Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelikasvaimet kohteeseen mesenkymaalitransitioon (EMT) edistää solujen liikkuvuuteen, invasiivisuus ja etäpesäkkeiden alkionkehityksen aikana ja kasvaimen kehittymisen. Transformoiva kasvutekijä-β (TGF-β) signalointireitistä on keskeinen säätelijä EMT. Monet todisteet viittaavat siihen, että tämä prosessi on Smad3-riippuvainen. Tässä osoitimme, että altistuminen ASPC-1 ja Pancin-1 haimasyövän soluja TGF-β1 johti ominaisuus morfologisten muutosten EMT, ja parantaminen soluliikkuvuus ja gemsitabiini (Gem) vastus yhdessä ylös-säätely EMT markers geenejä, kuten vimentiinista, N-kadheriinin, MMP2 ja MMP-9. Naringetiini (Nar) alassäädetty EMT merkkiaineiden ilmentymistä sekä mRNA ja proteiini tasoilla estämällä TGF-β1 /Smad3 signaalireitin haiman syöpäsoluja. Niinpä Nar tukahdutetaan solujen maahanmuuton ja hyökkäyksen ja käänteinen niiden vastustuskyky Gem.

Citation: Lou C, Zhang F, Yang M, Zhao J, Zeng W, Fang X, et al. (2012) naringetiini Vähennykset invasiivisuus ja metastaasin estämällä TGF-β-aiheuttama epiteelikasvaimet jotta mesenkymaalitransitioon haiman syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (12): e50956. doi: 10,1371 /journal.pone.0050956

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 helmikuu 2012; Hyväksytty: 29 lokakuu 2012; Julkaistu: 26 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Lou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Nature Sciences Foundation of China (81173633), avustuksia valtion Key Development Plan Project (2011CB707705), Tutkimussäätiön terveysministeriön Heilongjiangin maakunnassa (2010-107) ja käynnistyksen Fund The Affiliated kolmas sairaala Harbin Medical University (JJ2010-15). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on erittäin aggressiivinen kasvain tyypillistä varhainen hematogenic ja lymphogenic leviämistä ja korkeat paikallisen uusiutumisen [1]. Se, että kliinisen hoidon syöpäpotilaiden usein johtuvan lääkeresistenssin ja tuumorietäpesäke [2]. On kuitenkin olemassa mitään tehokasta hoitoa saatavilla kääntää monilääkeaineresistenssi ja estää aggression ja etäpesäkkeiden haiman kasvain [3], [4], [5]. Siten ymmärtää paremmin lääkeresistenssin ja etäpesäke haimasyövän voi johtaa kehitystä tehokkaamman hoitostrategia.

Useiden viime vuosina kertynyt todisteita mukaan epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) on tärkeä osassa kasvaimen etenemisen etäpesäkkeitä ja lääkeresistenssin erilaisissa kiinteitä kasvaimia kuten haimasyöpä [6], [7], [8]. Tälle menetelmälle on tunnusomaista menetys epiteelin ja hankkiminen mesenkymaalisten ominaisuudet [9], [10]. Aikana EMT etenemistä, ilmaus mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinistä, N-kadheriinin ja /tai fibronektiinin, on lisääntynyt, sopimus-, että epiteelisolujen adheesiomolekyylien, kuten E-kadheriinin ja /tai sytokeratiineja, on vähentynyt. Lisäksi epiteelisolujen myös saada toiminnan lisääntyminen matriksin metalloproteinaasien (MMP: t), mukaan lukien MMP2, MMP3, MMP-9, joka osaltaan invasiivisen ja metastaattisen fenotyypin [11], [12]. Kuten tiedetään, että kasvainsolujen etäpesäkkeitä on johtava kuolinsyy syöpäpotilaille, valvonta EMT prosessi on edelleen etusijalla haimasyövän hoidossa.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että transformoiva kasvutekijä-β1 (TGF β1) ja muut kasvutekijät pelata keskeisiä rooleja ajo EMT patogeneesissä haimasyövän [13], [14], [15]. TGF-β yliekspressio edistää kasvaimen etäpesäke myöhäisessä vaiheessa kasvain [16]. Kehittäminen TGF-β signaloinnin estäjillä on pidetty houkuttelevana tapa estää kasvaimen etäpesäkkeiden. Tällä hetkellä on useita ruiskeena proteiini-pohjainen TGF-β-inhibiittoreita on kehitetty, mukaan lukien vasta-aineita, jotka häiritsevät TGF-β-ligandin sitoutumista reseptoriin, ja oligonukleotidit kohdistuvat TGF-β1 mRNA [17], [18], [19]. Pienmolekyylisalpaajien tietyn tavoite tässä signalointireitillä on merkittäviä etuja vakauden ja hyötyosuus verrattuna makromolekyyliyhdisteisiin ehdokkaita. Ajan tasalla, useita pieniä molekyyli-inhibiittorien on osoitettu olevan inhibition vaikutuksia TGF-β-reseptorin toimintaa [20], [21].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että naringetiini (Nar, 4 ’, 5, 7-trihydroksi flavanonia), luonnollinen hallitseva flavanonia, estivät merkittävästi transkription TGF-β1-indusoidun Smad3, ja vähensi sitoutumisen todennäköisyyttä TGF-β1 sen spesifiseen reseptoriin TβRII, estäen siten reseptorin dimerisaation ja sitä seuraavan alavirran signaalitransduktiota. Lisäksi Nar voi parantaa kasvaimen vastainen vaikutus doksorubisiinin A549 ja MCF-7 syöpäsoluissa selektiivisesti inhiboimalla monilääkeresistenssin liittyvä proteiini, mutta ei p-glykoproteiinin [22], [23], [24], [25 ]. Nämä tulokset osoittivat myös sen potentiaali syövän hoitoon kuin TGF-β signaloinnin antagonisti.

