Krooninen sairaus

tiivistelmä

Using cell perustuva seulonta-analyysistä, me tunnistaneet uuden anti-tubuliinin aine (Z) -5- ((5- (4-bromi-3-kloorifenyyli) furaani-2-yyli) metyleeni) -2-tioksotiatsolidin-4-oni (BCFMT), joka inhiboi proliferaatiota ihmisen kohdunkaulansyövän (HeLa) (IC

50, 7,2 ± 1,8 uM), ihmisen rinta- adenokarsinooma (MCF-7) (IC

50, 10,0 ± 0,5 uM), erittäin metastaattisen rintasyövän adenokarsinoomaa (MDA-MB-231) (IC

50, 6,0 ± 1 uM), sisplatiini-resistenttejä ihmisen munasarjasyövän (A2780-cis) (IC

50, 5,8 ± 0,3 uM) ja monilääkeresistentin hiiren maitorauhasen kasvain (EMT6 /AR1) (IC

50, 6,5 ± 1 uM) soluihin. Käyttämällä useita ilmainen strategioita, BCFMT havaittiin estävän syöpäsolun uudiskasvua G2 /M-vaiheen solusyklin ilmeisesti kohdistamalla mikrotubulusten. Lisäksi, BCFMT suppressoi voimakkaasti dynamiikkaa yksittäisten mikrotubulusten elävien MCF-7-soluissa. Sen puoli maksimaalisen proliferaation estävä pitoisuus (10 uM), BCFMT vähensi määrien kasvaa ja lyhentää vaiheet mikrotubulusten MCF-7-solut 37 ja 40%, vastaavasti. Lisäksi se lisäsi aika mikrotubulusten vietetty tauko (ei kasvava eikä lyhentämällä havaittavasti) tilaan 135% ja pienensi dynaamisuutta (dimeeri vaihto aikayksikössä) mikrotubulushaarojen 70%.

In vitro

, BCFMT sidottu tubuliinin kanssa dissosiaatiovakio 8,3 ± 1,8 uM, esti tubuliinia kokoonpano ja tukahdutti GTPaasi aktiivisuutta mikrotubulusten. BCFMT kompetitiivisesti inhiboi BODIPY FL-vinblastiini ja tubuliinin kanssa estävä pitoisuus (K

i) on 5,2 ± 1,5 uM viittaa siihen, että se sitoutuu tubuliiniin on vinblastiini päällä. Viljellyissä soluissa, BCFMT-hoito depolymeroitua interphase mikrotubulukset, levoton kara organisaatio ja kertynyt tarkistuspisteen proteiinit (bubR1: tä ja Mad2) klo Kinetokori. BCFMT saaneilla MCF-7-solut osoittivat tehostettu tumakertymään p53 ja sen loppupään p21, joka siis aktivoitua apoptoosia näissä soluissa. Tulokset viittasivat siihen, että BCFMT estää lisääntyminen useiden syöpätyyppien solujen kuten lääkeresistenssin solut tukahduttamalla mikrotubulusdynamiikan ja osoitti, että yhdiste voi olla kemoterapeuttinen potentiaali.

Citation: Rai A, Surolia A, Panda D (2012) Antitubulin Agent BCFMT Estää syöpäsolujen lisääntymistä ja indusoi solukuoleman estämällä mikrotubulusdynamiikan. PLoS ONE 7 (8): e44311. doi: 10,1371 /journal.pone.0044311

Toimittaja: Miklos S. Kellermayer, Semmelweis University, Unkari

vastaanotettu: 27 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 01 elokuu 2012; Julkaistu: 31 elokuu 2012

Copyright: © Rai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: D.P. tukee DAE-SRC apurahan, Department of Atomic energiaa. A.S. tukee J. C. Bose apurahan, Intian hallitukselle. A. R. on CSIR (neuvoston Scientific Industrial Research) fellow. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Co-kirjailija Avadhesha Surolia on PLoS ONE Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

vastustuskyvyn kehittymistä nykyisten syöpälääkkeiden ja kasvaimen etäpesäke ovat suurimpia esteitä syöpähoidon [1], [2]. Cell perustuu sytotoksisuusmäärityksissä on todettu olevan houkutteleva seulontamenetelmä löytää syövän vastaisia ​​aineita. Useat kliinisesti tehokkaita syövän vastaiset aineet olivat ensin tunnistettiin suuren suoritustehon seulonnan [3] – [6]. Esimerkiksi taksolin havaittiin ensimmäisen läpi suurikapasiteettisten soluun perustuva seulonta-analyysi [6].

