa tutkimuksessa käytetty qRT-PCR tunnistaa AR muunnos transkriptien 40 luumetastaasipotilailla, joista 30 oli CRPC, ja löysi yhdistyksen välillä ilmaus AR varianttien ja selviytymisen [29]. Määritetään esiintyvyys AR varianttien eri sairaustiloja eturauhassyövän on kyseenalaistanut vaatimukset hyvin säilynyt pakastetut kudosnäytteiden transkriptio perustuvia analyyseja, ja vasta-aineiden puute, jotka kykenevät spesifisesti havaitsemaan useimmat AR muunnosproteiineihin. Tämän rajoituksen voittamiseksi, pyrimme hyödyntämään sitä, että uuden AR karboksyylipäät koodaa vaihtoehtoisesti silmukoituneet muodot AR-mRNA: n ei voida tunnistaa vasta-aineet kohdistuvat normaalin C-päähän täyspitkän AR (AR

FL). Oletimme, että tämä ominaisuus AR-varianttien antoi mahdollisuuden tunnistaa AR-proteiinin variantit formaliinilla kiinnitetyt kudokset vertaamalla ero värjäytyminen tunnistavien vasta-aineiden joko N- tai C-päähän AR. Näin ollen, esillä olevassa tutkimuksessa käytimme vasta-aineita vastaan, N- tai C-päähän AR proteiinin kysellä suuri määrä eturauhasen hyvänlaatuinen kudoksen, ensisijainen hormoni naiivi PCa ja useita metastaattisen CRPC selvittää esiintyvyys C-terminaalin katkaistu AR variantteja.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

käytetyt vasta-aineet tässä tutkimuksessa ja työoloja on lueteltu taulukossa 1.

Tissue

Ihmisen primääristä ja metastaattinen PCa kudokset saatiin osana PCA tutkimusohjelman ja University of Washington Medical Center Eturauhassyöpä Luovuttaja Rapid Autopsy Program, joka on hyväksynyt University of Washington Institutional Review Board. Institutionaalinen Review Board of University of Washington Medical Center hyväksyi kaikki menettelyt ihmiseen kohdistuvan, ja kaikki aiheet allekirjoittama kirjallinen lupa. Ihmisen kudossiruina (TMA) koostuu 42 potilasta Eturauhassyöpä Luovuttaja Rapid Autopsy Program (mukaan lukien 65 pehmytkudoksen etäpesäkkeet ja 120 luustometastaaseja) [30], 55 eturauhasen potilailla (mukaan lukien 28 normaalin eturauhasen, 24 hyperplastic eturauhasen, ja 50 ensisijainen eturauhasen syöpäkudoksissa) käytettiin. LuCaP 86,2 eturauhassyöpäksenograftista on adenokarsinooma, joka ei reagoi kastraatio ja oli peräisin ihmisen PCa virtsarakon etäpesäke. LuCaP 35 eturauhassyöpäksenograftista on adenokarsinooma, joka vastaa kastraatio ja oli peräisin PCa imusolmuke etäpesäke. Nämä ksenograftit eivät kasvaa solulinjoihin, joten ne ylläpitävät sarjareittien SCID-hiirissä. LuCaP 86,2 ksenografti ilmaisee tunnettu C-terminaaliset lyhennetyt AR variantti AR

v567es, joka on konstitutiivisesti aktiivinen. LuCaP 35 ksenografti vain ilmaisee leveä tyyppi AR [25]. Tuore LuCaP 35 ja 86,2 Ksenograftikudoksista käytettiin western analyysiä. Kaksikymmentäkaksi CRPC metastaattinen kudoksissa nopeasti ruumiinavauksen potilaiden vastaavat kudokset ihmisen TMA ollut helppoa jäädytettiin nestetypessä resektion jälkeen ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Kliiniset tiedot koskevat 42 ruumiinavaus potilailla on esitetty taulukossa 2.

