Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä on sairaus, johon liittyy koko genomin uudelleenjärjestelyjä mutta suurin osa geenejä, jotka ovat kohteena nämä muutokset jäävät tunnistamatta. Luettelointi nämä kohdegeenien tarjoavat hyödyllistä tietoa taudin etiologiaa ja saattaa tarjota mahdollisuuden kehittää uusia diagnostisia ja terapeuttisia interventioita. Korkean resoluution genomin laaja kopiomäärä ja vastaavia ilmaisun tietoja 68 ensisijaisen epiteelin munasarjojen karsinoomat eri histotypes integroitiin geenien tunnistamiseen alueilla yleisimmistä vahvistus vahvin korrelaatio ilme ja kopion numero. Alueet kromosomeissa 3, 7, 8, ja 20 olivat useimmiten lisääntynyt kopiomäärä ( 40% näytteistä). Näillä alueilla, 703/1370 (51%) ainutlaatuinen geeniekspressiota probesets oli ilmennetty eri näytteitä vahvistuksen verrattiin näytteitä ilman vahvistusta. 30% näistä differentiaalisesti ilmaisi probesets osoitti myös voimakas positiivinen korrelaatio (r≥0.6) välillä ilmaisun ja kopioluku. Havaitsimme myös 21 aluetta suuramplitudisten kopioluvun vahvistus, jossa 32 tunnettua proteiinia koodaavan geenien osoittivat voimakas positiivinen korrelaatio ilmaisu ja kopion numero. Kaiken tietomme vahvistaa aiemmin tunnettu munasarjasyöpä geenejä, kuten

ErbB2

, ja myös tunnistaa uusia potentiaalisia kuljettajia kuten

MYNN

,

PUF60

ja

TPX2

.

Citation: Ramakrishna M, Williams LH, Boyle SE, Bearfoot JL, Sridhar A Speed ​​TP, et al. (2010) tunnistaminen Ehdokas kasvua edistäviä Geenit munasarjasyövässä integroitujen Kopioi numero ja Expression Analysis. PLoS ONE 5 (4): e9983. doi: 10,1371 /journal.pone.0009983

Editor: Patrick Tan, Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore

vastaanotettu: 20 tammikuu 2010; Hyväksytty: 07 maaliskuu 2010; Julkaistu: 08 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Ramakrishnan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: MR on tukemana Cancer neuvoston Victoria jatko Scholarship. Tätä työtä on rahoitaa National Health ja Medical Research Council (NHMRC) Australian (ID: 566603). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka on edistytty selvittämisessä molekyyli tapahtumia, jotka ovat Euroopan kehittäminen munasarjasyöpä, identiteetti enemmistön geenien ajaa tämän taudin kehitystä jäävät hämäräksi. Lukuisat geenien ilmentyminen tutkimuksissa on todettu luetteloita geenien merkittävästi muuttunut ilme, mutta valitettavan ei juurikaan yksimielisiä tutkimukset [1]. Vaikka geenien ilmentyminen tutkimukset ovat käyttökelpoisia tunnistamisessa pääryhmään väyliä muuttaa syövän ja kliinisesti merkittävä alatyyppejä [2], omasta he eivät välttämättä pysty erottamaan sellaisten geneettisesti muunneltujen avaintekijä geenejä. Alterative strategia käyttää tunnistamaan kuljettaja geenien on merkinnästä toistuva kromosomipoikkeavuuksien. Varhaiset tutkimukset heikensivät koska tekniikat genominlaajuisia genomisen analyysin puuttui päätöslauselman riittävästi tarkentaa syöpään liittyvä loci [3]. Ongelma resoluutio on voitettu kehittämisen kanssa erittäin korkean resoluution aCGH ja SNP taulukot. Äskettäin ryhmämme on käyttänyt näitä uusimman sukupolven SNP paneelit käsinkirjoittaa pienetkin alueet (niin pieni kuin 25 kb) genomista muutos [4]. Tämä data osoitti myös, että geneettinen tapahtuneisiin munasarjasyöpiä ovat lukuisia ja monimutkaisia ​​kuin aiemmin epäilty. Vaikka joitakin mahdollisia kuljettajan geenejä voitaisiin nopeasti tunnistaa näistä tiedoista johtuen niiden sijainti polttoväli muutoksia, suurin osa toistuvat muutokset ovat suuria ja kattavat lukuisia geenejä.