Mikrotubulukset ovat rakenneosat sukkularihmaston ja dynaaminen mikrotubulusten tärkeä rooli useissa solun prosesseissa kuten solunsisäistä kuljetusta, solu muuttoliike ja solunjakautumisen [7]. Useat mitoosi-inhibiittorit tiedetään estävän mikrotubulusten kokoonpanoa [8] – [12] ja estämällä mikrotubulusten kokoonpanoa dynamiikka on osoitettu olevan toimintatavan useita kliinisesti menestyksekäs syöpälääkkeet, kuten vinblastiini, vinkristiini, estramustiini ja paklitakseli [11 ], [12]. Lisäksi niiden kliinisiä sovelluksia on monentyyppisiä sairauksia kuten syöpää, sieni- ja loistaudit [13], mikrotubulusten inhibiittorit ovat myös erittäin hyödyllisiä ymmärtämiseksi rooli mikrotubulusten solun prosessien [14], [15]. Mikrotubulusproteiinit inhibiittorit yleensä estävät solusyklin etenemistä mitoosin ja pitkittynyt mitoosi-pidätys laukaisee eri apoptoottisten reittien [12], [16], [17].

rodaniini johdettuja yhdisteitä hankkimalla huomiota kemoterapiassa läsnäolosta heterosyklinen rengas (2-tioksotiatsolidin-4-oni) emoyhtiön tukirunkoja [18]. Substituutiot heterosyklisen renkaan tarjoavat erinomaisen mahdollisuuden muotoilla uusia johdannaisia, joilla on laaja valikoima biologisia vaikutuksia [18]. Biologinen toiminta rodaniini johdettujen yhdisteiden on tutkittu monissa tutkimuksissa [18] ja näiden aineiden esillä antibakteerisia [19], [20], malarialääkkeitä [21], viruslääkkeiden [22] ja syövän vastaista potentiaalia [23]. Tässä työssä olemme tavoitteena oli löytää uutta kemiallista yhdistettä, jolla on antiproliferatiivisia ja mitoosia toimintaa suuri osajoukko (kirjaston 156-yhdisteet) rodaniinia johdettu telineiden kanssa ajatus, että yhdiste voi olla syöpää ehkäisevistä potentiaalia.

Olemme havainneet, että kolme yhdistettä eli (E) -5 – ((5- (2-metyyli-5-nitrofenyyli) furan-2-yyli) metyleeni) -2-tioksotiatsolidin-4-oni (MNFMT), (E) -5 – (3,5-dikloori-4-hydroksibentsylideeni) -3-fenyyli-2-tioksotiatsolidin-4-oni (DHBPT) ja (Z) -5 – ((5- (4-bromi-3-kloorifenyyli) furaani-2 yyli) metyleeni) -2-tioksotiatsolidin-4-oni (BCFMT) inhiboivat HeLa ja MCF-7-soluille. Näiden yhdisteiden joukossa, BCFMT todettiin lisäävän mitoottiseen solupopulaation HeLa ja MCF-7-soluissa voimakkaammin kuin muut kaksi yhdistettä. BCFMT esti kokoonpano puhdistetun tubuliinin

in vitro

ja viljellyissä soluissa, kun taas MNFMT ja DHBPT ei havaittu merkittävää vaikutusta tubuliinia kokoonpanoon. Saimme useita rivejä todisteita siitä, että BCFMT kykenee sen antiproliferatiivista ja mitoosia toimintaa hillitsevä dynaaminen epävakaus yksittäisten mikrotubulusten viljellyissä soluissa kautta sitova, vinblastiini sivuston tubuliinia. Lisäksi BCFMT voimakkaasti inhiboivat lääkkeille vastustuskykyiset eli sisplatiini vastustuskykyisiä ihmisen munasarjasyöpäpotilailla A2780-cis ja monilääkeresistentin hiiren maitorauhasen kasvain EMT6 /AR1 soluja ja erittäin metastaattinen MDA-MB-231-solujen viittaa siihen, että se saattaa olla kemoterapeuttisia potentiaalia.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

sulforodamiini B, naudan seerumialbumiini, hiiren anti-α-tubuliinin IgG, hiiren anti-β-aktiini-IgG, FITC konjugoitua anti-kani-IgG saatiin Sigma, St. Louis, MO, USA. Alexa Fluor 568 vuohen anti-hiiri-IgG hankittiin Molecular Probes, Invitrogen, CA, USA. Hiiren anti-sykliini B1, kanin anti-p-histoni H3 (Ser 10), hiiren anti-p53 IgG, hiiren anti-p21 IgG-vasta-aineita ja apoptoosin havaitsemiseen Kit (anneksiini V-propidiumjodidia) ostettiin Santa Cruz Biotechnology, CA, USA. Hiiren anti-bubR1: tä IgG saatiin BD Biosciences, CA, USA. Kanin anti-Mad2 IgG hankittiin Bethyl laboratorioista, Montgomery, USA. Hiiren anti-Hec1 IgG hankittiin Abcam, Cambridge, MA, USA. Naudan sikiön seerumia saatiin Biowest, Nuaille, Ranska. Kaikki muut reagenssit olivat analyysilaatua ja Sigma, MO, USA ja Himedia, Mumbai, Intia. Kaikki testatut yhdisteet saatiin Chembridge Corporation, San Diego, CA, USA.