Käänteinen transkriptio-PCR (RT-PCR) ja kvantitatiivinen RT-PCR: llä (qRT-PCR) B

Yhteensä kudos RNA eristettiin jauheliha tuoreesta kudoksesta käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaksi mikrogrammaa kokonais-RNA: ta pilkottiin DNaasi I, ja käänteiskopioitiin käyttäen Superscript Ensimmäisen Strand Synthesis System (Invitrogen). PCR suoritettiin käyttäen AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Applied Biosystems). PCR-tuotteet ajettiin 2% agaroosigeelissä ja kuva kuvat on otettu käyttämällä AlphaDigiDoc Pro kuvantamisjärjestelmä Alpha Innotech (San Leandro, CA). qRT-PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen Applied Biosystems 7900 sekvenssi-detektori 5 ng cDNA: ta, 200 nM kutakin aluketta parin ja Power SYBR Green PCR Master Mix tai TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems.

geeniekspressio tasot mitattiin suhteellisen määrän välillä RNA-näytteet, ja taita ilmentyminen muuttuu määritettiin 2-ΔΔCT menetelmällä [31]. Kaikki qRT-PCR-kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja siivous-geenin RPL13A käytettiin endogeenista ohjaus.

Alukesekvenssit on lueteltu taulukossa 3.

Soluviljelmä ja stimulaation

VCAP soluja, jotka ilmaisivat molemmat AR

FL ja AR

v567es variantti kasvatettiin 80% konfluenssiin 30 mm levyillä RPMI 1640-väliaineessa 5% seerumia, ja kytketään RPMI-1640-alustassa 5% puuhiilellä puhdistettua seerumia 24 tunnin ajan. Dihydrotestosteroni (DHT) 10

-9 M, MDV-3100 50 nM tai MDV-3100 plus DHT lisättiin kulttuureissa. 24 tunnin kuluttua, kokonais-RNA kerättiin rinnakkaisista kuopista varten qRT-PCR havaitsemiseksi AR

FL, AR

v567es ja AR-V7 selostukset. Koe toistettiin 6 kertaa kolmena kappaleena joka kerta, ja qRT-PCR tulokset normalisoitiin DHT hoitoryhmässä.

Western-blottaus

tuore kudos homogenoitiin ja hajotettiin kylmällä hajotuspuskuria (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100), joka sisältää Halt ™ fosfataasinestäjällä Cocktail ja proteaasi-inhibiittorit (Thermoscientific). Täydellinen lysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosakalvolle, estetty 5% maitoa PBS-Tween ja tutkittiin vastaavan yön yli 4 ° C: ssa. Membraanit inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Cell Signaling), ja kehitettiin ECL (Pharmacia Biotech). Kalvot stripataan 30 min strippaus Buffer (Thermoscientific) ja uudelleen tutkittiin anti-β-aktiini-vasta-aine latauskontrollina (Sigma-Aldrich). Riippumattoman kokeen validoitu että tämä tislausmenetelmän eivät johda signaalin kadotessa.

immunohistokemia

Formaliinifiksoidusta parafinoidut kudosleikkeiden (5pm) poistettiin parafiini ja nesteytyksestä. Antigeeni haku suoritettiin 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0), joka paine liesi (20 psi: n paineessa 10 min). Endogeeninen peroksidia ja biotiini /avidiini esti 15 min vastaaviin aineiden (Vector Laboratories). Kun oli inkuboitu 5% vuohen normaalia hevosen-kanan seerumia huoneenlämmössä 1 h, leikkeitä inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (taulukko 1) 4 ° C: ssa yön, jota seuraa biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineita ja SABC reagenssi (Vector Laboratories). DAB (Invitrogen) käytettiin kromogeeni, ja hematoksyliinillä kuten vastavärinä. Hiiren tai kanin IgG tarvittaessa samassa pitoisuudessa kuin ensisijainen vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina eikä se näytä epäspesifisen värjäytymisen [32].

immunohistokemiallinen arviointi

muutama käyttökelvottomaksi ytimien löytyivät TMA johtuen kudoksen ydin puuttuu, syöpä kuolion tai riittämätön syöpäsoluja. Ytimet ulkopuolelle tuloksista.