Täällä yritämme puuttua onko Nar kykenee sen antimetastaattisia ja anti-vastustuskykyinen vaikutukset haimasyöpäkasvainsoluissa estämällä kasvain solut Emt kautta alas säännellä TGF-β /Smad3 signalointireitin. Tämä tutkimus voi antaa järkevää selitystä Nar n antituumoriteholla, ja terapeuttinen hyöty yhdistettynä Nar muiden syöpälääkkeitä.

Tulokset

Nar kumoaa TGF-β1 aiheuttama vastus gemsitabiinin in ASPC-1-soluissa

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että ASPC-1 ja Panc-1 haima- syöpäsoluja olivat resistenttejä gemicitabin (Gem) ja oli kyky invasiivisuus ja etäpesäkkeiden [26]. Gem on yhteinen kemoterapeuttinen lääkeaine potilaille haimasyöpä klinikalla. Sen tutkimiseksi, onko Nar lisää herkkyyttä näiden kahden solulinjojen Gem, päätimme potentiaalista toksisuutta Gem ja ASPC-1 ja Panc-1-solujen MTT: llä läsnä ollessa tai poissa ollessa Nar. Kuten kuviossa 1A ja B, altistuminen ASPC-1 ja Panc-1-solut Nar 72 h johti IC

50 (50% kasvua estävä pitoisuus) arvoja 347 ± 13,6 uM ja 541 ± 11,9 uM, vastaavasti. Nar hieman solujen lisääntymisen tehostuneen jopa 100 uM. Lisäksi mittasimme solujen elinkelpoisuutta 24 tunnin kuluttua esikäsittelyn 50 uM Nar, jonka jälkeen 72 h hoito eri pitoisuuksilla Gem ASPC-1-soluissa. IC

50-arvot olivat 5,3 ± 0,4 uM Gem yksin ja 2,6 ± 0,4 uM Gem läsnäollessa Nar, mikä osoittaa Nar lisää merkittävästi sytotoksisuuden Gem ja ASPC-1 solun (kuvio 2A). TGF-β-signaalin reitti on tärkeä rooli tuumorisolujen resistenssiin kemoterapiaa, tutkimme vaikutuksia Nar on sytotoksisuutta Gem stimuloiduissa soluissa TGF-β1. Kuten odotettua, TGF-β1 stimulaatio tehostaa ASPC-1-soluissa resistenssin Gem verrattuna käsittelemättömiin soluihin (IC

50 10 uM verrattuna 5,3 ± 0,4 uM kuvio 2B). Meidän aikaisemmat tutkimukset ovat jo osoittaneet, että Nar vähentää merkittävästi seerumin TGF-β1 tasolla bleomysiinin aiheuttaman keuhkovaurion kuitua malli, ja sen seurauksena, estää kasvainsolujen etäpesäkkeitä keuhkoissa [22]. Siksi oletamme, että Nar voi olla kyky kääntää TGF-β1 aiheuttama vastus ASPC-1 solut Gem. Suoritettiin kokeita sen testaamiseksi ajatusta. Soluja esikäsiteltiin 5 ng /ml TGF-β1: ssa 24 tuntia, minkä jälkeen eri pitoisuuksia Gem läsnä ollessa tai poissa ollessa 50 uM Nar 72 tuntia, elinkelpoisuutta havaittiin MTT-määrityksellä. Kuten kuvassa 2B on esitetty, lisäksi TGF-β1 lisääntynyt vastus ASPC-1 solun Gem kun Nar päinvastaiseksi TGF-β1 aiheuttama vastus. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TGF-β1: lla on kriittinen rooli vastus kasvainsolujen kemoterapeuttiset lääkkeet, kuten Gem.

