Krooninen sairaus

tiivistelmä

seriiniproteaasiestäjien (SERPINs) näyttävät ilmentyvän erilaisissa lajien ja tärkeitä rooleja keskeisessä fysiologisten prosessien, kuten angiogeneesin, immuunivasteet, veren hyytymisen ja fibronolysis. Näiden, okasolusyöpä antigeeni 1 (SCCA1), joka tunnetaan myös nimellä SERPINB3, tunnistettiin ensimmäisen kerran vuonna okasolusyöpä kudosta kohdunkaula naisia. Kuitenkin on vähän tiedetään SERPINB3 ilmentymistä ihmisen epiteelin munasarjasyöpä (EOC). Siksi esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet toiminnallista roolia

SERPINB3

geeni ihmisen EOC käyttäen kanoja, tärkeimmät eläinmallin. 136 kanojen, EOC havaittiin 10 (7,4%).

SERPINB3

mRNA indusoitui syöpä, mutta ei normaalin munasarjat kanojen (P 0,01), ja se oli runsas vain rauhasepiteelin syöpä munasarjat kanojen. Lisäksi useat MikroRNA, erityisesti

miR-101, miR-1668

ja

miR-1681

löydettiin vaikuttaa

SERPINB3

ilmaisun kautta 3′-UTR, joka viittaa siihen, että posttranskriptionaalisen sääntely vaikuttaa

SERPINB3

ilmaisua kanoissa. SERPINB3 proteiini lokalisoitu pääasiassa rauhasten epiteelin syöpä munasarjat kanojen, ja se oli runsaasti ytimen sekä kanan ja ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa. Vuonna 109 ihmispotilaissa EOC, 15 (13,8%), 66 (60,6%) ja 28 (25,7%) potilaista havaittiin heikko, kohtalainen ja voimakas ilmentyminen SERPINB3 proteiinia, vastaavasti. Voimakas ilmentyminen SERPINB3 proteiinin oli ennustetekijä Platinan vastus (oikaistu OR; riskisuhde 5,94; 95% luotettavuusrajat, 1,21-29,15), ja köyhien etenemisestä vapaan eloonjäämisen (PFS; oikaistu HR, riskisuhde 2,07; 95 % CI, luottamusväli, 1,03-4,41). Siksi SERPINB3 voi olla tärkeä rooli munasarjan syövän synnyn ja olla uusi biomarkkereiden ennustamiseen platinaa vastarintaa ja huono ennuste selviytymisen potilailla, joilla EOC.

Citation: Lim W, Kim HS, Jeong W, Ahn SE Kim J, Kim YB, et ai. (2012) SERPINB3 että Chicken malli munasarjasyövän A ennustetekijä Platinum Resistance ja Survival potilailla, joilla epiteelikasvaimet munasarjasyöpä. PLoS ONE 7 (11): e49869. doi: 10,1371 /journal.pone.0049869

Editor: Wendong Huang, Beckman Research Institute of City of Hope, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 15 lokakuu 2012; Julkaistu: 21 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Lim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat World Class University (WCU) ohjelma (R31-10056) ja Basic Science Research Program (2010-0013078) kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, tiede- ja teknologia, ja myös avustusta seuraavan sukupolven Biogreen 21 Program (nro PJ008142), maaseudun kehittäminen hallinto, Korean tasavalta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on 7

th suurin syy syöpään liittyvien kuolemien naisilla maailmanlaajuisesti [1], [2]. Kliininen merkitys on kasvanut enemmän, koska ei ole merkittäviä oireita eikä tehokasta seulontamenetelmiä varhaiseen havaitsemiseen [3], mikä johtaa International Federation of Gynecologist (FIGO) Vaiheet III-IV sairaus aikaan diagnoosi yli 75 % potilaista, joilla EOC [4]. Vaikka alkuvaiheen tauti, hyvin eriyttäminen, platina herkkyys ja optimaalisen sytoreduktiivisen leikkaus on ehdotettu suotuisat ennustavat tekijät, mutta niiden arvo ennustetta ei ole parantunut merkittävästi [5]. Siksi varhainen havaitseminen EOC ja ennakointi ennusteen elossaololuku käyttämällä erityisiä biomarkkerit tunnustetaan yhä parempi lähestymistapa voittaa nämä rajoitukset. Tätä tarkoitusta varten geneettisesti manipuloitu jyrsijä on kehitetty valaista etiologia ja patogeneesi, EOC. Kuitenkin, keinotekoinen luonne indusoi hiirissä rajoittaa niiden kliinistä merkitystä [6], [7], [8]. Samaan aikaan munivia kanoja on tunnettu ainoa eläin, joka kehittää spontaanisti kasvaimia munasarjojen pintaepiteelissä, ja munivia kanoja on ainutlaatuinen ja sopiva malli kehittää uusia biomarkkereita ja syöpälääkkeet potilaille, joilla EOC [6], [7 ], [9].

