Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

LGR5 (leusiinirikkaita repeat sisältävän G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori 5) on vakiintunein markkeri suoliston kantasoluja. Hiiri mallit osoittavat, että LGR5 + solut ovat soluja on peräisin suoliston syöpä, ja LGR5 ilmentyminen on kohonnut ihmisen paksusuolen syövän kuitenkin hyvin vähän tiedetään LGR5 toiminto tai sen vaikutusta kantasolujen fenotyyppi ja peräsuolen syövän.

Keskeiset havainnot

Olemme moduloitu ilmentymistä LGR5 RNAi (estävä RNA: t) tai yli-ilmentymisen kolorektaalisyövän solulinjoissa. Paradoksaalisesti ablaatio LGR5 indusoi lisääntyneen invaasio ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua, ja tehostaa tumourigenicity in ksenografteissa kokeita. Toisaalta, yliekspressio LGR5 täydentää soluadheesion, vähentää kyky muodostaa klooneja ja vaimentaa tumourigenicity. Expression profilointi paljasti parannettu Wnt signalointia ja säätelyä EMT geenien kun knockdovvn LGR5, vastakkaiset muutokset LGR5 yli-ilmentävät solut. Nämä havainnot viittaavat siihen, että LGR5 on tärkeä rajoittava kantasoluja niiden kapealla, ja että menetys LGR5 samanaikainen aktivoidulla Wnt signalointi voi myötävaikuttaa invasiivisia fenotyyppi peräsuolen karsinoomat.

Citation: Walker F, Zhang HH, Odorizzi A, Burgess AW (2011) LGR5 Onko negatiivinen säätelijä Tumourigenicity, antagonisoi Wnt merkinanto ja Säätelee Cell Adhesion kolorektaalisyövässä Cell Lines. PLoS ONE 6 (7): e22733. doi: 10,1371 /journal.pone.0022733

Editor: Pierre-Antoine Defossez, Université Paris-Diderot, Ranska

vastaanotettu: 03 helmikuu 2011; Hyväksytty: 04 heinäkuu 2011; Julkaistu: 28 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Walker et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke osittain rahoittama NHMRC Program Grant numero 487922. Rahoitustuki AO myös antamat Pezcoller Foundation, Trento, Italia. Tätä työtä tukee myös operatiivisen Infrastructure Support Program tarjoamia Victorian hallituksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

käsite syövän kantasolut (CSCS: tarkistaa [1]) johtuu heterogeenisyys eniten kiinteitä kasvaimia sekä vastustuskyky kemoterapeuttisia järjestelmiin: tämän mallin mukaisesti, käsittelyn jälkeen jäljellä oleva populaatio lääkkeille vastustuskykyisten syövän kantasolujen hengissä ja lisääntyvät nopeasti palauttaa kasvaimet ([2]). Suhteellinen resistenssi kemoterapeuttisia lääke on syynä lepotilan tai hitaasti leviämisen CSCS, joka on yhteinen piirre on normaali kantasoluja (katso esimerkiksi [3]). Tuki olemassaolo ihmisen CSCS on läsnä, sisällä kasvaimia, solujen osajoukkoja ilmentävien proteiinit yleensä vain kantasoluja ja katoavat erilaistumista; Näiden proteiinien on käytetty rikastamiseksi otaksutun CSCS eri kasvaintyypeissä, ja todistaa, että kasvainsolut rikastettu nämä merkit aiheuttaa kasvaimia tehokkaammin kuin valitsematta väestöstä [4]. Koska merkitystä CSCS että tuumorigeneesiä ja etäpesäkkeiden [5], [6], tehokkaampi kasvaimen hoitojen vaativat parempaa tietoa ominaisuuksista tämän alijoukon syöpäsoluja ja niistä tekijöistä, ulkoisten ja sisäisten, jotka edistävät niiden ”stemness” . Arvioitaessa merkitystä ja fysiologinen rooli ”kantasolu markkereita” on kantasolujen fenotyyppi lisää merkittävästi ymmärrystämme CSCS ja pitäisi tukea suunnitteluun valikoiva hoitoja.