Immunovärjäys arvioitiin käyttäen lähes jatkuva ydin- AR pisteet, luodaan kertomalla kunkin intensiteetin taso (0 ilman tahra, 1 heikkoja tahra, ja 2 intensiivistä tahra) by vastaava prosenttiosuus positiivisten solujen, ja sitten yhteen tulokset.

Ki-67 värjäys mitattiin satunnaisesti valitsemalla jopa 4 aloilla 250 um

2 kussakin kudoksessa päällä. Solujen kokonaismäärä ja Ki67 positiivinen solujen määrä laskettiin, ja lopullinen Ki-67-indeksi laskettiin positiivinen solujen määrä jaettuna solujen kokonaismäärä.

AR-vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa kohdennettua kolme erillistä alueilla ihmisen AR proteiinia. Immunogeenit AR F39.4.1 (vastaan ​​aa301-320) ja AR441 (vastaan ​​aa299-315) sijaitsi N-terminaalin AR, kun AR C-19 (vastaan ​​aa900-919) C-terminaalista. Siksi kuvaamme AR F39.4.1 ja AR441, kuten N-terminaalista AR-vasta-aineita ja AR C-19 kuin C-terminaalinen AR-vasta-ainetta. Tiettyjä malleja AR ydin- Immunovärjäyksen arvioitiin: N + C + (samanlainen positiivinen N-terminaalin ja C-terminaalin AR värjäytymisen nucleus); N + C ↓ (C-terminaali AR pisteet laski yli 50% verrattuna N-terminaaliin nucleus) ja N-C- (samanlaisia ​​negatiivisia N- ja C-terminaali AR värjäytymistä nucleus). Kudokset N ↓ C + ryhmä ei sisällytetty, koska ne olivat harvinaisia, eikä suhteessa C-terminaaliset lyhennetyt AR variantteja.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit tuloksista tehtiin käyttämällä Prism-ohjelmiston (Prism Graphpad), jossa käytimme Mann-Whitneyn testi, ja

p

arvot ≤0.05 valittiin tilastollinen merkitsevyys.

tulokset

Vaihtoehtoisesti liitettyjä muotoja AR voisi voidaan tunnistaa käyttämällä N- ja C-terminaaliset vasta

Useat AR transkriptivariantissa on kuvattu, jotka koodaavat AR polypeptidit, joilta puuttuu C-terminaalinen LBD vuoksi vaihtoehtoisia eksonin silmukoinnin [21], [24] – [28] . Kuitenkin, spesifisiä vasta-aineita ei ole saatavilla havaita kaikki nämä vaihtoehdot kudokseen. Vasta-aineita on kehitetty kohti tiettyjä N-terminaaliset ja C-terminaaliset domeenit AR-proteiinin, pyrimme määrittämään, onko näiden reagenssien voitaisiin käyttää erottamaan PCa ilmaista erilaisia ​​AR muotoja. Validoida tätä lähestymistapaa, ensin arvioida kaksi PCa ksenograftin johdetut laboratoriossa yksi kirjoittajista (RLV) ja tiedetään ilmentävän erilaisia ​​AR-koodaavat mRNA: t. LuCaP 86,2 ksenografti, joka on peräisin ihmisen PCa virtsarakon etäpesäke ja ylläpitää sarja siirtoja kastroimattomille SCID-hiirissä, on osoitettu olevan C-terminaalinen katkaistu AR silmukointivariantti, että ohitetaan eksonit 5-7 ja koodaa vaihtoehtoista lukukehystä eksonista 8 , nimetty AR

v567es. LuCaP 35 ksenografti oli peräisin PCA imusolmuke etäpesäke ja ilmaisee täyspitkä AR (AR

FL) koodittava mRNA koostuu 8 eksonia ja proteiinin sopivan kokoisten tämä transkriptin [25].

