Krooninen sairaus

tiivistelmä

pienimolekyylisiä inhibiittoreita proteiini geranylgeranyltransferase-I, kuten P61A6 on osoitettu estävän proliferaation erilaisia ​​ihmisen syöpäsoluja ja osoittavat kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta hiiren malleissa. Kehittäminen nämä inhibiittorit voidaan nopeutunut antamalla tuumorikohdentamisen ja kontrolloidun vapautumisen ominaisuus. Ensimmäisenä askeleena kohti tätä tavoitetta olemme kapseloitu P61A6 uudentyyppiseen liposomien avattavat ja vapauttaa lastien vain matalan pH kunnossa. Nämä alhaisen pH-julkaisun tyyppiä liposomit valmistettiin säätämällä suhdetta kahden fosfolipidin johdannaisia. Lastaus geranylgeranyltransferase-I: n estäjä (GGTI) syntyy liposomien keskimääräinen halkaisija on 50-100 nm. GGTI julkaisu liuoksessa oli voimakkaasti riippuvainen pH-arvot, ainoastaan ​​osoittaa vapautuminen pH: ssa pienempi kuin 6. Vapauta lastien pH-riippuvaisella tavalla solun sisällä osoitettiin käyttämällä protonipumpun estäjä bafilomysiini A1 että Lisääntynyt lysosomaalisen pH ja estivät vapauttamaan väriainetta kuljetetaan pH-liposomi. Toimitus GGTI ihmisen haimasyövän soluja osoitettiin estämällä proteiinin geranylgeranylation solun sisällä, ja tämä vaikutus on estetty bafilomysiini A1. Lisäksi, GGTI toimittaa pH-liposomien indusoitua proliferaatiota inhibition, G1 solusyklin pysähtymisen, joka liittyy ilmentymisen solusyklin säätimen p21

CIP1 /WAF1. Proliferaation inhibitio havaittiin myös eri keuhkosyövän solulinjat. Saatavuus nanoformulated GGTI avaa mahdollisuuden yhdistää muuntyyppisten estäjiä. Tämän osoittamiseksi, yhdistimme liposomaalinen-GGTI kanssa famesyylitransferaasin estäjä (FTI) estävän K-Ras signalointi haiman syöpäsoluja. Tuloksemme osoittavat, että aktivoitu K-Ras signalointia näissä soluissa voidaan tehokkaasti estetty ja että synergistinen vaikutus kahden lääkkeen havaitaan. Tuloksemme viittaavat siihen, että uuden suunnan käytön GGTI syövän hoitoon.

Citation: Lu J, Yoshimura K, Goto K, Lee C, Hamura K, Kwon O, et ai. (2015) Nanoformulation of Geranylgeranyltransferase-I INHIBIITTOREIDEN Cancer Therapy: Liposomaalinen kapselointi ja pH-riippuvainen toimitus syöpäsoluihin. PLoS ONE 10 (9): e0137595. doi: 10,1371 /journal.pone.0137595

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2015 Hyväksytty: 18 elokuu 2015; Julkaistu: 09 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Lu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat NIH myöntää CA41996 (FT) ja R01GM071779 ja P41GM081282 (OK), https://grants.nih.gov/grants/giwelcome.htm. Osa työstä tässä asiakirjassa tukivat sponsoroi tutkimusta kanssa NOF, Inc (FT). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: NOF Corporation tuettiin muodossa palkkojen tekijöille [Kohei Yoshimura ja Ken Hamura ]. Niiden panos tutkimuksen määritellään tekijän osuus osassa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

luokka syöpälääkkeiden tarkoitettu estämään kalvoon yhdistys signalointi proteiineja on kehitetty vuosien varrella . GGTI (geranylgeranyltransferase-I: n estäjä) on esimerkki tästä tyypistä syöpälääkkeiden [1-3]. GGTI estää proteiinisynteesiä geranylgeranyltransferase I (GGTase-I), joka on entsyymi, joka lisää C20 geranyyligeranyyli ryhmä proteiineja, kuten RhoA, RhoC, Rap1 ja Ral on kysteiini sisällä karboksiterminaalinen tetrapeptidi konsensussekvenssi CAAL (C on kysteiini, A on alifaattinen aminohappo ja C-terminaalinen tähde on leusiini tai fenyylialaniini). Karakterisointi hiirillä ehdollisen knockout of GGTase-I osoitti, että GGTase-I puutos johtaa inhibitioon onkogeenisten K-ras-indusoitua keuhkon kasvaimen muodostumisen ja lisää huomattavasti hiirten eloonjääntiin [4]. GGTase-I inhibitio johtaa proliferaation esto liittyy G1 pidätyksen ja kertymistä solukierron sääntelyviranomaisten kuten p21

