Krooninen sairaus

tiivistelmä

ETK on ei-reseptori tyrosiinikinaasin, joka tarjoaa vahvan eloonjäämissignaalin ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. Src, toinen tyrosiinikinaasi että rajat aktivoi kanssa ETK, on ​​osoitettu olevan tärkeä rooli eturauhassyövän etäpesäkkeiden. Tässä huomasimme uuden luokan ETK estäjiä. Noiden inhibiittorit, CTA095 todettiin voimakas ETK ja Src dual estäjä. CTA095 havaittiin indusoivan autophagy sekä apoptoosin ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. Lisäksi, CTA095 esti HUVEC solujen putken muodostumiseen ja ”haavan paraneminen” ihmisen eturauhasen syöpäsolujen, mikä sen asema angiogeneesin inhibition ja etäpesäkkeiden ihmisen eturauhasen syöpä. Enemmän kiinnostavaa, CTA095 voisi voittaa Src-estäjällä resistenssin eturauhassyövän soluissa. Se indusoi apoptoosia Src-estäjällä resistenttien syöpäsolujen, todennäköisesti läpi mekanismin alas sääntelyn Myc ja BCL2. Tämä havainto osoittaa, että samanaikaisesti kohdistaminen ETK ja Src voisi olla lupaava lähestymistapa voittaa lääkeresistenssin eturauhassyövän.

Citation: Guo W, Liu R, Bhardwaj G, Ma AH, Changou C, Yang JC, et al . (2013) CTA095, Novel ETK ja Src Dual Inhibitor, indusoi apoptoosia syöpäsolujen ja voittaa kestävyys Src estäjät. PLoS ONE 8 (8): e70910. doi: 10,1371 /journal.pone.0070910

Editor: Qiming Jane Wang, University of Pittsburgh School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 25 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 15 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu C-Tag Bioscience Inc (Research apurahan RL); NIH myöntää DK52659 CA150197 (HJK), ja CA098116 (KSL); ja DOD tutkijatohtori Training Award PC080859 ja Auburn yhteisön Cancer Endowment Fund (ja WG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: C-Tag Inc on kaupallinen rahoittajan tälle työlle, ja molemmat KSL ja HJK ovat tieteelliset neuvonantajat C-TAG Inc. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä on useimmin diagnosoitu syöpä ja toinen johtava syy syöpäkuolemista miesten Yhdysvalloissa [1]. Vaikka alkuvaiheessa eturauhassyöpä (CAP) voidaan tehokkaasti ohjata hormonikorvaushoitoa, metastaattisen CaP edelleen parantumaton. Tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) ovat lupaavin kohdennettujen hoitomuotojen; mutta niiden potentiaali eturauhassyövän terapeuttisina ei ole täysin toteutunut, ja tähän mennessä tulokset kliinisissä tutkimuksissa TKI yksittäisinä aineina ovat yleensä olleet vaatimattomia, johtunee irtisanomisten reseptoriin sitoutumisen ja signaloinnin solunsisäisten välittäjien [2]. Useimmat TKI, jotka on kehitetty kohdistuvat reseptorityrosiinikinaaseihin. ETK on ei-reseptori-tyrosiinikinaasin, joka on yli-ilmentynyt ihmisen eturauhassyövän näytteet ja tarjoaa vahvan selviytymisen toimintoja eturauhassyöpäsoluissa [3], [4]. ETK välittää kriittistä aktivointi STST3 Cap viittaa siihen, että toiminnallinen häiriö ETK voi heikentää useiden keskeisten signaalien mukana Cap kasvua ja selviytymistä [5]. ETK säätelee myös selviytymisen [6], etäpesäke [7], lääkeresistenssin [3], [8], angiogeneesi [9], ja apoptoosin [10]. Yliekspressio ETK indusoi eturauhasen intraepiteliaalisten kasvainten hiiren [11]. Viimeaikaiset raportit osoittavat, että ETK on tärkeä rooli itseuudistumisen ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa glioblastoma kantasolujen avulla Stat3 aktivaation [12]. Siksi systeeminen estäminen ETK voi tarjota synergistisiä antituumorivaikutuksia. Kuin vielä ei ole tehokas estäjä tämän kinaasin.

Src, ETK, ja FAK liittävät ja rajat aktivoida toisiaan. Esto yhden usein vähentää aktiivisuutta muita. Nämä kolme kinaasien on osoitettu olevan tärkeä rooli angiogeneesissä ja etäpesäkkeiden eturauhasen syöpäsoluja. Src-inhibiittori, AZD0530, on raportoitu estävän eturauhassyövän luumetastaasipotilailla eläinmalleissa. Kuitenkin tämä inhibiittori puuttuu aktiivisuus indusoida apoptoosin eturauhasen syöpäsoluja. Dual inhibition ETK ja Src voi vain voittaa haitta Src-inhibiittorit, mutta se voi myös lisätä tehokkuutta metastaasin inhiboinnissa eturauhasen syöpäsoluja.