serpin peptidaasi estäjä, alatyypin B, osa 3

(

SERPINB3

) on jäsen serpin superperheen proteaasinestäjät mukana apoptoosin, immuunivaste, veren hyytymisen, solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus solujen [10], [11]. Se tunnetaan myös okasolusyöpä antigeeni 1 (SCCA1) löydettiin ensin okasolusyöpä kohdunkaula [12]. Ihmisillä geenin

SERPINB3

sijaitsee kromosomissa 18q21.3, ja se estää papaiini-like lysosomaalisen kysteiiniproteaasien, katepsiini K: n (CTSK), CTSL ja CTSS [10], [13]. Aiemmin tunnistimme

SERPINB3

kanoilla ja todennut, että sillä on kohtalainen homologiaa sen nisäkkäiden proteiinia ortologin (noin 36-47%). Avian SERPINB3 ilmentyy oviduct vastauksena estrogeenin kudos- ja solu-erityisellä tavalla [14]. Kuitenkin tiedetään vähän ilmaisun ja ennusteen arvioinnissa on

SERPINB3

joko kanojen tai ihmisten EOC.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ja ei-koodaavat RNA: t on 18-23 nukleotidin pituus. Ne säätelevät geeniekspressiota transkription jälkeen ja on myös mahdollisuus muuttaa solun kohtalon ohjaamalla käännös kohde- mRNA: iden erilaisissa kudoksissa ja solutyypeissä. Siksi miRNA pelata ratkaiseva rooleja eri biologisissa prosesseissa kuten selkärankaisten kasvun, kehityksen, erilaistumisen ja oncogenesis säätelemällä geenin ilmentymistä [15], [16], [17]. On kuitenkin olemassa ei julkaista tuloksia miRNA tutkimukseen liittyvät SERPINB3 kanoissa. Sen määrittämiseksi roolin SERPINB3 uutena biomarkkeri EOC vertasimme jakelu ja lokalisoinnin SERPINB3 välillä normaalin ja syöpä- munasarjat munivien kanojen, ja sitten teimme miRNA tavoite validointi määritys tutkia transkription jälkeisen sääntelyn

SERPINB3

ilme. Sen jälkeen vertasimme SERPINB3 ilme keskuudessa normaali ja syöpäsolujen munasarjojen peräisin munivien kanojen, ihmisen EOC solulinjoja (OVCAR-3 ja SKOV-3) ja ihmisen munasarja- teratokarsinoomasolut solulinja (PA-1). Lopuksi tutkimme ja ennustavia arvoja SERPINB3 ilmentymisen potilailla, joilla on EOC.

Tulokset

Expression ja lokalisaatio SERPINB3 mRNA ja proteiini Normal ja syöpä munasarjat munivien kanojen

vertailut ilmentymisen

SERPINB3

mRNA välillä normaalin ja syöpä- munasarjat munivien kanojen RT-PCR osoitti, että se oli ilmaistu vain syöpä munasarjat (Fig. 1A ja 1B). Lisäksi kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että

SERPINB3

mRNA indusoitui ainoastaan ​​syöpä munasarjat (

P

0,01; Fig. 1 C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että

SERPINB3

on biomarkkeri epithelia johdettujen munasarjasyövän munivia kanoja.

RT-PCR-analyysi suoritettiin käyttämällä cDNA malleja kanaa

SERPINB3

ja

GAPDH

erityisiä alukkeita. [A] kaistat 1-4 esittävät neljää erilaista normaali munasarjojen ja N on negatiivinen kontrolli. [B] kaistat 1-10 esittävät 10 eri syöpä munasarjat. [C] Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi suoritettiin käyttämällä cDNA malleja normaaleista ja syöpä munasarjat munivien kanojen (keskiarvo ± SEM; P 0,01).

In situ

-hybridisaatioanalyysillä osoittivat, että

SERPINB3

mRNA oli runsaampaa rauhasepiteeliin syöpä munasarjat munivien kanojen (Fig. 2A), mutta ei ollut havaittavissa strooman, verisuonia tai immuunisolujen syöpä munasarjat. Yhdenmukaisesti näiden tulosten SERPINB3 proteiini havaittiin pääasiassa sytoplasmassa rauhasepiteelin syöpäsoluissa, mutta ei normaaleissa munasarjat munivien kanojen (Fig. 2B). Nämä tulokset osoittavat, että SERPINB3 on nimenomaan ilmaistaan ​​ainoastaan ​​rauhasepiteeliin syöpä munasarjat munivien kanojen.

