Krooninen sairaus

tiivistelmä

kemopreventioon muodostaa merkittävän strategian lääkehoito peräsuolen syöpä. Useimmat huumeita käytetään peräsuolen syövän hoidossa aiheuttavat DNA-alkylointi vaurioita, jotka on ensisijaisesti korjataan pohjan leikkaaminen korjaus (BER) kautta. Siten saarto BER reitti on houkutteleva vaihtoehto leviämisen estämiseksi peräsuolen syöpä. Käyttämällä

in silico

lähestymistapa, teimme rakenne-pohjainen näyttö telakoimalla pienten molekyylien päälle DNA-polymeraasi β (Pol-β) ja tunnistettu voimakas anti-Pol-β yhdiste, NSC-124854. Tavoitteena oli tutkia, NSC-124854 voisi parantaa terapeuttista tehoa DNA-alkyloiva aine, temotsolomidi (TMZ), estämällä BER. Ensin määritellään spesifisyyden NSC-124854 Pol-β tutkimalla

in vitro

toimintaan APE1, Fen1, DNA ligaasi-I, ja Pol-β-suunnattu yhden nukleotidin (SN) – ja pitkän patch (LP) -BER. Toiseksi tutkimme vaikutus NSC-124854 tehosta TMZ kasvun estämiseksi epäsuhta korjaus (MMR) vajausta ja MMR-asiantunteva koolonsyöpäsolulinjaa käyttämällä

in vitro

klonogeeniset määrityksiä. Kolmanneksi tutkimme vaikutus NSC-124854 TMZ aiheuttama

in vivo

kasvaimen kasvun estäminen MMR-puutteellisia ja MMR-asiantunteva paksusuolen ksenograftien istutetaan naisen homotsygoottista SCID-hiiriin. Tuloksemme osoittivat, että NSC-124854 on erittäin spesifinen Pol-β ja esti Pol-β-suunnattu sn ja LP-BER toimintaa

in vitro

rekonstruoitu järjestelmään. Lisäksi NSC-124854 tehokkaasti aiheuttama herkkyyttä TMZ MMR-puutteellinen ja MMR-asiantunteva koolonsyöpäsoluihin sekä

in vitro

soluviljelmässä ja

in vivo

ksenograftimalleissa. Tulosten perusteella näyttää potentiaalinen uusi kehittämisstrategia erittäin spesifisten rakenne-pohjainen estäjä ehkäisyyn paksusuolen syövän etenemiseen.

Citation: Jaiswal AS, Banerjee S, Aneja R, Sarkar FH, Ostrov DA, Narayan S (2011) DNA Polymerase β uutena Tavoite Kemoterapia väliintulo peräsuolen syövän. PLoS ONE 6 (2): e16691. doi: 10,1371 /journal.pone.0016691

Editor: Ben Ko, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 04 lokakuu 2010; Hyväksytty: 03 tammikuu 2011; Julkaistu: 2. helmikuuta 2011

Copyright: © 2011 Jaiswal et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (R01 CA-097031 ja CA-100247). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti [1]. Vuonna 2010 arviolta 102900 uutta peräsuolen tapauksia diagnosoidaan ja 51370 kuolemantapausta tapahtuu vain Yhdysvalloissa. Vaikka kahden viime vuosikymmenen aikana huomattava edistysaskel on tehty hoitovaihtoehtoja, kuolleisuuden tästä taudista ei ole paljon parantunut. Siksi uusien hoitojen parantamiseksi tarvitaan ennustetta tämän taudin. Useiden vuosien ajan, ensimmäinen valinta kemoterapeuttisen lääkeaineen peräsuolen syöpä on ollut 5-fluorourasiili (5-FU). Eniten sitä käytetään neoadjuvant sädehoitoa ja yhdessä useiden muiden kemoterapeuttisten lääkeaineiden, kuten mitomysiini, sisplatiini, oksaliplatiini, CAMPTOSAR, ELOXATIN, Avastin, Erbitux, ja Vectibixin hoitoon peräsuolen syöpä, joka tulee etäpesäkkeitä [2]. Nämä lääkkeet antavat parhaat tulokset suuremmilla annoksilla, mutta aiheuttaa vakavia haittavaikutuksia, kuten tappaminen terveet solut limakalvon suun, limakalvon ruoansulatuskanavassa, karvatupet, luuytimeen ja aiheuttaa maksavaurion ja verenpainetauti [3].

