Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Annosvasteinen toksisuudet doksorubisiinia (DOX) rajoittavat kliiniset sovellukset, erityisesti lääkeresistenttiä syöpien, kuten maksasyöpää. Tässä tutkimuksessa selvitimme roolia quercetin on antituumorivaikutukset DOX maksan syöpäsoluja ja sen kyky tarjota suojaa DOX välittämän maksavaurio hiirillä.

Menetelmät ja tulokset

MTT ja anneksiini V /PI-värjäys määrityksessä osoitti, että quercetin selektiivisesti herkistyneet DOX aiheuttama sytotoksisuutta maksan syöpäsoluja samalla suojella normaali maksan soluihin. Kasvu DOX-välitteisen apoptoosin hepatoomasolujen by kversetiini oli p53-riippuvainen ja tapahtunut vähen- tämisessä Bcl-xl ilme. Z-VAD-fmk (kaspaasiestäjä), pifithrin-α (p53-estäjä) tai yli-ilmentynyt Bcl-xl laski vaikutuksia quercetin on DOX-välitteisen apoptoosin. Yhdistetty hoito quercetin ja DOX vähensi kasvun maksasyövän hiirissä. Lisäksi quercetin vähensi seerumin alaniiniaminotransferaasi ja aspartaattiaminotransferaasi että korotettiin DOX-käsitellyissä hiirissä. Quercetin myös päinvastaiseksi DOX aiheuttamaa patologisia muutoksia hiirissä maksa.

Johtopäätös ja merkitys

Nämä tulokset osoittavat, että quercetin voimisti antituumorivaikutukset DOX maksan syöpäsoluja samalla suojella normaali maksan soluihin. Siksi kehittäminen quercetin voi olla hyödyllistä yhdistetty käsittely DOX lisääntyneen terapeuttisen tehon vastaan ​​maksasyöpä.

Citation: Wang G, Zhang J, Liu L, Sharma S, Dong Q (2012) Quercetin voimistaa doksorubisiini kasvaimen vastaisen Effects vastaan ​​Maksasyöpä kautta p53 /Bcl-xl. PLoS ONE 7 (12): e51764. doi: 10,1371 /journal.pone.0051764

Editor: Ashraf B. Abdel-Naim, Ain Shams University, Egypti

vastaanotettu: 25 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 07 marraskuu 2012; Julkaistu 11 joulukuuta 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro .: 30400521), Science Technology Department of Zhejiang Province (nro .: 2012R10047 QD ja nro .: 2012C33116 GW) ja opetusviraston Zhejiangin maakunnassa (nro .: Y201224108). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on yksi yleisimpiä maksasyövän ja neljäs johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti [1]. Puute biomarkkereita, jotka tunnistavat kirurgisesti kokoisen alkuvaiheessa tauti on aiheuttanut ilmentymä vaiheissa useimmilla potilailla, kun kirurginen resektio ei ole enää mahdollista [2]. Siksi kemoterapiaa edelleen varteenotettava vaihtoehto hoitoon käyttökelvottoman HCC potilaista.

Vuosien doksorubisiini (DOX) on tullut rutiininomaisesti ja laajalti käytetty aine HCC hoidossa. Tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että jotkin syöpäsoluja, mukaan lukien hepatooma, ovat resistenttejä apoptoottisen vaikutusten DOX [3]. Lisäksi DOX kemoterapian liittyy vakavia sivuvaikutuksia ei-syöpäkudoksissa, kuten sydän, maksa, ja munuaisten, suuresti rajoittaa sen kliiniset sovellukset [4], [5]. Benjamin kuvattu kahdeksan potilasta, joilla on heikentynyt maksan toiminta, joka kehittyi vakava pansytopenia ja mukosiitti saadessaan DOX, pakottaen asiantuntijat vähentää annostusta takia muuttunut maksan toiminta [6]. Siten parannettu hoito-tehostavien DOX vaikutuksia, jotka mahdollistavat annoksen pienentämistä ja suojeluun kuin syöpäkudoksissa, parantamiseksi tarvitaan hoitoon maksasyövän potilaiden.

mekanismit DOX sytotoksisuus syöpäsoluissa ja normaalit kudokset ovat erilaiset [7]. DOX myrkyllisyys syöpäsoluissa ensisijaisesti tapahtuu läpi tunkeutumiseen DNA ja vaurioita [8], kun taas DOX-kardiotoksisuuteen tai maksatoksisuuden esiintyy pääasiassa synnyttämällä vapaita happiradikaaleja, joka inhiboitui vapaalla radikaalinpoistajien [9]. Tämä ero DOX-välitteistä toksisuutta syövän ja normaaleja soluja voidaan tutkia parantaa antituumorivaikutukset DOX kanssa kombinatorisista lähestymistapoja, jotka mahdollistavat annoksen pienentämistä DOX samalla suojella normaalit solut.