(A) AsPC-1 tai (B) Panc-1-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Nar 24 h, 48 h ja 72 h. Solujen elinkelpoisuus tutkittiin MTT. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SD (

n

= 4) yksittäisistä kokeista pistettä. IC50 suoritettiin käyttäen SPSS ohjelmistoa.

(A) 50 uM Nar esikäsittely 24 tuntia, jonka jälkeen kampaus eri annoksen Gem 72 tunnin ASPC-1-soluissa. (B) Esikäsittely 5 ng /ml TGF-β1: ssa 24 tuntia, minkä jälkeen seuraa käsittely eri pitoisuuksien Gem läsnä ollessa tai poissa ollessa 50 uM Nar seuraavan 72 tunnin ajan, solut elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Kukin piste edustaa keskiarvoa ± SD (

n

= 4) kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05; ** p 0,01; *** p 0,005.

Nar vaimentaa TGF-β1 aiheuttama muuttoliike ja hyökkäys Pancin-1 ja ASPC-1-soluissa

seuraavan määritetään, onko Nar voi estää TGF-β-indusoidun EMT, joka myös on yhteydessä solun liikkuvuutta. Kuten odotettua, morfologisia muutoksia, mukaan lukien vähentää solu-solu-kontakti ja risteys, luotu kuidun ja neulan tyyppisiä väärä jalat, havaittiin sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin TGF-β1 30 h (kuvio 3E), mikä osoittaa, EMT esiintyminen. Lisäksi haavan paranemista koe suoritettiin, tulos osoitti, että hoito Panc-1-solujen TGF-β1 36 tuntia johti noin 80%: een haavan sulkeutumiseen (kuvio 3aj) verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio 3Ag), mikä osoittaa, että TGF-β1 selvästi nopeutettu EMT prosessi. Kuitenkin hoito 50pM tai 100 uM Nar 36 h tai 72 h merkittävästi esti TGF-β1 aiheuttamaa solujen morfologisia muutoksia ja haavan (kuva 3Akl

vs

j; Kuva 3Aqr

vs

p). Lisäksi ilman TGF-β1, käsittely 50 uM tai 100 uM Nar 72 h myös merkittävästi estää noin 60%: een haavan solujen sulkeminen (kuvio 3Ano

v.s.

M). Tuloksemme osoittavat, että sisäiset tai ulkoiset TGF-β1 tehokkaasti parantaa Pancin-1-soluissa muuttoliike mutta Nar voi kääntää tätä prosessia. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös ASPC-1-soluissa (tietoja ei esitetty).

(A) Haavan paranemista määrityksessä, Panc-1-soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin. Yksisolukerrokset pilkottiin pipetin kärki keskialueella viljelmän. TGF-β1 ja Nar lisättiin esitetyllä kertaa. Valokuvat otettiin käyttämällä faasikontrastimikroskopiaan (suurennus x 100) heti viillon jälkeen 36 h ja 72 h hoidon. (B ja C) TranswellTM invaasiomääritys (B ASPC-1-soluissa ja C Pancin-1cells). In Matrigel-pinnoitettu soluviljelyinsertissä soluja käsiteltiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Solut, jotka olivat tunkeutuneet alapintaan suodattimen värjättiin kristallivioletilla ja valokuvattiin. (D) TranswellTM muuttoliike määritykset. Ei-matrigeeliä-päällystetyn soluviljelyinsertissä, määrällisesti muuttoliikkeen, värjätään solut hajotettiin DMSO ja niiden absorbanssi mitattiin. (E) Cell käsiteltiin 5 ng /ml TGF-β1 30 tuntia, ilmiö EMT havaittiin solujen morfologisia muutoksia. Nämä kokeet tehtiin kolminkertaisina. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,005.

Lisäksi tutkimme vaikutuksia Nar on TGF-β1 aiheuttaman hyökkäyksen ja maahanmuuttoa ASPC-1 ja Pancin-1-soluissa käyttäen Transvvell- määrityksiä. Tulokset osoittivat, että TGF-β1 käsittely tehosti merkittävästi kykyä ASPC-1 (kuvio 3BD

vs

a) ja Panc-1-soluissa (kuvio 3Cj

vs

g) ylittää tyvikalvon matriisin . Pancin-1-soluissa esiintyi enemmän aggressiivisia invasiivisia aktiivisuutta kuin ASPC-1-solujen vastata TGF-β1 stimulaatio (kuva 3Cj

v.s.