CIP1 /WAF1 osoittaen tärkeyttä GGTase-I soluproliferaatioon ja solusyklin etenemisen [5-7].

seulomalla kemiallinen yhdiste kirjasto rakennettiin fosfiinin katalyysiä allenoate yhdisteiden, olemme aiemmin tunnistettu useita GGTase-I: n estäjä (GGTI) yhdisteitä, jotka estävät proteiinin muutos ja estävät kalvon yhdistys ja toiminta Ral, Rho, ja Rap subfamily proteiinit [8,9]. Nämä yhdisteet estävät GGTase-I kilpailemalla sen alustaan ​​proteiineja. Cell aktiivisia yhdisteitä P61A6 ja P61E7 aiheuttaman solusyklin pysähtymisen ja esti kasvua ihmisen syövän solulinjojen haimasyöpä ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [10,11]. Tehoa GGTI P61A6 tuumorikasvun osoitettiin käyttäen ihmisen haimasyövän ksenografti [10]. Tässä kokeessa merkittävän tuumorikasvun eston havaittiin vähän sivuvaikutuksia arvioituna munuaisten ja maksaentsyymiprofiilit ja hematologiset luonnehdinta. Esto geranylgeranylation kasvain oli osoitettu. Samanlainen tuumorin kasvun havaittiin käyttämällä keuhkosyövän hiirissä [11].

suuri haaste edelleen GGTI kehittäminen on antaa kasvaimeen kohdistaminen kyky näitä yhdisteitä. Vaikka on mahdollista käyttää pieniä määriä GGTI minimoida mahdollisia sivuvaikutuksia, sitä mahdollisuutta, että se on annosta rajoittava toksisuus GGTI yhdistettä ei voida sulkea pois, koska GGTase-I on entsyymi, joka toimii myös normaaleissa soluissa. Näin ollen on tärkeää kehittää uuden sukupolven nano-muotoiltu GGTI, jotka edullisesti tuottaa GGTI yhdisteen kasvaimia. Tämä mahdollistaisi kasvaimen kohdistus, vähentää ei-toivottuja jakelu muihin kehon osiin, jolloin vältetään mahdolliset vaikutukset normaaleihin kudoksiin.

Dramaattinen etukäteen Nanoteknologia on johtanut siihen, että useita lääkeaineen, mukaan lukien liposomit , polymeeri misellit, virukset ja mesohuokoisella piidioksidi nanohiukkasten [12-25]. Nämä nanopartikkelit voivat toimittaa lääkkeen tuumoriin parannettu läpäisevyys ja säilyttäminen vaikutus [13] sekä käyttämällä ligandeja, jotka on kohdistettu reseptoreihin syöpäsolujen, jolloin vältetään ei-toivottuja systeemisiä chemotoxicity. Niistä liposomeilla on edullisia ominaisuuksia, jotka sisältävät tehokkaita kapselointi, suhteellisen helppo valmistelu, biohajoavuus ja biologinen yhteensopivuus [26-31]. Lisäksi, fosfolipidi kaksikerroksinen rakenne liposomeja on tarkoituksenmukaista luoda bio liittyviä toimintoja, kuten kalvo epävakautta ja /tai kalvofuusion, edistää solujen internalisaatioon kalvon läpäisemätön molekyylien koko solukalvoissa soluihin.

lisäksi kasvaimen kohdistus, on tärkeää saada aikaan säädellyn vapautumisen niin, että syöpälääkkeiden vapautetaan edullisesti kasvaimessa. Äskettäin lähestymistapoja syntetisoimiseksi uudenlainen liposomeja, joilla on alhainen pH vapauttavan ominaisuuden, on raportoitu [32,33]. Koska solunsisäinen lysosomaalisen pH on alhainen ja koska kasvain mikroympäristölle on alhainen pH johtuu hypoksinen olosuhteet [34-36], tämä ominaisuus on etua, että lääkeaineen vapautumista on rajoitetumpaa syöpäsoluja.

Tässä asiakirjassa, me raportoimme liposomien valmistus, joka tehokkaasti koteloida pienmolekyyleillä ja väriaineet ja vapauta lastin, kun he kohtaavat alhainen pH-olosuhteissa. GGTI P61A6 on tehokkaasti kapseloitu pH-herkkien liposomien ja toimitettiin ihmisen syöpäsoluja. Proteiinikinaasien geranylgeranylation sekä leviämisen estäminen, solusykliä vaikutukset ja kertymistä solusyklin estäjä p21

CIP1 /WAF1 havaittiin toimittamalla GGTI jonka pH-herkän liposomeja. Olemme edelleen laajentaa käyttöä liposomaalisen GGTI syöpähoitoa varten osoittamalla, että liposomaalinen-GGTI voidaan yhdistää famesyylitransferaasin estäjä (FTI) estävän K-Ras signalointi haiman syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