Kun kyseessä paksusuolen syövän kantasoluja (CCSC) tällä hetkellä paras tunnettu ”kantasolu” markkereita ovat pinta-antigeenit CD133 [4], [7] CD166 [8], CD44 ja CD24 ([9], [10] (Arvostellut [11]). Solunsisäiset merkkiaineet CCSCs sisältävät Musashi-1 ([12], [13]), BMI-1 [14] ja ALDH [15] (katsaus [16]. kuitenkin kaikkein valikoiva ja lupaava merkki kantasolujen in suoliepiteeliin ja suoliston syövän kantasoluja on LGR5 [17] (UniProt Accession # O75473; UniGene # Hs.658889; kutsutaan myös GPR49). normaaleissa suoli LGR5 ilmentyminen rajoittuu kantasolujen vyöhykkeen juuressa crypt [18], ja yhden solujen ohutsuolessa ilmentävät LGR5 voi tuottaa rakenteita muistuttava suoliston kryptojen ”in vitro” [19], [20]. Mikä tärkeintä, Barker et ai. [21] ovat osoittaneet, hiirimalleissa, että suoliston kasvaimet syntyvät LGR5 positiivisia soluja, mikä viittaa siihen, että merkkien suoliston syöpä kantasolut. LGR5 on yli-ilmentynyt ihmisen peräsuolen adenoomien ja karsinoomien suhteessa normaaliin limakalvoon [22]: jolloin LGR5 yliekspressio havaitaan varhaisessa vaiheessa paksusuolen tuumorigeneesiä. LGR5 on wnt kohdegeenin [23], ja Wnt-reitti aktivoituu aikaisin etenemistä enemmistön kolorektaalisyöpien avulla typistyk- APC (adenomatoottisen polypoosin coli), ja harvemmin, mutaatiot β-kateniinin (katsaus [24 ]). On kuitenkin epäselvää, onko LGR5 säätelyyn ylöspäin peräsuolen syöpäsoluissa edistää merkittävästi tuumorigeneesiä kunnossapidon kautta peräsuolen CSC, tai on yksinkertaisesti heijastaa aktivoitua Wnt signalointia, jolla ei ole suoraa toiminnallista roolia.

tiedetään vähän LGR5 toiminto kehittämiseen ja syövän syntymistä. LGR5 on harvinaislääkkeeksi ”reseptorin kuuluvat G-proteiiniin reseptorin kytkettynä (GPCR) perhe [25]; sen ligandi ja tila solunsisäisen signaloinnin tällä hetkellä epäselvä [26]. Knockout of LGR5 hiirillä aiheuttaa neonataalikuolleisuus liittyy kallon vikoja (ankyloglossia) [27]. Perusteellinen tutkimus Garcia et ai [28] syntymää suoliston kehityksen GPR49-LacZ mutanttihiiret (LGR5 nolla) osoittaa, että menetys LGR5 ei vaikuta leviämiseen tai kulkeutumista suoliston soluista. Kuitenkin kirjoittajat on ollut voimakas induktio Paneth solujen erilaistumista LGR5 knockout alkioiden, ja sen molekyylipaino allekirjoitus ominaisuus ilmen- tymisen lisääntymisen Wnt signalointia.

LGR5 näyttää olevan markkeri CCRCs, olemme tutkineet, mitkä parametrit solukasvun ja eriyttäminen vaikuttaa modulaatio LGR5 ilmaisun kolorektaalisyövässä solulinjoissa. Koska toiminnallinen redundanssi monien signalointimolekyylien ja vahva palaute silmukoita, jotka ylläpitävät homeostaasiin, nämä tutkimukset ovat vaikea tulkita eläinmalleissa, kun taas vähäinen transfektiotehokkuudet ja rajoituksia pitkäaikaiseen viljelyyn estää näitä tutkimuksia ihmisillä primaarikasvaimen näytteitä. Kiertää nämä vaikeudet olemme käyttäneet kahta kolorektaalikarsinoomasolulinjaa linjat, LIM1215 [29] ja LIM 1899 [30] mallina järjestelmän. Tuloksemme osoittavat, että LGR5 hiljentäminen ja yli-ilmentyminen on vastakkaiset vaikutukset solun fenotyyppiin, kuten ankkurointi riippumattoman kasvun, siirtolaisuuden ja kasvainten muodostumisen hiirissä. Paradoksaalisesti tukahduttaminen LGR5 ilmaisun parantaa tuumorigeneesiä ja liittyy enemmän mesenkymaaliset fenotyyppi. Tutkimus on geeniekspressiomalleja jälkeen modulaatio LGR5 solun tasosta vuoteen siRNA Knockdown tai siirtogeenisiä yliekspressio osoittaa, että menetys LGR5 ylössäätelee Wnt muuniresponssigeeneinä ja avain EMT reitin geenit; päinvastoin, yliekspressio LGR5 suosii solu-solu-adheesion. Nämä tulokset korostavat LGR5, ei pelkästään merkkiaineen kolorektaalisyöpäkasvainsoluja, mutta säätelijänä Wnt vastausten soluliikkuvuus ja solu-soluadheesion.

Tulokset

LGR5 ilmaistaan peräsuolen solulinjoja kanssa β-kateniinin mutaatioita ja voimistuvan Wnt stimulaatiota solujen APC mutaatioita