[A]

In situ

-hybridisaatio analyysit

SERPINB3

mRNA. Poikkileikkaukset normaalin ja syöpä- munasarjoja munivia kanoja hybridisoitiin sense tai antisense-kana

SERPINB3

cRNA antureista. [B]: n immunohistokemiallinen ilmaus SERPINB3 proteiinin: Jos negatiivinen kontrolli, ensisijainen vasta-aine, joka on substituoitu puhdistettua ei-immuuni-hiiri-IgG. F, follikkelia; GE, rauhasepiteeliin; S, strooman;

Mittakaava

edustaa 200 pm (ensimmäinen columnar paneelit ja sense) tai 50 um (toinen sarakemuotoon paneelit).

Post-transkription asetus MikroRNA vaikuttavat SERPINB3

tutkimaan mahdollisuutta, että

SERPINB3

ilmentymistä säädellään transkription jälkeisellä tasolla miRNA, teimme miRNA tavoite validointi määrityksessä. Selvitys mahdollisista miRNA sitoutumiskohtien 3′-UTR varten

SERPINB3

käyttäen miRNA kohde ennusteen tietokanta (miRDB; https://mirdb.org/miRDB/) paljasti kolmen oletetun sitoutumiskohdan

miR -101, miR-1668

ja

miR-1681

(kuvio 3A). Niinpä määritettiin jos nämä kolme miRNA vaikuttaneet

SERPINB3

ilmaisun kautta 3′-UTR. Fragmentti

SERPINB3

3′-UTR kätkeminen sitoutumiskohtia miRNA kloonattiin alavirtaan vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) lukukehys, mikä luo fluoresoiva reportteri funktion 3′-UTR alue. Lisäksi SERPINB3 3′-UTR mutantteja kuten muuntunut sitoutumiskohdat

miR-101

,

miR-1668

ja

miR-1681

myös syntyvät pistemutaatio jotta voitaisiin vahvistaa modulaatioon eGFP lausekkeen jokaisella miRNA (kuvio 3B). Kotransfektion jälkeen on eGFP-

SERPINB3

3′-UTR ja DsRed-miRNA, intensiteetti GFP: n ilmentymisen ja prosenttiosuus GFP-proteiinia ekspressoivien solujen analysoitiin fluoresenssimikroskopialla ja FACS (kuvio 3C ja 3D). Kun läsnä on

miR-101, miR-1668

ja

miR-1681

, intensiteetti ja prosenttiosuus GFP-proteiinia ekspressoivien solujen (44,8% valvonta vs. 27,5% in

miR-101

, 24,2% vuonna

miR-1668

, 14,8%

miR-1681

) laski (p 0,01). Kuitenkin, kun oli kotransfektoimalla eGFP-

SERPINB3

3′-UTR: n mutantteja, intensiteetti ja prosenttiosuus GFP-proteiinia ekspressoivien solujen eivät muuttuneet (14,8% ohjaus vs. 16,1% in

miR -101

, 13,5%

miR-1668

, 14,3%

miR-1681

) kontrollina (kuvio 3D). Nämä tulokset osoittavat, että nämä kolme miRNA suoraan sitoutua

SERPINB3

transkriptio ja transkription jälkeen säännellä

SERPINB3

geeniekspressiota.

[A] Kaavio

asennuspalveli- 101, miR-1668

ja

miR-1681

sitoutumiskohtiin in

SERPINB3

3′-UTR. [B] Ekspressiovektori karttojen eGFP kanssa

SERPINB3

3′-UTR ja mutatoitunut

SERPINB3

3′-UTR ja Ds-Red jokaisen miRNA. Villityypin (WT) ja mutanttien 3′-UTR

SERPINB3

transkriptin subkloonattiin välillä eGFP-geenin ja polyA-häntä tuottaa fuusio- konstruktin GFP transkriptin jälkeen miRNA tavoite 3′ UTR (pcDNA-eGFP-3’UTR) (ylä- ja keskimmäinen paneeli) ja miRNA ekspressiovektori suunniteltiin yhteistyössä ilmaista DsRed ja kukin miRNA (pcDNA-DsRed-miRNA) (alapaneeli). [C] Kun kotransfektoimalla pcDNA-eGFP-3’UTR varten

SERPINB3

transkriptio ja pcDNA-DsRed-miRNA varten

miR-101, miR-1668

ja

miR-1681

, fluoresenssisignaalit GFP ja DsRed todettiin käyttäen fluoresenssimikroskopian avulla. [D] nopeus inhibition eGFP ilmentymisen miRNA modulaatio on laskettu fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (FACS). Kiinteät pylväät edustavat WT on

SERPINB3

3′-UTR ja tyhjät palkit esittävät mutantin

SERPINB3

3′-UTR kullekin miRNA. Virhe palkit osoittavat keskivirhe kolmena kappaleena analyysejä. Tähdet tarkoittavat tilastollisesti merkittäviä eroja WT vs. mutantteja (*** P 0,001).

