Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Viimeaikaiset julkaisut viittaavat siihen, että neoplastisia aloittaminen ja kasvu ovat riippuvaisia ​​pieni joukko soluja, kutsutaan syövän kantasolut (CSCS). Anaplastic kilpirauhaskarsinoomaa (ATC) on hyvin aggressiivinen kiinteä kasvain huonon ennusteen, jolle on ominaista korkea erilaistamattomuuden. Olemassaolo CSCS voisi selittää heterogeenisyys ATC vaurioita. CD133 on tunnistettu kantasoluja merkkiaine normaali ja syöpäkudokset, vaikka sen biologinen toiminta on tuntematon.

Menetelmät /Principal Havainnot

ATC solulinjoissa ARO, KAT-4, KAT-18 edestakaisin analysoitiin CD133 ilme. Virtaussytometria osoitti CD133

pos soluja vain ARO ja KAT-4 (64 ± 9% ja 57 ± 12%, tässä järjestyksessä). Nämä tiedot vahvistettiin qRT-PCR: llä ja immunosytokemia. ARO ja KAT-4 olivat positiivisia myös sikiömarkkerin onkofetaalinen fibronektiiniä ja negatiivisia thyrocyte erityisiä erottavat markkereita tyreoglobuliinin, thyroperoxidase ja natrium /jodidi symporter. Lajitellut ARO /CD133

pos soluja oli korkeampi lisääntymistä, itseuudistumisen, pesäkkeitä muodostavat kyky verrattuna ARO /CD133

neg. Lisäksi ARO /CD133

pos osoitti kilpirauhashormonitasojen transkriptiotekijän TTF-1 samankaltainen kuin sikiön kilpirauhasen solulinjan TAD-2, kun taas ilmaisun ARO /CD133

neg oli vähäinen. Ilmaisu kantasolujen markkeri lokakuu-4 havaitsee RT-PCR ja virtaussytometria oli huomattavasti korkeampi ARO /CD133

pos verrattuna ARO /CD133

neg soluja. Kantasolujen merkkiaineita c-KIT ja THY-1 olivat negatiivisia. Herkkyys solunsalpaajiin tutkittiin, osoittaa merkittävää vastustuskykyä kemoterapian aiheuttaman apoptoosin ARO /CD133

pos verrattuna ARO /CD133

neg soluja.

Johtopäätökset /merkitys

kuvaamme CD133

pos solujen ATC solulinjoissa. ARO /CD133

pos soluilla kantasolujen kaltaisia ​​piirteitä – kuten korkean leviämisen, itseuudistumisen kyky, ilmentyminen MMA-4 – ja on ominaista korkeampi vastus kemoterapiaa. Samanaikainen positiivisuus kilpirauhasen kerroin TTF-1 ja onfFN ehdottaa he edustavat otaksuttu kilpirauhassyöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja. Meidän

in vitro

havainnoista saattaisi tarjota uusia näkökulmia uusia terapeuttisia lähestymistapoja.

Citation: Zito G, Richiusa P, Bommarito A, Carissimi E, Russo L, Coppola A, et al. (2008)

In vitro

tunnistaminen ja karakterisointi CD133

pos Cancer Stem-Like Solut Anaplastic Kilpirauhasen sinoomasolulinjoja. PLoS ONE 3 (10): e3544. doi: 10,1371 /journal.pone.0003544

Toimittaja: Karen S. Aboody, City of Hope Medical Center ja Beckman tutkimuslaitos, Yhdysvallat

vastaanotettu 7 huhtikuuta, 2008; Hyväksytty: 06 lokakuu 2008; Julkaistu: 28 lokakuu 2008

Copyright: © 2008 Zito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ osittain tuettu avustuksia Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (MIUR) 60% (CG) B

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Anaplastic kilpirauhaskarsinoomaa (ATC) on yksi aggressiivinen endokriiniset kasvaimet kanssa morfologisia ominaisuuksia eriytymättömän kasvaimen. Potilaat, joilla ATC on huono ennuste, jonka keskimääräinen eloonjäämisaika 2-6 kuukautta. Kirurgia, sädehoito ja kemoterapia eivät parane eloonjäämisaste [1].