peräsuolen kasvaimia on tunnusomaista mutaatiot Wnt koulutusjakson signalointikomponentteja [31], [32], [33], pääasiassa APC ja β-kateniinin, joka johtaa säätelemätön tai solu-autonominen vasteita Wnt. LGR5 yliekspressoituu ensisijainen Kolorektaalituumorien [34], [35]: n yliekspressio voi mahdollisesti johtua rikastuminen ”varsi-tyyppisiä soluja, jotta säätelyä Wnt-signalointireitin aktivaatio, ja /tai wnt-reittiin riippuvainen ylläpito” stemness ”. Hyödynsimme paneeli aiemmin tunnettu paksu- sinoomasolulinjoja [33] verrata LGR5 ilmentää ilmentymisen toisen otaksuttu suoliston kantasolujen markkeri, Musashi-1 (Msi-1) [36], [12], [37]. Solut, jotka ilmentävät korkeita LGR5 eivät yleensä ilmentävät korkeita tasoja MSI-1, ja päinvastoin (Fig. 1A). Mielenkiintoista on, että olemme havainneet kohonneet LGR5 mRNA vain solulinjoissa kuljettaa β-kateniinin mutaatioita (kuvio 1A). Korkeus LGR5 in β-kateniinin mutanttisoluja on silmiinpistävää, mikä viittaa siihen, että mutaatiosubstituoimalla aktivaatio β-kateniinin on vastuussa yli-ilmentymisen LGR5, kun mutaatio APC ei ole riittävä indusoimaan havaittavaa LGR5 ilmentymistä näissä solulinjoissa. Testaamiseksi Wnt riippuvuutta LGR5 ilmaisun, me stimuloi solujen L-soluissa tuotettu wnt3a, wnt5a tai kontrolli kasvatusliuos. LGR5 ja Musashi-1-mRNA-tasot testattiin rinnan qRT-PCR: llä 12 tuntia stimulaation jälkeen (kuva. 1 B). Kuten odotettua, LGR5 ekspressiotasot ovat muuttumattomana wnt3a stimulaation β-kateniinin mutantin solulinjan LIM1899 mutta valikoivasti voimistuvan wnt3a APC-mutantti solulinjat LIM 2537, LIM 2405 ja Lim1863 (Fig. 1 B, vasen paneeli). Wnt stimulaatio ei vaikuttanut ekspressiotasot MSI-1 missään testatuissa solulinjoissa (Fig. 1 B, oikea paneeli). Säätelyä LGR5 mukaan kanonisen Wnt signalointia reagoiva solulinjoissa vahvistettiin immunovärjäämällä validoidun vasta LGR5 (Fig. S1A). Näissä kokeissa maksimaalista LGR5 proteiinin havaittiin 48 tuntia stimulaation jälkeen solujen kanssa wnt3a, kun taas ei Wnt-5a tai L-solujen väliaine indusoi LGR5 ilmentymistä (Fig. S1B ja tietoja ei ole esitetty). Näin kohonneita LGR5 kolorektaalisyövässä solut ovat todennäköisesti toissijainen aktivoitu kanoninen Wnt signalointia, ja mutaatiot β-kateniinin ohitus vaatimus eksogeenisten ligandien. Olemme aiemmin osoittaneet, että LIM solulinjat, joilla on heterotsygoottinen APC mutaatiot ovat heikosti aktivoitu wnt johtuvan signaloinnin autokriinistä tuotantoa kanoninen wnts [33]: puute LGR5 yli-ilmentyminen näissä soluissa ilman eksogeenisen wnt3a viittaavat kynnysarvon vaikutus LGR5 induktion.

A) Ilmentymistasot LGR5 ja MSI-1 määritettiin qRT-PCR: llä, kuten on kuvattu menetelmät. Tulokset esitetään geeni-ilmentymisen suhteen endogeenisen ohjaus HPRT kussakin solulinjassa. Solut on ryhmitelty niiden β-kateniinin tai APC mutaatiostatuksesta riippumatta. B) Solulinjat kuljettavat β-kateniinin mutaatio (LIM 1899) tai APC mutaatioita (LIM2537, LIM2405, LIM1863) stimuloitiin 12 tunnin ajan elatusaineella (ei ärsyke), jossa kasvualusta L-soluista, jotka ilmentävät wnt 3a tai Wnt 5a, tai transfektoimattomat L-solujen väliaine (kontrolli CM). Expression of LGR5 (vasen paneeli) ja Musashi-1 (oikea paneeli) määritettiin qRT-PCR: llä, kuten on kuvattu menetelmät. Kutakin solulinjaa, palkit edustavat ekspressiotaso kannustanut suhteessa stimuloimattomiin soluihin.

modulaatio LGR5 ilmaisun vaikuttaa voimakkaasti kyky muodostaa klooneja ja tuumorigeneesiä