Immunofluoresenssikoe havaitseminen SERPINB3 Proteiini Chicken and Human munasarjasyöpäsoluja

Jos haluat vertailla ekspressiomalleja SERPINB3 proteiinin välillä kanaa ja ihmisen munasarjasyöpäsoluja teimme immunofluoresenssianalyysillä. SERPINB3 proteiini havaitaan harvoin normaaleissa soluissa, mutta runsaasti tumassa munasarjasyöpäsoluja munivien kanojen (Fig. 4A). Vastaavasti, SERPINB3 proteiini oli runsaasti ytimen kolmen ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa, OVCAR-3, SKOV-3 ja PA-1-solut (Fig. 4B).

[A] SERPINB3 proteiini havaitaan harvoin normaaleissa soluissa, mutta runsaasti ytimet kanan munasarjasyöpäsoluja. [B] SERPINB3 ekspressoitiin ytimet ihmisen OVCAR-3, SKOV-3 ja PA-1-soluja. Solujen tumat värjättiin DAPI (sininen). Kaikki kuvat otettiin kiinni 40X tavoite suurennus.

SERPINB3 Protein Expression liittyy Platinum Resistance ja Survival potilailla, joilla epiteelikasvaimet munasarjasyöpä

Yhteensä 109 potilasta, joiden keski-ikä 52 vuotta (vaihteluväli 23-82 vuotta) oli mukana nykyisessä tutkimuksessa. Kaikista potilaista, 38 (34,9%) oli FIGO vaiheessa I, 20 (18,3%) II vaiheessa, ja 51 (46,8%) vaiheessa III. Kasvaimen oli G1 21 (19,3%), G2 41 (37,6%) ja G3 47 potilaalla (43,1%). Histologisesti, 62 kasvaimet (57%) oli diagnosoitu vakavien karsinooma, 17 (15,6%) kanssa mucinous karsinooma, 12 (11%) selkeät cell carcinoma, 9 (8,3%) ja endomet- karsinooma, 4 (3,6%) ja erilaistumaton karsinooma ja 3 (2,7%) ja endomet- ja selkeät cell carcinoma, ja 2 (1,8%) ja vakavien ja selkeät cell carcinoma. Optimaalinen sytoreduktiivisen leikkaus tehtiin 65 potilaalla (59,6%), kun taas 44 (40,4%) tehtiin optimaalinen sytoreduktiivisen leikkausta. Yhdeksänkymmentä potilasta (82,6%) sai adjuvanttihoitoa leikkauksen jälkeen, ja 84 (93,3%) sai paklitakselia /karboplatiini, kun paklitakselia /sisplatiinia annettiin 6 (6,7%) potilaalla. Tulokset Immunohistokemian analyysi paljasti, että SERPINB3 proteiini havaittiin pääasiassa rauhasepiteeliin kuin että munivia kanoja malli, ja 15 (13,8%), 66 (60,6%) ja 28 (25,7%) potilaista oli heikko, kohtalainen ja voimakas ilmentyminen SERPINB3 proteiinin munasarjojen rauhasepiteelin, vastaavasti (Fig. 5).

(a ja a ’) Heikko, (b ja b’) kohtalainen ja (c ja c ’): n voimakasta ekspressiota SERPINB3-proteiinia ei havaittu naisilla, joilla on epiteelin munasarjasyöpä. Joko ei ollut ilmaus hyvin heikko ilmentyminen SERPINB3 normaalissa munasarjat, kun taas SERPINB3 protine oli helposti havaittavissa syöpä- munasarjat naisilta. Negatiivinen kontrolli käytettiin hiiren IgG: tä sen sijaan, että ensisijainen vasta-aine.

Mittakaava

edustaa 200 pm (ensimmäinen vaakasuora paneelit ja IgG) tai 50 um (toinen vaakasuora paneelit).