Autophagy on catabolic prosessi hajoamista solun oma komponenttien kautta lysosomaalisen koneet [13]. Se on tiukasti säänneltyä prosessi, joka auttaa säilyttämään tasapaino synteesin, hajoaminen, ja kierrätystä solun tuotteiden [14]. Autophagy voitaisiin edistää sekä solujen eloonjäämistä ja solukuoleman yhteydessä riippuvaisella tavalla. Autophagy modulaattorit ovat nykyään yhtä tärkeitä sensitizers tai määritteet kohdennetun hoidon [15], [16].

Tässä me raportoimme tunnistaminen uusi ETK ja Src dual estäjä, CTA095, joka indusoi autophagy ja apoptoosin, kuten sekä synergiavaikutuksen kanssa autophagy modulaattorit eturauhasen syöpäsoluja. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti olevan ETK ja Src dual estäjä sovelluksen kanssa kuin solunsalpaajaksi.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Puhdistettu ETK , Btk, Mertk, Kyllä ja Src-kinaasien saatiin Millipore Inc (Dundee, UK). Propidiumjodidia (PI),

N

,

N

-di-isopropyylietyyliamiinia (DIEA),

N

,

N

-dimethylformimide (DMF), etanoli, asetonitriili (ACN), 1- (3-aminopropyyli) piperidiini, trifluorietikkahappo (TFA), Pd /C, ammoniumformiaattia ja dimetyylisulfoksidi (DMSO) hankittiin Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO). L-fenyyliglysiinimetyyliesterihydrokloridia ostettiin Chem-Impex International Inc (Wood Dale, IL). Dibentsofuraanista-2-karboksaldehydiä hankittiin Oakwood Products, Inc. (West Columbia, SC). Anneksiini V-FITC apoptoosin detektioreagenssipakkaus saatiin Abcam (Cambridge, MA). Käänteisfaasilla korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (RP-HPLC) päässä Waters Corporation (Milford, MA) käytettiin analysointiin ja puhdistamiseksi CTA095. LNCAP, CWR22Rv1, RWPE1, 293 ja HUVEC-solut hankittiin ATCC (Manassas, VA).

Yhden potin synteesi CTA095

synteettinen lähestymistapa CTA095, 2-(dibenzo[

b

,

d

]furan-2-yl)-7-phenyl-1-(3-(piperidin-1-yl)propyl)-1

H

-imidazo[4,5-

g

]quinoxalin-6(5

H

)-one, on samanlainen lähestymistapa olemme aiemmin raportoitu [17]. Lyhyesti, liuos, jossa oli L-fenyyliglysiinimetyyliesterihydrokloridia (201,7 mg, 1,0 mmol) ja DIEA: ta (383,2 ui, 2,2 mmol) DMF: ssä (1,5 ml) lisättiin tipoittain voimakkaasti sekoittaen liuokseen, jossa on 1,5-difluori- 2,4-dinitrobentseeni (204,0 mg, 1,0 mmol) DMF: ssä (0,5 ml). Reaktioliuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 45 minuutin ajan. Tämän jälkeen lisättiin liuos, jossa oli 1- (3-aminopropyyli) piperidiini (159 ui, 1,0 mmol) ja DIEA: ta (174,2 ui, 1,0 mmol) DMF: ssä (1 ml). Saatua seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa yön yli. Etanoli (20 ml), Pd /C (10%, 200 mg), ja ammoniumformiaattia (1,50 g, 23,8 mmol) lisättiin liuokseen. Liuosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 3 tuntia ja jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilaan. Pd /C suodatettiin pois, ja suodos konsentroitiin pyöröhaihduttimella. Dibentsofuraani-2-karboksaldehydiä (196,2 mg, 1,0 mmol) DMF: ssa, lisättiin liuokseen. Tuloksena saatua liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1 päivä. DMF-liuosta kaadettiin 40 ml: aan jäätä. Sakka otettiin talteen suodattamalla ja pestiin vedellä, mitä seurasi RP-HPLC-puhdistuksesta. Tämä fraktio kerättiin ja lyofilisoitiin, jotta saatiin keltaista jauhetta, joka on lopullinen tuote (kuvio S1). Homogeenisuutta yhdisteen tarkistettiin analyyttisellä RP-HPLC: llä. Puhtaus määritettiin 95% puhdasta. Identiteetti yhdisteiden vahvistettiin matriisi laserdesorptio /-ionisaatio lennon massaspektrometriaa. Havaittu: 554,26 Dalton (laskettu: 554,26 Dalton MH

+).