Jos yliekspressio LGR5 kolorektaalisyövässä soluissa välittyy hyper-aktivoitu Wnt-reitin, mikä rooli ei LGR5 olla Wnt vastausten eikä ilmaus LGR5 edistävät ylläpito ”syöpä stemness”? Vastatakseen toiminnallista merkitystä LGR5 ilmentymisen CRC solulinjoissa, vähensimme ilmaisunsa soluissa kantavat β-kateniinin mutaatio (LIM1215 ja LIM1899) käyttäen estävä RNA: ita. Alussa käytetään lentiviraalinen transduktion shRNA (lyhyt hiusneula-RNA) ja LGR5. Kuten valvonta käytimme shRNAs suunnattu satunnaisjono (non-kohde, NT) tai MSI-1. Musashi-1 ilmentyy epäkypsiä suoliston soluihin [12], [37], ja yli-ilmennetään Kolorektaalituumorien [35], mutta se ei ole wnt-vaste-geenin (Fig. 1 B). Käytimme neljä erillistä shRNA konstrukteja kunkin kohdegeenin: kaikki olivat tehokkaita, ja sen jälkeen kokeet suoritettiin käyttäen tehokkain shRNAs. Transdusoimattomia soluja bulk valittu puromysiinissä kahden viikon rikastuttaa varten shRNA ilmentävien solujen, kytketään antibioottivapaa media toiminnallinen luonnehdinta. Knockdown tehokkuutta seurattiin qRT-PCR ja solujen lisäkasvua tutkittiin käyttäen MTT määrityksiä ja pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa. Lentiviruksen toimitus shRNA on LGR5 tai Musashi-1 oli tehokas molemmissa solulinjoissa ja johtaa merkitty ja erityinen vähentäminen ilmentymisen kohdegeenien (Fig. 2 A, B, B). Ilmentymisen tasot liittyvät geenit LGR6 ja MSI-2 ei ollut vaikutusta (tuloksia ei ole esitetty). Olemme vahvisti menetys LGR5 proteiinin jälkeen pudotus käyttäen immunofluoresenssilla (Fig. S2), kuten LGR5 vasta-aineet eivät ole sopivia havaitsemiseen endogeenisten tasojen tämän proteiinin Western Blot.

A) ja B): LIM1215 (A ) ja LIM1899 (B) solut transdusoitiin lentivirus- partikkeleita, jotka sisältävät shRNA muille kuin kohde-sekvenssejä (NT), ja LGR5 (shLGR5) tai Musashi-1 (shMsi-1) ja bulk valittu puromysiiniä. Expression of LGR5 (vasen paneelit) ja Musashi-1 (oikea paneeli) arvioitiin qRT-PCR kahden viikon kuluttua transduktion. Tiedot esitetään geeni-ilmentymisen suhteen kantasolulinjoista. Nämä tulokset edustavat 5 erillisen kokeen. C): solut ilmentävät shRNAs (shLGR5, shMsi-1: n ja NT) ja vanhempien soluja kasvatettiin antibiootti-väliaineessa kolme päivää sen jälkeen testattiin niiden kyky muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa Menetelmät kuvatulla tavalla .. Tulokset esitetään pesäkkeiden muodostavat tehokkuuden testinäytteet suhteessa kontrolliin (transfektoimattomat) vanhempien soluja ja ovat keskiarvoja ja sd kolmen erillisen kokeen. D): Kuvat ovat pesäkkeiden pehmeässä-agarmaljoille värjättiin kristallivioletilla. Kuvat otettiin Nikon 90i kanssa DXM 1200C kamera.

knockdovvn joko LGR5 tai MSI-1 tasot ei vaikuttanut solujen kasvu adherentteina yksikerroksia (Fig. S3A), mutta menetys LGR5 ja Msi-1 oli silmiinpistävää ja vastakkaisia ​​vaikutuksia kyky muodostaa klooneja solujen pehmeässä agarissa (Fig. 2C). Knockdown Musashi-1 lukemiin väheneminen pesäkkeenmuodostuskyvyn Sekä LIM1215 ja LIM1899 soluja, sopusoinnussa menetys lisääntymistä ja kasvaimen muodostavien kyky peräsuolen solulinjan HCT116 jälkeen downregulation Msi-1 ilmoittama Sureban et al [ ,,,0],13]. Sen sijaan, menetys LGR5 aiheutti toistettavia ja syvällinen

lisätä

on kyky muodostaa klooneja sekä LIM1215 ja LIM1899 (Fig. 2 C, D). Nämä vaikutukset pesäkkeen muodostumista havaittu johdonmukaisesti molemmissa solulinjoissa ja käyttämällä kahta erillistä, LGR5-specific shRNA rakentaa.

valinta solujen puromysiiniä ovat saattaneet johtaa muutoksiin geenien muiden kuin LGR5, myötävaikuttaa tämän yllättävä tulos. Olemme toistaneet knockdown kokeita käyttäen ohimenevä ilmaus Cy3-leimattua siRNA (pieni hiusneula-RNA) ja LGR5. Solut transfektoitiin rakenteiden ja ekspression Cy3-leimattua siRNA seurattiin fluoresenssimikroskopialla. Transfektio tehokkuus, arvioidaan Cy3 ilmaisua käyttäen fluoresenssimikroskopiaa oli 80% vuonna LIM1899, mutta 20% vuonna LIM1215; Näin ollen seuraavissa kokeissa suoritettiin käyttäen LIM1899 soluja.

knockdovvn LGR5 siRNA oli erittäin tehokas ( 90%) ja erityisiä (Fig. 3A). Tärkeää on, shRNA ja siRNA knockdovvn LGR5 oli samanlaiset vaikutukset kyky muodostaa klooneja LIM1899, joka vahvistaa, että tämä fenotyyppi johtuu LGR5 downregulation ja ei ole artefakti valintaprosessin (Fig. 3B).