Mutaatiot

adenomatoottisen polypoosin coli (APC) B-geeni on varhainen tapahtuma familiaalinen adenomatoottisen polypoosin (FAP) on oireyhtymä, jossa on perinnöllinen alttius paksusuolensyöpä [4], [5]. Useimmat mutaatiot

APC

geeni esiintyy mutaatio klusterin alue (MCR) ja johtaa tuotannon katkaistun proteiinin. Tämä katkaisu vaarantaa useita toimintoja APC, joka on mukana kromosomi epävakautta ja epänormaali toiminta Wnt-signalointireitin, solusyklin säätelyssä, stabilointi mikrotubulusverkoston solun tukirangan, solu-vuorovaikutuksiin ja DNA rep y [6] – [14]. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että ydin- APC kautta alue (aminohapot 1441-2077), joka on katkaistu useimmissa Kolorektaalituumorien, tekee yhteistyötä rekrytointi DNAPKcs vahingoittuneen DNA chromatin ja parantaa varhaisen reagoinnin kaksinkertaisen säikeen katkoksia (DSB ) DNA: n korjautumiseen [15]. APC myös vaikuttaa suoraan perimän DNA edullisesti A /T rich sekvenssit [16], mikä rooli APC DNA-replikaatioon [17]. On ehdotettu, että APC kautta C-päätteestä (aminohapot 2140-2421) on vuorovaikutuksessa DNA: n kanssa ja säätelee negatiivisesti solusyklin etenemistä estämällä DNA-replikaatiota suoraan vuorovaikutukseen DNA: n kanssa [17]. Olemme aiemmin osoittaneet, että hoito DNA-alkyloivien aineiden parantaa APC-taso peräsuolen syövän soluihin [14]. Lisäksi osoitimme, että APC on vuorovaikutuksessa DNA-polymeraasilla β (Pol-β) ja läppä-endonukleaasi 1 (Fen1) ja estää Pol-β-suunnatun yhden nukleotidin (SN) – ja pitkän patch (LP) -base Leikkauskorjauksessa (BER) toiminta vaikuttaa solujen vastata kemoterapiaa [14], [18]. Näiden tutkimusten perusteella vaikuttaa siltä, ​​että vuorovaikutus APC Pol-β ja muut BER proteiinit voivat olla sopiva kohde kemoterapeuttisten väliintulon peräsuolen syövän kasvua.

käyttö DNA-alkyloivat aineet, kuten kemoterapeuttiset lääkkeet on perustuen niiden kykyyn käynnistää solun kuolemaan vastauksen [19], ja niiden terapeuttinen teho määritetään tasapaino DNA-vaurion ja korjaus. DNA-alkylointi vaurioita aiheuttama vauriot korjataan ryhmäpoikkeusasetuksen, O

6-metyyliguaniini DNA-metyylitransferaasin (MGMT) ja mismatch korjaus (MMR) polkuja. Monet paksusuolen kasvaimet tulevat vastustuskykyisiksi DNA-alkyloivat aineet, koska yli-ilmentymisen MGMT tai MMR-puutos [20]. Solut puutteellisia MGMT eivät pysty käsittelemään O

6MeG DNA-synteesin aikana, ja jos sitä ei korjata, G: C-G: T siirtyminen mutaatio tapahtuu [21]. Aiemmissa tutkimuksissa rooli BER koulutusjakson on myös liitetty solujen vastustuskykyä TMZ [22], [23], joka riippuu erityisistä BER geenien ilmentymistä ja toimintaa [24]. Viimeisten vuosien syöpälääkkeitä, jotka on kehitetty pääasiassa kohdistaa MGMT ja MMR reittejä [25], [26]. Koska MMR-puutosta kolorektaalisyövissä aiheuttaa suuremman riskin vastustuskyvyn DNA-alkyloivat lääkkeet johtuen yli-ilmentymisen MGMT tai MMR-puutos [27] – [29], se on kriittinen löytää kemoterapeuttinen strategia, joka voi olla käyttökelpoinen hoidettaessa sekä MMR-puutteellinen ja MMR-taitavia Kolorektaalituumorien. Mielenkiintoista, vaikka BER vastaa korjaus 70%, 5% ja 9% N