Voit nopeuttaa tunnistamista munasarjasyövän kasvua edistävä geenejä olemme integroineet matching DNA kopiomäärä ja geenien ilmentyminen tietoja kohortin 68 ensisijaisen epiteelin munasarjojen syöpien. Olemme erityisesti keskittyneet geenien alueilla kopioluvun vahvistuksen, olettaen, että ilmentyminen kuljettaja geenin sisällä amplikoni on tiukemmin korreloida geenikopiomäärä kuin co-monistettujen geenien, joiden ekspressio on agnostikko kasvaimien syntyyn. Integrointi kopioluvun ja ilme on toimittanut luettelon ehdokas vallitsevasti toimiva kuljettaja geenejä, joita voidaan käyttää perustana toiminnallinen analyysi, joka on tarpeen vahvistaa niiden osallistumista munasarjojen kasvaimien syntyyn. Lisäksi vahvistetaan ja yli ilmaisi geenit on potentiaalia olla käyttökelpoisia terapeuttisia tai diagnostisia merkkiaineita munasarjasyöpä.

Tulokset

Taajuus kopioluvun muutokset (CNA) munasarjasyövän

arvio CNA 72 epiteelin munasarjojen kasvaimia (taulukko 1, taulukko S1) tuottivat yhteensä 36534 osina, joissa 20570 CN voitot ja 15964 CN tappioita. Mediaani määrä alueilla, joiden CN voitto per kasvain oli 208, mikä vastaa keskimäärin 13,6% genomin per näyte (taulukko S2). Mediaani alueiden määrä CN tappio oli 194 eli 12,2% genomin. Nämä CNAs esiintyi kaikkialla genomissa, mutta oli joitakin hyvin usein toistuvia alueita CNA joukossa 72 kasvainten (kuva 1), mukaan lukien voitot sijaitsee 1Q, 3Q, 6, 7q, 8q, 19, ja 20 ja tappiot kromosomeissa 4, 6, 8, 13, 16, 17, 18, 22q ja X. sisällä epiteelin munasarjasyöpä histotypes olemme huomanneet, että mucinous ja vähäisemmässä määrin selvää solun tapauksissa näytti olevan vähemmän CNAs ja pienempi osa genomin mukana verrattuna muihin alatyyppeihin (Kuva S1). Kuitenkin numerot näytteiden pieniä alatyyppeihin olivat pieniä, mikä vaikeuttaa tehdä tilastollisesti päteviä päätelmiä alatyypin erityisiä muutoksia. Valtaosa näytteistä oli sitä vakavien tai liittyvän korkealaatuista endomet- alatyyppi ja monet alueet voitto ja tappio ohjaavat ensisijaisesti näitä alatyyppejä.

esiintymistiheyden genomista voitot (keltainen) ja tappiot (sininen) poikki genomin, kuvattu kromosomi järjestyksessä 1p Xq.

integrointi mRNA ilmaisun alueilla usein kopio vahvistuksenkertojan

yhteinen mekanismi aktivointi geenien toiminnan syövän kehittymisessä kautta yliekspression seurauksena geenin monistamisen. Vaikka monet geenit voivat sijaita tietyn amplikonin, kohdegeenin (t) voisi odottaa jatkuvasti kohonneina ilmentyminen verrattuna viereisen sivullisten geenien [5]. Olemme aikaisemmin suoritettu integroidun ilmaus analyysi ehdokkaan tuumorisuppressorigeeneille alueiden sisällä menettämisen Heterotsygotian päällekkäisten kasvaimen kohortin [6], mikä tämän tutkimuksen päätimme keskittyä tunnistamiseen kandidaattigeenien sijaitsevat amplikoneja. Mielivaltainen taajuus kynnys on vähintään 40% valittiin suodattimen valitsemiseksi keskeisten alueiden, jolloin rajaus useiden kromosomaalisten alueiden 3q, 7q, 8q ja 20q (kuva 2). Kukin segmentti usein CN vahvistuksen leimattiin cytoband se kuului; minkä jälkeen alueet, joilla on sama cytoband tag oli kokoon yhdeksi suureksi alueella (kuvio S2-A). Ne alueet päällekkäin ituradan kopioluvun polymorfismi (CNPS, taulukko S3) jätettiin jäljempänä kuvassa S2-B. Lopullinen 106 amplikoneja vaihteli kooltaan 11 kb ja 7 Mb (taulukko S4) ja 90 näiden alueiden yhteensä sisälsivät 1370 geenin ilmentymisen probesets annetun Affymetrix Gene 1.0ST array vastaa 938 tunnettujen proteiinin koodaavan geenejä. Toinen 16 amplikoneihin joita ei edustanut probesets on Gene 1.0ST rakenteet.

Usein voitot esiintyä kromosomeissa 3, 7, 8 ja 20, joissa jokainen piste ilmaisee taajuuden voitto CN segmentin. Punainen viiva kaikissa paneelit osoittaa 40% taajuus kynnys.