LIM1899 soluja transfektoitiin ilmentävää Cy3 (Cy3) tai Cy3-siRNA on LGR5 (Cy3 siLGR5). A) LGR5 ilmentymisen qRT-PCR transfektoimattomissa soluissa (vanhempien) ja jotka on transfektoitu Cy3 tai Cy3-siRNA on LGR5. Tontit ovat LGR5 ilmaus koenäytteiden suhteessa vanhempien (transfektoimattomat) solulinjassa. B) LIM 1899 solua maljattiin pehmeässä agarissa kahden päivän kuluttua transfektiosta 5 x 103 solua /ml ja viljeltiin 10 päivää. Colony numerot arvioitiin värjäyksen jälkeen kristallivioletilla käyttäen preparointimikroskooppia. Tontit edustavat pesäkeluvussa testinäytteiden suhteessa vanhempien soluihin. Kasvu pesäkemäärät kun vaiennettu LGR5 on erittäin merkittävä (*** = p 0,0001 jonka pariton t-testi). Sekä paneelit tiedot ovat keskiarvo ja sd kolmesta näytteestä, ja ne edustavat vähintään 3 erillisestä kokeesta.

Koska vähenemiseen LGR5 tasoilla erityisesti parantaa kyky muodostaa klooneja paksusuolen syövän solulinjat, me tutkimme, LGR5 yli-ilmentyminen vähentäisi näiden solujen kasvua pehmeässä agarissa suorittamalla sekä ohimenevä ja pysyvä yliekspressio LGR5 peräsuolen solulinjoissa. Päätimme käyttää samaa solulinjoja sekä hiljentäminen ja yliekspressio LGR5 minimoimiseksi ei-LGR5 erityisiä muutoksia solun parametrit. Vaikka tämä strategia uhkaa aliarvioi vaikutuksia LGR5 yli-ilmentymisen, se mahdollistaa suoran vertailun transfektoitujen solujen ja on helpompi tulkita ilmentymisen profilointia.

LIM1899 ja LIM1215 solut transfektoitiin pTUNE vektorilla, joka sisältää ihmisen LGR5 sekvenssi reunustaa myc ja lippu sekvenssit. Transfektion tehokkuus ja LIM1899 vaihteli näissä kokeissa välillä 30 ja 60% arvioituna immunovärjäystä solut anti-flag-vasta-aineita, kun taas transfektion tehokkuus oli välillä 10-20% ja LIM1215 solujen välillä, minkä vuoksi seuraavissa kokeissa suoritettiin LIM1899 soluissa . Yliekspressio flag-merkitty LGR5 transfektoiduissa soluissa varmistettiin qRT-PCR: llä ja immunofluoresenssilla käyttäen anti-lippu ja anti-LGR5-vasta-aineita (Fig. 4 A, B). Yli-ilmaisi LGR5 oli läsnä sekä sytosoliin ja solukalvon; jossa kerääntyminen pistemäinen rakenteissa (Fig. 4A). Tämä jakauma on samanlainen kuin jakelun endogeenisen LGR5 peräsuolen syövän solut jälkeen wnt stimulaation (Fig. S2). PTune järjestelmä on suunniteltu IPTG- indusoituvan ilmentymisen proteiineja, mutta korkeat ekspressiotasot olivat läsnä IPTG: n puuttuessa, ja vain kohtuullista kasvua induktion jälkeen (Fig. 4 B). N yli-ilmentyminen LGR5 vuonna LIM1899 aiheutti huomattavan menetyksen pesäkkeitä muodostavien kyky pehmytagarissa (Fig. 4C) proliferaatioon vaikuttamatta alle kiinnittyvä olosuhteissa (Fig. S3). Parallel transfektio Solujen Cy3-siRNA on LGR5 aiheutti odotetun kasvun pesäkemäärät samassa määrityksessä (Fig. 4C). Stabiilit solulinjat, jotka yliekspressoivat LGR5 tuotettiin valinta transfektoitujen solujen neomysiini: LGR5 ilmentymistä näissä solulinjoissa, arvioituna qRT-PCR: llä ja immunofluoresenssilla, on lisääntynyt merkittävästi (kuvio. S4 A, B), ja sen korreloi käänteisesti kyky muodostaa klooneja pehmytagarissa (Fig. S4 C, D). Näin LGR5 modulaatio on johdonmukainen ja erityisiä vaikutuksia kyky muodostaa klooneja paksusuolen syövän solulinjat.