Analysoimme valkuaista LuCaP 86.2 ja LuCaP 35 ksenografteissa Western blot käyttämällä tunnistavien vasta-aineiden N-pää (AR 441) tai C-terminaalissa (AR C-19) AR

FL proteiinia. Vuonna LuCaP 35 kasvain, sekä AR-vasta-aineita havaittiin samanlainen 110 kDa: n AR-polypeptidin, joka vastaa koko AR

FL. Vuonna LuCaP 86,2 kasvaimen vieressä heikko 110 kDa, N-terminaalisen AR-vasta-aine myös tunnistaa 80 kDa: n AR-isoformin, joka vastasi ennustettua kokoa C-terminaaliset lyhennetyt AR silmukointivariantti-AR

v567es kun taas C-terminaalinen AR-vasta-aine ei (kuvio 1A).

(A) Western blot -analyysi AR ilmentymisen LuCaP 86,2 ja LuCaP 35 ksenograftikasvaimissa. (B) IHC värjäystä N- ja C-terminaaliset AR LuCaP 86,2 (a ja b) ja LuCaP 35 (c ja d) ksenograftikasvaimissa. (C) IHC värjäytymistä PSA (e), PSMA (f), Kromograniini-A (g), synaptofysiinin (h), Ki67 (i) ja negatiivinen kontrolli (j) on LuCaP 86,2 ksenograftin. (D) IHC värjäytymisen PSA (k), PSMA (l), Kromograniini-A (m), synaptofysiinin (n), Ki67 (o) ja negatiivinen kontrolli (p) on LuCaP 35 ksenograftin. (Alkuperäinen suurennos x200, aseta x400).

Kuten Western blot tulos, immunohistokemiallinen analyysi (IHC) ja LuCaP 86,2 osoitti hyvin heikkoa tumavärjäystä käyttäen C-päätteen AR (AR c-19) vasta-aine, mutta voimakas tumavärjäystä sarjanumeron osio AR-vasta vastaan ​​N-terminaalista (AR F39.4.1). LuCaP 35 kasvain, osoitettiin ilmentävän vain AR

FL Western-analyysillä, eivät osoittaneet mitään eroa N- ja C-terminaalista AR värjäyksen IHC (kuvio 1 B). Nämä tiedot vahvistivat, että vertaamalla N-terminaalinen AR C-terminaalinen AR ilmaisun voisi tunnistaa C-terminaaliset lyhennetyt AR variantit /mutaatiot PCa kudoksessa.

AR

v567es on osoitettu olevan konstitutiivisesti aktiivinen [25 ], tämä on sopusoinnussa sen kanssa, että eri AR immunoreaktiivisuus N- ja C-terminaali-vasta-aineita havaittiin tumassa. Edelleen vahvistaa ydin- AR toimintaa, me värjättiin AR-säänneltyjen PSA ja PSMA proteiineja. LuCaP 86.2 oli immunoreaktiivisia sekä PSA ja PSMA. Sen vahvistamiseksi, että LuCaP 86.2 ollut neuroendokriini ksenografti, meidän värjättiin neuroendokriini biomarkkerit Kromograniini A (CHG-A) ja synaptofysiinin (SYN). LuCaP 86.2 osoitti negatiivista CHG-A immunoreaktiivisuus, ja heikko tai kohtalainen SYN immunoreaktiivisuus hienona, rakeinen reaktiotuote, joka pääasiassa lokalisoitu reuna solujen sytoplasmassa. Lisäksi noin 20% kasvainsoluista oli Ki67 positiivisia osoittaa LuCaP 86,2 oli kohtalainen lisääntymisnopeus (kuvio 1C). Vastaavat IHC tulokset LuCaP 35 on myös esitetty kuvassa 1D.