Expression analyysit suoritettiin probesets kussakin 90 alueet (taulukot 2, 3, 4, taulukko S5). Kunkin alueen ryhmiä näytteitä, jotka osoittivat kopiomäärä vahvistus (3 tai useampia kopioita) testattiin ero ilmentymisen vastaan ​​ryhmiä näytteiden, jotka osoittivat normaalia kopiomäärä (~ 2 kappaletta). Kaikilla alueilla, oli 703 (51%) ekspressoituu differentiaalisesti probesets vastaa 629 geenien yksilöllisiä tunnisteita, kuten HGNC geenin symboli tai Ensembl ID (taulukko S5). Vain yksi geeni,

hCG_16001

, oli negatiivinen log kertainen muutos (-0,34, kuva S3). Keskimäärin (alueilla, joilla on ainakin 5 probesets), 50% probesets havaittiin olevan differentiaalisesti ilmaistuna viittaa yleistyvät geenien, CN voittoja. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että

MYC

, joka on onkogeeni, tunnettu siitä, että kopioluvun vahvistuksen erilaisia ​​kasvaimen tyyppejä, ei merkittävästi ilmentyvät differentiaalisesti välillä vahvistetaan ja unamplified ryhmien näytteitä. Yksi mahdollisuus on, että

MYC

ilmentyy korkealla tasolla kaikilla kasvaimia riippumatta kopioluvun tila ja siten ei eroa ryhmien välillä kasvaimia, jotka osoittavat voitto ja ne, jotka eivät. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi vertasimme ilmaus

MYC

amplifioidussa munasarjasyöpää näytteitä ilmentymisen normaalissa munanjohtimeen epiteelin. Emme löytäneet mitään kasvua

MYC

ilmaisu verrattaessa kasvaimia näistä näytteistä (p = 0,41, Welch korjattu paritonta t-testiä, kuva S4).

edelleen kehittää tätä luetteloa 703 kopioluvun ajettu, ilmentyvät eri probesets, päättelimme, että nämä geenit osoittavat vahvin korrelaatio kopioluvun ja ilmentyminen voi olla todennäköisin geenit kohteena CN vahvistusta. Niinpä laskettu korrelaatio yhteistyössä tehokkaasti kaikkien differentiaalisesti ilmentyvien geenien kopio numero probeset kattavuus ehdokas amplikonit (taulukko S5). Niistä 692 probesets testattu (11 ei sisältänyt kopioluku koettimia), 219 (vastaten 206 proteiinia koodaavan geenien) osoitti voimakas positiivinen korrelaatio (r≥0.6) välillä ilmaisun ja kopion numero.

Genes kohteina korkea CN vahvistus

tärkein lähestymistapa tunnistaa syöpään liittyvien geenien oli suodattaa kaikkein yleisempiä ilmiöitä, mutta totesimme, että hyvin tunnettu syöpää kuljettaja geenejä, kuten

CCNE1

ja

erbB2

[7], joita ei ole tunnistettu, koska ne monistettiin alle 40% kasvaimista. Sijaan käyttämällä alempaa raja-mikä voisi vaarantaa myös monilla alueilla muuttunut johtuen yleistää perimän epävakaisuuden (esimerkiksi -67% genomin katsottaisiin ehdokkaana alueiden jos katkeaminen 10% käytettiin), me sen sijaan suodattaa geenien osoittaa korkean amplitudin CN voitto. Täällä, me katsoimme kaikki segmentit, jotka oli kopiomäärä on suurempi tai yhtä suuri kuin 5 ja oli läsnä vähintään 5 näytettä, joka tunnistettiin 21 aluetta yli 27,2 Mt (taulukko 5). Nämä alueet vastasivat 181 geenin ilmentymisen probesets meidän Affymetrix Gene 1.0ST paneelit, joista 39 (22%) oli vahva positiivinen korrelaatio CN ja geenien ilmentymisen (r 0,6). Nämä probesets vastasi 32 tunnettujen proteiinin koodaavan geenejä, mukaan lukien tunnettu syöpää kuljettajan geenejä, kuten

erbB2

(taulukko S6).

etusijalle Hakijan geenien

Jotta priorisoida parhaiden ehdokkaiden edellisestä analyysien, rakensimme geeni listan käyttäen seuraavia kriteereitä. Ensinnäkin valitsimme ne tunnettuja geenejä, joilla on korkea taajuus voitto ( 40%), jotka olivat ilmentyvät eri (n = 629). Tästä luettelosta valitsimme geenit vahvimmin yli ilmaiseman taso log kertainen muutos ( 0,7) näytteiden välillä CN voitto ja näytteet, jotka olivat neutraaleja lokuksessa (n = 59). Koska eri mittaa, miten geenien ilmentyminen vaikuttivat kopiomäärän, myös valitut geenit, jotka olivat vahvasti ( 0,7) kopioluvun ja lauseke (n = 58). Liitto näistä kriteereistä tuottanut listan 110 geenejä. Tästä luettelosta, tunnistimme geenit kustakin kromosomista, jotka olivat useimmiten vaikuttavat kopiomäärä muutos; for CHR 8, tämä sisälsi geenit, joiden taajuus on ≥60%, sillä CHR3, ≥50% ja CHR20 ≥42%. Tämä lista koostui 37 geenejä (taulukko 6).