Molekyylimallinnus

Molecular telakoinnin tutkimukset suoritettiin ymmärtää sitoutumisen CTA095 on ETK. Energia optimoitu rakenne CTA095 laskettiin käyttäen Merckin Molecular Force Field (MMFF) [18], kuten se on toteutettu Marvin Suite v 5,11 (https://www.chemaxon.com/products/marvin). Kolmiulotteinen rakenne ihmisen ETK (tähteet 275-675) sekvenssin (NCBI GI: 42544182) ennustettiin käyttämällä homologiamallinnusta lähestymistapa toteutettuna HHPred [19], [20]. Jos haluat määrittää oletetun sitoutumiskohdan CTA095 annetun ETK proteiinien rakenteen, ensin käyttää sokeaa telakka lähestymistapa toteutettu SwissDock verkkopalvelussa (https://swissdock.vital-it.ch) [21], [22]. Niistä klusterit syntyvät SwissDock, konformaatio, jolla on alhaisin sitovia vapaan energian valittiin. Jotta edelleen ymmärtää vakautta ja dynamiikkaa ligandia kinaasikompleksi, teimme 20 ns molekyylidynamiikan (MD) simulointi, aloittaen parhaiten telakoituna rakenne ennustaa SwissDock. Nämä simulaatiot suoritettiin käyttäen NAMD v 2.7b2 [23]. CHARMM27 voimakentät käytettiin laskettaessa potentiaalit ETK, kun taas CHARMM22 (kuten toteutettu SwissParam (https://swissparam.ch) [24] voimakentät käytettiin laskettaessa potentiaalit CTA095. Kinaasi-ligandikompleksin solvatoitiin vesi laatikko määräajoin reunaehdot. mitat vettä laatikko valittiin olemaan vähintään 10 ångströmiä suurempi kuin liukenevan aineen joka suuntaan. koko järjestelmä neutraloitiin 0,15 M NaCl: a. Ensimmäinen minimointi vaihe suoritettiin 6000 vaiheita, minkä jälkeen 20 ns rentoutumisen. Trajectories näiden simulaatioiden visualisoitiin käyttäen VMD v 1.9 [25], ja vuorovaikutukset kinaasi ja ligandin piirrettiin käyttämällä PyMol ja LigPlot + v 1.4 [26].

Kinase inhibitiomäärityksellä

Kinase esto mitattiin käyttäen thin-layer-kromatografia (TLC). Lyhyesti, puhdistettu kinaasit (20 nM), vastaava substraatti (500 uM, TSFYGRH ETK, YIYGSFK muiden kinaasien), ja CTA095 (0 -10 pM) inkuboitiin kinaasireaktiossa (100 mM Hepes, pH 7,4, 10 mM MnCl

2, 10 mM MgCl

2, 1 mM DTT), 5 min, ja reaktio aloitettiin lisäämällä 5 pCi

33P-leimattu ATP. Reaktio (10 ui) inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunti ja pysäytettiin lisäämällä 10 ui H

3PO

4. Radioaktiivisuus peptidisubstraatin analysoitiin käyttäen TLC kuten aikaisemmin on kuvattu [27].

ETK autofosforylaation määrityksessä

ETK autofosforylaation aktiivisuus mitattiin in vitro -kinaasimäärityksessä. Lyhyesti, puhdistettuja ETK (100 ng) sekoitettiin CTA095 on kinaasimäärityspuskurilla (20 mM Hepes, pH 7,55, 10 mM MgCl

2, 10 mM MnCl

2, 1 mM DTT: tä, 500 uM Na

3Vo

4). Kylmä ATP (5 uM) ja kuuma r

33P-ATP: tä (5 uCi) lisättiin seokseen ja kinaasi reaktio suoritettiin 30 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Reaktiot lopetettiin 4X SDS-PAGE-näytepuskuria, ja ladattiin sitten 8% SDS-polyakryyliamidigeelillä elektroforeesia varten. Geeli kuivattiin tyhjiössä ja ETK auto-kinaasiaktiivisuutta analysoitiin fosfo- (Biorad).

Soluviljely

LNCAP, PC3, CWR22Rv1, ja RWPE1 soluja pidettiin RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiini /glutamiini.

Western blotting

Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [28]. Proteiinit havaittiin käyttäen seuraavia vasta-aineita: β-aktiini (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO), ETK (Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA), pEtk; Src, pSrc; STAT3, pStat3. Sillä fosfo-ETK, soluja esi-käsiteltiin 100 uM pervanadate 15 minuuttia ennen sadonkorjuuta.

MTT-määritystä

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja viljeltiin yön yli, minkä jälkeen seuraa käsittely 0,1% DMSO: ta, kun ajoneuvo ohjaus, ja CTA095, ilmoitettuina pitoisuuksina 72 tuntia. Kasvun inhibitio mitattiin käyttämällä 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) (Roche Diagnostic, Mannheim, Saksa).