GGTI yhdiste P61A6 käytetään tässä tutkimuksessa oli peräisin allenoate johdettuja yhdiste kirjaston kuvattu aikaisemmin julkaistu [9-11]. 20 mM kantaliuos GGTI P61A6 DMSO: ssa, pidettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. FTI yhdiste BMS225975 oli kuvattu aiemmin [37]. Tämä yhdiste estää proteiinisynteesiä famesyylitransferaasin nimenomaan pieni proteiinikinaasien geranylgeranyltransferase I ja RabGGTase. COATSOME

® MC-6081 (1-palmitoyyli-2-oleyyli-sn-glysero-fosfokoliinia (POPC)), SUNBRIGHT

® DSPE-PG8MG (kondensaatiotuote, N- (octaglycerol-glutaryyli) distearoyylifosfatidyylietanoliamiini 3- metyyliglutaarihappo (DSPE-PG8MG)), toimitti NOF CORPORATION (Tokio, Japani). 1, 2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-fosfoetanoliamiini-N- (lissamiini rodamiini B sulfonyyli) (ammoniumsuola) (Rhodamine-PE) ostettiin Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, USA).

suunnittelu ja valmistus matalan pH-herkkien liposomien

pH-herkän tyhjä liposomeja valmistettiin POPC ja DSPE-PG8MG. Tyypilliset menettelyt on kuvattu alla. POPC ja DSPE-PG8MG (moolisuhde, 85:15), liuotettiin kloroformi-metanoli-seosta, ja liuotin poistettiin kiertohaihduttimessa. Lipidiseos kuivattiin tyhjössä, ja sammutettua vesiliuoksella (10 ml), joka sisälsi sakkaroosia kryosuojana. Suulakepuristuksen jälkeen liposomisuspension kautta membraanin (huokoskoko 0,22 um), saatu suspensio pakastekuivattiin, jolloin saatiin pH-herkkä tyhjä liposomit [38].

rodamiinifluoresenssia-merkintöjä Liposomien

rodamiini-merkitty pH-herkkä tyhjä liposomeja valmistettiin POPC, DSPE-PG8MG, ja Rhodamine-PE: tä (moolisuhde 85: 15: 0,1). POPC ja DSPE-PG8MG liuotettiin kloroformi-metanoli-seosta. Rhodamine-PE: tä liuotettiin kloroformiin ja lisätään lipidien liuokseen, ja liuotin poistettiin kiertohaihduttimessa. Lipidiseos kuivattiin tyhjössä, sammutettua fosfaattipuskurilla, joka sisälsi sakkaroosia. Suulakepuristuksen jälkeen liposomisuspension kautta membraanin (huokoskoko 0,22 um), saatu suspensio pakastekuivattiin, jolloin saatiin fluoresoiva väriaine-leimatun pH-herkkä tyhjä liposomeja.

rodamiinileimattu liposomi jauhe liuotettiin uudelleen PBS: ään puskuria 10 ug /ml, sonikoitiin sonikaattorilla (vesihauteessa tyyppi) 10 min, ja lisättiin MiaPaca-2-soluja, jotka viljeltiin 8 kuoppaa lasikennoa kammioon 4 tuntia. Sitten solut pestiin PBS-puskurilla ja inkuboitiin 50 nM LysoTracker vihreä, jota seurasi inkubointi soluviljelykammion lisää 1 tunti ennen tarkkailemalla fluoresenssimikroskoopilla.

Drug ladattu Liposomivalmiste

pieni näyte (130 ui) liuenneen GGTI (1,2 mg) 75% EtOH 10% DMSO (lopullinen pitoisuus = 6,41 mg /ml) laimennettuna dH

2O 10%, sekoitettiin 1,3 mg jauhe liposomien, ja seosta pyöritettiin 4 ° C: ssa 4 tuntia ja sen jälkeen sonikoimalla 2 min käyttäen vesihaudetta-sonikaattorissa. Liposomisuspensiota suulakepuristettiin polykarbonaatti kalvon, jonka huokoskoko on 100 nm. Samaan aikaan, 6 ml Sepharose 4B geeliä sekoitettiin 2 ml: aan PBS: ää jäällä ja pantiin 10 ml: n kolonniin, pakataan nopeudella 15 cm /h. Ja sitten seos liposomin ja GGTI ladattiin päälle geelin sarakkeessa. Sen jälkeen antamalla näytteen tulee hartsin kolonni välittömästi täytetään kylmällä PBS-puskurilla, ja pumppaus aloitettiin nopeudella 15 cm /h poistaa vapaiksi lääkkeiksi, joita ei ole ladattu liposomeja lääkkeen liposomit [32] . Saadut eluaatit otettiin talteen ja fraktiot, jotka sisälsivät liposomit tunnistetaan niiden sameus. Näytettä pidettiin 4 ° C: ssa vielä kokeiluja.

