Krooninen sairaus

tiivistelmä

latenssi liittyvä peptidi (LAP) – ilmentävät säätelijä-T-solujen ( Tregs) ovat tärkeitä immunologisen Itsetoleranssiprosessi ja immuuni homeostaasiin. Tutkiakseen roolin LAP ihmisen CD4

+ Foxp3

+ Tregs, suunnittelimme poikkileikkaus tutkimus, johon osallistui 42 peräsuolen syöpä (CRC) potilasta. Fenotyypit, sytokiinin vapautumisen kuvioita, ja tukahduttava kyky Tregs eristetty perifeerisestä verestä ja kasvaimen kudokset analysoitiin. Huomasimme, että väestö LAP-positiivisten CD4

+ Foxp3

+ Tregs merkittävästi lisääntynyt ääreisverenkierron ja syövän kudoksissa CRC potilaista verrattuna että perifeerisessä veressä ja kudoksissa terveillä koehenkilöillä. Molemmat LAP

+ ja LAP

– Tregs oli samanlainen efektori /muisti fenotyyppi. Kuitenkin LAP

+ Tregs ilmaistu efektorimolekyyleille, kuten tuumorinekroositekijän reseptori II, grantsyymi B, Perforiinin, Ki67, ja CCR5, kuin niiden LAP

– negatiivinen kollegansa. In vitro immunosuppressiivinen aktiivisuus LAP

+ Tregs, kohdistuu kautta transformoiva kasvutekijä-β-välitteinen mekanismi, oli tehokkaampi kuin LAP

– Tregs. Lisäksi rikastamista LAP

+ Treg väestön perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC) CRC potilaiden korreloi syöpä etäpesäkkeitä. Lopuksi löysimme että LAP

+ Foxp3

+ CD4

+ Treg soluihin edustaa aktivoitua alaryhmä Tregs ottaa voimakkaampi sääntelytoimintaa CRC potilailla. Tihennetystä LAP

+ Tregs vuonna PBMC CRC potilaiden viittaa niiden mahdollinen rooli valvoa syövän immuunivasteen ja esittelee LAP markkerina kasvainspesifisen Tregs CRC potilailla.

Citation: Mahalingam J Lin CY, Chiang JM, Su PJ, Chu YY, Lai HY, et al. (2014) CD4

+ T soluja, jotka ilmentävät latenssi liittyvä peptidi ja Foxp3 ovat Aktivoidut alaryhmä Regulatory T Cells Rikastettu potilailla, joilla on peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (9): e108554. doi: 10,1371 /journal.pone.0108554

Editor: Derya Unutmaz, New York University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 24 elokuu 2014; Julkaistu: 30 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Mahalingam et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science neuvosto, Taiwan (NSC Grant NSC 99-3112-B-182-011, 97-2314-B-182A-027) ja CMRPG 380362, 380743, 392087 Chang Gung Memorial Hospital. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kaikki kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

immunosuppressiiviset toimintoja erikoistunut osajoukko T-solut ovat elintärkeitä immuuni sääntelyä. Säätelijä-T-solujen (Tregs) on keskeinen rooli ylläpidossa perifeerisen Itsetoleranssiprosessi ja immuuni homeostaasiin [1] – [3]. Useat tekijät osoittavat, että forkhead transkriptiotekijä (Foxp3) ilmentävä CD4

+ Tregs ovat heterogeenisiä niiden kehittämiseen ja toimintoja. Siten luonnollinen Tregs katso CD4

+ Foxp3

+ Tregs kateenkorvan alkuperää, kun taas aiheuttama Tregs (iTregs) ovat T-solujen populaation perifeerisesti muunnettu CD4

+ Foxp3

– T-solujen [4] – [6]. Huehn et ai. olivat ensimmäiset toteen erillisten osajoukkojen Tregs, naiivi Tregs ja effektori Tregs, joka perustuu ilmaus CD103, reseptorin α