Cell Culture

Ihmisen kohdunkaulan karsinooman (HeLa), ihmisen rinta- adenokarsinooma (MCF-7), ja metastaattisen rintasyövän adenokarsinooma ( MDA-MB-231) solut saatiin solusta varasto National Center for Cell Science, (NCC) Pune, Intia. NCC ominaista solut mt-rDNA-sekvenssin vahvistamiseksi lajeja. Nämä solulinjat havaittiin olevan mykoplasmaa. Sisplatiini-resistenttejä ihmisen munasarjasyövän (A2780-cis) solujen ja monilääkeresistentin hiiren maitorauhasen kasvain (EMT6 /AR1) solut hankittiin Sigmalta, St. Louis, MO, USA. Solulinja todennus tehtiin lyhyt tandem repeat profilointia ja isoentsyymiä analyysi toimittajan ja kerrottiin myös negatiiviseksi Mycoplasma.

HeLa ja MCF-7-soluja viljeltiin Eaglen Minimal Essential Medium (MEM). MDA-MB-231-soluja kasvatettiin Leibovitzin L-15 Medium. A2780-cis-soluja ylläpidettiin RPMI-1640-väliainetta, joka sisälsi 1 uM sisplatiinia. EMT6 /AR1 soluja kasvatettiin MEM-elatusainetta, joka sisälsi 1 ug /ml doksorubisiinia. Media oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2,2 g /l natriumbikarbonaattia ja 1% antibiootti-antimykoottia, joka sisälsi streptomysiiniä, amfoterisiini B: tä ja penisilliiniä. Soluja kasvatettiin ja pidettiin 37 ° C: ssa inkubaattorissa ssa kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2 ja 95% ilmaa.

Seulonta antiproliferatiivinen rodaniini Sarja yhdisteiden

antiproliferatiivinen potentiaali 156 rodaniinin johdettujen yhdisteiden vastaan ​​HeLa-soluista määritettiin sulforodamiini B määrityksellä [24], [25]. HeLa-soluja (1 x 10

5 solua /ml) siirrostettiin 96-kuoppaisille soluviljelylevyille. Varastot yhdisteet valmistettiin DMSO. Kun oli kulunut 24 h kylvö, elatusaine korvattiin tuoreella väliaineella, joka sisälsi joko vehikkeliä (0,1% DMSO) tai 2 uM kutakin rodaniini yhdisteitä. 24 tunnin inkubaation erilaisia ​​yhdisteitä, solut kiinnitettiin 10% TCA ja käsitellään sulforodamiini B määritys [24], [25].

Voit selvittää puoleen maksimaalisesta estävä pitoisuus (IC

50) ja MNFMT, DHBPT ja BCFMT, 1 x 10

5 solua /ml HeLa- ja MCF-7-solut ympättiin 96-kuoppaisille soluviljelylevyille. Eri pitoisuuksia yhdisteet laimennettiin median ja lisättiin kuoppiin 24 tunnin kuluttua solujen ymppäämisen. HeLa ja MCF-7-soluja kasvatettiin poissa ollessa ja läsnä yhdisteiden 24 h ja 48 h, vastaavasti. Solujen lisääntymisen inhibitio läsnä ollessa yhdisteiden määritettiin käyttämällä standardia sulforodamiini B määrityksessä. Tiedot olivat keskimäärin kolmen erillisen kokeen.

valonsironta Experiment

The effects of MNFMT, DHBPT tai BCFMT kokoonpanoon puhdistetun tubuliinin seurattiin valonsironta 400 nm. Tubuliinia puhdistettiin kuten aiemmin on kuvattu [26], [27]. Tubuliinin (10 pM) PEM-puskurissa (25 mM PIPES, pH 6,8, 3 mM MgCI

2, 1 mM EGTA) ja 1 M glutamaattia inkuboitiin ilman, ja eri pitoisuudet MNFMT, DHBPT tai BCFMT jäissä 10 min. Sitten 1 mM GTP lisättiin reaktioseosten ja kokoonpanoa kinetiikkaa seurattiin 37 ° C: ssa käyttäen FP-6500 spektrofluoro- JASCO, Tokio, Japani.