Äskettäin aikuisten kantasoluja tunnistettu ihmisen kilpirauhasen [2]. Nämä solut ilmentävät useita markkereita, kuten tumatranskriptiotekijä MMA: iden ja 4 (jotka tunnetaan myös okt-3, OCT-3/4) ja endodermaalinen markkereita GATA-4 ja HNF4α [2] – [4].

välinen yhteys kantasoluja ja syöpäsolujen on ehdotettu eri kudoksissa, joissa syöpäsolut on tarkoitus saada vihreitä esiasteita tai kantasoluja [5]. Syövän kantasoluja (CSCS) on löydetty leukemia [6], glioblastoma [7], rintojen [8], eturauhassyöpä [9], mahan [10], keuhkosyöpä [11], ja paksusuolen [12] syöpä. Nämä solut, jotka edustavat vain pientä väestön sisällä suurin osa kasvain, hallussaan samanaikaisesti mahdollistetaan itsenäinen uudistaa ja erilaistua muihin cytotypes [13]. Varsi kaltainen fenotyyppi on osoittautunut kykenevät vastustamaan hoitomuotojen, mikä johtaa sairauden uusiutumisen vaikka ensisijainen vaurio on hävitetty [14], [15]. Tähän mennessä ei kuitenkaan tutkimukset ovat varmasti osoittaneet, että kantasolut ovat vastuussa kilpirauhasen syövän synnyn. Kuitenkin harvinaisuus ja nopean kasvun mallia ATC muistuttaa luonteesta kantasoluja. Vain yksi tutkimus on kuvattu hyvin pieni väestö, kutsutaan puoli väestöstä, rikastettiin kantasolujen joukossa kilpirauhassyöpä solulinjoissa [16]. Lisäksi, hypoteesi sikiön karsinogeneesin, jossa syöpäsolut ovat peräisin jäänteitä sikiön kilpirauhasen solujen sijasta aikuisen thyrocytes, on ehdotettu [17].

useita merkkiaineita on tunnistettu luonnehdinta CSCS. Ihmisen CD133, erittäin konservoitunut antigeenin homologin hiiren Prominin-1, alun perin tunnistettiin alapopulaatio CD34

+ hematopoieettisten solujen, jotka ovat peräisin ihmisen sikiön maksan ja luuytimen [18] – [19]. CD133 on käytetty tunnistamisen ja eristämisen oletetun CSC väestön useissa ihmisen syövissä [20], [21]. Lisäksi ilmaus CD133

pos CSCS maksasolukarsinoomassa (HCC) on osoitettu antaa chemoresistance

in vitro

[14]. Kuitenkin sen biologinen toiminta on tuntematon. Transkriptiotekijä lokakuu-4 pidetään tärkein säätelijä ihmisalkion kantasolujen pluripotenttisuus ja itseuudistumisen valmiuksia [22]. Mielenkiintoista, nämä kantasolujen ominaisuuksia johtuvan lokakuu-4A, silmukointivarianttia MMA-4-geenin tumassa [23], [24].

tavoitteena läsnä oli tutkia ilmaisu oletettujen kantasolujen markkereista perustettu ihmisen ATC solulinjat, kuten ARO, KAT-4, KAT-18 ja FRO. Havaitsimme CD133

pos solujen ARO ja KAT-4 solulinjoissa. Tämä alaryhmä leimasi korkeammat

in vitro

leviämisen, itseuudistumiseen ja pesäkkeenmuodostuskyvyn. ARO /CD133

pos olivat vastustuskykyisempiä kuin ARO /CD133

neg solujen kemoterapian indusoiman apoptoosin. Lisäksi ARO /CD133

pos solut ilmaisivat thyroblast erityinen transkriptiotekijä TTF-1 ja kantasolujen markkeri lokakuu-4, kun taas ne olivat negatiivisia kantasolujen merkkiaineita c-Kit ja THY-1.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen ATC solulinjat ARO, KAT-4, KAT-18 ja FRO oli ystävällisesti toimittanut Prof. A. Fusco, University of Napoli , Italia. Aikana kasvuvaiheessa ja itseuudistumisen määrityksessä soluja viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS). Kaikkien muiden kokeissa soluja viljeltiin RPMI1640 seerumivapaassa väliaineessa (SFM), johon oli lisätty emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF, 20 ng /ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja epidermaalisen kasvutekijän (EGF, 20 ng /ml; Sigma-Aldrich) [25].

virtaussytometria

ilmentymisen kantasolujen merkkiaineita CD133, OCT-4, c-Kit ja THY-1 arvioitiin virtaussytometrillä taussytometria (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Sillä CD133 analyysiä varten solut käsiteltiin ensin FcR salpausreagenssissa (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa) ja inkuboitiin sitten pimeässä 4 ° C: ssa 10 minuuttia fykoerytriiniin (PE) -konjugoitu hiiren IgG2b anti-ihmis CD133 /2 (klooni 293C3, Miltenyi Biotec). For co-värjäystä c-Kit ja THY-1, jälkeen soluja inkuboitiin hiiren monoklonaalinen IgG1 anti-ihmis-c-KIT ja hiiren IgG1 anti-ihmis-THY-1-vasta-aineita (Chemicon International, Temecula, CA, USA) 4 ° C 30 minuutin ajan. Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin sitten fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoidulla polyklonaalisella vuohen anti-hiiri 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sillä värjäämällä lokakuu-4, solut kiinnitettiin ja läpäiseviksi Cytofix-Cytoperm Kit (BD Pharmingen, San Diego, Ca, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Sitten soluja inkuboitiin monoklonaalisten hiiren IgG2b anti-ihmis-MMA: iden ja 3/4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan, pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin fykoerytriini (PE) -konjugoitu polyklonaalinen vuohen anti-hiiri-4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Ensisijainen vasta-aine tunnistaa MMA-4A isoformi proteiinin (aa 1-134).