Virtaussytometria

PC3-soluja käsiteltiin 0,1% DMSO: ta (kontrolli) ja CTA095 ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Solusyklin pysähtymisen määritettiin sisällyttämällä propidiumjodidia (Sigma-Aldrich) otetaan läpäiseviksi soluihin. Apoptoosin alaisten solujen tunnistettiin käyttämällä anneksiini V-FITC Kit (Abcam), seuraten valmistajan ohjeita. Solut analysoitiin käyttäen Coulter Epics XL virtaussytometrillä (Beckman Coulter, Miami, FL).

analyysi kaspaasi-3/7 ja kaspaasi 9 toimintaa

kaspaasi 3/7 toimintaa, PC3-soluja ympättiin 5000 solua /kuoppa 96-kuoppaiselle levylle yön yli. Sitten soluja käsiteltiin 0-10 uM CTA095 24 tuntia. Kaspaasi 3/7 toiminta mitattiin käyttäen Apo-ONE homogeeninen kaspaasi-3/7 Assay Kit (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden. Kaspaasi 9 toimintaa, PC3-solut ympättiin 10 mm: n kudosviljelymaljalle ja kasvoi 50% konfluenssiin. Sitten soluja käsiteltiin 0-10 uM CTA095 24 tuntia. Solut kerättiin ja kaspaasi 9 aktiivisuus mitattiin käyttämällä Western blot anti-kaspaasi-9-vasta-aine.

Autophagy määrityksessä

PC3-solut transfektoitiin stabiilisti GFP-LC3 [16]. Soluja kasvatettiin 6-kuoppalevyllä 50% konfluenssiin ja käsiteltiin 5 uM CTA095 24 tuntia. Autophagy visualisoitiin GFP-LC3 ”puncta” ja immunoblottaus Endogeenisen LC3 isoformeja.

HUVEC solun putken muodostumiseen määrityksessä

HUVEC-solut ympättiin mitrogel ja käsiteltiin CTA095 (0 ja 5 uM) 6 h. Vaskulaarinen putki muodostuminen visualisoitiin käyttämällä mikroskooppia.

PC3 solu ”Haavojen paraneminen” määritys

PC3-soluja kasvatettiin 6-kuoppalevyllä 60% konfluenssiin. Sitten haavat tehtiin käyttäen kärki ja käsiteltiin CTA095 (0 ja 5 uM). Solujen vaeltamiseen (haavan paranemiseen) tehtiin näkyväksi mikroskoopin alla ilmoitettuina aikoina.

esto PC3 ksenograftin kasvaimen kasvua CTA095nano (CAT095 muotoiltu nano-misellit) B

Tutkimus toteutettiin tiukasti suositusten mukaisesti oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) ja University of California, Davis (Protocol numero: 16697). Lyhyesti, 2 x 10

6 PC3 solua injektoitiin ihon alle kyljissä 5 viikkoa vanhoja koiraspuolisia karvattomia hiiriä. Kasvaimen tilavuus mitattiin paksuus ja lasketaan kaavalla V = (L x W

2) 1/2. Kasvaimet kasvatettiin osoitettuun koon ja hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään (8 hiirtä /ryhmä). Kontrolliryhmä käsiteltiin vehikkelillä. Hoitoryhmässä käsiteltiin CTA095nano 10 mg /kg kahdesti viikossa kautta i.v. injektio. Tuumorin koko ja ruumiinpaino mitattiin kerran viikossa. Koe lopetettiin, kun kasvaimen koko kontrolliryhmän saavutettu inhimillinen loppupisteet IACUC. Käyrät kasvaimen tilavuutta jakeita kesto oli piirretty molemmissa ryhmissä.

CTA095 voittaa Src-estäjällä resistenssin eturauhasen syöpäsolujen

PC3 ja PC3-AZD20 (PC3 solujen resistenttejä 20 uM AZD0530, joka on peräisin AstraZeneca kautta MTA tohtori Chris Evans) soluja ympättiin 2000 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille yössä. Solut käsiteltiin AZD0530 tai CTA095 ilmoitettuina pitoisuuksina. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen MTT-määritystä 72 tunnin jälkeen.

CTA095 indusoi apoptoosia Src-estäjällä resistenttien syöpäsolujen kautta Myc ja BCL2 inhibition

PC3-AZD20 solut ympättiin 10

6 solua /kuoppa 6-kuoppaisille levyille yön yli. Solut käsiteltiin AZD0530 tai CTA095 10 uM. Apoptoosi analysoitiin anneksiini V FITC apoptoosin havaitseminen pakki. MRNA-tasot Myc ja BCL2 mitattiin käyttäen reaaliaikaista PCR. pEtk, ETK, pSrc, Src, pStat3, Stat3, Myc ja BCL2 mitattiin käyttämällä vastaavien vasta-aineiden kautta Western blot.