Kversetiini (3, 3 ’, 4 ’, 5, 7-pentahydroxyflavone), tärkeä ravinnon flavonoidi läsnä useissa hedelmiä ja vihanneksia, näyttelyissä antioksidantti, tulehdusta, ja syövän vastaisia ​​ominaisuuksia [10]. Quercetin on saanut kasvavaa huomiota pro-apoptoottinen flavonoidi erityisiä ja lähes yksinomainen aktiivisuus kasvainsoluihin sijaan normaalia, ei-transformoidut solut [11], [12]. Kuitenkin mekanismit, joilla quercetin kykenee sen antiproliferatiivisia ja apoptoottisten toimintaa jäävät epäselviksi. Useat

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset ovat arvioineet quercetin yhdistetty DOX rintasyövän ja leukemian hoitojen, paljastaen synergiavaikutuksia [13] – [15]. Hiiren rintasyövän malleja, yhdistelmä ruokavalion quercetin ja kasvaimensisäistä injektio DOX pienentää kasvaimen tilavuus ja metastaattinen leviäminen [13]. Vaikka kversetiini kumoaa DOX aiheuttama monilääkeaineresistenssin ihmisen myelooinen leukemia solujen [14], [16], ei tutkimuksia tehosta quercetin kanssa DOX vastaan ​​maksasyövän on raportoitu vielä.

Antioksidantit ovat suotuisia vaikutuksia vastaan ​​DOX indusoituvan toksisuuden hiirillä ja rotilla [17]. Quercetin on suojaava vaikutus DOX-kardiotoksisuuteen hiirissä, mutta mekanismit ovat edelleen epäselviä [18]. Quercetin myös näyttelyitä suojaava vaikutus AFB1 välittämän maksavaurio

in vivo

edistämällä antioksidanttisia puolustusmekanismeja ja estämällä lipidiperoksidaatiossa [19]. Lisäksi quercetin vähentää maksan sytokromi P450 sisältöä ja lisää maksan glutationi S-transferaasi (GST) aktiivisuus mukana aktivointi /vieroitus Kemiallisten mutageenien /karsinogeenien [20] – [22]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että quercetin voi suojaavat DOX välittämän maksavaurioita.

Tässä tutkimuksessa pyritään arvioimaan niiden yhdistelmän vaikutuksista DOX kemoterapeuttisen aineen kanssa luonnollinen yhdiste quercetin ihmisen maksasyövän ja normaalit solut. Mahdollinen toiminta quercetin kuin maksan suoja-aineena aikana DOX hoidon hiirillä tarkasteltiin.

Tuloksemme osoittavat, että kversetiini-tehostetun DOX-välitteistä apoptoosia hepatoomasolujen on p53-riippuvainen ja tapahtuu vähen- tämisessä Bcl- xl. Lisäksi quercetin esiintyy suojaava vaikutus DOX aiheuttamaa maksatoksisuutta hiirillä.

Tulokset

Quercetin valikoivasti voimistaa DOX sytotoksisuuden maksasyövän soluissa, mutta ei normaaleissa maksasoluissa

Cultures altistettiin kversetiini annoksilla 0 150 um vaikutusten määrittämiseksi kversetiinin maksan syöpäsoluja ja normaaleja soluja. Dimetyylisulfoksidia (DMSO; 0,1%), käytettiin negatiivisena kontrollina. 48 tunnin kuluttua, annoksesta riippuvainen väheneminen syövän solujen elinkelpoisuuden (IC

50-arvo SMMC7721 soluja = 133 uM ja QGY7701 soluja = 142 uM) havaittiin (Fig. 1A). Quercetin ei vaikuta normaaliin maksan solujen (L02) kasvu jopa suurilla pitoisuuksilla ( 100 uM). Ottaen huomioon, että 12 uM quercetin seerumissa ei aiheuttanut liittynyt sivuvaikutuksia ihmisiin ja sen sytotoksisuus useita syöpäsolulinjoissa [23], [24], valitsimme 20 uM quercetin huumeiden yhdistelmä tutkimuksia. Quercetin (20 uM) lisäsi DOX aiheuttama maksan syöpäsolun kuoleman ja vähensi IC