Elektronimikroskopian

Tubuliinin (10 uM) polymeroitiin ilman tai 25 ja 50 uM BCFMT 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan, kuten edellä on kuvattu. Näytteet kiinnitettiin 0,5% glutaraldehydillä, siirretään hiili-formvar päällystetty verkot (Electron Microscopy Sciences, USA) ja värjättiin negatiivisesti 2% uranyyliasetaatilla. Näytteet visualisoitiin elektronimikroskoopilla (Tecnai G

212, FEI, Eindhoven, Alankomaat).

vaikutukset BCFMT on GTPaasi aktiivisuus Mikrotubulukset in vitro

Tubulin (25 uM) in 4 M glyseroli, 5 mM MgCl

2 ja 1 mM GTP: tä polymeroitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Mikrotubuluksen siemenet tuotetaan leikkaamalla polymeerien läpi 23 gaugen neulan 5 ml: n ruiskuun. Tubuliinin (15 pM) PEM-puskuria ja 1 mM GTP polymeroitiin lisäämällä 20% (v /v), mikrotubulusten siemenet 37 ° C: ssa 10 min. 10 minuutin kuluttua polymeroinnin, eri pitoisuuksia BCFMT lisättiin reaktioon seoksia ja edelleen polymeroidaan 30 minuutin ajan. Hydrolyysireaktio keskeytettiin lisäämällä 10% (v /v) 7 M perkloorihappoa ja epäorgaanisen fosfaatin määrää vapautuu määritettiin malakiittivihreän määrityksellä [28].

mittaaminen dissosiaatiovakio Binding ja BCFMT tubuliiniin käyttäminen tryptofaani fluoresenssi Tubulin

Tubulin (2 uM) 25 mM PIPES-puskuria, pH 6,8, inkuboitiin ilman, ja eri konsentraatioilla BCFMT 25 ° C: ssa 20 min. Fluoresenssin intensiteetin seurattiin jännittävää reaktioseos 295 nm ja emissiospektrin kirjattiin välillä 310 nm 370 nm. Fluoresenssin solu 0,3 cm valotien pituus oli käytetty ja fluoresenssin intensiteetit korjattiin sisemmän suodattimen vaikutus kaavalla

Fluoresenssi tiedot sovitettiin seuraavan yhtälön; Jos AF on muutos fluoresenssin voimakkuus tubuliinin läsnä ollessa BCFMT, AF

max on suurin muutos fluoresenssin voimakkuus tubuliinia, kun se on kyllästetty BCFMT ja C on konsentraatio BCFMT. Dissosiaatiovakio (K

d) BCFMT sitoutumisesta tubuliinia arvioitiin käyttäen Graph Pad Prism 5 ohjelmisto (Graph Pad Software, CA, USA).

vaikutus BCFMT on BODIPY FL-vinblastiini Sitoutuminen tubuliinia

tubuliinia (2 uM) 25 mM PIPES-puskuria, pH 6,8, inkuboitiin ilman, ja 10, 25 ja 50 uM BCFMT 20 minuutin ajan 25 ° C: ssa. BODIPY FL-vinblastiini (2 uM) lisättiin reaktioseosten ja inkuboitiin 25 ° C: ssa vielä 20 min pimeässä. Tubuliinia BODIPY FL-vinblastiinin kompleksi viritettiin 490 nm ja emissio spektrin otettiin alueella 500-550 nm [29]. Spektri BODIPY FL-vinblastiini ilman tubuliinia seurattiin myös.

Immunofluoresenssimikroskopia

MCF-7 tai HeLa-soluja ympättiin tiheydellä 5 x 10

4 solut /ml polylysiinipohjaisilla pinnoitettu lasipeitinlevyn 24-kuoppaisille soluviljelylevy. Kun oli kulunut 24 h kylvö, eri pitoisuuksia BCFMT lisättiin kuoppiin. Kontrollisoluja käsiteltiin vehikkelillä (0,1% DMSO). Kun oli kulunut 24 tai 48 tunnin inkubaation BCFMT, immunovärjäys suoritettiin käyttäen vasta-ainetta vastaan, α-tubuliinin, p53, p21, bubR1: tä, sykliini B1, β-aktiini (1 ° 1:300, 2 ° 1:300 Alexa-568-leimattua), phosphohistone-H3 (Ser 10) (1 ° 1:300, 2 ° 1:300 FITC-leimatut), Hec 1 (1 ° 1:800, 2 ° 1:800 Alexa-568-leimattu) ja Mad2 (1 ° 1:500 2 ° 1:500 FITC-leimatut) kuten aiemmin on kuvattu [29] – [32]. DNA värjättiin Hoechst 33258 (1 ug /ml). Kuvat otettiin Eclipse TE 2000U mikroskooppi (Nikon, Tokio, Japani) 40 x suurennus ja käsitellään käyttäen Image-Pro Plus ohjelmisto (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

mittaukset mikrotubulusdynamiikan vuonna MCF- 7 solut

transfektio EGFP-α tubuliinin rakentaa MCF-7-soluissa tehtiin käyttämällä Lipofectamine-2000 [29]. Kineettiset parametrit dynaamiselle epävakaus mikrotubulusten määritettiin kuten aiemmin on kuvattu [8], [31] – [34].