Kuva 3BD). Mielenkiintoista, 50 uM Nar estivät merkittävästi invasiivisen kyvyn ASPC-1 (kuvio 3BB

vs

a) ja Pancin-1-soluissa (kuvio. 3C h.

vs

g) puuttuessa tai läsnäolo TGF-β1 (kuvio 3B e

vs

d; Kuva 3Ck.

vs

j), 100 uM Nar osoitti selvempi estävä vaikutus kuin 50 uM Nar näissä kahdessa solussa linjat (Kuva 3Bc

vs

bf

vs

e Kuva 3Ci

vs

hl

vs

k). Vuonna siirtokuoppaan Siirto määrityksessä, määrällisesti siirtynyt soluista, me liuennut solut ja sitten värjättiin kristallivioletilla DMSO. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä käyttäen levylukijaa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös (kuvio 3D). Yhdessä tarjoamme vahvoja todisteita siitä, että Nar voi voimakkaasti estää sekä perus- että eksogeenisen TGF-β1 aiheuttaman muuttoliikkeen ja hyökkäyksen ASPC-1 ja Pancin-1-soluissa.

Nar estää prosessin epiteelin ja mesenkymaalitransitioon ( EMT) vähentämällä ilmentymisen mesenkymaalisten merkkiaineiden

Sen testaamiseksi, Nar säätelee soluväliaineen ja ilmentymistä EMT markkerin geenien ASPC-1 ja Panc-1-solujen läsnä ollessa tai ilman TGF-β1, reaaliaikainen RT-PCR-analyysi suoritettiin. Alukkeet Mesenkymaalisten markkereita on esitetty taulukossa 1. Kokonais-RNA eristettiin soluista käsiteltiin ajoneuvon tai 5 ng /ml TGF-β1 tai 5 ng /ml TGF-β1 ja Nar (50 uM, 100 uM). Soluja käsiteltiin 5 ng /ml TGF-β1 24 tuntia johti merkittävään kasvuun EMT markkereita mRNA: ita, kuten vimentiinista, N-kadheriinin, MMP2 ja MMP-9. Samalla olemme havainneet, että tasot TGF-β1-indusoidun EMT markkereita mRNA vähensi merkittävästi Nar-käsitellyt solut (kuvio 4A, B, C F). Bändit kvantitoitiin skannausdensitometrialla käyttäen Bio-Rad malli 620Video tiheysmittarilla kanssa 1-D Analyst ohjelmistopaketti Macintosh. Nämä tulokset osoittivat, että Nar ilmeisesti alensi ilmauksia vimentiinista, N-kadheriinin, MMP2 ja MMP-9 proteiineja, ja parannettu E-kadheriinin ilmentymisen tai ilman TGF-β1 käsittely (kuvio 4G H). Lisäksi meillä on myös havainnut yhden kaistan 68 kDa, aktiiviseen muotoon MMP2, ja yksi bändi 72 kD, edeltäjä MMP2. Tuloksemme osoittivat, että Nar voi estää TGF-β1 aiheuttama EMT in ASPC-1 ja Pancin-1-soluissa.

(A-D) ilmentäminen mesenkymaalisten markkereita prosessin EMT mRNA tasolla mitattiin qRT -PCR. AsPC-1-soluja ja Panc-1-soluja esikäsiteltiin 50 uM tai 100 uM Nar 24 tuntia, jonka jälkeen läsnä ollessa tai ilman TGF-β1 vielä 24 h (A: vimentiinin, B: N-kadheriinin, C: MMP2, D: MMP-9).

# p 0,05,

## p 0,01

v.s.

Valvonta.

* p 0,05, ** p 0,01

v.s.

5 ng /ml TGF-β1 yksin. (E ja F). Proteiini ilmentyminen EMT merkkiaineiden mitattiin western blot (F ASPC-1-soluissa ja G Pancin-1-soluissa). (G ja H) arvo densitometrinen skannaus käytettiin määrittämään muutokset mesenkymaaliset markkereita (H ASPC-1-solut, I Panc-1-soluissa). Tiedot olivat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Nar kykenee sen vaikutus TGF-β1 signaalireitin säätelemällä Smad3

Classic Smad riippuvaisten reittien, TGF β-indusoitua reseptorin aktivaation kompleksi johtaa fosforylaatioon Smad2 ja Smad3, yhteistyössä Smad4 TGF-β-indusoitu transkriptio säätävät. Sen sijaan, Smad6 ja Smad7 estää reseptorin aktivaatio-säännelty Smad: ien [27], [28], [29]. Esillä olevassa tutkimuksessa, suoritimme RT-PCR tutkia geenin ilmentymistä säätelyyn osallistuvan TGF-β-signalointia. AsPC-1 ja Panc-1-soluja esikäsiteltiin 50 uM tai 100 uM Nar 24 tuntia, minkä jälkeen seuraa käsittely tai ilman TGF-β1 vielä 24 tuntia. MRNA-tasot on TβRI, TβRII, Smad2, Smad3, Smad4, ja Smad7 seurattiin RT-PCR: llä ja kvantitoitiin. Tulokset osoittivat, että Nar ollut vaikutusta mRNA tasoilla TβRI, TβRII ja Smad2, myös suurilla pitoisuuksilla (100 uM) (kuvio S1). Kuitenkin käsitelty TGF-β1, Nar selvästi alassäädetty mRNA taso Smad3 (kuva 5A C. kaista 5, 6