50 arvo DOX hepatooman SMMC7721 soluja (5,1 uM 2,2 uM; Fig. 1 B) ja QGY7701 soluja (6,2 uM 2,7 uM; kuvio . 1C). Sen sijaan esikäsittely 20 uM quercetin vähensi DOX sytotoksisuus normaaleissa maksan L02 solut (Fig. 1 D). Ihmisen plasmassa huippu ja vakaan tilan pitoisuus DOX ovat 5 uM ja 25 500 nm, vastaavasti [25]; Näin valitsimme 1 uM DOX varten lääkeyhdistelmän tutkimukset edustamaan asiaa plasmassa in DOX saaneilla potilailla. Anneksiini V /PI-värjäys suoritettiin tutkimaan, onko vai ei DOX-indusoituvaa solukuolemaa hepatoomasolujen tapahtuu apoptoosin kautta. DOX (1 uM) indusoi apoptoosin 13%: n SMMC7721 solut; co-hoidon kversetiini prosenttiosuus kasvoi apoptoottisten solujen 42%: iin (Fig. 1 E). Prosenttiosuus DOX: n indusoiman apoptoosin yksin tai co-hoidon quercetin L02 solut olivat noin 22% ja 18%, vastaavasti, mikä viittaa siihen, että kversetiini ei herkistää normaalissa maksassa solut DOX: n indusoiman apoptoosin. Samanlaisia ​​tuloksia vahvistettiin Hoechst-värjäys (tietoja ei esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, etuoikeutettu voimistumisen vaikutus kversetiini on DOX-välitteisen sytotoksisuuden maksasyövän soluissa, mutta ei normaaleissa maksasoluissa.

(A) Vaikutus kversetiinin proliferaatioon SMMC7721 ja QGY7701 maksan syöpäsoluja, ja L02 normaalit maksasolut. Soluja inkuboitiin kersetiinillä (0 uM 150 uM) 48 tunnin ajan ja altistettiin MTT-määritys määrittää leviämisen määrä. (B) Quercetin herkistyneet SMMC7721 solujen DOX. (C) Quercetin herkistyneet QGY7701 solujen DOX. (D) Quercetin osittain vähensi DOX aiheuttama kasvun esto in L02 soluissa. Soluja inkuboitiin DOX (1 uM) ja /tai kersetiiniä (20 uM) (B, C, ja D) 24 tuntia, ja sen jälkeen niille MTT-määritys. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. (E) SMMC7721 ja L02 soluja inkuboitiin DOX (1 uM) ja /tai kersetiiniä (20 uM) 24 tunnin ajan, ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V /PI-värjäyksen erottelemaan elävät solut (anneksiini V- /PI -), varhainen apoptoottiset solut (anneksiini V + /PI), kuolion tai myöhään apoptoottiset solut (anneksiini V + /PI +), ja kuolleet solut (anneksiini V- /PI +). *

P

0,05 vs. solujen yhteistyötä käsitelty kversetiini.

Quercetin parantaa DOX aiheuttama kaspaasin aktivaatio maksan syöpäsoluja

Caspase aktivointi on tärkeä tehtävä sekä sisäiseen ja ulkoiseen apoptoottisia reittejä. Niinpä myös tutkittiin, mikä vaikutus quercetin on DOX aiheuttamiin muutoksiin kaspaaseiksi. Quercetin ei suoraan aktivoi caspases, mutta voimakkaasti parannettu DOX aiheuttama kaspaasi-9 aktivaation, ei kaspaasi 8 aktivaation in SMMC7721 soluissa (kuvio. 2A). Aktivoitu kaspaasi-3, suuret efektori kaspaasien, ja PARP, tärkeimmät alustan kaspaasien, arvioitiin myös. Kversetiini yksinään ei indusoinut mitään pilkkominen kaspaasi-3 SMMC7721 soluissa; DOX indusoi 20 kDa pilkkominen muodostumista. Kuitenkin co-hoito quercetin ja DOX aiheuttamaa pilkkomista prokaspaasi-3 osaksi P20 väli, joka myöhemmin lohkaista aktiivisen p17-alayksikköä. Enemmän PARP proteiinit pilkotaan 85 kDa muotoihin yhdistämisen jälkeen hoito annettiin verrattiin DOX hoito yksinään. Variantit aktivaatio kuviot kaspaasien ja lohkaisu PARP havaittiin QGY7701 soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys vahvisti, että kersetiini lisäsi merkittävästi DOX-indusoidun kaspaasi-3-aktiivisuus SMMC7721 soluissa (Fig. 2B). Vaikutukset laajakirjoinen kaspaasiestäjä Z-VAD-fmk on maksasyövän apoptoosia määritettiin PI värjäys vahvistaa, että toiminnan quercetin on DOX oli kaspaasi riippuvainen. Yhteistyössä hoidon aiheuttama kertymistä osa-G1 vaihe solupopulaatioiden QGY7701 soluissa oli vähentynyt merkittävästi (26%: sta 7%), jonka esikäsittely Z-VAD-fmk (Fig. 2C). Sub-G1-vaiheen solupopulaation SMMC7721 soluissa myös laskeneet 39%: sta 8% (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittivat, että kversetiini voimistua DOX-indusoitua apoptoosia in maksasyövän soluissa aktivoimalla kaspaasit-9 ja -3 ja sisäisen reaktiotien.