Mediaaniaika seurata 69,2 kuukautta (vaihteluväli , 2-88 kuukautta), ja 70 potilasta (77,8%) osoitti, platinaa herkkyyttä ja 20 (22,2%) osoitti, platinaa vastarintaa. Voimakas ilmentyminen SERPINB3 proteiinin oli yleisempää potilailla, joilla on platinaa vastus (n = 11, 55%) kuin ne, joilla platinaa herkkyys (n = 17, 24,3%) (

P

= 0,01). Voimakas ilmentyminen SERPINB3 proteiini oli myös itsenäinen ennustetekijä platinan vastus jälkeen säätöjä käyttäen klinikka-patologisten tekijöiden (oikaistu OR; riskisuhde 5,94; 95% CI, 1,21-29,15) (taulukko 1). Voimakas ilmentyminen SERPINB3 liittyi lyhyempi PFS kuin heikko tai kohtalainen lauseke (keskimääräinen PFS oli 25,7 vs. 47,8 kuukautta;

P

= 0,03) huolimatta eroa OS (keskiarvo OS; kokonaiselinaika, 49,5 vs . 60,9 kuukautta;

P

0,05). Lisäksi SERPINB3 oli huono ennustetekijä PFS (etenemisestä vapaa elinaika) monimuuttujamenetelmin Coxin suhteellista vaara-analyysi (oikaistu HR, riskisuhde 2,07; 95% CI, luottamusväli, 1,03-4,41, taulukko 2), kun taas ei ollut ennustetekijä arvo OS paitsi optimaalinen cytoreduction (oikaistu HR 6,83; 95% CI, 2,34-20,02).

keskustelu

munivien kanojen on tunnettu malli tutkinta munasarjojen syövän synnyn ja kehittymisen syöpälääkkeet naisille, koska samankaltaisuuden spontaanisti aiheutuvien karsinoomien alkaen epiteelin munasarjojen soluista [18]. Histologia, etäpesäke ja vaiheet EOC munivien kanojen ovat samanlaisia ​​kuin ihmisellä, joka osoittaa mahdollisuutta käyttää munivia kanoja mallin tutkimiseksi munasarjojen syövän synnyn [6]. Lisäksi useat biomarkkerit, kuten CA-125, ovat yleisesti ilmaistu ja käyttää havaitsemaan Taudin alkuvaiheessa ja seurantaa hoitovasteen naisilla, joilla EOC ja ne ovat ristiin reagoiva biomarkkereita EOC muniville kanoille [18], [19].

yleensä useita monimutkaisia ​​rauhas arkkitehtuurit ovat yleensä löytyy eri karsinoomia, jotka syntyvät eri elimissä, kuten vatsan, keuhkoputken, gladder, eturauhas-, kives- ja munasarja vuoksi arjen luonne rauhaset. Varsinkin, munasarjat sekä lintujen ja nisäkkäiden lajeja, nämä rauhasrakenteet ovat pääasiassa endomet–tyypin kasvaimet useita ominaisuuksia kuten ydin- atypia, seulamaisessa pesäkkeet ja umpeuma peruskudoksen munarakkuloita. Lisäksi, rauhasten adenokarsinooman naisten koostuvat yhdestä kerroksesta epiteelisolujen meneillään mitoosia ja terävä luminaalinen marginaalit [6]. Alustavat tulokset osoittivat myös, että rauhas arkkitehtuuri primääri munasarjojen epiteelin karsinoomien munivia koostuu labyrintin rauhasten tai lacelike papillaarisen taittuvat suuret plieomorphic ytimet, jotka sisältävät mitoosi numerotiedot aiemmin raportoitu [6]. Nykyinen tutkimus löytää uusi ennustetekijöitä biomarkkeri potilaalla on EOC käyttäen munivia kanoja mallin tunnistaa korkea ilmentymä

SERPINB3

geenin rauhasepiteeliin cancerous munasarjojen verrattuna normaalissa munasarjat kanoista. Tulokset viittaavat siihen, että SERPINB3 voi liittyä munasarjojen karsinogeneesin kautta transkriptiotekijöiden tai apoptoosin estämiseen. Tuloksemme paljasti myös, että

SERPINB3

geeniekspressiota on transkription jälkeen säätelevät useat miRNA kriittinen kehittämiseen kanan munasarjojen syövän synnyn. Lisäksi voimakas ilmentyminen SERPINB3 proteiinin liittyvät platinaa vastarintaa ja lyhyempi aika ilman taudin etenemistä potilailla, joilla on EOC. Nämä havainnot tukevat hypoteesia, että SERPINB3 on rooli kasvainten kehittymiseen ja leviämisen maasta munasarjaepiteelisoluilla.