Variations in N-terminaalin ja C-terminaalin AR ilmaisun joskus harvoin hyvänlaatuinen epiteelin ja ensisijainen käsittelemättömän PCa

määrittämiseksi tiheys C-terminaalinen katkaistu AR variantit hyvänlaatuinen epiteelin ja käsittelemättömän lokalisoitu PCA me sijoitettiin IHC värjäys eturauhasen yksilöitä. Kaikki 28 normaalin eturauhasen näytteet oli yhtäpitävä N-terminaalin ja C-terminaalin ydin- AR lauseke (N + C +) (kuvio 2A a ja b). Niistä 24 hyperplastisten eturauhasessa, 21 tapauksessa (87,5%) osoitti johdonmukaisesti N + C + ilmentymistä (kuvio 2A c ja d), vain 1 (4,2%) oli alentunut C-pään AR värjäytymistä (N + C ↓) ja 2 (8,3 %) ei ollut AR immunoreaktiivisuus (NC-). 50 ensisijainen PCa näytettä, 46 tapauksessa (92%) ilmaistuna N + C + AR (kuvio 2A e-h), 2 tapausta (4%) oli laskenut ydin- C-terminaalista vastaan ​​N-terminaalinen AR värjäytymistä (N + C ↓) , kun taas 2 tapauksessa (4%) oli AR negatiivinen (NC-). Kaiken kaikkiaan ei ollut merkittävää eroa suhde N- vs. C-terminaali tumavärjäystä intensiteetti välillä normaalissa eturauhasessa ja hyperplastic eturauhasessa (

p

= 0,5756), normaalissa eturauhasessa ja PCa näytteet (

p

= 0,7428), ja hyperplastic eturauhasen ja PCa näytteet (

p

= 0,7508) (kuvio 2B).

(A) IHC värjäytymistä N- ja C-terminaaliset AR normaalissa eturauhasen (NP) (a ja b), hyperplastisessa eturauhasen (HP) (c ja d) ja ensisijaisen PCa (eh) (suurennos x200). (B) vertailu AR värjäystä profiilien kesken normaalin eturauhasen, hyperplastic eturauhasen ja ensisijainen PCa. (C) vertailu AR värjäystä profiilien välillä ensisijaisen PCa ja metastaattinen CRPC.

Variations in N-terminaalin ja C-terminaalin AR ilmaisu esiintyi usein CRPC

määrittämiseksi tiheys variantti AR ilmaisu metastaattisessa PCa, me sai IHC värjäys metastaasien 42 potilasta, jotka kuolivat kehittyneiden CRPC.

Niistä 162 metastaasien, 103 (63,6%) sivustot olivat pysyvästi ydin- AR ilmaisua sekä vasta-aineita (N + C +). Kuitenkin 39 (24,1%) sivustoja oli ydin- C-terminaali AR pisteet (N + C ↓), joka oli vähintään 50% vähemmän kuin vastaava N-terminaalista AR pisteet, ja 20 (12,3%) sivustoja etäpesäkkeiden ollut ydin- AR lauseke (NC-) (kuvio 2C). Nämä IHC tulokset olivat yhtä mieltä taajuus AR silmukointivarianteista metastaattisessa PCa määritetään käyttäen PCR-menetelmillä havaitsemiseksi AR-V7 /AR3 ja AR

v567es selostukset [25]. Ei ollut eroa N-terminaalin AR värjäys välillä ensisijainen ja metastaattinen PCa (

p

= 0,38, data ei näytä), mutta useammin heikentyneet ydin- C-terminaali AR ilmentyminen metastaattisessa CRPC oli huomattavasti korkeampi kuin ensisijainen PCa (

p

= 0,0027). Vertailu ydin- AR ilmaisun välillä ensisijaisen PCa ja metastaattinen CRPC on esitetty kuviossa 2C.