(A) katkaistiin kaspaasit-3, -8, ja -9 ja PARP ilmaisun arvioitiin western blotting in SMMC7721 soluissa, joita käsiteltiin DOX (1 uM) ja /tai kersetiiniä (20 uM) 24 tunnin ajan. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (B) Kaspaasi-3-aktiivisuus määritystä DOX- (1 uM) ja /tai quercetin- (20 uM) käsiteltiin SMMC7721 solujen kanssa 24 tunnin ajan. Solulysaatit inkuboitiin fluorogeenisen kaspaasi-3: n substraatti 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Kaspaasi-3-aktiivisuus normalisoitiin solulysaattiin proteiinia ja ilmaistaan ​​kertainen aktivaatio kontrolliin verrattuna. *

P

0,05 vs. DOX käsiteltyjä soluja. (C) kaspaasiestäjä Z-VAD-fmk vähensi vaikutusta quercetin on DOX aiheuttaman apoptoosin QGY7701 soluissa tutkittiin PI värjäystä. Ohjaus: 0,5% dimetyylisulfoksidi; quercetin: 20 uM; DOX: 1 uM; DOX + quercetin: DOX 1 uM plus quercetin 20 uM; Z-VAD-fmk + DOX + kversetiini: soluja esikäsiteltiin 25 uM z-VAD-fmk: ssa 1,5 tuntia ja käsiteltiin edelleen DOX plus kersetiinin 24 tuntia. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. *

P

0,05 vs. DOX käsiteltyjä soluja. **

P

0,01 vs. DOX + kversetiini käsiteltyjä soluja.

Quercetin potentiates DOX aiheuttaman apoptoosin maksasyövän soluihin Bcl-xl /Bax välittämää mitokondrion reitin

Kokeet suoritettiin käyttäen JC-1 tutkia mahdollisuuksia osallistumista mitokondrion kalvon häiriöitä. Määrälliset mittaukset osoittivat, että SMMC7721 solut käsiteltiin kversetiini yksinään eivät osoittaneet mitään muutosta verrattuna kontrolliin. DOX hoito indusoi maltillisesti punaisen fluoresenssin, mikä osoittaa laskua mitokondrion kalvon potentiaali, kun taas yhteistyössä hoitoon quercetin ja DOX aiheuttama terävä, merkittävä väheneminen (kuviot. 3A ja B). Yhdenmukainen mitokondrion kalvon, co-hoito SMMC7721 solujen kersetiinillä ja DOX vapautuu lisää sytokromi

c myynnissä maassa mitokondriot sytosoliin verrattiin DOX hoito yksinään (Fig. 3C).

(A, B) vaikutus DOX ja /tai quercetin on mitokondrion kalvon potentiaalia jaottelun SMMC7721 soluissa, joita käsiteltiin DOX (1 uM) ja /tai quercetin (20 uM) 24 tunnin ajan. JC-1 havaitaan vihreä fluoresoivia monomeereja sytosoliin tai punaisina fluoresoivia aggregaattien ennallaan mitokondrioissa. Vähentäminen punaisen fluoresenssin intensiteetti osoittaa mitokondrioiden jakautuminen ja ehjät kalvo potentiaalia. *

P

0,01 vs. DOX käsiteltyjä soluja. (C) Western blot analyysi yhteensä ilmentymisen Bid, Bcl-2 ja Bcl-xl, sekä mitokondrioiden jakautuminen Bax ja sytosolin jakelu sytokromi

c

in SMMC7721 soluissa, joita käsiteltiin DOX ( 1 uM) ja /tai kersetiiniä (20 uM) 24 tunnin ajan. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina kokonaisproteiinipitoisuus ja sytosolin proteiiniin. Hsp60 käytettiin sisäisenä kontrollina mitokondrioiden proteiinia. (D) Western blot analyysi mitokondrioiden jakelun Bax ja Bcl–xl in SMMC7721 transfektoiduissa soluissa Bcl-xl-ekspressiovektoriin ja käsiteltiin DOX (1 uM) ja /tai kersetiiniä (20 uM) 24 tunnin ajan. (E) vaikutus DOX ja /tai kversetiiniä on apoptoosin SMMC7721 /Bcl-xl ja SMMC7721 /neo-soluissa määritettiin PI-värjäys DOX (1 uM) ja /tai kersetiiniä (20 uM) annettiin 24 tuntia. *