Apoptoosi arvioitiin kaspaasi 3 määrityksessä. Solut ensimmäisen kiinteän ja läpäiseviksi Cytofix-Cytoperm Kit (BD Pharmingen, San Diego, Ca, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Sitten soluja inkuboitiin monoklonaalisten IgG kanin anti-aktiivinen kaspaasi 3 (BD ​​Pharmingen) huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin sitten fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoidulla polyklonaalisella vuohen anti-kani-IgG: tä (Santa Cruz Biotechnology) huoneenlämmössä 20 minuuttia.

Data analysoitiin CellQuest Pro -ohjelmistoa (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Gating toteutettiin perustuen negatiivinen kontrolli värjäys profiileja.

Immunosytokemia

ARO ja KAT-4 solulinjoja levytettiin kammiossa diat (Lab-Tek, Nunc, Inc. Naperville, USA), sallittu kiinnittyä 48 tunnin ajan ja käytettiin sitten immunosytokemian. Solut kiinnitettiin 3% H

2O

2 metanolissa 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, pestiin sitten kahdesti PBS: ssä, blokattiin 3% BSA: ta ja tehtiin läpäiseviksi PBS, joka sisälsi 0,1% Triton X-100: ssa 10 minuutin ajan huonelämpötila. Soluja inkuboitiin hiiren anti-ihmis-CD133 (lgG1, klooni AC133, Miltenyi Biotec) estopuskurissa 1 tunti huoneenlämpötilassa, sitten huuhdottiin PBS: llä. Expression havaittiin käyttäen toissijainen biotinyloitua vasta-aineita ja streptavidiini /piparjuuriperoksidaasi. Kromogeenin 3-amino-9-etyylikarbatsolia (AEC) on käytetty ja objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä.

lajittelu ARO /CD133

pos solujen

ARO solut trypsinoitiin ja leimattiin ensisijainen CD133-Biotin ja biotiini-mikrohelmiä (epäsuora CD133 solujen eristäminen Kit, Miltenyi Biotec) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen, kun magneettinen lajittelu, solujen puhtaus arvioitiin virtaussytometrialla käyttämällä fykoerytriini (PE) konjugoidulla anti-ihmis-CD133 /2 (klooni 293C3, Miltenyi Biotec).

eristäminen kokonais-RNA, RT-PCR ja qRT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin ja puhdistettiin viljellyistä KAT-4, KAT-18, FRO ja ARO (lajittelematon, lajiteltu CD133

neg ja CD133

pos) solulinjoja käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Milano, Italia), joka sisältää digestiovaiheen DNaasi I asetettu. RNA määrän ja laadun arvioitiin UV-spektrofotometrillä. 2 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio tilavuudessa 20 ui oligo-dT-alukkeita (Applied Biosystems, Darmstad, Saksa) ja Stratascript RT (Stratagene, Amsterdam, Hollanti), mukaisesti valmistajan protokollaa. Tyroglobuliinin (Tg), thyroperoxidase (TPO), natrium /jodidia symporter (NIS), onkofetaalinen fibronektiini (onfFN) sekä MMA-4-ekspressio analysoitiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) [26] – [27]. 1 ui komplementaarinen DNA: ta lisättiin 50 ui reaktioseosta, joka sisälsi 5 ui 10 x reaktiopuskuria, 50 mmol /L MgCl