Tilastot

Yksisuuntainen ANOVA käytettiin yhdistelmänä Tukey testi pareittain vertailua. P-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

CTA095 dual estäjä vastaan ​​ETK ja Src tyrosiinikinaaseihin

kautta seulomalla 9600-diversity kombinatorinen Liuosfaasin pienimolekyylisiä kirjasto, osuma yhdisteitä estävää toimintaa vastaan ​​ETK löydettiin. Myöhemmät rakenne-aktiivisuus-suhde tutkimukset johtivat tunnistamiseen CTA095 (kuvio 1A). Verrattuna muihin CT yhdisteillä on fuusioitunut kolmen renkaan ytimen rakenne identtinen CTA095, CTA095 osoittivat merkittäviä ETK esto (kuvio 1 B). Kiinnostavaa, oli vahva korrelaatio ETK esto ja PC3 kasvun estäminen (kuvio 1 C). Tämä data viittaa siihen, että ETK voi olla kohde vastuussa kasvun inhibition PC3-soluja.

Chemical rakenne CTA095 (A), tunnistaminen CTA095 kuin voimakas ETK estäjä (B) ja sen sytotoksisuus PC3-soluja (C). ETK esto, puhdistettua ETK (20 nM), vastaavat yhdisteitä (1 pM), ja peptidi alustan (YIYGSFK) inkuboitiin

33P-ATP: kinaasin reaktion. Saatu tuote analysoitiin TLC-levyllä. Kasvun inhibitio, PC3-solut ympättiin 5000 solua /kuoppa 96-kuoppaiselle levylle yön yli ja käsiteltiin vastaavia yhdisteitä (10 uM) Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen MTT-määritystä 72 tunnin jälkeen. Pylväät, keskiarvo; baareja, keskihajonta, n = 3.

Kun eristetty pieni molekyyli, joka estää ETK, seuraava looginen askel oli määrittää sen spesifisyyden tämän entsyymin. Tämän saavuttamiseksi, puhdistettu ETK, Btk, Src ja Kyllä inkuboitiin kinaasireaktiopuskurin kanssa CTA095 (0-1 uM), kun läsnä on

33P-leimatun ATP: n ja peptidin (YIYGSFK), on aiemmin osoitettu olevan erinomainen substraatti sekä BTK ja Src-ryhmän kinaasit. Kinaasi-aktiivisuus mitattiin käyttäen TLC tekniikkaa. Tutkimus osoitti, että CTA095 oli tehokas estäjä ETK, joiden IC

50 noin 60 nM (kuvio 2A). Inhibitio havaittiin pitoisuutena riippuvaisella tavalla. Lisäksi CTA095 voisi myös estää Src (IC

50 ≈ 120 nM). Kuitenkin Btk ja kyllä ​​olivat huomattavasti vastustuskykyisempiä CTA095 eston IC

50 yli 10 uM (kuvio 2A, kuvio S2).

potenssi CTA095 ja ETK, Src, Btk ja kyllä ​​mitattiin käyttäen TLC (A) tunnistaa

33P-fosforyloitu peptidisubstraatilla. Puhdistettu TK (20 nM), CTA095 (0, 0,2, ja 1 uM), ja peptidi alustan (YIYGSFK) inkuboitiin

33P-ATP: kinaasin reaktion. Saatu tuote analysoitiin TLC-levyllä. Vaikutus CTA095 ja ETK autofosforylaatioon (B) tutkittiin edelleen inkuboimalla ETK kanssa CTA095 ilmoitettuina pitoisuuksina läsnä ollessa

33P-ATP radioaktiivisuus ETK mitattiin käyttämällä säteilylle elokuva. Intensiteetti radioaktiivisen spot mitattiin käyttämällä densitometriä. Pylväät, keskiarvo; baareja, keskihajonta, n = 3.

Btk perheen ei-reseptorityrosiinikinaasien on ominaista, että läsnä on autofosforylaatiokohta sisällä ei-katalyyttinen Src homologia 3 (SH3) domain. Näin ollen se oli myös tärkeää määrittää kyky CTA095 estää ETK autofosforylaatioon. Siksi

in vitro

ETK autofosforylaation määritys perustettiin jossa puhdistettu ETK sekoitettiin CTA095 läsnäollessa

33P-ATP. 30 minuutin kuluttua, reaktio lopetettiin, ja näytteet ladattiin SDS-polyakryyliamidigeelillä elektroforeesia varten. Kuivauksen jälkeen geeli analysoitiin fosfo-. Kuvio 2B osoittaa, että CTA095 kykeni inhiboimaan ETK autofosforylaatiota pitoisuutena riippuvaisella tavalla.

Lisäksi Btk perheen tyrosiinikinaasien, estoaktiivisuus CTA095 muiden kinaasien, mukaan lukien Lyn, Axl, Mer, EGFR, ja Abl, tutkittiin käyttäen TLC-määrityksellä. Kuten on esitetty taulukossa 1, CTA095 näyttää olevan vahva reaktiivisuus kohti ETK ja Src, paljon suurempi kuin minkään muun kinaasien testattu.