E-integriiniin, joka ohjaa T-solujen tulehtunut sivustoja [7]. Immunomodulatorinen toiminto aktivoituu tai efektorin Tregs ilmentämiseen liittyvän erilaisten molekyylien, kuten kemokiinireseptoreita CCR6 ja CCR5, sytotoksisten T-lymfosyyttiantigeeniä 4 (CTLA-4), ja tuumorinekroositekijä-reseptori (TNFR) II sitten tutkittu kroonisiin tulehdussairauksiin, käänteishyljintä, ja kasvaimet [8] – [15]. Sakaguchi et ai. edelleen rajattu rooli Foxp3

+ CD4

+ Tregs perustuu ilmaus CD45RA ja Foxp3 ja jaettu CD4

+ Foxp3

+ Tregs kolmeen fenotyypiltään ja toiminnallisesti erillisiä alaryhmiä, nimittäin ei-tukahduttava, lepää, ja aktivoitu Tregs; Jälkimmäisessä uskotaan toimivan vaimentimia immuunivasteen ja välittäjiä immuunijärjestelmän hemostaasin [16]. Meillä oli aiemmin hyväksynyt tämän luokittelun ja totesi, että paksusuolen syövän potilaille, vain aktivoitua eikä naiivi Tregs kertynyt tuumoripaikkaan, tukahdutti efektori-T-solujen lisääntymistä in vitro, ja korreloivat kasvaimen etenemiseen [17]. Olemme ehdottaneet, että koska ero sääntelytoiminta ihmisen Tregs, on tarpeen erottaa Foxp3

+ Tregs toiminnallisiksi alaryhmiin ja kohdistaa tiettyyn Treg alapopulaation varmistaakseen onnistuneen immunoterapiaa.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että transformoiva kasvutekijä (TGF) -β on keskeisessä asemassa immunosuppressio kohdistaman Foxp3

+ Tregs [18] – [22]. TGF-β yhdessä IL-2 voimakkaasti indusoi erilaistumista naiivi Tregs funktionaalisiksi Foxp3

+ iTregs [19]. Latenssi liittyvä peptidi (LAP), on N-terminaalinen pro-peptidi TGF-β edeltäjä, että ei-kovalenttisesti sitoutuu TGF-β, muodostavat latentin TGF-β monimutkainen ja irrotusta helpottavan TGF-β1 solunulkoiseen matriisiin [23]; sen jälkeen, aktivoitu TGF-β edistää konversio naiivi Tregs on iTregs ja välittää Treg-liittyvä immunosuppressio [24]. LAP ilmentyy solukalvolla monien immuunisolujen, mukaan lukien Tregs, ja osallistuu immuunijärjestelmän asetuksessa. TGF-β-riippuvaisen LAP-ilmentävien Tregs ovat osoittaneet suppressiivinen kyky hiirissä ja ihmisissä. Siten osajoukko indusoitavissa LAP-positiivisia Foxp3

CD4

+ Tregs tukahdutetaan allergisen tulehduksen hiirissä [25] – [27]. Gandhi et ai. todettu, että tämä uusi Treg populaation, jotka on eristetty ihmisen perifeerisen veren, tukahdutti leviämisen muihin T-solujen in vitro, joka oli osittain välittämä TGF-β: n ja IL-10 [28]. Aikaisemmat tutkimus on paljastanut, että väestö CD4

+ LAP

+ soluja lisättiin perifeerisessä veressä paksusuolen syöpä (CRC) potilasta; Lisäksi nämä solut osoittivat TGF-β-riippuvainen tukahduttava fenotyyppi [29]. Mikä tärkeintä, havaitsimme vaatimaton lisäys CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solujen CRC potilailla, nämä Tregs havaittiin harvoin terveillä henkilöillä. Chen et ai. saatu samankaltaisia ​​tuloksia hiiren kokeellinen autoimmuunienkefaliitin (EAE) malli, jossa ainutlaatuinen osajoukko LAP-ilmentävät CD4