AR-säädellään geenin ilmentyminen oli muuttunut metastaattisessa CRPC vähentyneeseen ydin- C-terminaali AR

Voit selvittää, väheneminen ydin- C-terminaali AR ilmentyminen liittyi muutoksen ilmaisemisessa AR säänneltyjen proteiinien, jotka edustavat menetystä AR aktiivisuuden, tutkimme AR säännelty proteiineja PSA, PSMA, ja TMPRSS2 ilmaisun metastaattisen CRPC näytteistä (kuvio 3A) . Vaikka tuskin puuttuu merkitys, ilmaus PSA N + C ↓ metastaasien oli pienempi kuin N + C + metastaasien (

p

= 0,0505). PSA ilmentyminen N-C- metastaasien oli huomattavasti alhaisempi kuin N + C + ja N + C ↓ metastaasien (

p

0,001) (kuvio 3B). Lisäksi ilmaus PSMA N + C + metastaasien oli suurempi kuin N + C ↓ metastaasien (

p

= 0,0097), mutta PSMA vuonna NC- metastaasien oli huomattavasti alhaisempi kuin N + C + ja N + C ↓ metastaasien (

p

0,0001) (kuvio 3B). Lopuksi ilmaus TMPRSS2 N + C + metastaasien oli merkittävästi suurempi kuin N + C ↓ metastaasien (

p

= 0,045). TMPRSS2 N-C- metastaasien oli huomattavasti alhaisempi kuin N + C + ja N + C ↓ metastaasien (

p

0,01) (kuvio 3B). Menetys TMPRSS2 ilmentymisen N + C ↓ ja NC- metastaasien ei ollut yhtä jyrkkä kuin menetys PSA ja PSMA: n ilmentymistä, mikä viittaa siihen, että TMPRSS2 saa säädellä AR samalla tasolla kuin PSA: n ja PSMA: n in CRPC.

(A) IHC värjäytymistä N-päätteen AR (a), C-terminaalinen AR (b), PSA (c), PSMA (d), TMPRSS2 (e), AKT-1 (f), Ki -67 (g), negatiivinen kontrolli (h) on metastaattinen CRPC kudoksen (suurennos x200, aseta X400). (B) PSA, PSMA, TMPRSS2 ja AKT-1 värjäystä profiilit CRPC.

vieressä tutkineet geenejä, jotka on tunnistettu joiden ilmentyminen kasvoi vastauksena AR C-päähän katkaistu variantteja [ ,,,0],26], [29], mukaan lukien AKT1, CDC20, CDK1, C-MYC, CyclinA2, UGT2B17 ja UBE2C. Kvantitatiivinen RT-PCR-tulokset osoittivat, että AKT1, CDC20, CDK1 ja UGT2B17 ilmentyminen olivat merkittävästi korkeammat N + C ↓ (n = 11), verrattuna N + C + näytteitä (n = 7), (p 0,05) (kuvio 4A) . UBE2C myös tiettyjä kehityssuuntia korkeampi, mutta ei saavuttanut merkitsevyyttä (p 0,10). Olemme edelleen havainneet AKT-1-proteiinin ilmentymisen IHC. Kuitenkin suhteellisen alhainen syklin osoitti suhteellisen suuria geeni-ilmentymisen kaikissa tapauksissa. Siksi, kun myös värjätään TMA varten AKT1, suhteellisen vahva signaali oli läsnä useimmissa kasvain näytteenvalmistukseen TMA ja annetaan puoli kvantitatiivisia mittauksia Eroja ei havaittu ryhmien välillä IHC (kuvio 3B). Näin ollen, syövät N + C ↓ AR ilmaistuna korkeampi AKT1 tasoilla, mutta tämä ero ei voitu havaita IHC johtuen runsaasti proteiinia kaikissa ryhmissä.

(A) Profiili seitsemän AR variantti liittyy geenien ilmentymistä ihmisen metastaattinen kudoksiin. (B) Samat geenit mitattiin LuCaP 86,2 ja LuCaP 35 ksenograftit. Housekeeping-geeni RPL13A käytettiin endogeenista kontrolli.