CTA095 estää ETK sitomalla sen ATP: n sitovan alueen

Tutkitaan oletetun mekanismin vastuussa ETK inhibitiota CTA095, molekyyli- telakointi ja dynamiikan tutkimukset suoritettiin. Nämä tutkimukset ennustavat, että CTA095 vuorovaikutuksessa back-taskuun ATP sitovan alueen. Tämä sitova tasku muodostuu tähteistä glysiinirikas silmukka, ”portinvartija” T489, ja sarana-alueen (kuvio 3A). R

3 ryhmä CTA095 vuorovaikutuksessa portinvartija molekyylin Thr489, ja myös vakauttaa Phe555 on DFG motiivin inaktiivisessa ”pois” -asentoon (kuva 3B). Lisäksi kolmen renkaan ydinryhmä yhdisteen vuorovaikutuksessa Cys496, joka on hyvin ainutlaatuinen ETK. Vain 8 kinaasien ulos 491 kinaasien jotka analysoitiin aikaisemmassa tutkimuksessa [29], [30] osoittavat, treoniini ja kysteiini näissä asemissa. Näin CTA095 vuorovaikutusta sekä Thr489 ja Cys496 voivat antaa sille ainutlaatuisen kinaasin valikoivuus. Käytimme myös LigPlot + ennustaa vetysidoksen ja /tai hydrofobisia vuorovaikutuksia, että sitova tasku, ja tuloksemme osoittivat, että useita hydrofobisia vuorovaikutuksia ovat vastuussa CTA095-ETK sitoutumiseen (kuvio S3A ja S3B). Sivuketjuja että oletettavasti vuorovaikutuksessa CTA095 on esitetty kuvassa S3C. Analyysi Molekyylidynamiikan liikeradat osoittavat myös, että R

3 ryhmän ja kolmen renkaan ytimen vuorovaikutuksessa vahvasti ja vakaasti kanssa sivuketjujen sitova taskussa, kun taas R

1 ja osaa R

2 ovat liuotin alttiina, ja ne voivat toimia kohteina edelleen parantaa CTA095 sitova ja spesifisyys (elokuva S1).

(A) pinta näkymä ETK telakoituna CTA095 jälkeen 20 ns MD minimoinnin ja rentoutumista. R

3 ja kolmen toroidiydin typistetty syvempää välillä glysiinirikkaan silmukka-alue (syaani) ja sarana-aluetta (oranssi), R

1 ja R

2 ovat alttiina liuottimelle. Sininen: Helix C; Red: Aktivointi Loop; Green: DFG motiivi (554-556); Cyan: Glysiini-rikas silmukka; Oranssi; Sarana-alue. (B) Cartoon esitys, joka osoittaa ennustettua vuorovaikutukset CTA095 reitittimeen Thr489, DFG (554-556) motiivi, ja Cys496. CTA095 sitova stabiloi Phe555 in ”out” kokoonpano, ja vaikuttaa aktiivinen tila suolan sillan muodostumisen välillä Lys445 ja Glu460. Sininen: Helix C; Red: Aktivointi Loop; Green: DFG motiivi (554-556); Cyan: Glysiini-rikas silmukka; Oranssi; Sarana-alue. Luvut luotiin käyttäen PyMol.

Toisin ETK-CTA095 sitova, Src osoittaa sitoutumisen CTA095 aktiivisen keskuksen taskun muodostettu N-lohko, C-lohko ja aktivointi silmukka. CTA095 sen typistetty asennossa ulottuu tähteiden Asp404 ja Asn 391, jotka ovat molemmat tärkeitä Mg

2+ ja ATP: n sitoutuminen. CTA095 myös oletettavasti vuorovaikutuksessa toiminnallisesti tärkeä Tyr416 jäännös, joka on osa aktivointi silmukka-alue (kuva S4). Kaiken kaikkiaan uskomme, että CTA095 estää ATP: n sitoutuminen tasku Src, ja estää ATP: n sitoutuminen in ETK indusoimalla konformaatiomuutoksia kautta takaisin taskun.

CTA095 estää fosforylaatiota ETK, Src ja loppupään signaaleja Stat3 ja Akt eturauhassyöpäsoluissa

estoaktiivisuus CTA095 vastaan ​​fosforylaation ETK vuonna ehjien solujen tutkittiin Western blot. ETK sekä Src: n fosforylaatiota PC3-ETK (PC3-solut transfektoitiin stabiilisti ETK), solut estivät merkittävästi 5 uM ja 10 uM. Src esto johtaa todennäköisesti sekä suoraan inhibitiota CTA095, sekä pienemmästä aktiivisuudesta ETK, joka aktivoi Src. Valikoiva tavoite ETK ja Src on STAT3, jonka fosforylaatio on myös inhiboi CTA095. Akt on toinen tärkeä alavirtavaikuttajainhibiittorit ETK, ja sen fosforylaatio estyi CTA095 (kuvio 4).