+ CD25

+ Tregs näytteillä voimakkaampi tukahduttava kyky kuin LAP-negatiivinen Tregs [30]. Olemassaolo CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs kanssa tukahduttava aktiivisuus havaittiin myös autoimmuuni oireyhtymä scurfy hiirten [31]. Kuitenkin ihmisillä, immunomodulatorinen rooli LAP-ilmentävät CD4

+ Foxp3

+ Tregs ominaisuudet eivät ole tarkoin. Tässä työssä olemme osoittaneet, että CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Treg väestö oli hieman korkeampi perifeerisessä veressä CRC potilaiden ja esitetään selvä osajoukko aktivoidaan Tregs voimakkaiden tukahdutti efektorisolujen välityksellä TGF -β-liittyvä mekanismi. Prosentuaalisesti enemmän LAP

+ Tregs korreloivat syövän etenemiseen, mikä viittaa siihen, että LAP

+ Tregs tärkeä rooli immuunitoleranssin CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

yhteensä 42 CRC potilasta ja 21 tervettä luovuttajien otettiin tässä tutkimuksessa. 42 CRC potilasta vastikään diagnosoitu sairaus ja jalostustoiminto kolektomian ilman ennen leikkausta kemoterapian ja /tai sädehoidon Chang Gung Memorial Hospital, Linkou haara, Taoyuan, Taiwan. Verinäytteet kerättiin potilailta laskimopunktiolla ennen leikkausta. Potilaiden kliinisiä tekijöitä kuten kasvain patologian, CRC vaiheessa ja syöpä -antigeeni tasot haettiin potilastietoja.

Veri ja kudosnäytteiden

Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) eristettiin Ficoll- Paque Plus heysgradienttisentrifugoinnilla menetelmä [12]. Lymfosyytit eristettiin myös resektoitua yksilöitä sekä kasvaimen ja ei-tuumorikudoksissa. Non-kasvain kudokset valittu resektio marginaali näytteen ja vahvistettu olevan ei-syöpä mukaan patologinen tutkimus. Kasvain ja ei-tuumorikudokset hienoksi viipaloitu ja murskattu, inkuboitiin 0,1% kollagenaasia D (Sigma-Aldrich, USA) HBSS: ssä 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja suodatettiin nailonverkon. Yksisoluinen suspensio valmistettiin Ficoll (Pharmacia, USA), ja leukosyytit erotettiin interphase, kuten aiemmin on kuvattu [29].

Ethics esitetyt

Allekirjoitettu suostumus saatiin kaikki osallistujat ennen tutkimukseen. Tutkimuksen protokolla suunniteltiin mukaisesti eettisten ohjeiden vuoden 2008 Helsingin julistuksen ja hyväksyi Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan.

Vasta-aineet ja reagenssit

Juuri saatu ihmisen lymfosyyttejä värjättiin seuraavasti fluoresoivien vasta-aineita ihmisen leukosyytti pintamarkkereiden: CD4-peridinin-klorofylli-syaniini 5 (PerCP-Cy5.5), CD25-fykoerytriini (PE) tai -allophycocyanin (APC), CD45RA-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC ), CCR7–PE, CCR5-FITC, CCR4-PE-Cy7, CD62L-PE, Ki67-PE tai -APC alkaen (BD Biosciences, USA), ja LAP (PE ja APC) välillä (R 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001) katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism 5.0 ohjelmisto (GraphPad Software, USA).

Tulokset

ryhmä CD4

+ Foxp3

+ Tregs ensisijaisesti ilmaisee LAP CRC potilailla

ensin selvitettiin ilmaisua pinnan LAP CD4

+ Foxp3

+ Tregs eristetty CRC potilaista. Luotettavuus LAP värjäys vahvisti isotyyppikontrollia monoklonaalisella ja yhdistelmä-LAP (rLAP) monoklonaalisia vasta-aineita. (Kuva S1) Verrattaessa CRC potilaiden ja terveiden luovuttajien (HD) paljasti, että LAP ilmaisun CD4