Vaikka toiminnallista roolia

SERPINB3

geeni EOC biologian ei tiedetä, tuloksia esillä tutkimus osoittaa selvästi, että

SERPINB3

liittyy rauhas morphogenesis vaikuttavia munasarjojen syövän syntymistä sekä kanojen ja naisille EOC. Sekä naisilla ja kanat, SERPINB3 ilmentyy rauhasepiteeliin, mutta on vain vähän tai ei SERPINB3 ilmentymistä muissa kudoksissa ja soluissa, mukaan lukien strooman ja verisuonia munasarja. Nämä havainnot osoittavat, että SERPINB3 proteiini voi aktivoida transkriptiotekijöiden tai estävät apoptoosin johtavat kehitystä EOC vuonna munivia kanoja ja naisia. Aiemmissa tutkimuksissa, SERPINB3 havaittiin säädellä ohjelmoidun solukuoleman eri mekanismeilla erilaisissa syövissä ja sen yli-ilmentyminen oli ominaista syöpäsolujen epiteelisolujen alkuperää. Lisäksi, SERPINB3 vaimentaa apoptoosin välittämän syöpälääkkeet NK-solujen ja estämällä sytokromi c vapautumista mitokondrioiden [20], [21], [22] Lisäksi rauhasten morfogeneesiin liittyvien

SERPINB3

voi myötävaikuttaa epiteeli–mesenkymaalitransitioon, joka voi vapauttaa liimauksena jotta etäpesäkkeitä ja lisätä invasiivisuus potentiaalia kasvainsolujen naisilla [23].

Strong ilmentymistä SERPINB3 liittyi myös platinaa kestävyys ja lyhyempi PFS potilailla jossa EOC. Mekanismi vastaa kehittämisestä chemoresistance ja mahdollinen rooli SERPINB3 ei ole perustettu EOC. Kuitenkin, huonosti permeabilisaation lysosomeihin edistää kehitystä chemoresistance munasarjasyövän soluihin [24], ja SERPINB3 resistenssin lääkkeen indusoiman apoptoosin inhiboimalla lysosomaalisen katepsiini proteaasien syöpäsoluissa [25]. Siten SERPINB3 saattaa osaltaan platinaa vastarintaa seuraavat kemoterapian aiheuttaman lysosomaalisen epävakautta. Vaikka vahva ilmentyminen SERPINB3 liittyi lyhyempi PFS, on mahdollista, että platinaa vastus liittyy SERPINB3 johtaa lyhyempiin PFS. Tämä seikka tukee aikaisemmassa tutkimuksessa, jossa SERPINB3 ilmentyminen havaittiin olevan yhteydessä huonoon selviytymisen potilailla, joilla on rintasyöpä [26].

SERPINB3 tai SCCA1 on tutkittu erilaisia ​​okasolusyöpä [27 ], [28], [29], [30], mutta se on vain ehdotettu niin ennustetekijä rintasyövän ja keuhkon adenokarsinooman [26], [31]. Tietääksemme tulokset nykyisen tutkimuksen ovat merkittäviä oli ensimmäinen luoda todennäköisyyttä toiminnallisen roolin SERPINB3 vuonna EOC munivien kanojen. Nämä tulokset validoivat munivia kanoja mallina tutkimus ihmisen EOC. Edelleen tulokset viittaavat vahvasti siihen, että SERPINB3 on tärkeitä tehtäviä kehittämisessä EOC vuonna munivat kanat ja että se on uusi biomarkkereiden ennustamiseen platinaa vastarintaa ja huono elinaikaan ilman taudin etenemistä EOC. Meidän hypoteesi, että SERPINB3 on erityinen tehtävä inhimillisen EOC edellyttää lisäarviointia kliinisesti tulevaisuudentutkimusta.

Materiaalit ja menetelmät

Kokeellinen Eläimet ja eläinten hoito ja käyttö

kokeellinen käyttö kanojen tässä tutkimuksessa hyväksyi Institute of Laboratory Animal Resources, Seoul National University. White Leghorn (WL) munivat kanat olivat onnistuneet mukaisesti hyväksyttyjä standardeja toimintaa yliopiston Animal Farm, Seoul National University, Korea. Kaikki kanat oli vapaa

mielinmäärin

päästävä syömään ja vesi.

kudosnäytteiden Chicken Model

Yhteensä 136 munivia kanoja (88 yli 36 kuukauden ja 48 yli 24 kuukauden ikäisiä), joka oli pysähtynyt munia, lopetettiin sillä koepala ja kokoelma syöpä (n = 10) munasarjat. Kontrollina, normaali (n = 5), munasarjat kerättiin munivia kanoja samanikäisiä. Tutkimme kasvain vaiheet 10 kanojen syöpä munasarjat perustuu ominaispiirteet kanan munasarjasyöpä [6]. Kolme kanat oli vaiheen III EOC kuten munasarjojen kasvainsoluja oli metastasized ruoansulatuskanavassa ja maksassa pinta runsas askites vatsaonteloon. Viidessä kanat, niiden kasvaimet olivat metastasized kaukaisiin elinten, kuten maksan parenchyma, keuhko, maha-suolikanavan ja oviduct runsas askites, joka ilmaisee vaihe IV EOC. Kaksi muuta kanoja ei ollut kasvaimia missään muissa elimissä; Siksi niiden munasarjan kasvaimet luokiteltiin vaiheen I EOC. Niiden osia näytteet kiinnitettiin 4% paraformaldehydi jatkotutkimuksiin. 24 tunnin kuluttua, kiinteä kudokset muutettiin 70%: sta etanolia 24 tuntia ja sitten kuivattu ja upotettiin Paraplast-Plus (Leica, Wetzlar, Saksa). Kanojen EOC luokiteltiin perustuen niiden solujen alatyyppejä ja malleja solujen erilaistumisen viitaten ihmisen munasarjan pahanlaatuinen kasvain tyypit [6].