Soluja kasvatettiin 10 mm: n levy 50% konfluenssiin ja käsiteltiin CTA095. Solut kerättiin 24 tunnin kuluttua. pEtk, ETK, pSrc, Src, pStat3, Stat3, Pakt ja Akt mitattiin käyttämällä vastaavien vasta-aineiden Western blot. Yksi kolmesta samanlaisia ​​kokeita on kuvattu.

CTA095 ensisijaisesti estää niiden kasvun pahanlaatuisten eturauhasen solujen

vaikutuksen määrittämiseksi CTA095 proliferaatioon, paneeli syöpäsolulinjoja, mukaan lukien LNCAP, CWR22Rv1 , PC3 ja normaalissa eturauhasessa solun RWPE1 inkuboitiin CTA095 ja niiden leviäminen mitattiin käyttäen MTT-määritystä. CTA095 oli tehokas kasvun estämiseksi eturauhasen syöpäsolujen (LNCAP, CWR22Rv1 ja PC3), kun taas kuolemattomaksi normaalin eturauhasen solujen RWPE1 oli resistentti CTA095 (kuvio 5), mikä johtuu todennäköisesti ”riippuvuus” on ETK signaalin eturauhasen syöpäsolujen , kuten on esitetty aiemmin [11].

solut ympättiin 5000 solua /kuoppa 96-kuoppaiselle levylle yön yli ja käsiteltiin CTA095 ilmoitettuina pitoisuuksina. Solujen elävyys mitattiin käyttäen MTT-määritystä 72 tunnin jälkeen. pisteitä, tarkoittaa; baareja, keskihajonta, n = 3.

CTA095 indusoi autophagy eturauhassyöpäsoluissa

Aiemmin osoitti, että Src-estäjällä AZD0530 indusoi autophagy eturauhassyöpäsoluissa, joka edistää apoptoosia vastus ja vähentää tehoa Src-estäjällä [16]. Sen määrittämiseksi, onko CTA095 voi laukaista autophagy, PC3-solut transfektoitiin stabiilisti GFP-LC3 käsiteltiin CTA095, sitten tutkitaan fluoresenssimikroskopialla. 24 tunnin kuluttua hoidon CTA095, nämä solut tuottivat laaja erillinen ”puncta” autophagosome morfologia, kun taas ajoneuvon käsittely ei (kuva 6A). Kyky CTA095 aiheuttaa autophagy PC3-soluissa vahvistettiin edelleen muuntaminen endogeenisen LC3-I LC3-II muotoja (kuvio 6B). Näin ollen, kuten Src-tyrosiinikinaasi-inhibiittorin, esto ETK indusoi myös autophagy.

Soluja kasvatettiin 6-kuoppalevyllä 50% konfluenssiin ja käsiteltiin CTA095. Autophagy visualisoitiin GFP-LC3 ”puncta” (A) ja immunoblottaus Endogeenisen LC3 isoformien (B). Kaikki kokeet suoritettiin 24 h käsittelyn jälkeen.

CTA095 indusoi apoptoosia eturauhassyöpäsoluissa

Sen määrittämiseksi, onko kasvun esto indusoi CTA095 on PC3-solujen johtui apoptoosin, virtaus sytometrinen analyysi suoritettiin. Hoidon jälkeen CTA095 24 tuntia, annoksesta riippuva kertyminen ”sub-G1” fraktio havaittiin käyttäen PI-värjäyksellä (kuvio 7A). Data perustuu anneksiini-V reaktiivisuus ilmaisivat myös annosriippuvainen nousu apoptoosin PC3-solujen käsittelyn jälkeen CTA095 (kuvio 7B). Lisäksi tutkimus osoitti, että hoito PC3-solujen CTA095 johti annoksesta riippuvaan aktivaatioon caspase3 /7 (kuvio 7C) ja kaspaasi 9 (kuvio 7D). Näin ollen, toisin kuin Src-estäjällä AZD05350, tämä Eläketurvakeskus estäjä indusoi merkittävän apoptoosin taso, vaikka sen stimulaation autophagy kautta. Enemmän kiinnostavaa, 293-solut (ETK negatiivinen) ovat resistenttejä apoptoosin by CTA095, osoittaa spesifisyyttä tämän yhdisteen ETK (kuva S5). Kuten tuonnempana, ETK ohjaa suoraan selviytymisreittiin, jonka puuttuminen ilmeisesti voi ohittaa suojaava vaikutus autophagy. Tämän seurauksena, CTA095 indusoitua apoptoosia voidaan lisätä myös pitämällä autophagy esto (katso alla).