2, 1 ui dNTP: itä, 50 pmol sense- ja antisense-alukkeita ja 0,5 U Taq Gold DNA-polymeraasia. Reaktiot suoritettiin 95 ° C: ssa 10 minuuttia; 35 sykliä 95 ° C 45 sekuntia, 55 ° C: ssa 45 sekunnin ajan (spesifinen aluke) ja 72 ° C: ssa 45 sekunnin ajan, minkä jälkeen tehdään pidennys 72 ° C: ssa 7 minuuttia ja päättäminen 4 ° C: ssa. Alukeparia sekvenssit, cDNA-fragmentti, koot ja hehkutus lämpötilat olivat seuraavat: Tg (762 bp): 5′-CTTCGAGTACCAGGTTGATGCC-3 ’ja 5′-GGTGGTTTCAGTGAAGGTGGAA-3′ (55 ° C), TPO (593 bp): 5’- TGTGTCCAACGTGTTCTCCACAG-3 ’ja 5′-AAGACGTGGCTGTTCTCCCAC-3′ (55 ° C), NIS (179 bp): 5’-CTATGGCCTCAAGTTCCTCT-3 ’ja 5′-TCGTGGCTACAATGTACTGC-3′ (57 ° C), onfFN (215 bp) : 5’-TCTTCATGGACCAGAGATCT-3 ’ja 5′-TATGGTCTTGGCTATGCCT-3′ (55 ° C), OCT-4 (456 bp): 5’-AGCCCTCATTTCACCAGGCC-3 ’ja 5′-TGGGACTCCTCCGGGTTTTG-3′ (63 ° C) , β-aktiini (439 bp): 5’-GATGACCCAGATGACCCAGATCATGTTTG-3 ’ja 5′-AGGCTGGAAGAGTGCCTCA-3′ (55 ° C). MMA-4 analyysi, nTERA2 cDNA (positiivinen kontrolli) luovutti ystävällisesti Dr. S. Liedtke, Düsseldorfin yliopisto, Saksa. Sillä onfFN ja TTF-1, TAD-2 cDNA: ta käytettiin positiivisena kontrollina. CD133 ja TTF-1 ilmentyminen analysoitiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR (qRT-PCR) yksittäisissä näytteissä. Yhteensä 2 ug käytettiin mittaamaan mRNA-tasot suhteessa p-aktiinin mRNA ilmaisun. PCR-alukkeet ja koettimet (ostettu Qiageniltä Quantitect Primer Prominin1 ja TTF1). Kaikki reaktiot suoritettiin lopputilavuudessa 20 ui, 2 ui cDNA-templaattia käyttäen LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Saksa). Data-analyysi suoritettiin Qbase selain, jossa käytetään Δ-Ct suhteellisen kvantifioinnin malli PCR tehokkuutta korjauksen ja yhden viite-geenin normalisointi (β-aktiini: 5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3 ’, ja 5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’) [28] .

In vitro

kulttuurin ja solulisääntymisanalyysin ARO /CD133

pos solujen

eristyksen jälkeen ARO /CD133

pos ja ARO /CD133

neg soluja viljeltiin heti SFM täydennetty bFGF ja EGF ilmapiirissä 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Solulisääntyminen arvioitiin kolorimetrisellä määrityksellä käyttäen 3- (4,5 -Dimethylthiazol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) ja BrdU (kolorimetrinen) kit (Roche Diagnostics GmbH, Saksa). MTT-määritys, lajitellaan ARO /CD133

pos ja ARO /CD133

neg solua maljattiin 96-kuoppalevylle 100 ul SFM /syvennys ja viljeltiin 72 tuntia. Soluja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa MTT; inkubaation jälkeen, väliaine poistettiin ja soluja käsiteltiin DMSO: ssa 5 minuuttia. Elinkelpoisuus arvioitiin UV- absorptiospektri 550 nm Microplate Reader Model 550 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

BrdU määritystä, lajitellaan ARO /CD133

pos ja ARO /CD133

neg maljattiin 96-kuoppalevylle 100 ul SFM /syvennys ja viljeltiin jopa 144 tuntia. Elinkelpoisuus arvioitiin UV- absorptiospektri 450 nm: ssä Microplate Reader Model 550 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

itseuudistumisen määritys ARO /CD133

pos solujen

Lajiteltu ARO /CD133

pos-soluja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää. CD133: n ekspressio havaittiin virtaussytometrialla päivinä 0, 4, 8 ja 11. Samalla pistettä apoptoosia määritettiin anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, San Diego, Ca, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Pesäkkeenmuodostusta määritys ARO /CD133

pos solujen

Lajittele ARO /CD133

pos ja ARO /CD133

neg soluja viljeltiin 6-kuoppalevyillä metyyliselluloosa SFM (HSC-CFU emäksinen väliaine, Miltenyi Biotec). Levyjä pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 2 viikkoa. Pesäkkeiden määrä arvioitiin mikroskooppisen laskenta.

solunsalpaajiin

ARO /CD133

pos ja CD133

neg soluja viljeltiin SFM täydennetty bFGF (20 ng /ml ) ja EGF: ää (20 ng /ml) kanssa tai ilman sisplatiinia (5, 10, 15 ja 20 uM, Pharma, Itävalta), doksorubisiini (0,5, 1, 1,5, ja 2 uM, Ebewe Pharma, Itävalta), etoposidi (10, 30 , 100 uM; Teva Pharma, Hollanti). Prosenttiosuus elinkelpoisten ARO /CD133

pos ja CD133

neg soluja arvioitiin 24, 48 ja 72 tunnin MTT: llä ja 48, 96 ja 120 tuntia BrdU määrityksessä.

apoptoosin arviointi, ARO /CD133

pos ja CD133

neg soluja viljeltiin 6-kuoppalevyille ja käsitelty korkein pitoisuus kunkin lääkkeen (20 uM sisplatiini, 2 uM doksorubisiinin ja 100gM etoposidin) jopa 120 tuntia. Apoptosis arviointi (kaspaasi 3 määritys) arvioitiin virtaus citometry edellä kuvatulla tavalla.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS v. 11 Windowsille. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Tilastolliset vertailut perustuivat nonparametric testejä ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin p 0,05. Sillä kokeiluja chemoterapics, erot elinkelpoisuus ATC solulinjojen laskettiin Mann-Whitney testi; p suuntaus eri lääkeainepitoisuudet laskettiin W Kendallin testin.