P

0,01, SMMC7721 /neo vs. SMMC7721 /Bcl-xl soluissa. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. kolmen itsenäisen kokeen.

tutkittiin Bcl-2-perheen proteiinien ilmentymisen taso tutkia mahdollisuuksia kohdemolekyylit ylävirtaan kaspaasi-9 reittejä. Bcl-2: n ilmentymisen tasoa ei muuttanut erilaisten käsittelyjen jälkeen tehtiin. Yhteistyössä käsittely DOX ja quercetin ei vaikuttanut DOX aiheuttama lasku Bid ilmaisun tasolla. Yllättäen yhteistyössä hoito aiheutti jyrkkään laskuun Bcl-XL ilmaisu, kun taas DOX tai quercetin hoito yksinään ei vaikuttanut Bcl-xl ilmentymisen (Fig. 3C). Näin ollen yhteistyössä hoitoon SMMC7721 solujen kersetiinillä ja DOX lisääntynyt huomattavasti Bax translokaation alkaen sytosoliin osaksi mitokondrioita verrattuna DOX hoito yksinään, joka vain aiheutti maltillista Bax translokaatio.

SMMC7721 soluja vakaasti transdusoiduilla käyttämällä Bcl-xl ekspressiovektorin vahvistaa tärkeä tehtävä Bcl-xl proteiinin vaikutuksia quercetin on DOX indusoiman apoptoosin. Yli-ilmentyminen Bcl-XL SMMC7721 soluissa merkittävästi estivät Bax translokaation mitokondriot, joka indusoitiin yhteistyössä hoitoon DOX ja quercetin (Fig. 3d), ja vähensi voimistumista vaikutusta kversetiini on DOX aiheuttaman apoptoosin (Fig. 3E ). Nämä tulokset viittaavat siihen, kversetiini potentiates DOX aiheuttaman apoptoosin hepatoomasolujen kautta mitokondrio-reitin vähen- tämisessä Bcl-XL-proteiini ja sen jälkeen lisäämällä Bax translokaation mitokondrioita.

Quercetin tehostaminen DOX aiheuttaman apoptoosin maksasyövän solujen p53-riippuvaisen

Aktivoitu p53-välitteisen edistäminen apoptoosin kasvainsoluissa on tärkeä mekanismi kasvainten kasvua estävistä lääkeaineista, kuten DOX [26]. Näin ollen, olemme tutkineet, onko p53-proteiini on osallisena voimistumista vaikutus kversetiini on DOX: n indusoiman apoptoosin maksan syöpäsoluja. Mitään havaittavaa p53-proteiinin ilmentymistä ei havaittu kontrolli tai kversetiini-käsiteltyjä soluja, kun taas co-hoidon kersetiinin ja DOX huomattavasti ilmentymisen taso p53-proteiinin indusoima DOX SMMC7721 soluissa (Fig. 4A). p53 voimistunut modulaattori apoptoosin (PUMA), pro-apoptoottisten BH3-vasta-proteiinia, on suora transkription kohteena p53. Quercetin myöhemmin lisäsi DOX aiheuttama PUMA ekspressiotasot. SMMC7721 soluja transfektoitiin ohimenevästi p53-lusiferaasi-plasmidia ja altistettiin erilaisia ​​hoitoja selventää p53 on voimistumista vaikutus kversetiini on DOX: n indusoiman apoptoosin. Kversetiini ei yksinään parantaa p53 aktiivisuutta. Sitä vastoin yhdistetty hoito DOX ja DOX hoito yksinään merkittävästi parannettu p53-aktiivisuus 15- ja 6-kertaisesti, vastaavasti, verrattuna kontrolliryhmään. Lisäksi pifithrin-α, tietyn p53-estäjä, ei vaikuttanut solujen eloonjäämistä, mutta esti merkitsevästi p53 aktiivisuutta (2,4-kertaisesti), joka parantaa yhdistetyn kversetiinin ja DOX hoitoon (Fig. 4B), ja vähensi voimistumista vaikutus kversetiini on DOX: n indusoiman apoptoosin (Fig. 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että tehostettu p53 toiminta on välttämätöntä edistää voimistumista vaikutus kversetiini on DOX: n indusoiman apoptoosin.