Toiseksi myös halusi ovat geenit, jotka olivat erittäin monistettiin. Vuodesta lista erittäin monistettujen geenien vähintään 5 näytettä valitsimme ne, jotka oli vahva positiivinen korrelaatio kopiomäärä ja ilmaisun (r 0,6, n = 32). Jotkut geenit olivat erittäin monistettiin myös ilmentyvät eri perustuu ilmentymisen analyysi usein sai alueiden, niin me myös geenejä, joiden log kertainen muutos on suurempi kuin 0,6 (n = 17). Kun geenit täyttävät jompaakumpaa näistä kriteereistä, lisäsimme 41 geenien korkeat prioriteettilistan (taulukko 6).

Kun yhdistimme nämä kaksi geeniä luetteloita, joista ensimmäinen ”suurtaajuus” ja toisen on ”suuri amplitudi”, mutta molemmat lisääntynyt ilmentyminen, lopullinen määrä ainutlaatuisia geenejä oli 70 (taulukko 6).

keskustelu

geeniekspressioanalyysissä on laajalti käytetty tunnistamaan keskeiset reittejä ja kliinisesti tärkeitä alaryhmiä munasarjasyövän mutta tunnistaminen erityisen kuljettaja geenien tätä menetelmää käytettäessä yksin on haitannut se, että ilmaisu on varsin muovi- ja ei ole juurikaan yksimielisyys tunnistettujen geenien välillä tällaiset tutkimukset [1], [8]. Yksi syy tähän johdonmukaisuuden puute on, että useimmat tutkimukset ovat analysoineet RNA kokonaisista kasvainnäytteestä tarkastamatta prosenttiosuuden syövän epiteelin ja /tai ovat käyttäneet erilaisia ​​kontrollisilkkipaperia kuten koko maa munasarja [9]. Toisin kuin geenin ilmentymisen, genomista muutokset voivat olla vakaampi ja luotettava ennustaja sijainnin kuljettajan geenejä. Munasarjojen syöpä on pitkään epäilty olevan sytogeneettisesti monimutkaisia ​​[10] ja viimeaikainen edistys genomiikan tekniikka on vahvistanut syvällinen genomista poikkeamia, jotka luonnehtivat useimmat munasarjasyöpiä [4], [11], [12], [13]. Tästä huolimatta monimutkaisuus, julkaistu kopioluku profiilit munasarjan syövistä ovat erittäin vertailukelpoisia maailmanlaajuisesti [3] ja monet tutkimukset ovat tunnistettu hyvin samankaltainen alueilla usein kopioluvun muutos. Kuitenkin käynnissä tunnistaa avaintekijä geenejä on ollut hidasta, eri tutkimuksissa usein tunnistaa eri ehdokkaita samalla genomin alueella. Esimerkiksi kromosomi 20 amplikonin kuljettaja on vaihtelevasti arveltu

ADRM1

[14],

EYA2

[15],

AURKA

ja

ZNF217

[16], useiden muiden. Varhaiset tutkimukset integrointi ilmaisun ja kopioluvun data on joko käytetyn syöpäsolulinjat tunnistaa yli ilmaistaan ​​geenien [17], [18] ja /tai mikrosirujen alustojen rajoitettu resoluutio ja genomin kattavuus [19], [20]. Tähän mennessä harvat tutkimukset ovat käyttäneet todella genominlaajuisten integroitu kopioluvun ja ilme analyysi Hyväksytty näytteitä puolueeton tunnistamiseksi kandidaattigeenejä [21], [22], [23] ja on ollut vain yksi aikaisempi tutkimus pienemmän kohortin ovariokasvainten [12]. Tässä tutkimuksessa olemme siis pyrkineet kiertämään joitakin kysymyksiä tutkia ilmaisun tai kopioida numeron erillään integroimalla kaksi tiedostoa saatu mikropaloitelluista kasvain epiteelisolujen.