LIM1899 solut transfektoitiin pTune vektorilla, joka sisältää ihmisen LGR5 reunustaa lippu sekvenssin ja analysoitiin 3 päivää transfektion jälkeen. A) Konfokaalimikroskopia: LIM 1899 transfektoitujen solujen pTune /LGR5 oli yhteistyössä värjättiin anti-flag (M2) -vasta-ainetta ja sen jälkeen Alexa488 anti-hiiri-lg (vihreä), anti-LGR5 vasta-aineen HPA012530 seuraa Alexa 546 anti-kani-Ig ( punainen) ja ydinvoiman tahra DAPI. Näkyy on yhdistetyn kuvan (kaikki kanavat) ja harmaasävy kuvia vihreä ja punainen kanavia, vastaavasti. Konfokaalimikroskopia suoritettiin, kuten on kuvattu menetelmät. B) qRT-PCR: transfektoimattomat solut (vanhempien) ja transfektoitujen solujen LGR5 ekspressiovektorin viljeltiin kolmen päivän ajan tai ilman IPTG: tä (100 uM). RNA ja qRT-PCR suoritettiin, kuten on kuvattu menetelmät. Käyrä osoittaa ilmentymisen tasoon LGR5 transfektoiduissa suhteessa vanhempien soluihin. Tiedot ovat keskiarvo +/- SD kolmesta näytteestä, ja edustavat 3 erillisestä kokeesta. C) klonogeeninen määritys: transfektoimattomia soluja ja soluja, jotka on transfektoitu pTune /LGR5 tai Cy3-siRNA on LGR5 ympättiin soft-agarmaljoille 5 x 103 solua /levy, kuten on kuvattu menetelmät. IPTG: tä (100 uM). lisättiin kolminkertaisiin levyt vanhempien ja LGR5 ilmentäviä soluja vain. Levyjä inkuboitiin 10 päivää sen jälkeen värjättiin kristallivioletilla ja pesäkkeiden leikemikroskoopil-. Kuvaaja osoittaa keinot ja keskihajonta kolmen erillisen kokeen, kukin normalisoitu yhdyskunnan numerot vanhempien soluja. Ero vanhempien ja transfektoituja soluja on erittäin signficant (** = p 0,005 ja *** = p 0,001 kahden viljelyolosuhteet).

kyky muodostaa klooneja puolikiinteässä media kasvainsolujen usein korreloi niiden kyky muodostaa kasvaimia immuunipuutteisilla hiirillä. Käytimme ksenograftimallia testata, onko moduloinnin LGR5 vaikuttaa tumourigenicity on LIM1899 soluja. LIM1215 ei testattu tässä järjestelmässä, koska se on sekä huonosti kasvaimia kuin ksenografti ja transfects hyvin alhainen tehokkuus. LIM1899 soluja laajennettiin ja transfektoitiin massana Cy3-siRNA on LGR5 tai pTune-LGR5. Transfektoidut ja vanhempien solut laajennettiin kaksi päivää, sitten talteen rinnakkaiseen määrittämiseksi LGR5 ilmentymisen qRT-PCR, kyky muodostaa klooneja ”in vitro” ja kasvaimen muodostavien kapasiteetti ”in vivo” (Fig. 5). Osuus transfektoitujen solujen, seurattiin fluoresenssimikroskopialla ja Cy3siRNA ilmaisun ja immunovärjäys anti-flag-vasta-ainetta LGR5 yli-ilmentymisen, olivat 80% ja 60%, vastaavasti. Soluja käytettiin ksenografteissa oli odotettu väheneminen tai lisääntyminen LGR5mRNA (Fig. 5B): tukahduttaminen LGR5 ilmaisun kesti jopa kaksi viikkoa soluissa käsitelty siRNA, kun taas yli-ilmentyminen LGR5 palautui perustasoon 14 päivää (kuvio. 5C). Kyky muodostaa klooneja käytettyjen solujen ksenografteissa oli kääntäen verrannollinen tason ilmentymisen LGR5 (Fig. 5D). Solut, jotka ilmentävät siRNA on LGR5 osoitti tehostetun kasvaimen muodostumisen; päinvastoin, solut yli-ilmentävät LGR5 olivat vähemmän tuumorigeeninen (Fig. 5A, B). Ero kasvaimen koon välillä LGR5 pudotus ja vanhempien solut oli erittäin merkitsevä (p 0,0001) kaikkina ajankohtina, mutta kasvainten kasvua yli-ilmentävät LGR5 poikkesivat merkittävästi vanhempien soluista vain ensimmäisen 10 päivän ksenograftien kokeessa (kuvio . 5A). Ero vakautta ilmaus siRNA on LGR5 vs. LGR5 konstruktin (Fig. 5C) on sopusoinnussa pitkän aikavälin vaikutuksia LGR5 downregulation ja enemmän ohimeneviä vaikutuksia LGR5 kiihdytyssäätely on ksenografteista. Havaitsimme erittäin hyvä korrelaatio (R = 0,996) välillä kyky muodostaa klooneja pehmeässä agarissa ja tumourigenicity (Fig. 5D), joissa vahvistetaan entisen korvikkeena määritys.