(A) p53 ja PUMA ilmaisuja arvioitiin western blot SMMC7721 soluissa, joita käsiteltiin DOX (1 uM ) ja /tai kersetiiniä (20 uM) 24 tunnin ajan. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (B) Lusiferaasimääritys ja DOX- ja kversetiini aiheuttama p53 aktivaation. SMMC7721 soluja esikäsiteltiin 1 tunnin ajan 2 uM pifithrin-α, ja sitten käsiteltiin DOX (1 uM) tai kersetiiniä (20 uM) 12 tuntia. p53-aktiivisuus määritettiin lusiferaasiaktiivisuus määrityksellä. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. *

P

0,01 vs. DOX käsiteltyjä soluja. **

P

0,001 vs. DOX + kversetiini käsiteltyjä soluja. (C) SMMC7721 soluja esikäsiteltiin 2 uM pfithrin-α 1 h, ja sitten käsiteltiin DOX (1 uM) ja /tai kersetiiniä (20 uM) 24 tunnin ajan. Apoptosis hinnat analysoitiin anneksiini V /PI värjäystä. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. *

P

0,001 vs. DOX käsiteltyjä soluja. **

P

0,01 vs. DOX käsiteltyjä soluja. ***

P

0,001 vs. DOX + kversetiini käsiteltyjä soluja.

Quercetin lisää DOX aiheuttama kasvun esto SMMC7721 hiirissä

vaikutukset quercetin on DOX meidän soluviljelymalli

in vitro

validoitu tässä tutkimuksessa. Näin ollen meidän arvioida, onko kversetiini voi voimistaa antituumorivaikutusta DOX kohteessa SMMC7721 kasvaimen nude-hiirissä. SMMC7721 yhden solun suspensiot injektoitiin s.c. kylkiin kuuden viikon ikäisiä immuuni-hiirillä, hiiret jaettiin sitten neljään ryhmään 10 päivää kasvaimen istuttamisen, kun kasvaimet olivat palpoitavissa: 1) normaalia suolaliuosta kontrolliryhmään (i.p., 3 x /wk); 2) kversetiini (100 mg /kg, i.p., 3 x /wk); 3) DOX (4 mg /kg, i.p., 1 x /wk); ja 4) DOX (4 mg /kg, i.p., 1 x /wk) plus kersetiiniä (100 mg /kg, i.p., 3 x /wk). Sillä DOX ryhmän potilaille annettiin vasta kun kumulatiivinen annos on 12 mg /kg saavutettiin. Quercetin ei yksinään estää kasvaimen kasvua; sen sijaan, quercetin edistänyt kasvaimen kasvu ensimmäisten 14 päivän aikana ja sen jälkeen hidasti kasvaimen kasvua seuraavan 7 päivän verrattuna kontrolliryhmään. Lopussa kokeen keskimääräinen kasvaimen tilavuus kversetiinin hoito oli 531,3 mm

3, samanlainen kuin kontrolliryhmän. DOX hoito vähensi merkitsevästi kasvaimen tilavuudet (334,7 mm

3) verrattuna kontrolliryhmään. Merkittävä väheneminen kasvaimen tilavuus co-käsitelty ksenografteissa havaittiin päivästä neljä jälkikäsittelyä loppuun saakka kokeen (Fig. 5A). Sen jälkeen co-hoito annettiin, kasvaimet kasvoivat alennetuin joissa alku- ja lopullinen keskimääräinen kasvainten tilavuudet 76,5 ja 118,1 mm

3, vastaavasti.

SMMC7721 soluperäisissä kasvaimia kehitettiin nude-hiirissä ja käsiteltiin suolaliuoksella, quercetin, DOX, ja DOX + quercetin. (A) Kasvaimen kasvua seurattiin mittaamalla tuumorin tilavuus kolme viikkoa. (

n

= 5 hiirtä per ryhmä). *

P

0,01 vs. kontrolli ja kversetiini hoidetuissa ryhmissä. **

P

0,01 vs. DOX-hoidetussa ryhmässä. (B) lopussa kolme viikkoa, kasvaimet kerättiin ja punnittiin. DOX vähentää kasvaimen kokoa verrattuna kontrolliin ja kversetiini-käsiteltyjen ryhmien (*

P

0,05). Co-hoito vähensi merkitsevästi kasvaimen kokoa verrattuna muihin hoitoryhmiin (**

P

0,001). (C) Kasvaimen näytteille tehtiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja immunohistokemiallinen analyysi käyttäen Ki67, Bcl-xl, ja p53-vasta-aineita. Co-käsitellyt tuumorit osoittivat merkittävää vähenemistä Ki67 ja Bcl-xl ilmentymisen sekä lisääntyminen p53 ilmaus verrattuna muihin käsiteltyjen kasvainten (