Tulokset

tunnistaminen CD133

pos solujen ATC solulinjoissa

Jotta tunnistaa CSCS ATC solulinjoissa, olemme analysoineet ilmentymisen CD133 virtaussytometrialla ARO, KAT-4, KAT-18 ja FRO (kuvio 1A). ARO ja KAT-4 osoitti keskimääräinen positiivisuus 64 ± 9% ja 57 ± 12%, tässä järjestyksessä; KAT-18 edestakaisin olivat negatiivisia. Tulokset varmistettiin qRT-PCR (Kuva. 1 B). CD133

pos solujen ARO solulinjat tunnusomaista sytoplasmista ja polarisoitunut lokalisointi antigeenin apikaalisella pinnalla solujen (Fig. 1 C). Erilaistumattomat tilan ATC solulinjojen varmistettiin PCR: ssä, kun läsnä on onfFN [26] ja se, ettei thyrocyte-spesifisten erottaa markkereita Tg, TPO ja NIS [27] (Fig. 2A ja B).

(A) Virtaussytometrianalyysi of CD133 ARO, KAT-4, KAT-18, ja FRO solulinjat. Mustat viivat edustavat positiivista värjäytymistä CD133, harmaat viivat osoittavat negatiivinen kontrolli Hyväksytty isotyypin vasta-aineella. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (B) analyysi CD133 ilmentyminen ATC solulinjoissa qRT-PCR. Tiedot edustettuina kertainen muutos (suhteellinen asteikko), ottaen huomioon KAT-18 = 1. (C) Immunosytokemia of CD133 ARO solulinjassa. Nuolet osoittavat apikaalisella ja polarisoitunut lokalisointi CD133 (20-kertainen suurennus).

Expression kilpirauhasen erityisiä geenejä (Tg, TPO, NIS) (A) ja sikiömarkkerin onfFN (B) ARO, KAT- 4 ja normaali kilpirauhanen RT-PCR: llä. TAD-2 solulinjaa käytettiin positiivisena kontrollina onfFN mRNA. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina molemmissa kokeissa. kp = emäsparia.

C

ell kulttuuri lajitellun ARO /CD133

pos solujen

Cluster muodostavaa tehokkuutta lajitellun ARO /CD133

pos solut arvioitiin FACS-analyysillä, joka osoittaa 90%: CD133 positiivisuus (Fig. 3A). Eristämisen jälkeen ARO /CD133

pos soluja, viljellään SFM täydennetty bFGF ja EGF, kasvoi single, tarttumaton, pallomaisia ​​soluja. Muutaman päivän kuluttua, ARO /CD133

pos solut alkoi muodostua klustereita joka vähitellen kasvoi lukumäärältään ja kooltaan, mutta ne eivät muodosta munarakkuloita. Päinvastoin, ARO /CD133

neg solujen tuskin yhteen klustereissa (Fig. 3B).

(A) puhtaus ARO /CD133

pos solujen jälkeen magneettinen solulaji arvioitiin virtaussytometrialla. (B) ominaisuudet lajitellun ARO /CD133

pos ja ARO /CD133

neg päivinä 0, 3 ja 10 kulttuurin. ARO /CD133

pos solut muodostivat klustereita, jotka kasvoivat kooltaan jatkoajalla.

In vitro

soluproleferaatiomäärityksessä, itseuudistumiseen ja pesäkkeitä muodostavat kapasiteetti ARO /CD133

pos solujen

Lisääntyminen arvioitiin MTT ja BrdU määritys. ARO /CD133

pos soluista osoitti

in vitro

lisääntyvän leviämisen verrattuna ARO /CD133

neg solujen sekä MTT klo 48-72 tuntia ja BrdU klo 72-144 tuntia (p = 0,028 ja p≤0.001, vastaavasti) (Fig. 4A ja B). Mitä tulee kaspaasi 3, virtaussytometria osoitti spontaani apoptoosin SFM, jotka vaihtelivat jälkeen 144 tunnin 0,5-2% ARO /CD133

pos soluja ja 3,4-8,8% ARO /CD133

neg soluja (tietoja ei esitetty). Self uusiminen arvioitiin myös (Fig. 4C). CD133 ilme ARO /CD133

pos solut aluksi laski 90% päivänä 0 46% 8. päivänä, ja ylläpidetään vakaassa tilassa, kunnes päivä 11. väheneminen CD133 ilmaisua ylitöitä ei johtunut solukuolemaa ( 2%, tuloksia ei ole esitetty). Sen sijaan, soluproliferaatioon jatkui koko kulttuurin aikana, mikä viittaa siihen, että ARO /CD133

pos solut ominaista epäsymmetrinen jako kyky (eli tuotanto kaksi tytärsoluksi, yksi CD133

pos ja yksi CD133

neg). Pesäkkeitä muodostavien määritys vahvisti korkean itseuudistumisen kyky ARO /CD133

pos, verrattuna ARO /CD133

neg soluja. Itse asiassa, ARO /CD133

pos solut pystyivät muodostamaan suurempi määrä kasvaimen pesäkkeiden (p = 0,028) (Fig. 4D ja 4E).