v.s

2). Koska TGF-β1, 50 uM Nar oli vain suhteellisen vähäinen vaikutus Smad3 mRNA: ta ja proteiinia tasolla (kuvio 5A C. kaista 3, 4

vs

1), mutta 100 uM Nar ilmeisesti väheni Smad3 proteiini tasolla (kuvio 5Fab. kaista 6

vs

1). Nämä havainnot osoittivat, että Nar downregulate Smad3 proteiinin taso riippumaton TGF-β1. Kun TGF-β-signalointireitin, fosforylaatio Smad3 jonka TβRII on tärkeä askel signaalitransduktion. Joten me tutkittiin lisäksi Nar voi estää TGF-β1 aiheuttama fosforylaatiota Smad3. Löysimme TGF-β1 indusoi merkittävän kasvun taso fosfo-Smad3 taas Nar lyhensi TGF-β1 aiheuttama Smad3 fosforylaatio, joka vaikutus saattaa liittyä laski Smad3 proteiinin taso aiheuttama Nar. Lisäksi, tämä inhiboiva vaikutus Nar oli yhdensuuntainen sen annostuksia käytetään hoitamaan ASPC-1 ja Panc-1-soluissa (kuvio 5F a b).

Soluja käsiteltiin 50 uM ja 100 uM Nar tai 10 uM ja 20 uM SB431542 24 tuntia ennen tai ilman 5 ng /ml TGF-β1 lisäksi 24 tunnin inkuboinnin RT-PCR: llä tai 36 h inkuboinnin western blot. (A ja B, E) mRNA taso TβRI, TβRII, Smad2, Smad3 ja Smad7 määritettiin RT-PCR: llä (A ASPC-1-soluja käsiteltiin Nar, B Panc-1-soluja käsiteltiin Nar, E Panc -1-soluja käsiteltiin SB431542, tulos oli samanlainen ASPC-1-solut, tuloksia ei ole esitetty). (C ja D) arvo densitometrinen skannaus käytettiin määrittämään muutokset mRNA Smad3 ja Smad7 (C ASPC-1-soluja ja D Panc-1-soluja käsiteltiin Nar). (F ja G) taso p-Smad3 mitattiin western blot. (F. A ASPC-1-soluja ja F. b ja Panc-1-soluja käsiteltiin Nar, G Panc-1-soluja käsiteltiin SB431542, tulos oli samanlainen ASPC-1-solut, tuloksia ei ole esitetty). Tiedot olivat keskiarvoja ± SD kolmesta yksittäisten kokeiden.

osoittavat lisäksi roolin downregulation Smad3 on estävää vaikutusta Nar on TGF-β1 välittämä fenotyyppiä kuten muuttoliike, me tutkia eksogeeninen yliekspressio of Smad3 voi kääntää estävää vaikutusta Nar. Rakensimme GFP-Smad3-ekspressiovektoriin käyttäen täysimittaista ihmisen Smad3 fragmentti pCMV5B-Smad3 vektori [38] ligoitiin GFP-C1-konstrukti (Clontech). Sitten tutkittiin, mikä vaikutus Nar siirtyvien Pancin-1 transfektoitujen solujen GFP-Smad3 ja GFP-C1 ohjaus plasmidiin. Tulokset osoittivat, että sekä Smad3 mRNA: ta ja proteiinia, tasot olivat merkittävästi lisääntyneet GFP-Smad3-transfektoiduissa soluissa verrattuna GFP-C1- transfektoiduissa soluissa (kuvio 6C B) osoittivat, että 100 uM Nar ilmeisesti inhiboi TGF-β1-muuttoliikkeelle GFP-C1-transfektoiduissa soluissa (p 0,01), kun taas eksogeeninen yliekspressio Smad3 vaimensi merkittävästi estävää vaikutusta Nar on TGF-β1 muuttoliikkeelle. Nämä tiedot osoittavat, että Nar voi erityisesti estää endogeenisen ilmentymisen Smad3 ja sen jälkeen vähentää fosforylaation Smad3 siten, downregulates TGF-β1-indusoidun signaalin transduktion.