P

0,05).

keskimääräinen tuumorin paino verrokkiryhmässä saavutti 163 mg, kun taas kversetiini-käsitelty ryhmä sai aikaan mitään vaikutusta SMMC7721 kasvaimen kasvua. DOX-hoito johti noin 50% kasvaimen kasvun inhibitio verrattuna kontrolliryhmään; keskimääräinen kasvaimen paino laski 87 mg. Yhteistyössä käsittely DOX ja quercetin herättivät tehokkain kasvaimen kasvun estäminen ja johti kasvaimen keskimääräinen paino on 20 mg (Fig. 5B). Tulokset osoittivat, että quercetin kasvattaa antituumorivaikutuksen DOX

in vivo

.

Kudostutkimuksissa kasvaimet olivat huomattavasti pienempiä solujen ja koostuu pääasiassa acellular materiaalia yhteistyössä käsitellyn ksenografteissa. Sitä vastoin kasvainsolujen hiirillä, jotka saivat ajoneuvon ohjaus ja kversetiiniä hoito oli järjestetty pesät erotettu nippua soluväliaineen (Fig. 5C). Pieni joukko kasvaimia todettiin DOX-käsitellyissä hiirissä. Kasvaimen osastoja nude-hiirissä arvioitiin Ki67 ilmentymisen vaikutuksen tutkimiseksi yhdistetyn hoidon kasvainsolujen proliferaatiota (kuvio. 5C). Kolmen viikon hoidon, 24%, 62%, 91% ja 92% ja Ki67 + kasvainsoluja löydettiin yhteistyössä, DOX- ja ajoneuvon ohjaus- tai kversetiini-käsitellyissä hiirissä, vastaavasti. Muita immunohistokemiallista analyysit suoritettiin vahvistamaan

in vitro

havainnot mekanismeja, joilla quercetin esiintyy voimistumista vaikutus DOX

in vivo

. Quercetin ja DOX yhteistyössä käsiteltyjen kasvainten exhibitd lisääntynyt p53 tasoilla ja laskivat Bcl-xl tasot verrattuna kontrolliryhmään (Fig. 5C), vastaa meidän

in vitro

havainnoista.

Quercetin vaimentaa DOX indusoimaan hepatotoxicity

in vivo

Kun otetaan huomioon meidän

in vitro

havainnot että quercetin voi vähentää DOX sytotoksisuuden normaali maksan soluihin (Fig. 1 D), me tutki tarkemmin sen vaikutus DOX aiheuttama hepatotoxicity

in vivo

. C57BL /6-hiiriä käsiteltiin DOX 20 mg /kg (i.p.), joka on annos, joka aiheuttaa akuuttia toksisuutta [27]. Akuutti maksatoksisuuden DOX selvästi paljasti seerumin biokemiallisia merkkiaineita, erityisesti alaniiniaminotransferaasin (ALT) ja aspartaattiaminotransferaasin (ASAT). DOX-hoito johti merkittävään kasvuun 765% ja 378% ALT ja AST vastaavasti verrattuna verrokkiryhmään (taulukko 1). Quercetin täydentämistä yksinään eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia biokemiallisten merkkiaineiden. Kääntäen, co-hoito DOX ja quercetin johti osittaiseen käänteinen DOX aiheuttaman seerumin lisäys ALAT ja ASAT (

p

0,05).

Mikroskooppitutkimus kävi ilmi, että ohjaus ja kversetiini käsiteltyjen maksan kudoksissa on suuri normaalit monikulmion solujen näkyvä pyöreä ytimet ja eosinofiilinen sytoplasma, sekä muutama erillään maksan sinusoids järjestetty-välillä maksan johdot (Fig. 6A). Sitä vastoin hiirillä, jotka saivat 20 mg /kg DOX osoittivat massiivisen maksatoksisuus, jossa liukenemista mukana maksan johdot, joka ilmestyi tyhjinä vacuoles linjassa säikeiden nekroottisen hepatosyyttien ja Kupfferin solut lisääntyivät diffuusisti tavalla välillä rasva rappeutunut hepatosyyttien. Histopatologisia osoittaisivat, että maksavaurio jälkeen DOX hoidon väheni merkittävästi, kun yhtäaikainen käsittely kversetiini.