+ Foxp3

+ T-solut eristettiin PBMC: istä oli merkittävästi lisääntynyt syöpäpotilailla (CRC: 18,8% ± 9,2% vs. . HD: 7,8% ± 3,3%; Fig. 1A ja B). Lisäksi kuvio 1 C esittää, että prosenttiosuus CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solujen määrä oli merkitsevästi suurempi tuumorikudoksissa kuin ei-tuumorikudoksissa CRC potilasta (12,4% ± 8,8% vs. 5,5 % ± 3,8%, P = 0,02). Tulokset viittaavat siihen, että lisääntynyt väestön CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs CRC voi olla tärkeä rooli säätelyssä kasvaimen vastaisen immuunivasteen.

(A) prosenttiosuus of LAP

+ solujen aidatulla CD4

+ Foxp3

+ alaryhmien peräsuolen syöpä (CRC) potilasta ja terveillä luovuttajilla. Verrattuna terveisiin luovuttajien, CRC potilailla havaittiin useammin LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ T-solut perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC) ja kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL). (B). PBMC CRC potilaista ja terveistä luovuttajista eristettiin, ja prosenttiosuus LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ Tregs laskettiin FACS-analyysillä. Ero näytteiden analysoitiin Studentin

t

-testi (*** P 0,001). (C). Lymfosyytit eristettiin kasvain ja ei-kasvain kudoksia CRC potilaita, ja prosenttiosuus LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ T-solut laskettiin FACS-analyysillä. CRC-TIL, kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä; CRC-Nils, ei-kasvainkudoksessa-tunkeutuvia lymfosyyttejä. Ero suhteessa CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solujen välillä CRC-NIL ja CRC-TIL populaatioiden analysoitiin Studentin

t

-testi (* P 0,05 , ** P 0,01 ja *** P 0,001).

fenotyyppi CD4

+ Foxp3

+ Tregs CRC potilaista analysoitiin perustuen ilmaisun pinnan muistisolun markkereita CD45RA- ja CCR7 (Fig. 2A). CD45RA- ja CCR7 ekspressiokuvioiden osoitti, että molemmat LAP

+ ja LAP

– osajoukot Foxp3

+ CD4

+ T-solut enimmäkseen oli efektori /muisti fenotyyppi ääreisveren sekä kasvain sivustoja CRC potilailla (Fig. 2B) [17]. Niinpä LAP-positiivinen Tregs CRC eivät poikkea LAP-negatiivinen kollegansa ilmaus efektori /muisti fenotyyppi.

PBMC ja TIL suspensiot analysoitiin ilmentymisen fenotyyppiset merkkiaineiden CCR7- ja CD45RA arvioida eriyttäminen vaiheessa CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-soluja. (A) Dot blot edustaa naiivi (N, CD45RA

+ CCR7-

+), Keski-muisti (CM, CD45RA

-CCR7

+), effektori (EM, CD45RA

– CCR7-

-), ja terminaali efektori (TE, CD45RA

+ CCR7-

-) CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs. (B) eriyttäminen vaiheissa CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs perifeerisen veren, kasvaimen kudokset, ja ei-tuumorikudoksissa CRC potilaita määritettiin virtaussytometrialla. Jokainen piste on keskiarvo ± SD yksittäisen näytteen.

Kohonnut ekspressio aktivoitua Treg liittyviä markkereita CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solut

tarkasteltiin ilmentymisen Treg liittyviä aktivoivia /efektorimolekyyleille, kuten TNFR Super perheenjäsenet, grantsyymi B, perforiinin, Ki67, CTLA-4, ja Tim-3, CD4

+ Foxp3

+ T solut. Verrattuna CD4

+ Foxp3

+ LAP

– T-soluja, CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solut osoittivat merkitsevästi korkeampi ilmaus TNFRII, grantsyymi B, Perforiinin, Ki67 ja Tim-3 ja alemman ilmentyminen CTLA-4 (Fig. 3A). Nämä tiedot osoittavat, että CRC, kasvaneesta osuudesta LAP-positiivisten CD4

+ Foxp3

+ Tregs on aktivoitu lisääntyvien fenotyyppi.