häviäminen ydin- C-terminaali AR immunoreaktiivisuus liittyy ilmaus AR varianttien metastaattisessa CRPC

todenneet, että tappio C-terminaalin AR immunoreaktiivisuus esiintyi usein metastaattisen CRPC. Tämä menetys C-terminaalin immunoreaktiivisuus voi johtua ilmaus useiden tunnettujen (esimerkiksi AR-V7 /AR3, tai AR

v567es) ja tuntematon AR silmukointivariantit. Sen määrittämiseksi, mikäli N- ja C-terminaaliset immunoreaktiivisuus liittyy AR transkriptivariantissa, suoritimme RT-PCR: llä osajoukko metastaattisen CRPC kudosten ja verrattiin RT-PCR-tulokset IHC Tulokset (taulukko 4). 4 N + C + metastaattinen näytteet tutkittiin RT-PCR, kaikki ilmaisseet AR

FL (yksi oli myös rajoitettu ilmaus AR-V7). 8 metastaattisen näytteistä luokiteltu N + C ↓ IHC analyysin ilmaisivat kaikki AR

FL ja 6 (75%) ilmaisi myös ainakin yksi tunnettu AR variantti (AR-V7 /AR3 ja /tai AR

v567es ) RT-PCR. Nämä N + C ↓ metastaattinen näytteet myös näytteillä vähemmän tasoja PSA ja PSMA immunoreaktiivisuus. Yksikään neljästä NC metastaattinen näytettä ilmaisi AR

FL tutkittiin RT-PCR, vaikka yksi oli hyvin alhainen AR

v567es ilme.

Nämä tiedot osoittivat, että IHC analyysi eri AR tunnistavien vasta-aineiden erillisten AR proteiinin alueilla oli erittäin yhtäpitävä selostukset koodaavat AR

FL ja AR silmukointivariantit, joilta puuttuu C-terminaalista eksonit.

AR variantti mRNA oli herkkä androgeenikonsentraatio vitro

VCAP soluja viljeltiin hiilellä raidallinen seerumissa (CSS), ja käsiteltiin sitten dihydrotestosteroni (DHT), MDV-3100 tai MDV-3100 DHT, erikseen. qRT-PCR osoitti, että AR

FL mRNA tukahdutettiin lisäämällä DHT, MDV-3100 ja DHT + MDV (kuvio 5A). Variantti AR

v567es mRNA supistaa myös DHT; kuitenkin, se voitaisiin lisätä lisäämällä androgeenireseptoriantagonistin MDV-3100 yksinään ja tukahdutetaan tasolle CSS, kun DHT lisättiin MDV-3100 (kuvio 5B). AR-V7 mRNA vastasivat samalla tavalla kuin AR

FL (kuvio 5C).

(A) AR

FL mRNA tukahdutettiin DHT, MDV-3100 ja MDV-3100 + DHT mutta ei parane DHT yksin. (B) AR

v567es mRNA tukahdutettiin läsnä ollessa DHT, entisestään lisäämällä MDV-3100 ja tukahdutetaan tason CSS, kun DHT lisättiin yhdessä MDV-3100. (C) AR-V7 mRNA vastasivat samalla tavalla kuin AR

FL.

heterogeeninen ilmentymistä AR havaittiin yksittäisillä potilailla

tunnistettu G terminaalisella katkaistulla AR proteiinit useita metastaasien kustakin 42 CRPC potilaista (kuvio 6). 42 potilasta, 16 (38%) ei ollut menetystä C-terminaalin AR ilmaisu, 23 (55%) oli vähintään yksi metastaattisen sivuston vähentynyt ydin- C-terminaalinen AR immunoreaktiivisuuden, ja 6 (14,3%) oli vähintään yksi sivuston ilman AR ilme. Nämä tiedot korostavat heterogeenisyys AR ilmaisun eri metastaasien samassa potilaassa.

Useita metastaasien 42 CRPC potilaista oli analysoitu IHC käyttämällä 2 AR-vasta-aineita. Värjäytyminen tulokset yhteenvetona N + C + (sininen), N + C ↓ (oranssi) ja N-C- (punainen). LN = imusolmuke; L = lannenikama; R. = oikea; L. = left; T = rintakehä nikama.