Koska ensikierron tiedoista keskityimme voitot esiintyy erittäin suuri osa tapauksista johon kuului alueita kromosomien 3, 7, 8 ja 20. tunnistaminen erilaisesti ilmaisi geenien vähentäneet listan ehdokas syövän geenien näillä alueilla noin puolet (alue 6-89% alueille, joilla on vähintään 5. probesets). Olemme validoitu useita geenejä tunnistettiin Haverty

et ai

., Esimerkiksi, on 3q26.2 me vahvisti kohonneen ekspression 7/8 niiden geenejä. Olemme kuitenkin myös tunnistettu useita muita vahvistetaan ja yli ilmaisi geenien (taulukot 2, 3, 4), todennäköisimmin johtuen eroista metodimme ja suurempi otoskoko. Osuus ilmentyvät eri geenien tutkimuksessamme on yhdenmukainen aiempien tutkimusten muiden syöpätyyppeihin [24] tukevat käsitystä, että kopioiden määrä voi olla voimakas vaikutus geenien ilmentymisen. Niinpä monien alueiden emme pystyneet tunnistamaan yhden tietyn kuljettaja geeni. On mahdollista, että voi todella olla monia kuljettajan geenejä kussakin amplikonin ja vaikka kukin voi erikseen vaikutus on pieni syövän etenemisessä, koordinoida yli näiden geenien ilmentymistä monistuneilla alueilla olevien voi olla additiivinen tai synergistinen onkogeeninen vaikutus. Vaihtoehtoisesti monet differentiaalisesti ilmaisi geenit voivat olla matkustajia, joiden yli ilme itse antaa mitään valikoivaa etua tai haittaa kasvaimeen. Erotteleva välillä matkustajien ja kuljettajien sisällä perimän alue voi siis saada aikaan vain laajamittaisen toiminnallisia analyysejä ja kombinatorisista lähestymistapoja tutkia monien geenien yhdessä.

Huolimatta suhteellisen suuri määrä vahvistetaan ja differentiaalisesti ilmentyvien geenien tunnistettu tässä tutkimuksessa , vielä hypoteesin, että nuo geenit osoittavat voimakkainta yli ilmaisua, ja myös ne geenit, joilla on korkein amplitudi kopioluku voittoja, saattaa olla todennäköisemmin kuljettajille tumorigeneesin kuin heikosti yli ilmaistuna geenejä. Näin ollen meidän priorisoitu geenirakenteeseemme listaa käyttämällä tiukkoja ilmaisua kriteerit. Esimerkiksi yksi geeneistä useimmin kohteena kopioluku, joka on voimakkaasti yli ilmaistuna on

PUF60

(

poly-U sitova silmukoinnin tekijä 60 kDa

). Tämä geeni koodaa ennalta mRNA tekijä ajatellaan olevan mukana tunnustamista 3 ’silmukointikohdista [25]. Se voi myös estää transkription vuorovaikutuksessa TFIIH helikaasin, avaintekijä mutatoitunut syövän altis oireyhtymä xeroderma pigmentosum, ja tämä vuorovaikutus on osallisena oikeaan sääntelyn

MYC

transkriptio [26], [27] .

Myoneurin tai

MYNN

on geeni, joka sijaitsee alueella usein (60%) kopioi numero voitto 3q26.2. Se ilmentyy differentiaalisesti (oikaistu p = 1.51E-05) välillä vahvistetaan ja unamplified ryhmiä, ja näyttää vahvin korrelaatio kopiomäärä ja ilmaisun (r = 0,74, kuva 3) keskuudessa geenejä tällä alueella. Tämä geeni tunnistettiin jäseneksi Broad monimutkainen, Tramtrack, BRIC ”brac (BTB) tai rokkovirusta ja sinkin sormi (POZ) -ZF so BTB /POZ-ZF perheen transkriptiotekijöiden [28]. Ensimmäinen löydettiin

Drosophila

, tämä perhe koostuu noin 60 ihmisen proteiineja, kuten useita syöpään liittyviä proteiineja, kuten leukemiaa liittyvä tekijä (LRF /ZBTB7) ja B-solulymfooman 6 (BCL6). Vaikka rooli MYNN syövän on vielä tunnusomaista, muut tämän perheen jäseniä ovat samoin yliekspressoituvat kasvaimissa [29].