LIM1899 solut valetransfektoidut (no vektori), transfektoitu Cy3LGR5 tai pTune /LGR5. Soluja laajennettiin kaksi kahdentumista (48 tuntia) transfektion jälkeen, sitten kerätään inokulaatiossa nude-hiirissä, määrittämiseksi kasvua pehmeässä agarissa ja mittaus LGR5 ilmentymisen qRT-PCR: llä, kuten on kuvattu menetelmät. A) Vasen paneeli: ksenografteissa kasvaimen kasvukäyrät, oikea paneeli: kasvain massa day18. Kasvu ihonalainen kasvainten mitattiin kolme kertaa viikossa käyttäen satulat, ja tilavuus määritetään kaavalla V = 1/2 (pituus x leveys

2). Lopussa kokeen (päivä 18) kasvaimet leikeltiin ja punnittiin. Tiedot ovat keskiarvoja ja keskivirheet kussakin ryhmässä (16 kasvaimet /ryhmä). Ei ollut tilastollista eroa vanhempien ja pTune Lgr5 syöpäkasvaimen, mutta ero vanhempien ja siLGR5 kasvaimia on merkittävä (*** = p 0,001). B) Näyte käytettäviä soluja ksenografti injektiota testattiin qRT-PCR: LGR5 ilmaisua. Tiedot analysoitiin ABI 7300 (ΔΔCt tutkimus), ja esitetään LGR5 ilmaisun suhteessa vanhempien soluihin. Tiedot esitetään keinot ja keskivirheet. C) Aika aikana ilmentymistä viljellyissä LIM 1899 ilmentyminen LGR5 transfektoiduissa soluissa siLGR5 tai pTune LGR5 seurasi yli kahden viikon ajan, jonka qRT-PCR: llä. Tasot LGR5 ilmaisun esitetään suhteessa vektorisäätö kullekin ajankohtina. D) näyte soluja käytettiin ksenografti kokeessa viljeltiin pehmeässä-agarmaljoille 5 x 10

3 solua /malja määrittää kloonaus tehokkuutta. Levyjä inkuboitiin 10 päivää, sitten värjättiin kristallivioletilla ja pesäkkeiden lukumäärä määritetään valomikroskoopilla. *** = P 0,001. E) välinen korrelaatio kasvaimen massan (käyrä A) ja kloonaustehokkuuteen (kaavio D).

Analysoimme ihonalainen kasvaimista LGR5 ilmaisua käyttäen immunofluoresenssilla. Edustavat kuvat kasvainten värjättiin heamatoxilin ja eosiinilla (A), tai yhdessä värjätään LGR5 ja β-kateniinin (im- kuvat) on esitetty kuvassa. 6. morfologisesti, kaikki kasvaimet koostui hyvin määritelty rauhaset, ja voitiin luokitella kohtuullisesti erilaistunut adenokarsinoomia (Fig. 6A). Kasvaimet johdettu siLGR5 LIM1899 taipumus olla enemmän epäjärjestyksessä morfologia, heijastuu pieni mutta merkittävä ero määrän hyvin muodostuneita rauhaset per kenttä emo kasvainten (26 +/- 3 n = 16) ja siLGR5 kasvaimet (15 + /-2 n = 16; p = 0,0014). Määrä rauhaset per alalla on lisääntynyt kasvaimet yli-ilmentävät LGR5 (31 +/- 2, n = 16) kuitenkin eroa vanhempien kasvaimia ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Kaikissa kasvainnäytteestä LGR5 värjäytyminen oli merkittävintä rauhaset, etenkin kohti rauhanen onteloon, ja oli heikompi enemmän amorfinen alueilla kasvain (Fig. 6B). Värjäys LGR5 oli spesifinen, koska mitään signaalia ei havaittu näytteissä inkuboitu normaalia kanin seerumia (Fig. 6C). LGR5 immunoreaktiivisuus marginaalisesti koholla kasvaimia, jotka ovat peräisin LIM1899 transfektoitujen solujen pTune LGR5, mutta ei kaikilla alueilla kasvaimia. LGR5 värjäys väheni, mutta ei kokonaan poissa, kasvaimissa peräisin LIM1899 transfektoitujen solujen siLGR5. Näiden näytteiden, LGR5 ilmaisu ilmestyi rajoittuvat rauhasrakenteet (Fig. 6B).

A) Haematoxilin ja eosiinivärjäykset Jääleikkeiden edustavien kasvaimista syntyvät vanhempien LIM1899, LIM1899 transfektoitu siRNA on LGR5 tai LIM1899 transfektoitujen jossa pTune-LGR5 rakentaa. Brightfield kuvat hankittiin Nikon 90i mikroskooppi 20 x objektiivia. B) Konfokaalinen kuvia Jääleikkeiden värjättiin vasta-aineiden kanssa p-kateniini (punainen), LGR5 (vihreä) tai DNA tahra DAPI (sininen). Kaikki kuvat ovat Z-kasana konfokaali kohdat. Kunkin asetettu, ylempi paneeli esittää kolme yhdistettyä tahroja, keskimmäinen paneeli LGR5 (harmaasävy), ja pohjalevy β-kateniinin (harmaasävyt). Kuvat saatiin Nikon C1 -konfokaalimikroskoopilla kanssa 60 × öljyä linssi. C) Spesifisyys ohjaus LGR5 värjäys: jäädytetyt leikkeet värjättiin vasta-p-kateniinin ja normaali kanin seerumi, jonka jälkeen Alexa 488 anti-kani-Ig (vihreä) ja Alexa 546 anti-hiiri-lg (punainen) ja tumaväriä DAPI ( sininen). Vihreä kanava (NRS) ja punaisen kanavan (β-kateniinin) esitetään erikseen harmaasävyissä. Kuvat saatiin B).