PC3-solut ympättiin 10

6 solua /ml (2 ml) 6-kuoppaiselle levylle yön yli ja käsiteltiin sitten CTA095 ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Solusyklin pysähtymisen analysoitiin PI värjäystä (A). Apoptoosi analysoitiin käyttämällä anneksiini-V-FITC apoptoosin detektioreagenssipakkaus (B). Kaspaasi 9 aktivaatio mitattiin western blot (D). Kaspaasi 3/7 aktiivisuutta, PC3-solut ympättiin 5000 solua /kuoppa 96-kuoppaiselle levylle yön yli ja käsiteltiin CTA095 on 0-10 uM 24 tuntia. Kaspaasi 3/7 toiminta mitattiin käyttäen Apo-ONE homogeeninen kaspaasi-3/7 Assay Kit (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden. Pylväät, keskiarvo; baareja, keskihajonta, n = 3. 5 uM ja 10 uM poikkeavat merkittävästi 0 uM (*, p 0,05, yksisuuntainen ANOVA Tukey testi pareittain vertailun).

CTA095 inhiboi HUVEC solujen putken muodostumiseen ja eturauhassyövän solumigraatio

ETK ilmentyy vahvasti endoteelisolujen ja osoitettu olevan osallisena angiogeneesissä [31]. Tutkia kykyä CTA095 inhiboida angiogeneesiä, verisuonten putken muodostumiseen HUVEC endoteelisolut käsittelyn jälkeen CTA095 tutkittiin. Kuten odotettua, putken muodostumiseen HUVEC-solujen hajotettiin CTA095 (kuvio 8A). Tutkia kyky CTA095 estää solujen vaeltamiseen, ”haavan paranemista” PC3-solujen mitattiin seuraavan hoidon CTA095. Kuten kuviossa 8B on esitetty, ”haavan paraneminen” PC3-solujen suuresti inhiboi CTA095 48 tunnin jälkeen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CTA095 on kyky paitsi tukahduttaa eturauhasen syöpäsolujen kasvua, mutta myös vähentää angiogeneesiä.

Inhibition of vascular putken muodostumiseen HUVEC endoteelisolut (A) ja inhibitio muuttoliike (haavan paranemisen) ja PC3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen (B) CTA095. (A) HUVEC-soluja siementen mitrogel ja käsiteltiin CTA095 (0 ja 5 uM) 6 tuntia. Vascular putken muodostumiseen visualisoitiin käyttäen mikroskooppia. (B) PC3-soluja kasvatettiin 6-kuoppalevyllä 60% konfluenssiin. Sitten haavat tehtiin ja käsiteltiin CTA095 (0 ja 5 uM). Solujen vaeltamiseen (haavan paranemiseen) tehtiin näkyväksi mikroskoopin alla ilmoitettuina aikoina.

CTA095 kuin kemiallis-herkistävä

Meidän ensimmäinen tutkimukset osoittivat, että CTA095 on hyvä sytotoksisuus kohti paneeli eturauhasen syöpäsoluja. Sen tutkimiseksi, onko ETK ja Src dual estäjä toimii tehokkaasti kuin Chemo herkistävä, PC3-solut samanaikaisesti käsiteltiin CTA095 ja paklitakselin (PTX) (2 ng /ml), tai autophagy inhibiittorin klorokiinin (CQ) (10 uM). Kasvun estäminen määritettiin käyttäen MTT-määritys 72 tunnin jälkeen. On kiinnostavaa, että synergistinen vaikutus CTA095 kanssa PTX tai CQ eturauhasen syöpäsolujen havaittiin (kuvio 9). Tämä viittaa siihen, että CTA095 on Chemo herkistävä, ja esto autophagy mukaan CQ edistää CTA095 solukuolema.

Growth Inhibition of CTA095 ja yhdessä 10 uM klorokiinin (CQ), tai 2 ng /ml paklitakselia (PTX ) ja PC3 ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. Solut ympättiin 5000 solua /kuoppa 96-kuoppaiselle levylle yön yli ja esikäsiteltiin vastaavan co-hoitoja 1 tunti, sitten sitä käsiteltiin 2,5 uM CTA095. Solujen elävyys mitattiin käyttäen MTT-määritystä 72 tunnin jälkeen. Pylväät, keskiarvo; baareja, keskihajonta, n = 3.

CTA095nano estää PC3 ksenograftin kasvaimen kasvua in vivo

Koska

in vitro

aktiivisuus CTA095 vastaan ​​eturauhasen syöpäsoluja, on tärkeää vahvistaa nämä tulokset

in vivo

. Koska CTA095 liukenee heikosti veteen, muotoilimme CTA095 osaksi nano misellejä. Tämä misellin kehitettiin meidän lab ja sitä on käytetty menestyksekkäästi muotoilla hydrofobisten lääkeaineiden kuten paklitakseli ja vinkristiini [32], [33].