(A) Soluproliferaatiomääritys (MTT). Pisteviiva ARO /CD133

neg soluihin, jatkuva viiva edustaa ARO /CD133

pos soluja. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD, ja ne edustavat neljää itsenäistä koetta. p 0,03. (B) Soluproliferaatiomääritys (BrdU). Pisteviiva ARO /CD133

neg soluihin, jatkuva viiva edustaa ARO /CD133

pos soluja. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD, ja ne edustavat neljää itsenäistä koetta. p≤0.001. (C) Self-uusiminen kyky ARO /CD133

pos soluja. Musta viiva kuvaa useita ARO /CD133

pos solut arvioitiin virtaussytometrialla. Pisteviiva solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT: llä. (D) Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä metyyliselluloosa väliaineessa lajitellun ARO /CD133

pos ja CD133

neg soluja (40-kertainen suurennus) (E) määrä siirtomaita ARO /CD133

pos ja CD133

neg soluja 15 päivän kuluttua inkuboinnin (p 0,03).

hoito ARO /CD133

pos ja CD133

neg solut kemoterapiaa huumeita

Drug herkkyys arvioitiin MTT ja BrdU määritys. ARO /CD133

pos ja ARO /CD133

neg soluja inkuboitiin eri pitoisuuksia doksorubisiinin, sisplatiinin ja etoposidin. ARO /CD133

pos solut osoittivat merkittävää lääkeaineen vastustuskyvyn kolmesta aineesta verrattuna ARO /CD133

neg solujen aikana koko kulttuuri ajan (p≤0.05 MTT ja p≤0.001 varten BrdU, vastaavasti). Yksi edustava koe 48 tunnin kuluttua kunkin hoidon on esitetty kuviossa. 5A-F. Johdonmukaisesti näiden havaintojen apoptoosin arvioidaan kaspaasi 3 toiminta osoitti dramaattisen aktivointi ARO /CD133

neg verrattuna ARO /CD133

pos soluja kaikkina ajankohtina analysoitiin (kuvio 6A edustava kolmen erillisen kokeen doksorubisiinin ). Histogrammit ajan hetkellä 72 tuntia on esitetty kuvassa 6B. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin muiden käytettyjen lääkkeiden (tuloksia ei ole esitetty).

(A) MTT-analyysi sen jälkeen, kun on viljelty 48 h, kun läsnä on 0,5, 1, 1,5, ja 2 uM doksorubisiini (B) sen jälkeen, kun 48 tunnin kun läsnä on 5, 10, 15 ja 20 uM sisplatiinia (C) 48 tunnin jälkeen, kun läsnä oli 10, 30 ja 100 uM etoposidi. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD ja edustavat kolmen erillisen kokeen (p≤0.05). (D) (E) (F) edustavat BrdU analyysi samoissa olosuhteissa A, B, C (p≤0.001). Pisteviiva ARO /CD133

neg soluja ja jatkuva viiva edustaa ARO /CD133

pos solujen kaikki graafit.

(A) kaspaasi 3 toimintaa sen jälkeen doksorubisiinihoidon. Pisteviiva ARO /CD133

neg soluihin, jatkuva viiva edustaa ARO /CD133

pos soluja. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (p≤0.001). (B) kaspaasi 3 aktiivisuus aikapisteessä 72 tuntia doksorubisiinin. Musta viiva kuvaa positiivista värjäytymistä kaspaasi 3, harmaa viiva osoittaa negatiivinen kontrolli Hyväksytty isotyypin vasta-aineella. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

In vitro

luonnehdinta ARO /CD133

pos solujen

Jotta edelleen luonnehtia ARO /CD133

pos väestö, arvioimme ilmentäminen rinnakkain muiden kantasolujen merkkiaineita. MRNA ilmentymistä kilpirauhasen transkriptiotekijä-1 (TTF-1) ARO /CD133

pos oli merkittävästi korkeampi kuin ARO /CD133

neg soluja, samanlainen TAD-2 sikiön kilpirauhasen solulinja (positiivinen kontrolli) ( kuva 7A). Lokakuu-4 ilmentyminen oli 91 ± 3% ARO /CD133

pos solujen

vs

5 ± 1,5% ARO /CD133

neg, mikä viittaa pluripotenttien kantasolujen piirteitä ARO /CD133

pos soluja (kuvio 7B). Nämä tiedot vahvistettiin semikvantitatiivinen PCR: llä käyttämällä nTERA2 solulinja positiivisena kontrollina (kuvio 7C). Kvantifiointi ilmaistuna suhteessa nTERA2 tiheyteen, osoitti lokakuu-4 mRNA-tasot ARO /CD133

neg solujen lähes kaksi kertaa pienempi kuin ARO /CD133

pos (35%

vs

62% vastaavasti , jossa nTERA2 = 100%).