Western blot -analyysi

MCF-7-soluja inkuboitiin ilman ja läsnä oli 20 ja 40 uM BCFMT 36 tuntia. Vaikutus polymeroitu määrä mikrotubulusten soluissa määritettiin western-blottauksella käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta varten α-tubuliinin kuten aiemmin on kuvattu [31]. Intensiteetti proteiinivyöhykkeet laskettiin käyttäen Image J ohjelmistoversiota 1.43u.

vaikutukset BCFMT kinetiikkaan vapauttamisesta nokodatsoli aiheuttaman Mitoottista Block MCF-7 soluissa

MCF-7 soluja blokattiin M vaiheessa solusyklin kuluttua 24 h hoidon 1pM nokodatsoli. Voit poistaa nokodatsolin solut cytospinned ja pestiin huolellisesti kolme kertaa tuoreella media. Jälkeen nokodatsoli poistamisen, soluja inkuboitiin poissa ja läsnä ollessa 40 uM BCFMT 37 ° C: ssa. Solut kiinnitettiin 0, 1, 2 ja 4 h inkuboinnin BCFMT 37 ° C: ssa inkubaattorissa. Kiinnitettyjä soluja värjättiin Hoechst 33258 ja mitoosi solut sijoitettiin (n = 3, kussakin asetettu 1000 solut laskettiin).

anneksiini V /PI-värjäys

MCF-7-solut (5 × 10

4 solua /ml) ympättiin polylysiinipohjaisilla pinnoitettu lasipeitinlevyn in 24-kuoppaisen soluviljelylevy. 24 tunnin kuluttua kylvö, soluja inkuboitiin ilman ja eri pitoisuuksia BCFMT 48 tuntia. Solut kerättiin cytospinning 2400 rpm 30 ° C: ssa 10 min. Anneksiini V /PI värjäys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [30].

Tulokset

Effects of rodaniini johdannaisten leviämisen HeLa ja MCF-7 soluissa

Tutkimme antiproliferatiivinen potentiaalin 156 rodaniinin yhdisteiden käyttäen HeLa-soluja. Niistä 156 yhdisteet, kolme yhdisteet, MNFMT, DHBPT ja BCFMT (Fig. 1A), havaittiin estävän HeLa-solujen lisääntymisen 30% 2 uM. MNFMT, DHBPT ja BCFMT valittiin jatkotutkimuksiin. MNFMT, DHBPT ja BCFMT inhiboivat HeLa (Fig. 1 B) ja MCF-7 (Fig. 1 C) solut puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC

50) 16,8 ± 1, 7,3 ± 0,4, 7,2 ± 1,8 uM, ja 12,2 ± 0,3, 4,9 ± 0,3 ja 10,0 ± 0,5 uM, tässä järjestyksessä.

(A) rakenteet MNFMT, DHBPT ja BCFMT. (B Siksi me tutkia edelleen Antimitoottisten aktiivisuutta BCFMT.

BCFMT lisäsi Mitoottista indeksi MCF-7 ja HeLa Cells

mitoosi soluissa histoni H3 saa fosforyloitiin seriini 10 [36 ], ja sitä käytetään markkerina mitoosi-soluja. BCFMT hoito lisäsi phosphohistone-H3 positiivisia soluja (kuvio S1 tukevat tiedot). Esimerkiksi, 2 ± 0,5%, 7 ± 1%, ja 11,5 ± 1,5% solujen havaittiin olevan phosphohistone-H3 positiiviseksi poissa ja läsnä ollessa 20 ja 40 uM BCFMT, vastaavasti. Edelleen BCFMT-hoito lisäsi metafaasivaiheen /Anaphase suhde MCF-7-soluissa. Ajoneuvon käsitellyn MCF-7-soluissa, metafaasivaiheen /anafaasia-suhteen määritettiin olevan 2,7 ± 1,2, kun taas, kun läsnä on 20, 30 ja 40 uM BCFMT, metafaasivaiheen /anafaasia-suhteet määritettiin olevan 5 ± 1, 10 ± 2 (p 0,001) ja 15 ± 1 (p 0,001) (n = 3, kussakin asetettu 1000 solut laskettiin), vastaavasti. Lisääntynyt mitoosi-indeksi ja metafaasi /anafaasia suhde ehdotti, että BCFMT inhiboi solusykliä MCF-7-solujen mitoosin. BCFMT havaitsi myös tukahduttaa mitoosi etenemistä HeLa-solujen määritettynä mitoosi-indeksi, phosphohistone-H3 värjäys ja metafaasissa /Anaphase suhde (kuva S2 tukeminen Information).

Lisäksi BCFMT hoito todettiin viivästyttää kinetiikkaa vapauttamista nocodazole- aiheuttama mitoottisten lohko MCF-7-soluissa. Esimerkiksi 60% soluista havaittiin olevan mitoosin aikaan nokodatsoli washout, kun taas 30%, 15% ja 5% soluja on mitoosi vaiheen jälkeen 1, 2 ja 4 h vapautumista nokodatsoli lohkon. Kun läsnä on 40 uM BCFMT, 46%, 38% ja 30% solujen havaittiin olevan mitoosi vaiheen jälkeen 1, 2 ja 4 h lohkon vapautumisen viittaa siihen, että BCFMT voi estää mitoosi-etenemistä.