RNA: n eristäminen

Solun kokonais-RNA eristettiin pakastetusta kudoksista käyttämällä Trizol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan suositusten mukaisesti. Määrä ja laatu kokonais-RNA määritettiin spektrometrisesti ja denaturoivalla agaroosigeelielektroforeesilla, vastaavasti.

Puolikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

ilmentyminen

SERPINB3

mRNA: normaali ja syöpä munasarjat kanojen arvioitiin käyttäen semi-kvantitatiivinen RT-PCR: llä kuten aiemmin on kuvattu [32]. Komplementaarisen DNA: n (cDNA) syntetisoitiin kokonais-RNA (2 ug) käyttämällä satunnaisia ​​heksameeriä (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja oligo (dT) alukkeita ja AccuPower® RT esiseos (Bioneer, Daejeon, Korea). CDNA laimennettiin (1:10) steriiliin veteen ennen käyttöä PCR. PCR: n jälkeen, yhtä suuret määrät reaktiotuote analysoitiin käyttäen 1% agaroosigeelillä, ja PCR-tuotteet visualisoitiin käyttäen etidiumbromidivärjäyksellä.

Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

Geenien ilmentyminen mitattiin käyttämällä SYBR® Green (Sigma, St. Louis, MO, USA) ja StepOnePlus ™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). [33]

GAPDH

geeniä samanaikaisesti analysoitiin kontrollina ja käytetään normalisoinnin huomioon vaihtelu lastaus. Jokainen kohdegeenin ja

GAPDH

analysoitiin kolmena kappaleena. ROX väriaine (Invitrogen) käytettiin negatiivisena kontrollina fluoresenssin mittauksiin. Sekvenssi-spesifisiä tuotteita tunnistettiin muodostetaan sulamiskäyrä, jossa C

T arvo edustaa syklin numero, josta fluoresoiva signaali oli tilastollisesti suurempi kuin tausta, ja suhteellinen geeniekspressio kvantifioitiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmä [34]. Valvontaa varten, suhteellisen kvantifioinnin geenin ilmentyminen oli normalisoitu C

T valvonnan munasarja.

In situ -hybridisaatio Analyysi

hybridisaatiokoettimina, PCR-tuotteet tuotetaan ja olivat geeli-uutetaan ja sitten kloonattiin pGEM-T-vektoriin (Promega), kuten aiemmin on kuvattu [35]. Tarkastamisen jälkeen sekvenssit, sisältävien plasmidien oikean geenin sekvenssit monistettiin T7 ja SP6-spesifisiä alukkeita sitten digoksigeniinilla (DIG) leimattua RNA-koettimet transkriptoitiin käyttämällä mäpakkausta DIG RNA (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Hybridisaation jälkeen ja esto, leikkeitä inkuboitiin yön yli lampaan anti-DIG-vasta-ainetta konjugoituna alkaliseen fosfataasiin (Roche). Signaali visualisoitiin altistamalla liuos, joka sisälsi 0,4 mM 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli fosfaatti, 0,4 mM nitrosinitetratsoliumia, ja 2 mM levamisolia (Sigma).

MicroRNA Target Validation Assay

3′-UTR

SERPINB3

kloonattiin ja varmistettiin sekvensoimalla. 3′-UTR alakloonattiin välillä EGFP-geenin ja naudan kasvuhormonin (bGH) poly-A-hännän in pcDNA3eGFP (Clontech, Mountain View, CA) tuottaa EGFP-miRNA kohde 3′-UTR (pcDNA-eGFP-3 ’-UTR) fuusiorakenteita. Lisäksi mutantit SERPINB3 3’-UTR kunkin miRNA muodostettiin pistemutaatio ja kloonattiin sitten samantyyppistä plasmidit. Sillä dual fluoresenssin reportteri määrityksessä fuusiokonstruktioita sisältävä DsRed geenin ja joko