Cell-soluadheesiota ja siirtolaisuuden säätelee LGR5 tasot

LGR5 tasolla erittäin merkittäviä vaikutuksia ankkurointia riippumaton leviämisen paksusuolisyövän solujen sisään vitro ”ja” in vivo ”; mutta miten LGR5 moduloi ankkurista riippumaton kasvu on epäselvä. Havaitsimme, että LIM1899 solut yli-ilmentävät LGR5 taipumus kasvaa ”pesäkkeitä” tiukat solu-solu yhteydet, kun taas LIM1215 ja LIM1899 solujen vähentää LGR5 ovat hajanaisia ​​muovisen pinnan (ei esitetty). Vastakkainen fenotyypit jälkeen havaittu knockdown tai yliekspressio LGR5, ja niiden johdonmukaisuutta häiriö- ja stabiilin ekspression järjestelmät, osoittavat, että tämä ilmiö korreloi suoraan LGR5 tasolle. Näin LGR5 voivat moduloida tasapaino solu-solu- ja solu-substraatti-adheesio. Luonnehtia soluväliaineen ja solu-solu-vuorovaikutuksia me viljellään soluja, kuten rakeita roikkuu tippaa [38] ja suoritettiin sekä haavan määritykset ja liikkuvuus määrityksissä mittaamaan muuttopotentiaalia solujen. Roikkuu tippaa määritykset mittaavat proliferaatiopotentiaali solujen puuttuessa solu-matriisin vuorovaikutuksia; haava määrityksiä arvioida nopeuden liikkeen yksisolukerros ja liikkuvuuden määritys mittaa nopeutta kulkeutumista solujen läpi ECM suodattimen huokosiin.

Lapsen LIM1899 soluja, tai LIM1899 solut transfektoitu tyhjällä vektoreilla, kasvaa riippuvasta tippa kiviaineksina tiheällä keskusten (Fig. 7A). Samanaikaisesti kulttuureissa, sferoidit solujen määrän väheneminen LGR5 (siLGR5) ympäröi halo löyhästi liittyvien solujen ja helposti häiriöitä, kun taas solut, jotka ekspressoivat korkeita tasoja LGR5 (M2LGR5), joko ohimenevästi tai stabiilisti, pakata tiiviiksi pallosia kestävä mekaaninen hajotus (Fig. 7A ja tietoja ei ole esitetty). Ero solutiheyden heijastuu volyymin pallojen suhteessa niiden cellularity: kun pallosia Eri solulinjat sisältävät samanlaisia ​​määrä soluja (Fig. 7A, oikeanpuoleinen kaavio), ero välinen tilavuus siLGR5 palloset ja pallosia yliekspressoivat LGR5 (Fig. 7A, vasen käsi kaavio) on merkittävä (p = 0,001), mikä heijastaa tiukempi pakkaus solujen M2LGR5.

Lim1899 solut transfektoitiin vektorilla valvontaa (Cy3V ja pTuneV), jossa Cy3- siLGR5 tai jossa pTune /LGR5. Vanhempien, lyhytaikaisesti transfektoidut solut (Tr) tai stabiilisti transfektoituja solulinjoja (St) viljeltiin seuraavissa olosuhteissa: A) Solut siirrostettiin 30 ui pisaroita muovipinta, ja levy ylösalaisin luoda roikkuu tippaa Menetelmät kuvatulla tavalla. Kuvat otettiin 8 päivän kuluttua uudelleen kääntämällä muovi tukea ja kuvantamisen kirkkaan kentän Nikon 90i mikroskoopilla ja 10 x linssin. Digitaaliset kuvat hankittiin kanssa Photometrics CoolSnap digitaalikamera. Sferoidiviljelmiä volyymit (vasen kuvaaja) laskettiin näistä kuvista käyttämällä modifioitua ellipsoidin kaavalla. Sferoidiviljelmiä koot vaihteli merkitsevästi siLGR5 tai M2LGR5 transfektoitujen solujen ja heidän kollegansa transfektoitu tyhjällä vektorilla (p = 0,0312 ja p = 0,321, vastaavasti, jonka pariton t-testi). Cellularity of pallojen (oikeanpuoleinen kaavio) arvioitiin Menetelmät kuvatulla tavalla. Molemmissa kuvaajat Tulokset edustavat keskiarvoa ja keskihajonta 10 yksittäisten pallosia per solulinja. B) Vanhempien soluja ja soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu pTune /LGR5 (kloonit 6-1) maljattiin korkean tiheyden 24-kuoppaisilla levyillä. Haavat naarmuuntua kiinnittynyt monolyers ja kuopat kuvattiin kahden päivän välein, jossa Nikon90i mikroskoopilla käyttäen 10 x objektiivi (ylempi paneeli). Mikrovalokuva alemman oikealla näkyy suurempi suurennos LGR5 6-1 haavan päivänä 6 (20 x objektiivi). Aseta: Valuuttakurssi haavan yli 96 tunnin.