BCFMT esti in vitro Tubuliinipolymerisaatio

Koska BCFMT esti solusyklin etenemisen klo M vaiheessa solusyklin; me tutki BCFMT voisi häiritä mikrotubulusten kokoonpanoa

in vitro

ja viljellyissä soluissa. BCFMT esti kokoonpano puhdistetun tubuliinin pitoisuutena riippuvaisella tavalla (kuvio. 2A). Esimerkiksi, kun läsnä on 25, 50 ja 100 uM BCFMT laajuus tubuliinin polymerisaatiota inhiboitui 27 ± 3%, 38 ± 4,5% ja 64 ± 3%, vastaavasti. Alkuperäinen kasvu valon sirontaintensiteettien mikrotubulusverkoston kokoonpano reaktion määritettiin olevan 0,97 ± 0,03, 0,54 ± 0,07 ja 0,28 ± 0,06 (AU /s) ilman ja läsnäolo 50 ja 100 uM BCFMT, vastaavasti osoittaen että BCFMT vähensi voimakkaasti alkunopeus tubuliinin kokoonpano. Nimikroskooppikuvia ohjaus osoitti tyypillisen mikrotubulusten polymeerit (Fig. 2B). Läsnäollessa 25pM BCFMT, vähemmän mikrotubulusten havaittiin kohti seuranta-alalla kuin kontrolli. Lisäksi aiheuttamaa aggregaatiota tubuliinidimeereistä. Kun läsnä on 50 uM BCFMT, mikrotubulusten muodostumiseen oli inhiboi voimakkaasti ja vain tubuliinin aggregaattien havaittiin (Fig. 2B). Samanlaisissa olosuhteissa DHBPT ja MNFMT ei ollut merkittävää vaikutusta mikrotubulusten kokoonpanoa. Esimerkiksi 50 uM DHBPT ei ollut havaittavaa vaikutusta valonsironta mikrotubulusten kokoonpanoa ja 50 uM MNFMT laski valon sironta mikrotubulusten kokoonpanoa vain 10%.

(A) Tubuliinin (10 uM) polymeroitiin puuttuessa (▪) ja läsnä oli 10 (◊), 25 (▴), 50 (x), 75 (○) ja 100 (□) uM BCFMT. (B) nimikroskooppikuvia tubuliinin polymeerien poissa ja läsnä ollessa 25 ja 50 uM BCFMT. Mittakaavapalkki on 2000 nm. (C) BCFMT tukahdutti GTPaasi aktiivisuutta mikrotubulusten. Vaikutukset Vinblastiinin on GTPaasi aktiivisuutta mikrotubulusten samanlaisissa koeolosuhteissa näkyvät upotettavat. Data olivat keskimäärin kolmen erillisen kokeen. Pylväät edustavat ± SD.

Lisäksi olemme määritti BCFMT on GTPaasi aktiivisuutta mikrotubulusten. BCFMT vähentynyt vapautuminen epäorgaanisen fosfaatin pitoisuudessa riippuvaisella tavalla. Esimerkiksi 20, 30 ja 50 uM BCFMT vähensi epäorgaanisen fosfaatin määrää vapauttaa 17%, 25% ja 32%, vastaavasti (Fig. 2C). Samanlaisissa koeolosuhteissa, 1, 2, 4 ja 10 uM vinblastiinin vähensi epäorgaanisen fosfaatin määrää vapauttaa 12%, 20%, 25% ja 35%, vastaavasti, mikä osoittaa, että BCFMT estää GTPaasi-aktiivisuus mikrotubulusten kuten vinblastiinin (Fig. 2C upotettu).

karakterisointi sitoutuminen BCFMT tubuliiniin

luontainen tryptofaanin fluoresenssi tubuliinin on laajalti käytetty määrittämään sitoutumisvakio ligandin tubuliiniin [37]. BCFMT vähentää luontaista tryptofaanin fluoresenssin voimakkuus tubuliinin pitoisuutena riippuvaisella tavalla (kuvio. 3A). Esimerkiksi, kun läsnä on 10 uM BCFMT tryptofaanin fluoresenssi tubuliinin väheni 21 ± 2,5%. Sovittamalla fluoresenssi muutoksia sitovalla isotermi tuotti K

d 8,3 ± 1,8 uM (Fig. 3B).