. Taajuus kopioluvun voiton kromosomissa 3 p-ter vasemmassa Q-ter suorassa osoittamalla tavalla ideogrammi. B. Geenit on CHR 3: +169,209-+172,478 Mbp, alue sai 60% (41/68) kaikista näytteistä, mukaan lukien geenit aikaisemmin yhdistetty munasarjasyöpä (

PRKCI, MECOM

tai

MDS1 /EVI1

) ja mahdollisesti uusia oncogenes (

MYNN

). C. Tulivuori juoni tuloksia esittelevät ilmaisun analyysien välillä vahvistetaan ja unamplified näytteet tällä alueella. Geenit sisään oikeassa yläkulmassa yliekspressoituvat merkittävästi näytteissä kopio vahvistuksenkertojan (p 0,05, punaisen viivan yläpuolella at -logP 4,32) verrattuna näytteisiin ilman kopioluvun muutos (valitut geenit merkitty). Kattava luettelo erilaisesti ilmaisi geenien katso taulukko S5. D. Plot vertaamalla kopiomäärä ja ilmaisun kaikissa näytteissä geeniä

MYNN

että osoitti suurin korrelaatio (r = 0,74, Pearson testi) välillä kopiomäärä ja ilmaisu tälle alueen 3q26.2.

sekä tunnistaa korkean taajuuden, ilmentyvät eri geenit, mukaan lukien tunnetut syövän geenejä, kuten

PIK3CA

ja

AURKA

, me myös käyttää suuri amplitudi alueita sijoittaa ylimääräisiä tiedossa ( esimerkiksi

ErbB2

ja

CCNE1

) ja mahdolliset onkogeenejä. Esimerkiksi kromosomissa 20, korkean amplitudin lähestymistapa tunnistaa pieni minimaalinen alue, joka ei käy ilmi matalaa syvyyttä analyysi. Tämä 421 kb tiheästi 20q11.21 kattaa 10 geenejä, joista

TPX2

voimakkaimmin korrelaatio kopiomäärä (r = 0,53). Tämä geeni myös ilmentyvät eri näytteiden välillä minkään

TPX2

voitto ja ne, joilla on normaali

TPX2

kopioluvun ja oli vahvin kertainen muutos minkä tahansa geenin kromosomissa 20 (log2 kertainen muutos 1,03 ). Koodaaman proteiinin tämän geenin toimii aktivaattorina Aurora-A rooli kehräkokoonpanon [30]. Mielenkiintoista munasarjasyöpä, on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa BRCA1 /BARD1 kompleksin (15). Viime aikoina on todettu potentiaaliseksi onkogeenin haimasyövän [31].

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoittaa, että yhdistämällä korkean taajuuden ja suuri amplitudi analysoi ja kohdistuvat voimakkaimmin yli ilmentyvien geenien vähensi ehdokaslistan vain 70 geenejä ulos tuhansia kohteena kopiomäärä muutoksen yksin. Olemme tunnistaneet monia lupaavia kandidaattigeenit ole aiemmin todettu munasarjasyövän, erityisesti geenejä, kuten

MYNN

,

TPX2

ja

PUF60

. On kuitenkin huomattava, että analyysimenetelmä on yksi monista, joita voidaan käyttää tunnistamaan uusia syövän geenien, ja on epätodennäköistä, että on todettu, kaikki mahdolliset ehdokkaat. Esimerkki

MYC

, ole vahvasti ilmaistu meidän tietoja, mutta aiemmin osoitettu olevan toiminnallista vaikutusta munasarjasyövän solulinjoissa [32], osoittaa selvästi, että lähestymistapamme olisi harkittava täydentää muita, kuten funktionaalisia seulontoja ja syvä sekvensointi ensisijainen syöpä näytteitä. Kuitenkin meidän data muodostaa tärkeän foorumin, josta järkevästi jatkaa validointi näistä mahdollisista hallitseva kuljettajien munasarjojen kasvaimien syntyyn. Lisäksi tämä luettelo sisältää geenejä, jotka ovat voimassa ehdokkaita diagnostisia tai terapeuttisia tarkoituksia varten.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki näytteet kerättiin luovuttajan Kirjallinen suostumusta. Tutkimus hyväksyi Peter MacCallum Cancer Centre Human Research Ethics Committee (Protocol numero 01/38).

Näytteiden kerääminen

Kasvainten koepaloja saatiin 72 potilasta, jotka olivat leikkaukseen varten primääri munasarjojen syövät (a) sairaaloissa Wessex alueella Kaakkois-Englanti, Iso-Britannia ja (b) sairaaloissa Victoria, Australia (käyttö Peter MacCallum Cancer Center Tissue Bank). Verta kerättiin samalla potilaiden vastaavat lymfosyytit. Munanjohtimen näytteet kerättiin kudoksen läpi pankin

BRCA1

tai

BRCA2

mutaation kantajia, joille tehdään ennalta ehkäisevää kahdenvälistä salpingo-oophorectomy sairaaloissa ympäri Melbourne. Suoriteperusteisen ja käyttö potilaiden näytteistä liittyvät tähän hankkeeseen hyväksyttiin asianomaisten institutionaalisten eettiset toimikunnat. Kliiniset ja histopatologisia tietoa näytteet on esitetty taulukossa 1 ja taulukossa S1.