(A) C57BL /6-hiiriä käsiteltiin kersetiiniä (100 mg /kg /päivä, po) neljä päivää ennen ip anto DOX (20 mg /kg). Maksat poistettiin viiden päivän kuluttua DOX hoidon, ja leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 100 uM. Toisin kuin muun tyyppiset ihmisen syöpäsoluja, kversetiini on anti-proliferatiivisia ja pro-apoptoottinen vaikutus pienillä pitoisuuksilla [23], kuten 21 uM MDA-MB-468 ihmisen rintasyöpäsoluilla [24]. Useat raportit ja tuloksemme osoittivat, että ihmisen hepatoomasolujen katsotaan vastustuskykyisiä quercetin koska IC

50-arvo on 100 uM. Ihmisen maksasoluja ovat myös resistenttejä DOX (IC

50 arvon 5 uM) ja huippu DOX pitoisuus ihmisen plasmassa on 5 uM. Tuloksemme paljasti myös, että co-hoidossa quercetin (20 uM) ja DOX (1 uM) merkittävästi voimistaa antituumorivaikutukset DOX ihmisen maksan syöpäsoluja. Syöpäsolut näytteille niiden vastustuskyky kemoterapia-aineiden karkottamalla solunsisäisen syöpälääkkeiden ulos soluista kautta P-gp: n ja muiden huumeiden pumput. Kversetiini voivat inhiboida P-gp pumppu effluksiaktiivisuus annosriippuvaisesti ja indusoida apoptoosia resistenttien ihmisen myelooista leukemiaa ja rinta- syöpäsolujen [29] – [31]; Näin ollen, helpottavan DOX: n indusoiman apoptoosin ehkä tulosta kversetiini aiheuttaman P-gp: n inhibition, jonka jälkeen solunsisäisen DOX, ja näin ollen parantaa apoptoosin [32]. Kuitenkin pieniä annoksia DOX voi lisätä hieman MDR1 mRNA, mutta ei proteiinin ilmentyminen [33]. Sillä MRP1, mitään havaittavaa MRP1 mRNA DOX saaneilla SMMC7721 soluista todettiin [34]. Konfokaalinen mikroskooppisen tekniikoita, havaitsimme, että solunsisäistä jakelua DOX näissä hepatoomasolujen ei vaikuttanut kversetiini (tuloksia ei ole esitetty). Siten quercetin todennäköisesti voimistaa DOX: n indusoiman apoptoosin, mutta ei läpi kannettaan lääkkeen retentio ja ulosvirtaus. Lisätutkimuksia tarvitaan sen määrittämiseksi, onko vai ei kversetiini herkistää DOX-resistenttejä maksasyövän solut vaikuttamalla MDR liittyvien geenien ilmentymisen.

DOX-aiheuttaman apoptoosin liittyy kaksi erillistä apoptoosin väyliä: kuolema reseptorin reitin aktivoimalla kaspaasi -8 ja mitokondrioiden reitin aktivoimalla kaspaasi-9 [35]. Mitokondrioiden reitti on tärkeä mekanismi DOX: n indusoiman apoptoosin [36], jossa keskeinen Prosessissa läpäiseväksi ulomman mitokondriokalvon kanssa myöhemmin vapauttaa usean pro-apoptoottisten tekijöiden sytosoliin [37]. Sytokromi

c

, yksi pro-apoptoottisten tekijöiden, CARD adaptoriproteiini Rahastolla-1, ja pro-kaspaasi-9 koota sytosoliin muodostamiseksi apoptosome. Pro-kaspaasi-9 jälkeen autoproteolytically käsitellään ja laukaisee aktivointi efektori kaspaasien, mikä johtaa katkaisun useiden substraattien. Huomasimme, että quercetin huomattavasti DOX aiheuttama menetys mitokondrion kalvon potentiaalin, mikä osoittaa kasvun mitokondrioiden jakautuminen. Oleellisesti parannettu vapautuminen sytokromi

c

ja pilkkominen prokaspaasia 9 jälkeen tapahtui, mikä johtaa kasvuun kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja PARP hajoamista. Z-VAD-fmk esti kversetiini-parannettu, DOX: n indusoiman apoptoosin, mikä viittaa siihen, että kversetiini herkistää DOX aiheuttaman apoptoosin maksasyövän soluissa pääasiassa mitokondrioiden reitin.

Lukuisat raportit osoittivat, että p53 tuumorisuppressoriproteiinia säätelee mitokondrioita -johdetussa apoptoosin [38]. p53, kuten transkriptiotekijän, voivat stimuloida ilmentymisen pro-apoptoottisen kohdegeenien, kuten PUMA, Bax, ja Bid [39]. Lisäksi p53 voi käyttää suoraan pro-apoptoottisen funktion mitokondrioissa, siten aktivoimaan mitokondrioiden apoptoottisen reitin, joka on hiljattain tunnettu piiri p53 kuoleman signalointi [40].