(A) PBMC CRC potilaista analysoitiin ilmentymisen Treg markkereita TNFR II, grantsyymi B, Perforiinin, Ki67, CTLA-4, ja Tim-3 FACS. Histogrammi edustaa ilmaus Treg merkkiaineiden CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs ja CD4

+ Foxp3

+ LAP

– Tregs; ilmaisun välinen ero T solupopulaatioiden analysoitiin pariksi

t

-testi (* P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001). (B) Tyypillinen histogrammit edustavat prosenttiosuutta CD62L-, CCR4-, ja CCR5-positiiviset CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs ja CD4

+ Foxp3

+ LAP

– Tregs; ilmentymistasojen CD62L, CCR4 ja CCR5 verrattiin molempien T-solujen populaatioita. Aineisto analysoitiin pariksi

t

-testi (* P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001).

Useat riviä näyttöä hiiren ja ihmisen tutkimukset viittaavat siihen, että ilmaisu tiettyjen kemokiinin reseptoreihin, kuten CCR4 ja CCR5, on ominaista aktivoitu alaryhmä CD4

+ Foxp3

+ Tregs. Ilmaisu analyysi CCR4, CCR5, ja L-selektiini (CD62L) osoitti, että CD62L oli merkittävästi vaimentua CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solujen verrattuna niiden LAP

– negatiivinen kollegansa ( keskifluoresenssi intensiteetti (MFI), 594 ± 41,9 vs. 684 ± 70,9, P = 0,006); ilmaus CCR4 oli samanlainen, kun taas CCR5 lisääntynyt CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solujen verrattuna CD4

+ Foxp3

+ LAP

– T-soluja ( CCR4: 40,7% ± 5,9% vs. 37,7% ± 6,2%, P = 0,2, CCR5: 13,2% ± 1,9% vs. 6,2% ± 1,7%, P = 0,001). Nämä tulokset osoittavat, että CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs on aktivoitu fenotyyppi.

CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs näytteille voimakas TGF -β-riippuvainen tukahduttaminen kyky

TGF-β on immunosuppressiivinen sytokiini tiedetään kriittinen rooli tuottamiseen ja toiminnallinen aktiivisuus Tregs. Kalvo TGF-β ylläpidetään piilevä muodossa ei-kovalenttisilla sitoutumisen LAP. Tutkia yhdistys LAP-positiivisten Treg fenotyypin TGF-β, analysoimme TGF-β tuotannon CRC Foxp3

+ LAP

+ Tregs stimuloidaan PMA /ionomysiinillä. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, TGF-β-tasot olivat korkeammat LAP-positiivisten Treg osajoukko kuin LAP-negatiivinen Treg osajoukko (7,50% ± 1,1% vs. 2,8% ± 1,1%, P = 0,001), mikä viittaa siihen, että CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ solut panevat liikkeelle sääntelytehtävä kautta TGF-β-reitin.

(A) TGF-β CD4

+ Foxp3

+ LAP

+, CD4

+ Foxp3

+ LAP

– ja CD4

+ Foxp3

+ Tregs analysoitiin FACS. T-solut stimuloitiin in vitro kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, ja TGF-β ilmentymistä verrattiin näiden kolmen ryhmien pariksi

t

-testiä (** P 0,01). (B) CD4

+ CD25

+ LAP

+ T-solujen ja CD4

+ CD25

+ LAP

– T-solut erotettiin solujen lajittelua käyttämällä FACSAria ja stimuloidaan anti- CD3 ja anti-CD28-vasta-aineita 96 tuntia. T-soluproliferaatiota arvioitiin tymidiinillä [

3H] sisällyttämistä ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmen erillisen kokeen; tiedot analysoitiin pareittain

t

-testi (* P 0,05). (C) Anti-TGF-β-vasta-ainetta (10 ug /ml) lisättiin CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs viljeltiin yhdessä CD4

+ CD25

-LAP

+ T-soluja (suhde 01:01) ja aktivoitiin anti-CD3 ja anti-CD28-mAb: t. Prosenttiosuus tukahduttaminen läsnä ollessa tai puuttuessa anti-TGF-β-mAb on ilmaistu keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 pariksi

t

-testissä.