Drug and Dye vapautuminen Liposomit

vapautuminen lääkkeitä liposomien mitattiin korkean erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC). 400 ui Liposomien kapseloidaan GGTI (kerätään Sepharose -pylväästä) sekoitettiin 150 mM NaCl, sentrifugoitiin 100000 rpm: ssä 10 min, 4 ° C, jolloin saostui liposomaalinen GGTIs. Sakka suspendoitiin uudelleen 400 ui PBS: ää. 73 ui uudelleen suspendoitua lisättiin 927 ul: aan PBS-puskuria, jossa pH-arvoa vaihdellen, ja sitten sekoitettiin 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Triton X-100 käytettiin 100% kontrolli, koska Triton X-100 voidaan hajottaa liposomit (lopullinen pitoisuus: 0,1%). Seokset lisättiin sisärenkaat on ultrasuodatin Amicon Ultra-4 (MWCO = 10 kDa, Millipore), sentrifugoitiin 13000 g: ssä 10 min huoneenlämpötilassa. Eluaatit HPLCrhen mittaamista julkaissut GGTI (Waters Micromass LCT Premier Mass Spectrometer). Vapautuminen fluoresoiva väriaine Pyranine suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [32]. Pieni näyte (500 ui) ja 35 mM pyranine, 50 mM DPX (p-ksyleeni-bis-pyridiniumbromidi), ja 25 mM fosfaattipuskuriliuoksella (pH 7,4) sekoitettiin 7 mg liposomien, ja seosta sonikoitiin 2 min käyttäen vesihauteessa sonikaattoria. Pyranine fluoresenssi sammutetaan DPX sisällä liposomeja, mutta päästää voimakasta fluoresenssia jälkeen vapautuu liposomiin. Liposomit kapseloidaan pyranine ja DPX lisättiin 25 mM fosfaattia ja 125 mM NaCl: a puskurissa, jonka pH-arvoa vaihdellen ja fluoresenssin intensiteetti (512 nm) mitattiin spektrofluorometrillä (416 nm, Jasco FP-6500). Prosentuaalinen vapautuminen pyranine liposomeista määriteltiin Release (%) = (Ft-Fi) /(Ff-Fi) x 100 jossa Fi ja Ft tarkoittaa alku- ja välittäjä fluoresenssivoimakkuuksien, vastaavasti. Ff on fluoresoiva intensiteetti lisäyksen jälkeen Triton X-100 (lopullinen pitoisuus: 0,1%).

Cell Culture

ihmisen rintasyöpäsolujen, MCF-7, haimasyöpä solulinja MiaPaCa2, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjassa H596, H358, A549 ja normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelin solulinja BEAS-2B saatiin American Type Culture Collection. Kaikki syöpäsolulinjoja pidettiin DMEM: ssä tai RPMI, jota oli täydennetty 10% FCS: ää (Sigma), 2% L-glutamiinia, 1% penisilliiniä ja 1% streptomysiiniä. BEAS-2B-solua viljeltiin BEBM median lisätty erityistä kasvutekijät (Lonza /Clonetics Co.). Väliaine oli rutiininomaisesti vaihdetaan joka 3 päivä, ja solut erotettiin trypsinoimalla ennen konfluenssin.

Toimitus Väriaineet Cancer Cells

Doksorubisiini toimitus tutkittiin seuraavasti. Sentrifugoinnin jälkeen Sepharose-4B-kolonnilla poistamiseksi vapaiksi lääkkeiksi, homogeeninen suspensio doksorubisiinin liposomit lisättiin rintasyövän MCF-7-solut, jotka kasvatettiin 8 hyvin lasin kammioon. 6 tunnin inkubaation jälkeen solut pestiin ja tutkittiin fluoresenssimikroskopialla kuvan jakeluun Doksorubisiini syöpäsoluissa. Pyranine-liposomit valmistettiin, kuten on kuvattu edellä. MiaPaca-2-solut (3 x 10

5 solua) viljeltiin yön yli 8 kuoppiin lasi Soluviljelykammio. Liposome suspensiot lisättiin soluihin ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin PBS: llä kaksi kertaa, ja havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (Carl Zeiss). Bafilomysiini käsittely suoritettiin 160 nM bafilomysiini A1 6 tuntia ennen liposomien lisäämistä. Akridiini Orange (Sigma) värjäys suoritettiin 6 uM.

leviämisen inhibitiomääritys

leviämisen inhibitiotesti suoritettiin käyttäen solu-laskenta-kittiä Dojindo Molecular Technologies, Inc. Syöpäsolut ympättiin 96-kuoppalevyille (5000 solua hyvin