(A) Transwell migraatiokokeessa, ei-Matrigel- päällystetyn soluviljelyinsertissä, Panc-1-solut transfektoitiin GFP-Smad3 tai GFP-C1-plasmidi 6 tuntia, sitten se pestään, muutettu täydellinen DMEM, jossa 0,1% DMSO: ta, 100 uM Nar 24 tuntia, sitten altistusta 5 ng /ml TGF-β1 tai yhdistelmänä 5 ng /ml TGF-β1 ja 100 uM Nar seuraavan 24 tunnin ajan. Kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Solut, jotka olivat tunkeutuneet alapintaan suodattimen värjättiin kristallivioletilla ja valokuvattiin. (B) TranswellTM muuttoliike määritykset. Ei-matrigeeliä-päällystetyn soluviljelyinsertissä, määrällisesti muuttoliikkeen, värjätään solut hajotettiin DMSO ja niiden absorbanssi mitattiin. Nämä kokeet tehtiin kolminkertaisina. * P 0,05; ** P 0,01. *** P 0,005. (C) ja (D) Panc-1-solut transfektoitiin GFP-Smad3 tai GFP-C1-plasmidi 6 tuntia, sitten se pestään, muuttunut täydelliseen alustaan, 100 uM Nar 24 tuntia, sitten altistusta 5 ng /ml TGF- β1 tai yhdistelmä 5 ng /ml TGF-β1 ja 100gM Nar seuraavan 24 h qRT-PCR (C) tai western blot (D).

Toisaalta, SB- 431542, tunnettu spesifinen inhibiittori TβRI, on osoitettu estävän fosforylaatio Smad2 /Smad3 [30]. Tutkimuksessamme SB-431542 ei vaikuta mRNA: n ilmentymisen ja Smad3 ja Smad7 (kuvio 5E), mutta vähensi fosforylaatiota Smad3 in Panc-1-soluissa (kuvio 5G). Samanlainen tulos havaittiin myös ASPC-1-soluissa (tietoja ei esitetty). Tuloksemme viittaavat siihen, että Nar on eri mekanismin SB-431542 estämään TGF-β-välitteinen biologisia vaikutuksia. Yhdessä tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että Nar kykenee sen vaikutus TGF-β1 signaalireitin pääasiassa alaspäin säätäminen Smad3.

Keskustelu

EMT edistää kasvainsolujen muuttoliike ja invasiivisia sivustosta alkuperä- ja diffuusio kaukaisiin kudoksia ja elimiä, ja myös välittää kasvainsolujen vastustuskyvyn kehittymistä kemoterapeuttisten. Tämä prosessi liipaisee sekä autokriininen ja parakriininen TGF-β-signaaleja. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että TGF-p yksin tai yhdessä muiden kasvutekijöiden kuten EGF: lla on elintärkeä tehtävä välittäjänä EMT monissa pahanlaatuisia kasvaimia, kuten haimasyövän [31], [32]. Niinpä säätelemällä TGF-β-signaalin reitti on tehokas strategia ohjata syövän etenemisessä.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että Nar herkempiä haimasyövän soluja Gem läsnä ollessa tai poissa ollessa TGF-β1. TGF-β1 merkittävästi parannettu kestävyys ASPC-1 solut Gem mutta Nar täysin päinvastainen TGF-β1 aiheuttama vastus, mikä viittaa siihen, että Nar voi estää TGF-β1 välittävä signaalitransduktion. Tämä havainto oli myös hyvä kanssa aiemmat raportit että Nar on kykyä estää TGF-β1 eritystä ja vähentää sitoutumista todennäköisyyttä TGF-β1 sen erityinen reseptoriin TβRII [22], [23]. Yksi aiempien tutkimukset osoittivat, että Nar parempi syövänvastainen vaikutus doksorubisiinin A549 ja MCF-7 syöpäsoluissa selektiivisesti moduloimalla lääkevuoto- reittejä [25]. Muut tutkijat havaitsivat myös, että Nar näytteillä korkea antineoplasic toimintaa vastaan ​​klassisen MDR-alalinja johdettu mahalaukun (EPG85-257), haiman (EPP85-181), ja paksusuolen (HT-29) karsinoomia syöpäsolun linjat sekä muiden johdettujen monilääkeresistenttien solulinjat [33]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että saattaa olla yhteys TGF-β1 signaalireitin ja monilääkeresistenssiin polkuja, jotka on tutkittu tulevaisuudessa.