7-metyyliguaniini (MEG), N

3-MeG, ja N

3-metyyliadeniinin (MEA) leesioita vastaavasti aiheuttama DNA-alkyloivat lääke Temozolomide (TMZ, NSC-362856) [23], [30], [31], mahdollinen hyöty BER koulutusjakson saarto ei ole perusteellisesti tutkittu. Siten yhdistelmällä BER estävien aineiden ja temotsolomidin hoidon kliininen tulos kemoterapeuttisen tehoa temotsolomidin voidaan parantaa. Aikaisemmat tutkimukset tukevat myös, että DNA alkylointi aiheuttama vahinko on ensisijaisesti korjataan ryhmäpoikkeusasetuksen polku [26], [27]. Aiemmin BER polku on hyödynnetty kohteena uusien lääkkeiden, mutta kliininen seuraus näistä lääkkeistä on edelleen tutkittavana [31] – [36].

TMZ on onnistuneesti käytetty ja metastaattisen melanooman ja glioblastoma multiforme, jälkimmäinen yhdessä sädehoidon [37], [38], mutta on osoitettu olevan vähemmän tehokkaita hoidettaessa muiden pahanlaatuisten kasvainten. Vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa TMZ ennalta valittujen kehittynyt aerodigestive suolikanavan syöpien, kuten peräsuolen kasvain, on hiljattain valmistunut Schering-Plough, Kenilworth, NJ, osoittaa vain osittaisen hoitovasteen (https://clinicaltrials.gov/CT2 /Show /NCT00423150). Aiemmassa faasi I kliinisessä tutkimuksessa temotsolomidin osittainen vaste lääkkeen metastasoitunut kolorektaalisyöpä havaittiin myös, mikä viittaa huomattava kasvaimen hoito ei tehoa. [39] Vastuksen voittamiseksi temotsolomidin, vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa suoritettiin joka lomeguatrib yhdistettiin temotsolomidin, mutta tulokset eivät olleet kovin merkittäviä [40]. Niinpä on olemassa kiireellinen tarve kehittää uuden strategian, jonka avulla tehoa TMZ voidaan lisätä hoitoon peräsuolen syöpiä.

Koska useimmat kemoterapeuttisten aiheuttaa DNA-vaurioita ja vastustuskyky johtuen aktivointi DNA korjaukseen liittyvä reitti (s), kohdistaminen proteiinit näiden reitin (t) estää niiden toimintaa voi olla lupaava strategia kehittää uusia lääkkeitä, joilla on suurempi terapeuttinen teho sekä chemo-resistenttien ja herkkien kasvainten. Viime vuosina, rakenne-pohjainen virtuaalinen suunnittelu ja kolmiulotteinen rakenne lääkkeen kohde-vuorovaikutuksen pienten molekyyli-paino-inhibiittoreita on käytetty ohjaamaan perustelut lääkekehityksen [41]. Tietokoneavusteiseen lääkekehityksessä voisi löytää uusia lyijy yhdisteitä ja auttoi rakenteen optimointi biologisten ja farmakologisten [42] – [44]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme suoritetaan rakenne-pohjainen molekyyli telakointi Pol-β paikassa, jossa adenomatoottisen polypoosin coli (APC) vuorovaikutuksessa ja estää Pol-β-suunnattu BER [14], [45], [46]. Rakenne-pohjainen molekyyli telakka pidetään sopiva lähestymistapa uusien lääkkeiden kehittämiseen, koska tämä lähestymistapa on suunnattu tiettyyn proteiiniin ja erityisiä reitti [47]. Perustuen in silico toimia, olemme tunnistaneet hyvin voimakas pieni molekyylipaino estäjä, NSC-124854 {[5- (4-amino-6-jodi-2-okso-5,6-dihydropyrimidin-1-yyli) -3- hydroksi-oksolan-2-yyli] methoxyphosphonic happo}, joka spesifisesti vuorovaikutuksessa Pol-β ja estää Pol-β-suunnattu yhden nukleotidin (SN) – ja pitkän patch (LP) -BER. Tässä esittelemme kuvaavat tiedot, jotka NSC-124854 voi parantaa tehoa TMZ MMR puutteesta ja asiantunteva koolonkarsinoomasoluissa

in vitro

ja

in vivo

malleissa. Ehdotamme, että näitä ennalta kliinisten löydösten perustaa uuden paradigman kliinisen hoidon paksusuolen syöpä.