-1) ja inkuboitiin tuoreessa elatusaineeseen 37 ° C: ssa 5% CO

2/95,% ilma ilmakehässä 24 tuntia. Sitten solut pestiin PBS: llä, ja väliaine vaihdettiin tuoreeseen väliaineeseen, joka sisälsi GGTI liposomit tai tyhjä liposomeja, joissa on sama määrä puskuria kontrollina ilmoitettuina pitoisuuksina. 24 tunnin kuluttua solut pestiin PBS: llä poistaa liposomit, jotka eivät olleet ottaneet solut, ja soluja inkuboitiin sitten tuoreeseen elatusaineeseen vielä 48 tuntia. Solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin DMEM: ssä, jossa oli 10% WST-8 ratkaisu toiset 2 tuntia. Absorbanssi kunkin kuopan mitattiin 450 nm: ssä levylukijalla. Koska absorbanssi on verrannollinen elävien solujen keskipitkällä, elinkykyisten solujen lukumäärä määritettiin käyttämällä aikaisemmin valmistettua kalibrointikäyrän (Dojindo Co.).

Western blot -analyysi

Solut käsiteltiin GGTI-liposomit, tyhjiä liposomeja, tai GGTI 24 tuntia, kerättiin ja lyysattiin lyysipuskurissa (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl: ää, pH 7,5, 1 mM EDTA, ja 1 × proteaasinestäjä seosta). Proteiinit erotettiin geelielektroforeesilla SDS-polyakryyliamidigeelillä ja sitten siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit blokattiin Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS), joka sisälsi 5% (w /v) kuorittua maitoa. Kun oli pesty TBS: llä, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä (Sigma), kalvoja inkuboitiin yön yli ensimmäisen vasta-aineen (vastaan ​​unprenylated muodossa rapl, Santa Cruz Biotechnology, CA) laimennettuna TBS. Pesun jälkeen membraaneja inkuboitiin 2 tuntia toisen vasta-aineen (Santa Cruz Biotechnology, CA). Vyöhykkeet havaittiin kanssa ECL-järjestelmää (Amersham Pharmacia Biotech K.K., UK). Fosforylaatiota ERK testattiin käyttämällä vasta-ainetta phorphorylated muodossa ERK sekä vastaan ​​yhteensä ERK (Cell Signaling, CA). Anti-aktiini-vasta-aine hankittiin Sigma-Aldrich (CA).

Tilastollinen analyysi

Kaikki tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD. Tilastolliset vertailut tehtiin Studentin t-testi, kun varianssianalyysillä. Tuloksia pidettiin merkittävästi erilainen P arvoon 0,05, on merkitty *.

Tulokset

Suunnittelu ja valmistus matalan pH-herkän liposomeja (pH-liposomit) B

pH-liposomit ovat stabiileja fysiologisella pH, mutta tullut destabilized happamissa olosuhteissa johtuen protonaatio, siis vastata alhaisen pH ympäristöihin endosomissa-lysosomeihin solujen sisällä [32]. Liposomit valmistettiin käyttämällä kahta eri lipidejä, DSPE-PG8MG ja POPC. Yleinen järjestelmä on DSPE-PG8MG on esitetty kuvassa 1. Tämä molekyyli sisältää fosfolipidin, joka liittyy karboksyloiduiksi polyglyseriini- osaan (PG ketju). Happamissa olosuhteissa, PG ketju protonoidaan johtaa epävakautta liposomimembraanit aiheuttaa fuusio endosomaalisiin kalvoja. Sisällön liposomit sitten vapautetaan sytosoliin. Muuttamalla kahden lipidien, on mahdollista suunnitella liposomeja, jotka vastaavat erilaisia ​​pH-arvoja. Tässä, polyglyseriiniyhdisteiden muunnettu 3-metyyli glutaarihappo tiedetään pKa-arvo on 6,3 [39,40]. Siksi DSPE-PG8MG on samanlainen pKa-arvo polyglyserii- johdannaisen, ja niiden pH-vaste lähellä pH 6. Meidän tapauksessa halusimme saavuttaa sisällön vapautuminen pH: ssa alle 6, mutta vähän julkaisu yllä pH 6. Niinpä päätettiin löytää sopiva lipidi koostumusta vastaava menettely. Lyhyesti, dispersiot pH-liposomeja, jotka kapseloitu pyranine väriaine lisättiin ratkaisuja eri pH-arvoissa. Ja pH-reagointikykyä liposomien arvioitiin mittaamalla määrä pyranine vapautuu niistä. Testauksen jälkeen eri suhteita, päätimme käyttää POPC ja DSPE-PG8MG suhde 85 and15 (mol-%).