(A) qRT-PCR TTF-1 mRNA: n ekspression ARO /CD133

pos ja CD133

neg soluja; TAD-2-solulinjaa käytettiin positiivisena kontrollina. (B) Virtaussytometrianalyysi MMA-4A ARO /CD133

pos ja ARO /CD133

neg soluja. Musta viiva kuvaa positiivista värjäytymistä MMA-4A, harmaa viiva osoittaa negatiivinen kontrolli Hyväksytty isotyypin vasta-aineella. (C) semikvantitatiivinen RT-PCR MMA-4 mRNA ARO /CD133

pos ja ARO /CD133

neg soluja. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. nTERA2 solulinjaa käytettiin positiivisena kontrollina. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Kalvo kantasolu merkkiaineiden c-Kit – ilmaistuna talous- ja sosiaalineuvostot (alkion kantasoluja) – ja THY-1 – tyypillistä mesenkymaalisten ja Veren kantasolut – olivat negatiivisia (tuloksia ei ole esitetty).

keskustelu

viime vuosina useita tutkimuksia on julkaistu tukee oletusta, että kasvaimet syntyvät heterogeeninen solupopulaatioiden, joilla on erilaiset biologiset ominaisuudet. Viime aikoina on ehdotettu, että kantasoluja, tunnettu itseuudistumiseen ja erilaistuminen, tällä voi olla rooli syövän kehittymisessä [29], [30]. Koska useita mutaatioita esiintyy monien vuosien aikana ovat tarpeen ennen solusta tulee syöpä, kantasoluja, joilla on pitkä elinikä voi olla parhaita vaihtoehtoja kertyvät tällaisia ​​syöpää aiheuttavaa heterogeeninen soluista [5], [31]. Ei kuitenkaan ole vielä selvää, ovatko nämä CSCS peräisin erilaistamattomuuden kypsien solujen elimiä tai asukas kantasoluja, jotka vähitellen hankkia pahanlaatuiseen fenotyyppiin [32].

ATC on yksi aggressiivinen hormonitoimintaa kasvaimia ominaista korkea erilaistamattomuuden [1]. Olemassaolo asukas kilpirauhasen kantasolut voivat selittää sekä jatkuvaa lisääntymistä ja heterogeenisuus ATC vaurioiden [4]. Takano et ai. oletettu, että läheinen suhde kantasolujen ja syövän synty saattaa esiintyä ATC [17], [26], [33]. ATC geeniekspressioprofiili ehdotettu ainakin kolmenlaisia ​​erilaistumattomien solujen alkuperästä: kilpirauhasen kantasoluja, jotka ilmentävät onfFN mRNA muttei Tg, jolla on korkea eriyttäminen potentiaali, itseuudistumiseen ja kyky luoda anaplastinen karsinoomat; thyroblasts, ilmensivät sekä Tg ja onfFN mRNA ja jotka eivät munarakkuloita; prothyrocytes, jotka ovat enemmän kuin kuin thyroblasts, jotka ilmentävät Tg mutta ei onfFN mRNA, jolla on kyky muodostaa munarakkuloiden. Mitsutake et ai. ovat tunnistaneet hyvin pienten puolella väestöstä (SP), erittäin runsaasti kantasoluja, useissa ihmisen kilpirauhassyöpä solulinjoissa. Kuitenkin molemmat SP

pos ja SP

neg väestö muodostuu kasvaimia kun istuttaa nude-hiirissä, jotka osoittavat, että syöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja eivät yksin tai samanlaisia ​​SP soluihin [16].

Tässä tutkimuksessa olemme itse väittävät, että ATC voivat olla peräisin kilpirauhasen kantasoluista. Kuvaamme CD133

pos solujen fenotyyppiset ominaisuudet kantasoluja, kasvava muodostamatta munarakkuloita. Kuitenkin yksi neljästä solulinjoista analysoidaan ainoastaan ​​ARO ja KAT-4 osoitti suuri prosenttiosuus CD133

pos soluja (64 ± 9% ja 57 ± 12%, vastaavasti, kuvio. 1A). Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​viimeaikaisten huomautuksia erittäin aggressiivinen hepatoomasolulinjassa linjojen, myös ominaista erittäin suuri osa CD133

pos soluihin [34]. Korkea CD133 ilmentyminen ATC saattaa siis liittyy kasvaimen aggressiivisuus. Se, ettei tämän markkerin KAT-18 ja FRO solulinjoja, viittaa siihen, että pelkkä läsnäolo CD133 ei ole riittävä ja muita merkkiaineita on vielä tunnistettu. Lisäksi ilmoituksen mukaan Takano et al. [17], huomasimme, että ARO ja KAT-4 solulinjat ilmensivät onfFN muttei Tg, TPO ja NIS, vahvistetaan heidän eriytymättömiä tila.