Seuraavaksi arvioimme ilmaus LAP keskuudessa CD4

+ CD25

-, CD4

+ CD25

lo, ja CD4

+ CD25

hi alaryhmien CD4

+ Tregs ja havaitsi, että CRC potilailla, LAP-positiiviset CD4

+ Foxp3

+ Tregs olivat pääasiassa havaita CD4

+ CD25

hi lokero. Sitten CD4

+ CD25

+, CD4

+ CD25

-, CD4

+ CD25

+ LAP

+ ja CD4

+ CD25

+ LAP

– Treg populaatiot erotettiin solujen lajittelua, ja niiden kyky estää leviämisen juuri eristettyjä CD4

+ CD25

– T-solut arvioitiin [H

3] tymidiininsisällytysmääritys . Näistä Treg alapopulaatioiden, CD4

+ CD25

+ LAP

+ soluilla voimakkaimmista tukahduttava kyky (P 0,03; Fig. 4B), joka estyi in vitro antamalla anti-TGF β-vasta-ainetta (Fig. 4C). Enrichment ääreisverenkierrossa CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solut korreloivat CRC etenemiseen.

kliinistä merkitystä CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solut CRC tutkittiin 42 CRC potilailla (heidän demografiset ja kliiniset ominaisuudet on esitetty taulukossa 1). Vain 9 potilaalla oli uusiutuva syöpä tai taudin etenemistä. Prosenttiosuus CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solujen CD4

+ Foxp3

+ T-solujen populaatio ei korreloinut että CD4

+ Foxp3

+ T-solujen CD4

+ T-solujen populaatio perifeerisessä veressä. Kasvaimen infiltroituneen lymfosyyttien (TIL) väestö, prosenttiosuus CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solut korreloivat että CD4

+ Foxp3

+ T-solut (r

2 = 0,1, P = 0,04). Osuus CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solujen korreloi käänteisesti, että CD8

+ T-soluja perifeerisen veren (r

2 = 0,2, P = 0,01); TIL, suuntaus käänteinen korrelaatio CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ ja CD8

+ T-solujen havaittiin; kuitenkin, se ei ollut tilastollisesti merkitsevä (r

2 = 0,08, P = 0,18). Lisäksi emme havainneet korrelaatiota kiertävien CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solujen ja muiden inflammatoristen solujen, kuten neutrofiilien, lymfosyyttien ja monosyyttien (Fig. 5A). Tutkimuksessa oli mukana 26 potilasta, joilla paksusuolen syöpä ja 16 potilasta, joilla peräsuolen syöpä; kuitenkin, prosenttiosuus verenkierrossa tai kasvaimen infiltroituvien CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solujen CD4

+ Foxp3

+ T-solujen populaatio ei ollut eroa kahden ryhmän CRC potilaalla (kuvio 5B).

(A) välinen korrelaatio LAP

+ Foxp3

+ CD4

+ T-solujen ja CD4

+ Foxp3

+ T-solujen, CD8

+ T-solut, yhteensä lymfosyytit, monosyytit, ja neutrofiilit (r

2 ja P-arvot) arvioitiin Pearsonin korrelaatiota menetelmällä. (B) prosenttiosuus LAP

+ Tregs PBMC ja TIL populaatioiden verrattiin välillä CRC potilailla, joilla peräsuolen ja paksusuolen kasvaimet; tiedot analysoitiin pareittain

t

-testi (* P 0,05). (C) CRC potilasta ryhmitetään läsnäolo tai puuttuminen imusolmukkeiden tai etäispesäkkeitä. Prosenttiosuus CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs PBMC ja TIL populaatioiden verrattiin joukossa potilasryhmien eri CRC vaiheista ja terveiden luovuttajien. Tilastollinen analyysi suoritettiin yksisuuntaisella ANOVA (** P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001).