solunsisäinen lokalisaatio pH-liposomien

tutkimiseksi soluunottokokeissa ja solunsisäinen lokalisaatio pH-liposomien, syntetisoimme rodamiinileimattu pH-herkkä tyhjä liposomeja (rodamiini väriaine kovalenttisesti konjugoida lipideihin synteesin aikana), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Haimasyöpäsoluissa MiaPaca-2 inkuboitiin rodamiinileimattu liposomeja 4 tuntia ja liposomaalisen fluoresenssi tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla. Kuten kuvassa 2A, pistemäinen fluoresenssi havaittiin klo perinuclear alue osoittaa lysosomaalisen lokalisointi. Tämä seikka vahvistettiin käyttämällä Lysosensor Green DND-189 (Life Technologies). Lysosensor Green DND-189 esittelee vihreän fluoresenssin vain silloin, kun sisällä solunsisäiset happamia osastojen kuten lysosomeihin. Kolokalisaation punaisen Rhodamin fluoresenssi ja vihreä Lysosensor fluoresenssi havaittiin, vahvistaa lysosomien lokalisointia liposomien. Näin ollen, liposomit näyttävät kerääntyä lysosomeihin, kun otetaan solujen.

GGTI-liposomit valmistettiin ja altistettiin sitten liuos säädettiin eri pH-arvoja 15 min ja vapautumista GGTI tutkittiin HPLC: llä. Triton-100 käytettiin koko julkaisu ohjaus. Symboli * tarkoittaa tilastollisesti merkittävää eroa P-arvo 0.05.

Drug Loading ja Release

Liposome lastaus tehokkuutta huumeiden ja väriaineet testattiin sekoittamalla liposomeihin käyttäen Sepharose 4B pylväs poistaa vapaiksi lääkkeiksi ja vapauttamalla sisällön liposomien Triton X-100. GGTI mitattiin vertaamalla tavallisella GGTI näytteestä LC-MS. Arvioimme, että kuormauskapasiteetti GGTI liposomeihin on noin 30% koko GGTI. Tutkia koko rekonstruoitu liposomien, me altistetaan GGTI liposomit dynaaminen valonsironta (DLS) mittaus. Kuten voidaan nähdä kuviosta 2B, olemme huomanneet, että koko GGTI liposomit olivat 46-65 nm halkaisijaltaan keskimääräinen koko 54,9 nm. Siten meidän valmiste on suhteellisen kapea kokojakauma.

vapautuminen GGTI liposomeista tutkittiin kuormittamalla GGTI keräten GGTI liposomit ja vapauttamalla sisältöä altistamalla PBS-puskurissa eri pH-arvot vaihtelevat välillä 4,5 8. Kuten on esitetty kuviossa 2C, liposomeja säilytetään GGTI sisällä tiukasti on neutraali tai emäksinen puskureita. Pieni vapautuminen GGTI havaittiin pH-alueella 6-8. Kuitenkin, kun pH oli alle 6, merkittävä vapautuminen GGTI liposomeista havaittiin. PH: ssa 5,5, yli 80% ladattu GGTI julkaistiin. Vastaavasti, lähes täydellinen vapautuminen havaittiin pH: ssa 5 ja pH: ssa 4,5 (ei esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että pH-herkän liposomit tehokkaasti epätasapainoon happamissa olosuhteissa. Terävä siirtyminen pH 5,5 ja pH 6 ehdottaa, että tämäntyyppinen liposomin tarjoaa sopivan ajoneuvon solunsisäisen kontrolloidun vapautumisen.

matalan pH-riippuvaista toimittaminen Loaded Dye Sisällä Cell

doksorubisiinin ladattu liposomeja käytettiin tutkimaan solunsisäiseen lääkeaineen laukaisumahdollisuuksilla, koska doksorubisiini emittoi vahva punainen fluoresenssi UV eksitaatio. Sen jälkeen, kun se eluoituu Sepharose-4B-kolonnilla poistamiseksi vapaiksi lääkkeiksi, homogeeninen suspensio doksorubisiinin liposomit lisättiin rintasyövän MCF-7-soluja, jotka viljeltiin kahdeksan hyvin lasin kammioon. 6 tunnin inkubaation jälkeen solut pestiin ja tutkittiin fluoresenssimikroskopialla kuvan jakeluun Doksorubisiini syöpäsoluissa. Solut käsiteltiin doksorubisiini osoitti vahvaa punaista fluoresenssia (kuvio 3A) sytosoliin ja ytimet. Tämä oli samanlainen kuin havaittiin soluissa, joita käsiteltiin vapaan doksorubisiinin (tuloksia ei ole esitetty). Toisaalta, ohjaus solut käsiteltiin liposomeja ilman doksorubisiinin pysyi ei-fluoresoiva.