Tulokset

Screening pienten molekyylien estävän Pol-β-suunnattu säikeen-syrjäytysaktiivisuus

tunnistamiseksi voimakas anti-Pol-β yhdiste, käytimme

in silico

suurikapasiteettisten rakenne-pohjainen molekyyli telakointi lähestymistapa ja seulotaan noin 140000 pienimolekyylisiä yhdisteitä (molekyylipaino 500 daltonia) niiden kyky olla vuorovaikutuksessa APC-sitomiskohta Pol-β (Fig. 1

) [48]. 22 eniten pisteitä pieni molekyyli yhdisteiden pyydetty Developmental Therapeutics Program (DTP) National Cancer Institute (NCI) toiminnallisten arviointia. Suoritimme alustavan seulonnan yhdisteiden määrittämällä niiden kyky inhiboida Pol-β-suunnattu juosteen-siirtymä synteesi. Käytimme

in vitro

reconsitiuted määritys järjestelmä näissä tutkimuksissa. Me seulotaan 22 alkuun pisteytys yhdisteitä ja data 12 yhdisteiden Tässä näytetään (Fig. 2

–

C

). Niistä 22 pieniä molekyylejä, NSC-21371 ja NSC-91855 esti Pol-β-suunnattu säikeen-siirtymä synteesi 125 uM (Fig. 2

B

; vertailla kaista 3 kaistaa 9-13 ja 19-23 , vastaavasti). Nämä pienet molekyyliyhdisteitä eivät vaikuttaneet 1-nt sisällyttäminen aktiivisuus (24-mer tuote) ja Pol-β missään testattu pitoisuus. Kuitenkin NSC-124854 esti Pol-β-suunnattu säikeen-syrjäytysaktiivisuus 5 uM, kun taas suurempia pitoisuuksia NSC-124854 kumosi kokonaan muodostumista säikeen-siirtymä tuotteiden (Fig. 2

; vertailu kaista 3 kaistaa 4-8 vastaavasti). Kun pitoisuus NSC-124854 lisättiin vielä 50 uM tai enemmän, 1-nt sisällyttäminen (24-mer tuote) aktiivisuus Pol-β oli täysin tukossa mikä näkyy kertyminen 23-mer viillon tuote ja puute 1 -nt sisällyttäminen tuote, mikä täydellinen menetys Pol-β aktiivisuutta (Fig. 2

, vertaa kaista 3 4-8, tässä järjestyksessä). Nämä tulokset viittaavat siihen, että NSC-124854 on tehokkain estäjä Pol-β aktiivisuus joukossa kaikki testatut yhdisteet.

Panel

esittää ennustettu vuorovaikutus NSC-124854, joka perustuu kiderakenteen Pol-β. Pol-β esitetään kulta ja sivuketjut ennustetaan muodostavan yhteyksiä NSC-124854, Asp17 ja Arg89, on kuvattu kultaa hiilidioksidin, sininen typen ja punainen happea. APC sitova taskutähteet, Thr79, Lys81, Arg83 Pol-β näkyvät palloja harmaana hiilidioksidin, sininen typen ja punainen happea. Polar kontaktit kuvataan keltaisina katkoviivojen välillä NSC-124854 ja Pol-β tähteet Lys81 ja Arg89. Luku tehtiin PyMol. Paneeli

B

kuvaa Pol-β-ligandivuorovaikutuksia ennustetusta perustuen aiheuttamiin molekyylien telakointi suunta NSC-124854. Välittämien vuorovaikutusten vetysidoksia (vihreä) ja hydrofobisia (harmaa) koskettimet on esitetty. NSC-124854 ja Pol-β näkyvät musta hiili, sininen typen ja punainen happea. Inter-atomi kahleet NSC-124854 on esitetty magenta. Inter-atomi kahleet Pol-β esitetään kultaa. Vetysidoksia katkoviivoin atomien välillä mukana, kun taas hydrofobiset kontaktit edustaa kaari pinnoja säteilevän kohti NSC-124854 atomien ne koskettavat. Otettu yhteyttä Pol-β atomeja näytetään pinnoja säteilevää takaisin. Luku tehtiin HBPLUS ja LigPlot.