Lopuksi tutkimme yhdistys CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solujen kasvain vaiheessa. Kuten on esitetty kuviossa. 5C, prosenttiosuus CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ T-solujen ääreisveren metastaattisen potilaista oli merkittävästi suurempi kuin vuonna CRC potilailla, joilla ei etäpesäke ja terveillä luovuttajilta. Lisäksi koko CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Treg väestö lisääntyi tuumorikudoksissa verrattuna ei-tuumorikudoksista (kuvio 5C). Täten kasvua LAP

+ Tregs perifeerisessä veressä CRC potilaat voivat heijastaa kasvua LAP

+ Tregs kasvainkudoksissa ja voitiin korreloida syövän vaiheessa, mikä viittaa siihen, että koko ääreisverenkierron Lapin positiiviset CD4

+ Foxp3

+ T-solujen alaryhmästä voi toimia surrogaattimarkkerina immunosupressioaine prosessin CRC.

keskustelu

tulokset Tutkimuksemme osoittavat, että LAP ilmaisu merkkien alapopulaatio CD4

+ Foxp3

+ Tregs voimakkaiden ehkäisevästä kyky. Vaikka suurin osa CD4

+ Foxp3

+ Tregs CRC potilailla luokitellaan aktivoidaan, niiden joukossa, LAP-positiiviset Tregs on vieläkin voimakkaampi ehkäisevästä toimintoja. Tämä ilmenee korkeammat ilmaus solu- merkkiaineiden, lisääntynyt tuotanto immunosuppressiivisten TGF-β, ja voimakkaampi tukahduttava kykyä in vitro LAP-positiivisten Tregs verrattuna LAP-negatiivinen Tregs. Tuloksemme viittaavat siihen, että LAP voi olla mahdollinen merkki tunnistaa alaryhmä Tregs, joilla on TGF-β-liittyviä ehkäisevästä toimintoja. Tämä Treg alapopulaatio on rikastettu perifeerisestä verestä CRC potilailla, jotka korreloivat kasvaimen etenemiseen, mikä viittaa siihen, että CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs voi olla kliinistä soveltamista merkkiaineina kasvain-spesifisen Tregs CRC potilaita.

toiminnallista roolia LAP in Tregs ei ole selvä. LAP pysyy kovalenttisesti liittyy TGF-β katkaisun jälkeen esiasteesta peptidin ja muodostavat inaktiivisia latenttia TGF-β kompleksi; Näin ollen se edistää ehkäisyyn hallitsemattoman TGF-β-reseptoreihin. Nakaruma et ai. ensimmäisinä osoittamaan, että sekä hiiren että ihmisen CD4

+ CD25

+ Tregs voisi käyttää TGF-β-riippuvainen tukahduttaminen efektorisolujen, joka purettiin rekombinanttia LAP. He osoittivat myös, että LAP-positiiviset CD4

+ T-solut voivat tukahduttaa koliitti in vivo, mikä viittaa, ensimmäistä kertaa, että LAP voitaisiin pitää sääntelyn merkki [24]. Qida et ai. lisäksi osoittaneet, että LAP ilme hiiren CD4

+ T-solut indusoitiin TGF-β riippumatta Foxp3 [25]. Shevach et ai. havaittu TGF-β-LAP komplekseja aktivoitu Tregs mutta ei levossa Tregs indusoidun kautta ei-antigeenin stimulaatiota [21], [31], [32]. LAP

+ Tregs tukahdutti leviämisen aktivoitujen T-solujen, mutta ei naiivien T-solujen TGF-β-riippuvaisella tavalla ja välittämä infektio toleranssin muuntamalla Foxp3-negatiivinen Tregs toiminnallisesti aktiivista Foxp3-positiivisia Tregs [32]. Uskotaan, että LAP-TGF-β kompleksi on tärkeä mekanismi Tregs ylläpitää immuunijärjestelmän homeostaasin kautta TGF-β-signalointia.