DNA ja RNA

Pakastemarjat kudos upotettiin Optimal Cutting Lämpötila yhdisteen (MMA, Sakura Finetek, Torrance , CA) ja leikattiin 10 um: n leikkeiksi. Kasvaimen DNA ja kasvain ja munanjohtimen RNA uutettiin identtisiä alueita jälkeen neula mikro-leikkelyn 80% kasvain epiteelisolujen. Osastossa RNA värjättiin kresyylivioletilla ja RNA uutettiin käyttäen Ambion Mirvana yhteensä RNA-protokollan (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX). Kudosleikkeet, joita käytetään DNA: n eristämiseksi värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla, ja DNA uutettiin käyttämällä Qiagen Blood and Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). DNA Matching normaalista lymfosyyttien näytteitä Peter MacCallum Cancer Centre Kudospankki uutettiin käyttäen samaa kit. DNA Matching normaalin lymfosyyttien näytteitä Southampton uutettiin, kuten aiemmin on kuvattu [33].

Microarray luonti ja laadunvalvonta

500 ng DNA: ta kustakin kasvaimen näyte analysoitiin käyttämällä Affymetrix Genome laajuinen Human SNP Array 6,0 (SNP6.0) seuraten valmistajan ohjeita (Affymetrix, Santa Clara, CA). Jos saatavilla (57 tapausta) DNA Matching ääreisveren lymfosyyteissä analysoitiin samalle alustalle ja samassa erässä. MRNA: n ilmentyminen, 300 ng kokonais-RNA samasta kasvain näytteet analysoitiin käyttäen Affymetrix Human Gene1.0 ST Array. Analyysi array suorituskykyä SNP6.0 taulukot tehtiin käyttäen genotyypityksen puhelun hinnat ( 90% puhelutaajuuden vaaditaan) sekä silmämääräinen tarkastus kopioluvun jälkiä poistaa meluisa näytteitä. 72 näytettä läpäissyt laadunvalvontaa toimenpiteitä ja käytettiin kopioluku analyysi. Sillä ilme paneelit, profiilit hybridisaation valvonnan, piikki-kontrolleissa ja positiiviset versus negatiiviset käyrän alapuolinen alue (AUC) arvioitiin käyttäen Affymetrix Expression Console. Lisäksi laatu paneelit arvioitiin perustuen Suhteellinen Log-Todennäköisyys (RLE) ja Normalised Skaalaamaton keskivirheet (nKäytä) perusteet luotu käyttämällä ”affyPLM” paketin R avoimen lähdekoodin ohjelmistoja. Expression paneelit, jotka merkitä epäilyttäviä 2 out of 3 toimenpiteiden (AUC, RLE, nKäytä) jätettiin pois ilmaisua analyysejä. 68 kasvain näytteet (57 normaali DNA) läpäisi sekä ilmaisun ja kopioluvun ja jäivät integroidun ilmaisun analyysit. Lopulliseen otokseen asetettu integroitu analyysiin sisältyi neljä yleisimmin nähty histologisia alatyyppejä munasarjasyöpä – vakavien (n = 37), endomet- (n = 14), mucinous (n = 7) ja selkeä solujen (n = 9). Yksi näyte tutkimuksessa oli tuntematon histotype (taulukko 1). Sekä geenien ilmentyminen ja kopioluvun tiedot ovat MIAME yhteensopiva ja on toimitettu National Center for Biotechnology Informationin (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) verkkosivuilla, sarja hakunumero GSE19539.

Kopioi numero analyysi

Kopioi numero sukupolven ja analyysit suoritettiin käyttäen Partek

® Genomics Suite ™ versio 6.03 (Partek Inc., St. Louis, Missouri) ja Bioconductor paketteja R-avoimen lähdekoodin puitteet [34], [35]. SNP 6,0 CEL tiedostot tuotiin Partek oletusasetuksilla tausta korjausta ja tiivistämistä. Human Genome Build 36,1 (hg18, maaliskuu 2006) käytettiin emäsparin paikoissa. Probeset kopiomäärä suhteet laskettiin vertaamalla kunkin kasvaimen sen matching normaalia, kun käytettävissä (n = 57). Näytteissä, jotka eivät ole vastaavia normaalin datan (n = 15), yhdistetyssä normaali lähtötilanteessa kaikista muista normaalin näytteitä käytettiin. Pyöreä binary segmentointi [36] suoritettiin käyttäen R-pohjainen paketti ”DNAcopy” segmentin datan erilliseen alueeseen muutos käyttäen oletuksena paketin asetuksia. Tämä analyysi tuotti luettelo alueista per näyte, joka suodatettiin sitten niille alueille, jotka osoittivat voitto (kopiomäärä suhde 2,5) tai tappio (kopiomäärä suhde 1,5) poikki ≥40% (n≥29) kaikista näytteistä. Nämä alueet olivat ajautunut cytobands helpottaa tietojen käsittely (kuva S2 tarkemmin). On tärkeää huomata, että koska nämä alueet ovat läpikäyneet suodatuksen vaiheet edellä, ne eivät sisällä koko cytoband joilla ne ovat edustettuina ja siten korkean resoluution tietojen ei vaarannu.