: fluoresenssimikroskopialla kuvia MCF7-soluja inkuboitiin doksorubisiinin liposomit 6 tunnin ajan (punainen fluoresenssi). Ohjaus solut eivät saaneet liposomeja. B: vapautuminen Pyranine väriaineen MiaPaca-2-solut tutkitaan sen fluoresenssia tai ilman hoitoa bafilomysiini A1. Vaihekontrasti kuva näkyy. C: Effects of bafilomysiini A1 pH solunsisäisten soluelimiin joille näytetään akridiinioranssia.

Edellä mainitut kokeet osoittavat, että liposomeja voidaan ladata väriaineiden ja lääkkeiden ja menestyksekkäästi ja tehokkaasti toimittaa sisältöä syöpäsoluja. Halusimme karakterisoimiseksi edelleen alhaisen pH: sta riippuvainen vapautuminen ominaisuus liposomien solun sisällä. Tämän tutkimiseksi vaiheessa käytimme Pyranine väriaine liposomit ja käsiteltyjen solujen kanssa bafilomysiini, muuttava lääke lysosomaalisen pH. Bafilomysiini A1 (Baf) on spesifinen estäjä solunsisäisen vakuolaarisen protonipumpun, estämällä happamaksi vakuolaarisen järjestelmän, kuten endo /lysosomeihin, mikä lisäisi lysosomaalisen pH [41,42]. Haimasyöpäsoluissa MiaPaca-2 käsiteltiin 160 nM Baf 6 tuntia ja sitten Pyranine väriaine-liposomit lisättiin soluihin. Soluja inkuboitiin vielä 12 tuntia ennen tutkimista fluoresenssimikroskopialla. Kuten on esitetty kuviossa 3B, käsittely Baf kokonaan estää solunsisäistä vapauttamista Pyranine, osoittaa, ettei värjäytymistä, verrattuna kirkkaan vihreä fluoresenssi solujen altistettu Baf. Vahvista vaikutuksen Baf on happamuuden endosomien, akridiinioranssia (AO) värjäys suoritettiin. AO on fluoresoiva heikko emäs, joka on usein käytetty koettimena valvomiseksi happamoitumisen organelles. Vapaalla tai emästä ympäristöissä tämä väriaine emittoi vihreää fluoresenssia, mutta kun se altistetaan happamia osastoihin, se on ionisoituneen ja sen emissio käy läpi punasiirtymä. Kun käsittelemättömissä soluissa, punainen fluoresenssi havaittiin sisällä erillisiä sytoplasmassa organelleja, mikä osoittaa, että AO oli kertynyt happamassa soluelimiin (kuvio 3C). Kuitenkin, punainen fluoresenssi laski jyrkästi 6 tuntia sen jälkeen Baf hoidon, mikä osoittaa, että Baf oli kasvanut pH endosomien on MiaPaca-2-soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vapautuminen väriaineen liposomien riippuu alhainen pH-olosuhteissa solunsisäisen organelles.

Liposomalia GGTI estää proteiinisynteesiä Geranylgeranylation solun sisällä ja tämä vaikutus riippuu alhainen pH lysosomeihin

GGTI vapautuminen ja tehokkuus estävän proteiinin geranylgeranylation sisällä syöpäsoluja tutkittiin. Kuvio 4A osoittaa, että toimitus GGTI että liposomit tulokset proteiinikinaasien geranylgeranylation solun sisällä. Tässä kokeessa MiaPaca-2-soluja käsiteltiin liposomaalisen-GGTI 3 tunnin ajan, ja proteiinit kerättiin solu- lysaatin Western-analyysillä. Kuten on esitetty, solujen käsittely joko GGTI P61-A6 yksin tai GGTI ladattu liposomin johti ulkonäön unprenylated Rap1 kaistan, mikä osoittaa, että liposomit tuottaa ja vapauttaa GGTI yhdiste sisällä solujen toiminnan ja esti proteiinin geranylgeranylation. Koska pH-liposomien osoittavat merkittävää epävakautta alle pH 6, mikä vastaa pH: endolysosome sisätila, pH-liposomit olivat todennäköisesti epätasapainoon tai fuusioida endosomaalisiin kalvot johtaen lääkeaineen vapautumista lastin sytosoliin, estämällä GGTase-I ja esto Rap1 prenylaatio. Tutkia pH-herkkyys GGTI vapautumisen, sama koe toistettiin sen jälkeen, käsittelemällä soluja pH-muuttamalla yhdisteen bafilomysiini A1. Kuten on esitetty kuviossa 4A, hoito bafilomysiini A1 poistetaan vaikutus liposomaalisen-GGTI on Rap1 prenylaatio. Tämä on sopusoinnussa ajatus, että lisääntynyt pH lysosomeihin muuttaa bafilomysiini A1 voinut horjuttaa pH-liposomien enää siis GGTIs pidettiin sisällä liposomeja. Siksi, kun tarttunut solut, happamuus endosomien on kriittinen epävakautta ja /tai fuusio pH-liposomien endolysosome tehokasta vapauttamista ja sisällön siirtämistä sytosoliin.