Chen et al. ovat edelleen toiminnallisesti ominaista CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs in hiiren autoimmuunienkefaliitin (EAE) malli [30]. CD4

+ CD25

+ LAP

+ Treg väestöstä oli korkeampi taajuus FOXP3 ilmaisun ja tuottanut kohonneeseen efektorimolekyylien ja sytokiinien kuin niiden LAP-negatiivinen kollegansa. LAP-ilmentäviä Tregs olivat anergiseksi ja tukahduttava in vitro; kuitenkin niiden suppressiivinen aktiivisuus oli tehokkaampi verrattuna muihin Treg tyyppejä. Nämä solut ilmaisivat sekä TGF-β ja sen reseptorit; tukahduttaminen kyky LAP

+ Tregs purettiin TGF-β neutralointi, mikä osoittaa, että CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs olivat ainakin osittain säännelty TGF-β- riippuvaisella tavalla. Lisäksi in vivo adoptio siirtoon CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs paranevat EAE, vahvistaa immunosuppressiivinen teho tämän Treg väestöstä. Näiden tulosten perusteella, LAP voidaan pitää markkerina tunnistamiseksi alaryhmä CD4

+ CD25

+ Tregs voimakkaiden tukahduttava kyky [30]. Ihmisillä Shevach et al. osoitti, että läsnäolo pinta TGF-β kompleksoituna LAP aiheuttama Foxp3 ja johti tukahduttaminen vastesoluja, mikä osoittaa mahdollisuus, että molemmat Foxp3 ja LAP voisi antaa voimakkaampi tukahduttava aktiivisuus ihmisen Treg solupopulaation [31].

vaikka rooli LAP-positiivisten Tregs ei ole täysin selvitetty, käytettävissä olevat tiedot viittaavat siihen, että LAP voi olla hyödyllinen biomarkkereiden ja tunnistamaan aktivoitu Tregs hiirillä ja ihmisillä. Hiirillä, LAP voidaan soveltaa in vitro valinta laajennettu CD4

+ Foxp3

+ tukahduttava Tregs [33], kun taas ihmisillä, on ehdotettu markkerina valvomiseksi Tregs jälkeen anti-CTLA-4- immunoterapia [34]. Tutkimuksemme vahvistaa edelleen käsitystä, että lantio ilmaisu voi erottaa aktivoida Tregs, etenkin niitä kiertävän ääreisverenkierron CRC potilaista. Tärkeintä on, kasvaimen etenemistä korreloi lisääntyneen osuuden LAP

+ Tregs. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että kiertävä LAP-positiiviset CD4

+ Foxp3

+ Tregs sijaan väestön CD4

+ Foxp3

+ T-soluja, voidaan käyttää tarkemman ja erityinen merkkiaine seurantaan immunologinen tila syöpäpotilailla.

Yhteenvetona CD4

+ Tregs että ilmaista sekä Foxp3 ja LAP esille korkeampia immunosuppressiivista aktiivisuutta kuin muut Treg solualaryhmiä. Suppressii- LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ Tregs immuunivasteita, ainakin osittain, via TGF-β signalointi. Rikastamisen CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs perifeerisessä veressä CRC potilaista voidaan mahdollisesti käyttää seurantaan syövän immunoterapiaa kliinisissä puitteissa.

tukeminen Information

Kuva S1.

Expression of LAP. (A). Isotyyppikontrollia monoklonaalinen vasta-aine (IC) ja rekombinantti-LAP (rLAP) vahvistettiin luotettavuuden värjäystä. (B). Tunnistaminen CD4

+ Foxp3

+ T-soluja. Isotyyppikontrollia monoklonaalinen vasta-aine (IC) käytettiin vahvistamaan LAP

+ T-solujen värjäytymistä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0108554.s001

(TIF)