tunnistamaan mahdollisia ituradan kopiomäärä polymorfismit (CNP), jotka voivat häiritä tarkkoja tunnistamisen somaattisen muutoksia, kopioiden määrä tietoja 57 normaaliin näytteissä syntyi suhteessa yhdistetyssä lähtötilanteessa normaalien näytteiden. Alueet osoittaa voitto tai tappio 5% kaikista näytteistä kutsuttiin CNPS (taulukko S3). Alueet kiinnostusta kasvain tiedot skannattiin näille CNPS ja ottelut poistettiin myötävirtaan analyyseistä (kuvio S2-B). CNP-poistettu, cytoband-romahtanut alueilla tiedusteltiin vastaan ​​koko kopioluvun aineisto tuottaa tarkkoja, aluekohtaisella arvoja kopioluvun.

Kopioi numero oli uutettu geeni-by-geenin perusteella suorittaa Pearson korrelaatio analyysi ilme. Koska jotkut geenit olivat niin pieniä, ettei kopiomäärä probesets kartoitus heille ylimääräinen 10 kb lisättiin kaikkiin geenin käynnistys ja pysäytys kantoja ennen talteen niiden kopiomäärä.

Expression mikrosiruanalyysi

jokaisen ehdokkaan alueen, näytteet jaettiin kahteen ryhmään, G – joka koostuu kaikista näytteistä, joka osoitti vahvistus ( 3 kopiota) on SNP6.0 alustalla; ja N – joka koostuu kaikista näytteistä, jotka osoittivat normaalia kopiomäärä (1,5-2,5 kappaletta). Testi erilainen ekspressio suoritettiin näiden kahden ryhmän käyttämällä ”Limma” paketti saatavilla R-avoimen lähdekoodin ohjelmistoalustan [34]. Histologinen alatyyppi sisällytettiin tekijänä analyysissa. Geenit katsottiin merkittävästi differentiaalisesti ilmaista p-arvo 0,05 toistuvassa testaus korjauksen [37]. Pearsonin korrelaatio analyysi välillä kopioluku ja ilmentyminen suoritettiin myös. Erilliset analyysit suoritettiin geenin-by-geenin perusteella kaikkien geenien (a) useimmiten monistettiin alueiden (CN≥3; Freq≥40%) ja (b) eniten monistettiin alueilla (CN≥5; Freq≥7% ).

tukeminen Information

Taulukko S1.

Näyte yksityiskohtia. Kliinis-ja määritys tiedot kustakin näytteestä. 57 ulos 72 kasvainten oli Matching lymfosyyttinen DNA saatavilla kopiomäärä mikrosiruanalyysi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0009983.s001

(0,06 MB PDF) B Taulukko S2.

osuus genominlaajuisten voitto ja tappio näyte. Kaikissa näissä näytteiden poikkeava genomin lisää jopa 95,4% keskimäärin. Puuttuva 4,6% johtuu alueille kromosomissa Y, mitokondrio-DNA ja toistuvat sekvenssit noin sentromeerisen alueita, jotka ovat joko poistetaan segmentointi analyysiä tai ei kuulu Affymetrix SNP6.0 array.

Doi: 10,1371 /journal.pone .0009983.s002

(0,06 MB PDF) B Taulukko S3.

Ituradan kopioluvun polymorfismien on Chr 3, 7, 8, 20. alueet /segmentit kopioluvun voitto, joka sisälsi yhden tai useamman näistä CNPS poistettiin tai muutettava esitetty kuviossa S1-B. Tyyppi CNP näkyy myös kaukana oikeassa sarakkeessa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0009983.s003

(0,05 MB PDF) B Taulukko S4.

alueiden voitto läsnä 40% näytteistä. Tämä taulukko sisältää genomista tietoa 90 alueille sisältyvät ilmaisun analyysit, eli kaikkia niitä alueita, jotka kartoitetaan 1 tai enemmän probesets inhimillisestä GeneST1.0 mikrosiruja. Tällä mikrosirujen alustalla, useimmat probesets kartta yksiselitteisesti proteiinia koodaavan geenin. Alueella tunnukset vastaavat taulukoissa 2, 3, 4 ja S5.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0009983.s004

(0,13 MB PDF) B Taulukko S5.

Kaikki ilmennetty eri probesets ahkerassa alueilla vahvistuksen.