miR-101

,

miR-1668

ja

miR-1681

suunniteltiin sovitettava -expressed hallinnassa CMV-promoottorin (pcDNA-DsRed-miRNA). PcDNA-eGFP-3′-UTR: n ja pcDNA-DsRed-miRNA (4 ug), olivat kotransfektoitiin 293FT soluihin käyttäen kalsiumfosfaattimenetelmää. Kun DsRed-miRNA ilmentyy ja sitoutuu kohdepaikkaan 3′-UTR alavirtaan GFP transkriptio, vihreän fluoresenssin intensiteetti vähenee johtuen hajoamisesta GFP transkriptio. 48 h transfektion jälkeen, dual fluoresenssi havaittiin fluoresenssimikroskopialla ja laskettu FACSCalibur virtaussytometrialla (BD Biosciences). Virtaussytometriako-, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja analysoitiin käyttämällä FlowJo ohjelmistoa (Puu Star Inc., Ashland, OR).

Soluviljely

Yhteensä viisi solulinjojen, mukaan lukien kolme ihmisen munasarjan epiteelin syövän ja kaksi kanan primääri munasarjojen solut, käytettiin tässä tutkimuksessa. Ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa (OVCAR-3, SKOV-3 ja PA-1) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) ja niitä viljeltiin mukaan toimittajan ohjeiden. Kaksi eri kana munasarjojen pinnan epiteelisolujen (normaalit ja syöpäsolut) eristettiin ja viljeltiin kuten edellä kuvattiin joitakin muutoksia [36], [37].

immunofluoresenssimikroskoopilla varten havaitseminen SERPINB3 Activation

munasarjasyöpäsoluja ja normaalin munasarjan solut saadaan munivia kanoja, ja kolme ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa, OVCAR-3, SKOV-3 ja PA-1, tutkittiin SERPINB3 ekspressiokuvioiden immunofluoresenssimikroskopialla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Kunkin kennon ympättiin Lab-Tek kammio kalvot (Nalge Nunc International, Rochester, NY). 24 tunnin kuluttua solut kiinnitettiin -20 ° C metanolia ja immunofluoresenssilla värjäys suoritettiin käyttäen anti-ihmis-SERPINB3 monoklonaalinen vasta-aine (luettelonumero: ab55733; Abcam plc, Cambridge, UK). Sitten soluja inkuboitiin Alexa Fluor 488 Rabbit anti-vuohi-IgG sekundääristä vasta-ainetta (A21222, Invitrogen). Objektilasit peitettiin DAPI ennen kuvien otettiin käyttäen Zeiss -konfokaalimikroskoopilla LSM710 (Carl Zeiss) varustettu digitaalisella mikroskoopilla kamera AxioCam ja Zen 2009 -ohjelmiston.

Human Study Väestö

Kliiniset tiedot haettiin tietokannasta potilaita, joilla EOC kesäkuu 2003 ja maaliskuussa 2009 antama hyväksyntä Institutional Review Board of Seoul National University Bundang Hospital saatiin etukäteen nykyisen tutkimuksen. Tukikelpoisuusperusteet olivat seuraavat potilaiden: he olivat diagnosoitu EOC; niitä käsiteltiin maksimaalinen sytoreduktiivisen leikkausta seuraa adjuvantti taxane- ja platinapohjaisen kemoterapian jos osoitettu; heillä oli Eastern Cooperative Oncology Group tehokkuustilana 0-2; ja heillä ei ollut taustalla sairaus selviytymistä. _ENREF_4Optimal Sytoreduktiivisen leikkaus määriteltiin jäljellä kasvain ≤1 cm, kun taas optimaalinen sytoreduktiivisen leikkaus määriteltiin jäljellä kasvain 1 cm maksimaalinen halkaisija. Kaikki potilaat paitsi matalan riskin varhaisvaiheen tauti kuten FIGO vaiheessa IA tai IB arvosanalla 1 tai 2 sairaus, saivat adjuvanttihoitoa paklitakseli (175 mg /m

2) /karboplatiinin (AUC 5,0) tai paklitakselin (175 mg /m

2) /sisplatiinia (75 mg /m

2) 1-2 viikon kuluttua leikkauksesta, ja kemoterapiaa toistettiin joka 3. viikko 6 sykliä. Etenemisestä vapaa elinaika (PFS) määriteltiin aika kulunut valmistumisen ensisijainen adjuvanttihoitoa päivämäärään kliinisesti todistettu paheneminen. Kokonaiselinaika (OS) laskettiin alkaen lavastus laparotomy päivämäärän syöpään liittyvän kuoleman tai tutkimuksen lopussa. Platinaa vastarintaa määriteltiin vastauksena platinapohjaisen kemoterapian vähintään hoito-tauko on alle 6 kuukautta, kun platina herkkyys määriteltiin vastauksena platinapohjaisen kemoterapian vähintään Hoitotauon välein suurempi tai yhtä suuri kuin