Lisäksi onko AR tila edisti kasvaimen kasvunopeus, jaoimme CRPC luumetastaasipotilailla näytteet kolmeen ryhmään: N + C + (n = 93), N + C ↓ (n = 39), ja NC- (n = 18). Ki67 indeksi N + C + sivustoja oli 18%. Tämä ei ollut merkittävästi erilainen kuin N + C ↓ sivustoja (20,8%) (p = 0,4225) tai NC- sivustoja (17,8%) (p = 0,95).

Keskustelu

Perinteinen käsitteet AR translokaation tumaan, joissa ligandi sitovia, irtaantuu chaperones ja tumaansiirtymiseen tarkoita sitä, että ilman androgeenireseptorin ligandin, AR löytyisi pääasiassa sytoplasmassa ja CRPC kasvaimen etenemiseen voitaisiin saavuttaa mekanismeja, joihin ei liity AR. Tämä ei kuitenkaan ole lukuun ottamatta kaikkein neuroendokriinisten kasvainten. CRPC yleensä hallussaan kopiointia ajatellen aktiivisen AR joka moduloi ilmentymistä AR säännellyn lähetti-RNA: t [1], [33]. Lisäksi useimmissa tutkimuksissa CRPC kudoksia, AR on todettu tumassa.

Useita mekanismeja on ehdotettu selittämään AR ydinvoiman lokalisointi ja joitakin tai kaikkia voivat olla vastuussa, joka nähdään CRPC [34], [35]. Useimmat ehdotettuja mekanismeja voisi translokoituvat AR tumaan, koska ne edellyttävät ligandin sitoutumista LBD. Jos näin oli, olettaen että ei ole eroja AR rakenteissa, me voisimme odottaa mitään eroja AR immuunivärjäysmenetelmällä N- tai C-terminaalin suunnattu vasta metastaattisessa CRPC. Kuitenkin kun osoitamme tässä tutkimuksessa, on olemassa merkittävä ero ydin- N- ja C-terminaalisten AR-vasta-aineiden metastaattisen kudoksissa. Tämä viittaa siihen, että mekanismi (t) muista kuin edellä mainittuja voisi olla mukana aikana AR translokaation tumaan ilman ligandia CRPC.

Vaikka vasta-aineita on kehitetty AR-V7 /AR3 ja AR

v567es silmukointivariantit, vähintään 20 AR silmukointivariantit on raportoitu tähän mennessä. Spesifisten vasta-aineiden saatavilla vain 2 varianttien käyttö spesifisen vasta-aineen värjäytymisen kudoksen havaitsemiseksi kastraatio aiheuttama C-terminaalinen katkaistu AR variantteja ei ole mahdollista [20] – [25]. Täällä, me kehittää uusi ja nopea immunohistokemiallinen lähestymistapa, jossa verrataan N- ja C-terminaalista AR immunoreaktiivisuus, joka voi menestyksekkäästi osoittaa yleinen esiintyvyys G terminaalisella katkaistulla AR silmukointimuunnokset potilailla.

ilmoitetaan tässä korreloivat ilmentymistä AR proteiinin IHC 2-vasta-aineiden ja validointi ilmentymisen AR silmukointivarianttien RT-PCR: llä, viittaavat vahvasti siihen, että vaihtelu AR N- ja C-terminaalissa immunoreaktiivisuus tulokset ilmaus vaihtoehtoisten AR-mRNA: iden. Kuitenkin vaihtoehtoiset selitykset olisi tutkita. Primäärikasvaimissa ja pehmytkudoksen metastaasit formaliinilla ja parafiiniin, kun taas etäpesäkeleesioita luun oli formaliinilla ja kalkittomat 10% muurahaishappoa, ennen kuin parafiiniin. Havaitsimme mitään merkittävää eroa AR värjäytymistä pehmytkudoksen verrattuna luumetastaasi (p 0,05, tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi emme ole nähneet eroja muiden vasta välillä luun ja pehmytkudoksen valmistusmenetelmät käyttämällä samoja kudoksia ja menetelmiä [36], [37]. Siksi emme ole pystyneet tunnistamaan tekninen syy eroihin värjäystä.