(A) vaikutukset BCFMT on tryptofaanin fluoresenssispektrejä tubuliinin näkyvät. Spektrit seurattiin puuttuessa (♦) ja läsnä oli 0,25 (▪), 0,5 (▴), 1 (x), 2 (-), 5 (○), 7 (l) ja 10 (•) uM BCFMT. (B) muutos fluoresenssin voimakkuus tubuliinin (AF) piirrettiin konsentraation BCFMT. Dissosiaatiovakio (K

d) BCFMT sitoutumisesta tubuliinia arvioitiin käyttämällä yhtälöä on kuvattu menetelmissä. Tiedot olivat keskimäärin neljä toisistaan ​​riippumatonta koetta. (C) vähentäminen fluoresenssin voimakkuus tubulin- BODIPY FL-vinblastiini kompleksin puuttuessa (♦) ja läsnä oli 10 (▪), 25 (▴) ja 50 (•) uM BCFMT. (D) Tubuliinin (2 uM) 25 mM PIPES-puskuria (pH 6,8) inkuboitiin ilman, ja eri pitoisuuksilla (5, 10, 15, 20, 25 uM) BCFMT 25 ° C: ssa 20 min. Kolme tällaista erilaista valmisteltiin. Kun 20 minuutin inkuboinnin, yhdet 2 uM (♦), ja toisen sarjan 4 uM (▴) ja kolmas sarja 6 uM (▪) BODIPY FL-vinblastiinin lisättiin. Fluoresenssi tubuliinia BODIPY FL-vinblastiinin kompleksi mitattiin ja estävä pitoisuus (Ki) laskettiin modifioitu Dixon juoni.

estäjät tubuliinin kokoonpanon yleensä joko sitoutuvat vinblastiini tai kolkisiini sitoutumiskohdat tubuliinin [11], [12]. Siksi me tutki BCFMT sitoutuu tubuliinin tällä kolkisiinin sivuston avulla kolkisiinin-tubuliinin fluoresenssi [38]. BCFMT (10 ja 20 uM) ei estänyt kehitystä kolkisiinin-tubuliinin fluoresenssi osoittaa, että se ei estänyt sitovaa kolkisiinin tubuliiniin (kuva S3 tukeminen Information). BODIPY FL-vinblastiini on käytetty koetin sitoutumiskohdan vinblastiinin tubuliinin [29]. Fluoresenssin voimakkuus BODIPY FL-vinblastiini kasvoi sitoutumisen tubuliinia (Fig. 3C). Vinblastiini vähensi fluoresenssin parantamiseksi BODIPY FL-vinblastiinin viittaa siihen, että se sitoutuu vinblastiini sivuston tubuliinia. BCFMT vähensi myös fluoresenssin BODIPY FL-vinblastiini-tubuliinin kompleksin pitoisuus riippuvaisella tavalla osoittaen, että BCFMT inhiboi BODIPY FL-vinblastiini tubuliiniin (Fig. 3C). Esimerkiksi 10, 25 ja 50 uM BCFMT laski fluoresenssi BODIPY FL-vinblastiini-tubuliinin kompleksin 40 ± 2,5%, 51 ± 3% ja 64 ± 4%: lla.

Lisäksi, BODIPY FL- vinblastiini osoitti merkittävää kasvua fluoresenssipolarisaatiossa arvo, kun se oli sitoutunut tubuliinin (kuva S4 olevat tiedot). Sisällyttäminen BCFMT reaktiossa miljöössä pieneni polarisaatio BODIPY FL-vinblastiinin osoittaa, että se vähensi sitoutumisen BODIPY FL-vinblastiinin tubuliiniin. Kontrolliin verrattuna, 20 ± 3%, 31 ± 4% ja 49 ± 2%: n vähennys fluoresenssin polarisaation arvot tubuliinia BODIPY FL-vinblastiini havaittiin, kun läsnä oli 10, 25 ja 50 uM BCFMT, vastaavasti.

Koska BCFMT esti BODIPY FL-vinblastiinin sitoutumista tubuliinin selvitimme tilan eston käyttämällä muunnettua Dixon juoni [39]. Analyysi muunnetun Dixon juoni ehdotti, että BCFMT inhiboi BODIPY FL-vinblastiinin tubuliiniin kilpailukykyisesti kanssa estävä pitoisuus (K

i) 5,2 ± 1,5 uM (Fig. 3d).

lyhyt altistuminen BCFMT depolymerisoitunut mikrotubulukset MCF-7 solut

vaikutuksen tutkimiseksi BCFMT cellular mikrotubulusten, MCF-7-soluja inkuboitiin ilman, ja 40 uM BCFMT 3 tuntia. Ajoneuvo-käsitellyt solut näytetään tyypilliset verkko mikrotubulushaarojen taas BCFMT (40 uM) käsitellyt solut osoittivat merkittävää depolymeroitumisen mikrotubulusten (Fig. 4A). Mikrotubuluksen polymeerit eivät näkyneet 40 uM BCFMT käsiteltyjä soluja; diffuusin värjäytymisen liukoisen tubuliinin havaittiin käsitellyn MCF-7-soluissa.