Paremmin luonnehtia toiminnalliset ja fenotyyppiset ominaisuudet näiden oletettujen CSCS ATC, tutkimme lajitellut ARO /CD133

pos soluja. ARO /CD133

pos solut osoittivat suurempi solujen lisääntymistä nopeudella verrattuna CD133

neg soluja (Fig. 4A ja B). Lisäksi itseuudistumisen kyky ARO /CD133

pos soluissa varmistettiin väheneminen CD133 ilmentyminen rinnakkain kasvavan soluproliferaatioon, mikä viittaa siihen epäsymmetrinen jako eli tuotanto CD133

pos ja CD133

neg tytär solut. Kuitenkin muita menetelmiä kuin epäsymmetrinen jako (esimerkiksi CD133 posttranskriptionaalisella alassäätöä) ei voida sulkea pois. Minimaalinen solukuoleman prosenttiosuudet estä sitä, että lasku CD133 ilmentyminen oli apoptoosin vuoksi ( 2%).

Edelleen vahvistus siitä, että suurin osa ARO /CD133

pos solut voivat olla kantasoluja /progenitorisolujen tulee ilmentymisen analyysi muita geenejä, jotka liittyvät ”stemness”. Vaikka kantasolujen merkkiaineita c-Kit ja THY-1 olivat negatiivisia, vahva positiivisuus todettiin lokakuu-4. Lokakuu-4 kuuluu POU (Pit-Oct-setä) perheen transkriptiotekijöiden joka välittää pluripotenttisuus on talous- ja sosiaalineuvostojen kautta eston kudosspesifisiä ja edistäminen kantasoluja geenit [22], [23]. ARO /CD133

pos lajitellut solut olivat vahvasti positiivisia lokakuu-4A verrattuna ARO /CD133

neg soluja, ja niiden ilmentyminen oli samankaltainen kuin nTERA2 alkion teratoma solulinjassa. Alukkeet ja monoklonaalinen vasta-aine käytetään kokeissa ydin- silmukoivat lokakuu-4A pois mitään pseudogeenistä saastumisen tai esineitä [24].

ydin- kilpirauhasen erityinen transkriptiotekijä TTF-1 on homeodomeenin sisältävä proteiini, jonka omistaja että Nkx-2 luokan homeobox geenien, joka tarvitaan riittävään kilpirauhasen kehittämiseen ja sitä käytetään markkerina kilpirauhasen ja keuhkosyöpä [35]. TTF-1 ekspressio havaittiin merkitsevästi suurempi ARO /CD133

pos kuin ARO /CD133

neg soluja, jossa mRNA-tasot verrattavissa TAD-2 sikiön kilpirauhasen solulinja (positiivinen kontrolli). Tämä merkitsee sitä, että vaikka kaikki ATC solulinjat ovat dedifferentoituneiden (poissa ilmentyminen kilpirauhasta erityisiä geenejä, kuten Tg, TPO ja NIS ja positiivisuutta onfFN), ARO /CD133

poscells merkkiaine kilpirauhasen organogeneesin on yhä voimassa.

Lisäksi jotta toiminnallisesti luonnehtia näiden oletettujen syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja, testasimme herkkyys yleisimpiä kemoterapiaa huumeita käytetään ATC eli sisplatiini, doksorubisiini ja etoposidi. Sisplatiini silloittaa DNA usealla eri tavalla häiritse solunjakautumisen mitoosin, doksorubisiinin vuorovaikutuksessa DNA interkalaation ja estämällä makromolekyylisten biosynteesiä ja etoposidin inhiboi topoisomeraasi II [36] – [38]. ARO /CD133

pos solut paljasti huomattavan vastus kaikille käytettäville lääkkeille kunakin ajankohtana verrattuna ARO /CD133

neg soluja, kuten on osoitettu selvästi pienempi apoptoosin tasot havaittiin kautta kaspaasi 3 (Fig. 6). Mahdollinen induktio antiapoptoottisten sijaan apoptoottiset tai tukos thyrocyte fysiologisia solun liikevaihdon sääntelymekanismit, osoittaa muiden kilpirauhasen sairaudet, kuten autoimmuuni kilpirauhastulehdus [39], saattaisi selittää hankittu kyky kilpirauhasen kantasolujen kaltaisia ​​soluja tulla vastustuskykyisiä kemoterapiaa.