Liposomal GGTI syyt inhibitio leviämisen haiman ja Lung Cancer Cells

vaikutus lääkeaineen vapautumista pH-liposomeja tutkittiin solujen lisääntymisen määrityksessä. Haimasyöpä solulinja MiaPaca-2 käsiteltiin kuormittamattomassa liposomit, GGTI liposomit tai vapaa GGTI (sama tilavuus puskuria) eri pitoisuuksilla 72 tunnin ajan. Kuten on esitetty kuviossa 4B, merkittävää proliferaation esto havaittiin GGTI-ladattu liposomiin. Tämä inhibitio oli samanlainen tai parempi kuin mitä havaittiin vapaa GGTI. Sen sijaan tyhjä liposomit ei vaikuttanut solujen lisääntymistä jopa 180 ug /ml. Liposomit itse näyttävät olevan myrkyttömiä näillä pitoisuuksilla.

Yksi tärkeimmistä ominaisuuksista GGTI on, että ne aiheuttavat solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa. Sen tutkimiseksi, onko tämä koskee solun vaikutuksia käyttäen liposomaalinen GGTI, solut, joita käsiteltiin liposomiin GGTI analysoitiin virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa 4C, hoito MiaPaca-2-solut joko GGTI liuoksen tai Lipo-GGTI 24 tuntia aiheutti rikastumista G1 vaiheessa olevien solujen, kun taas prosenttiosuus S-vaiheessa olevien solujen väheni näitä hoitoja. Prosenttiosuus G2-solujen muuttunut vain hieman.

Olemme aiemmin osoittaneet, että GGTI indusoi solusykliä säädin p21

CIP1 /WAF1 [7]. Induktio tämän sykliiniriippuvaisen kinaasin inhibiittori johtaa kertyminen G1 vaiheen soluja. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että RhoA on yksi tärkeimmistä tavoitteista GGTI ja että RhoA estää p21

CIP1 /WAF1 ilme. Sen tutkimiseksi, liposomaalinen-GGTI indusoi p21

CIP1 /WAF1 ilme, käsittelimme MiaPaca-2 solujen liposomaalisen GGTI ja suorittaa Western-analyysi. Kuten on esitetty kuviossa 4D, merkittävä induktio p21

CIP1 /WAF1 havaittiin käsittelemällä liposomaalisen GGTI.

Aiemmissa tutkimuksissa osoitimme, että GGTI P61A6 esti sekä haiman ja keuhkojen syöpäsoluja eläimen malleja, siis, testasimme myös liposomaalinen GGTI eri keuhkosyövän solulinjat, H596, H358 ja A549 sekä normaaleissa keuhkoputken epiteelisolulinja BEAS-2B. Kuten on esitetty kuviossa 5, verrattuna puretaan liposomit, liposomi-GGTI osoitti merkittävää soluproliferaatiota inhibitio erilaisia ​​ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat testattiin. Liposomaalinen GGTI tukahdutetaan noin 60-80% soluproliferaation, kun taas sama pitoisuus tyhjien liposomien ei. Mielenkiintoista, normaali ihmisen keuhkoputken epiteelin solulinjaa BEAS-2B osoittivat odottamattoman voimakasta vastarintaa liposomaalisen GGTI verrattuna keuhko- syöpäsoluja. Mekanismi tätä vastus ei tiedetä ja optio lisätutkimuksia.

Cell numerot jälkeen 72 tunnin hoidot esitetään prosentteina käsittelemättömien solujen. Tyhjät liposomit eivät vaikuta leviämistä. Symboli * tarkoittaa tilastollisesti merkittävää eroa P-arvo 0.05.

Liposomalia GGTI synergoi FTI (famesyylitransferaasin estäjä) proliferaation inhiboimiseksi K-Ras Activated Syöpäsolut

Edellä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että liposomaalinen-GGTI on uudenlainen syövän vastaisen lääkkeet, jotka on mahdollista toimitetaan kasvain. Tämä avaa mahdollisuuden, että sitä voidaan käyttää estämään K-Ras signalointi, joka on aktivoitu useissa ihmisen syövän tapauksissa, mukaan lukien haima-, keuhko- ja paksusuolen syöpiä. Ras proteiinit, erityisesti K-Ras, voidaan vaihtoehtoisesti prenyloituja joko Ftase tai GGTase-I [43-45].