(A) Soluja käsiteltiin kanssa ja ilman 40 uM BCFMT: ssa 3 h ja mikrotubulusten värjättiin käyttäen vasta-ainetta vastaan, α-tubuliinin (punainen) . (B) BCFMT levoton interphase mikroputkiorganisaatiota MCF-7-soluissa. MCF-7-soluja inkuboitiin poissa ja läsnä erilaisina pitoisuuksina BCFMT 48 tuntia. Solut kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen vasta-ainetta α-tubuliinin (punainen). (C) BCFMT vähensi Polymeerisen /liukoisen tubuliinin MCF-7-soluissa määritettiin western blot. MCF-7-soluja käsiteltiin ilman (kaista 1) tai 20 uM (kaista 4) ja 40 uM (kaista 5) ja BCFMT 36 tuntia. 20 nM taksoli (kaista 2) ja 200 nM nokodatsoli (kaista 3) käytettiin myös samoissa koeolosuhteissa. Polymeeriset ja liukoinen tubuliinin fraktiot eristettiin ja yhtä suuret määrät proteiineja ladattiin SDS-PAGE. Immunoblottaus tehtiin α-tubuliinin vasta-aine. Koe suoritettiin itsenäisesti kolme kertaa. Näkyy on edustava blot. (D) BCFMT depolymerisoitunut kara mikrotubulusten MCF-7-soluissa. DNA värjättiin sinisellä. Mitta-asteikko on 10 um.

BCFMT depolymerisoitunut Mikrotubulukset MCF-7 ja HeLa Cells

MCF-7 tai HeLa-soluja inkuboitiin eri pitoisuuksia BCFMT yhden solusyklin. BCFMT depolymerisoitunut interphase mikrotubulusten MCF-7-soluissa pitoisuutena riippuvaisella tavalla. Esimerkiksi, mikrotubulusverkoston ei näkyvästi häiritsi, kun läsnä on 10 uM BCFMT ja 20 uM BCFMT indusoi merkittävän depolymeroitumisen interphase mikrotubulusten ja vahva depolymerointi mikrotubulusten havaittiin, kun läsnä oli 30 uM BCFMT (Fig. 4B). Western blot-analyysi osoitti, että vehikkelillä käsitellyssä MCF-7-soluissa, suhde polymeerisen liukoiseen tubuliinin oli 2,2 ± 0,3 kun se oli 1,2 ± 0,1 ja 0,8 ± 0,1, kun läsnä oli 20 ja 40 uM BCFMT, vastaavasti viittaa siihen, että BCFMT hoitoa depolymeroitua solujen mikrotubulusten (Fig. 4C). Polymeerin liukoinen tubuliinin suhde MCF-7-soluissa havaittiin olevan 3,1 ± 0,2, kun läsnä oli 20 nM taksolin ja 1,1 ± 0,1, kun läsnä oli 200 nM nokodatsoli (Fig. 4C). BCFMT-hoito depolymerisoitunut kara mikrotubulusten MCF-7-solut ja myös indusoi muodostumista monopolaarisessa tai moninapaista karan kanssa vinossa kromosomien at metafaasivaiheen levy (Fig. 4D). Samanlaisia ​​sen vaikutuksia MCF-7-solut, BCFMT depolymerisoitunut mikrotubulusten HeLa-soluissa sen tehokas leviämisen estävä konsentraatioalue (kuva S5 siinä olevat tiedot). Kuitenkin BCFMT (15 ja 30 uM) hoito ei häiritse järjestämistä aktiini kuitujen MCF-7-solut (kuva S6 tukevat tiedot).

BCFMT Tukahdetut Microtubule kokoaminen MCF-7 solut

mikrotubulukset oli depolymeroitu inkuboimalla MCF-7-solut jäissä 1 h ja sen jälkeen, kasvukinetiikkaan interphase mikrotubulusten seurattiin inkuboimalla soluja 37 ° C: ssa. Mikrotubulukset ajoneuvon käsiteltyjä soluja kasvoi nopeasti ja saavutti normaalin interphase verkkoon 30 minuutin aikana BCFMT (40 uM) hoito suppressoi voimakkaasti kasvua mikrotubulushaarojen (kuva S7A siinä olevat tiedot).

Lisäksi vaikutus BCFMT kokoonpanoon kinetiikkaan karan mitoosi MCF-7-solut analysoitiin. Solut ensimmäinen estetty mitoosin inkuboimalla niitä 1 uM nokodatsoli 20 tuntia. Solut pestiin huolellisesti tuoreella liuoksella ja edelleen inkuboitiin jäillä 30 min ja ilman 40 uM BCFMT. Sen jälkeen solut laitettiin 37 ° C: ssa ja kokoamista kinetiikka karan mikrotubulusten seurattiin värjäämällä mikrotubulusten eri aikavälein.