Lisäksi, Nar estivät merkittävästi TGF-β1-indusoidun EMT vähentämällä ilmentymistä vimentiinista, N-kadheriinin, MMP2 ja MMP-9 sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Sitten tutkittiin TGF-β /Smad: ien signaalireitin liittyvien geenien ilmentymistä ASPC-1 ja Panc-1cells, ja totesi, että Nar nimenomaan alassäädetty Smad3 ilmentymistä näissä kahdessa solulinjassa ja eksogeenisen ilmaus Smad3 voitaisiin tehokkaasti kiertää estävää vaikutusta Nar on TGF-β1 aiheuttama EMT fenotyyppiä kuten muuttoliike. Muut tutkijat raportoivat, että Smad ubikinaa- sääntelyn tekijöitä (Smurfs) aiheuttama Smad3 ubikinaa- varten proteasomaalisten hajoamisen tulos häiritä muodostumista Smad3 komplekseja sammuttaa TGF-β signaalitransduktioreittiin [34]. Tutkimuksessamme vaikutuksia Nar laskeva Smad3 proteiinin taso saattaa olla riippumattomia TGF-β1, joka tarkkaa mekanismia ei vielä tunneta. Kuitenkin meidän tulokset osoittavat selvästi, että Nar estää EMT prosessi kasvainsolujen alaspäin säätelemällä TGF-β /Smad3 signaalitransduktioreittiin. Tämä havainto antaa selitystä miksi Nar on suotuisa anti-kasvain metastaattisen tehoa in vivo lievä toksisuus kasvainsoluihin in vitro [22], [35]. SB-431542 [36], pieni molekyyli inhibiittoria TβIR, oli osoitettu inhiboivan TGF-β-indusoidun EMT säätelemällä fosforylaatio Smad2 /3 tuumorisoluissa, joka on johdonmukainen tuloksia. Ero Nar ja SB-431542 säätelyssä TGF-β /Smad: ien signaalireitin vihjaa, että he saattavat olla eri biofunctions.

Yhteenvetona Nar estää migraation, invaasion ja Gem vastus haimasyöpäsoluissa estämällä TGF-β /Smad3 välittämän EMT. Nämä havainnot osoittavat, että Nar voi toimia uutena potentiaalinen aine ehkäisemään kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden kliinisiin sovelluksiin.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

naringetiini (Nar) ostettiin Shanxi Huike kasvit Development Co. (Kiina). SB-431542 saatiin Sigma-Aldrich (Saksa), ne on tallennettu kantaliuoksena dimetyylisulfoksidiin (DMSO), joka käytettiin laimentamisen jälkeen elatusalustassa kutakin määritystä. DMSO: n konsentraatio ei ylittänyt 0,05% missään määrityksessä. Sytokiini, ihmisen rekombinantti-TGF-β1 ostettiin R & D-järjestelmä (Minneapolis, MN, USA) ja liuotetaan 10 mM sitruunahapolla, joka sisältää kantaja-proteiinia (0,1% BSA), pH 3,0 pitoisuuteen 2 mg /ml. Gemicitabin (Gem) tarjosi Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.LTD (Kiina). Trizol reagenssi ja SuperScript III Platinum kaksivaiheinen qRT-PCR Kit SYBR Green saatiin yhtiöltä Invitrogen ™ (USA). BCA ™ proteiini Assy Kit oli Thermo tieteelliset (USA). Sepectra ™ Multicolor Broad Range proteiinia Ladder ja DL1000bp, DL500bp DNA Ladder markkereita hankittiin TaKaRa Biotechnology Co (Dalian, Kiina).

proteaasinestäjiä ja fosfataasinestäjällä cocktail 3 ostettiin Sigma-Aldrich (Saksa) .Vimentin primaarista vasta-ainetta (hiiren monoklonaalinen IgG Sc-32322) saatiin Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA), Cell lyysipuskuria ja Phospho-Smad3 (Rabbit mAb IgG Ser423 /425), E-kadheriinin (Rabbit mAb), N-kadheriinin (Rabbit mAb), GAPDH (Rabbit mAb) primaarisen vasta-aineen ja toisen vasta-aineita (anti-kani-IgG, HRP-kytketty vasta-aine ja anti-hiiri-IgG, HRP-kytketty vasta-aine) hankittiin Cell Signaling Technology Inc. (USA). MMP2-vasta-ainetta (ab80737, hiiren monoklonaalinen IgG), MMP-9-vasta-ainetta (ab76003, Rabbit monoklonaalinen IgG) hankittiin Abcam (Hong Kong). Kaikki muut reagenssit olivat analyyttisesti puhdasta.

Soluviljely

AsPC-1 ja Panc-1-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Soluviljelyalustaan ​​ja naudan sikiön seerumia ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Kulttuuri pullot ja astiat olivat Corning (Corning, NY). Soluja viljeltiin RPMI 1640 tai DMEM, johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, penisilliiniä (100 U /ml), ja streptomysiinillä (100 U /ml), ja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Soluja jatkoviljeltiin joka 3-4 d. Jokaisessa testissä lääkkeet laimennettiin X-VIVO 15 kemiallisesti määritellyt seerumivapaassa väliaineessa (Lonza, Sveitsi) B

Cell Growth Inhibition Assay

AsPC-1 ja Panc-1-soluja maljattiin tiheys 10 x 10

3-solujen tai 3 x 10

3 per kuoppa 100 ui RPMI 1640 tai DMEM 96-kuoppalevyille ja kasvatettiin 24 h. Solut altistettiin eri pitoisuuksia Nar 24 h, 48 h tai 72 h: n Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen methylthiazoletetrazolium (MTT) menetelmällä, kuten aikaisemmin on kuvattu [37]. Lyhyesti, 150 ui MTT-liuosta (0,5 mg /ml fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa [PBS]) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Inkuboinnin jälkeen, 150 ui DMSO: ta (Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä käyttäen levylukijaa (Thermo, Erlangen, Saksa). Keskimääräinen prosenttiosuus solujen eloonjäämistä että verrattuna käsittelemättömiin soluihin arvioitiin tiedot kolmesta erillisestä kokeesta. Lääkkeen konsentraatio, jolla solun lethaling oli 50% laskettiin käyrän sovitus SPSS (versio 12.0, SPSS, Chicago, IL). Yhdistettyjen eri lääkkeitä, jälkeen, kun solut oli inkuboitu yön yli, kasvualusta korvattiin tuoreella kasvualustalla, joka sisälsi (50 uM, 100 uM) Nar yksinään tai yhdistelmänä TGF-β1 (5 ng /ml) 24 tuntia ja sitten altistetaan Gem vielä 72 h, solujen elinkelpoisuus havaittiin MTT: llä.

Haavan paranemista määritys

tyhjästä tehtiin poikki kerroksena ASPC-1-soluissa ja Pancin-1-soluissa. Soluja viljeltiin 6-kuoppalevyille ja Konfluenttien viljeltyjen solujen (80%), yksisoluiset kerrokset huolellisesti haavoittui raaputtamalla steriilillä muovinen pipetin kärki. Solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), käsiteltiin 5 ng /ml TGF-β1 tai yhdistelmänä 5 ng /ml TGF-β1 ja 50 tai 100 uM Nar. Kunkin tyhjästä, Valokuvia otettiin 0, 36 h, 72 h käyttämällä käännettyä mikroskooppia (Nikon ECLIPSE TS100 10 × 4. Japani) samoilla aloilla. Kukin koe suoritettiin vähintään kahdesti.

matrigeelin invaasio ja muuttoliike määritykset

Invasion analyysit suoritettiin käyttäen 24-kuoppaista BD Falcon ™ soluviljelyinsertissä (8 um huokoskoko, Becton Dickinson USA). Lyhyesti, solut ympättiin 60 mm kertakäyttöiset soluviljelymaljoille (Shanghai sunab Bio-Tech Development Inc. Kiina) ja esikäsiteltiin ne 50 tai 100 uM Nar 24 tuntia, sitten altistusta 5 ng /ml TGF-β1 tai yhdistelmä 5 ng /ml TGF-β1 ja 50 tai 100 uM Nar seuraavan 24 tunnin ajan. Suodatin päällystettiin 15 ul: tyvikalvon matriisin (kasvutekijä pienentää, ilman fenolipunaista, LDEV-Free, BD Biosciences). Käsitellyt solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen x-vivo 15 keskipitkällä ja ympättiin tiheydellä 3 x 10

4 solut tai 2 x 10

4 per kuoppa alkuun kammion. Alaosaan täytettiin 0,6 ml x-vivo15 jossa oli 5% FBS: ää sisälsivät näytteitä (kontrolli, 5 ng /ml TGF-β1, 50 uM ja 100 uM Nar, yhdistelmä 5 ng /ml TGF-β1 ja 50 uM tai 100gM Nar) kuin kemiallisten houkutin. Kun määritys kammiot inkuboitiin 24 tunnin ajan CO

2 yrityshautomo, ei-tunkeutuvat solut poistettiin varovasti pumpulipuikolla. Suodatinmembraani kiinnitettiin kylmällä metanolilla ja värjättiin kristallivioletilla 15 minuuttia. Solut yläpinnalla hellävaraisesti poistettiin vanupuikolla, ja solut alapinnalla on suodattimet kuvasin alla Leica DM 2500 patologinen kuva ja analyyttinen järjestelmä (Saksa) 50-kertaisella suurennuksella. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa.

Migration analyysit suoritettiin käyttäen 24-kuoppaista BD Falcon ™ Soluviljely insertti. Lyhyesti, täyspitkä ihmisen Smad3 cDNA monistettiin pCMV5B-Smad3 vektori [38]. Smad3-fragmentti ligoitiin GFP-C1-konstrukti (Clontech) GFP-C1-Smad3 (GFP-Smad3). Panc-1-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Gibco), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone), 37 ° C: ssa 5% CO

2. Transfektiota, Panc-1-soluja inkuboitiin opti-MEM-alustassa (Invitogen), joka sisälsi GFP-C1 tai GFP-Smad3 plasmidi 6 tuntia, sitten se pestään, muutettu täydellinen DMEM, jossa 0,1% DMSO: ta, 100 uM Nar 24 tuntia, sitten