vaikutuksen määrittämiseksi Yhdisteiden tukkiminen Pol-β-aktiivisuus, me koottu

in vitro

säikeen-siirtymä synteesi määrityksessä puhdistettu APE1 precut

32P-leimattua 63-mer F-DNA: n ja Pol-β. Paneeli

(NSC-124854, NSC-143995, NSC-160172 ja NSC-263659),

B

(NSC-10730, NSC-21371, NSC-43656 ja NSC-91855) ja

C

(NSC-274937, NSC-351093, NSC-668472 ja NSC-674711) osoittavat vaikutuksen pienten molekyylien Pol-β-kohdistuu säikeen synteesiä. Kussakin paneelissa kaista 1 esittää 63-mer

32P-leimattua F-DNA, kaista 2 on esitetty 23-mer tuote jälkeen APE1 viilto, kaista 3 osoittaa 1-nt sisällyttäminen (24-meeri) ja lohkon siirtymän tuotteita. Kaistat 4-8, 9-13, 14-18 ja 19-23 esittävät lohkon siirtymän aktiivisuus Pol-β inkuboitiin 0, 5, 10, 25, 50 ja 125 uM, vastaavasti, ilmoitetaan yhdisteitä. Tiedot edustavat kahden kokeen.

pienmolekyylisalpaaja-, NSC-124854, nimenomaan estää Pol-β aktiivisuus

täsmentyvät onko NSC-124854 on erityinen estäjä POL β toimintaa tai se voi myös estää toiminnan muiden BER entsyymejä. Ensin määritetään IC

50 NSC-124854 Pol-β-suunnattu säikeen-siirtymä synteesi. Tämä koe oli sama kuin on kuvattu seulonta kokeessa, paitsi päätimme pienemmät pitoisuudet määrittää IC

50 NSC-124854. Olemme kvantitoitiin lohkon siirtymän synteesin tuotteet (Fig. 3

, kaistat 3-10 vastaavasti), ja piirrettiin prosenttia muutoksen NSC-124854-välitteisen tukos Pol-β aktiivisuus (Fig. 3

B

). Hoito NSC-124854 osoitti annoksesta riippuvaista lasku juosteen-siirtymä synteesin aktiivisuutta IC

50 5,3 uM (Fig. 3

B

). Nämä tulokset viittaavat siihen, että NSC-124854 on voimakas estävä vaikutus Pol-β-suunnattu juosteen-siirtymä synteesi.

affiniteetin määrittämiseksi NSC-124854, että tukkeutuminen Pol-β-suunnattu juosteen-syrjäytysaktiivisuus määritimme sen IC

50 on saatettu määrityksessä järjestelmää kuin on kuvattu kuviossa 2. Panel

näyttää autoradiogrammissa säikeen-syrjäytysaktiivisuus. Kaista 1 esittää

32P-leimattua 63-mer F-DNA, kaista 2 on esitetty 23-mer tuote jälkeen APE1 viilto, ja kaista 3 esittää lohkon-syrjäytysaktiivisuus Pol-β. Kaistat 4-10 osoittaa vaikutuksen 0,5-20 uM NSC-124854 on Pol-β aktiivisuutta. Paneeli

B

esittää IC

50 data. NSC-124854 esti Pol-β-suunnattu juosteen-tilavuus-aktiivisuuden annoksesta riippuvaisella tavalla, jossa IC

50 5,3 uM. Tiedot ovat edustavia kahden riippumattoman arvioita.

Seuraavaksi määritetään, NSC-124854 voi inhiboida muiden BER reitin entsyymejä, kuten apurinic /apymidinic endonukleaasi 1 (APE1), Fen1 ja DNA-ligaasi I. tulokset osoittivat, että NSC-124854 ei inihibit toimintaa näiden entsyymien (Fig. 4

–

C

, vastaavasti). Näistä tuloksista päättelimme, että estävää vaikutusta NSC-124854 oli erittäin spesifinen Pol-β ja ei vaikuttanut toimintaan muiden BER entsyymejä.

Panel

esittää vaikutuksen NSC-124854 on APE1 toimintaa. APE1 (10 nM) inkuboitiin eri pitoisuuksien NSC-124854 (0,5-20 uM, kaistat 3-9, vastaavasti) ja

32P-leimattu 63-meeri F-DNA: ta. Kaistat 1 ja 2 esittävät leikkaamaton

32P-leimattua 63-mer F-DNA: n ja 23-mer viillon tuote, vastaavasti. Paneeli

B

esittää vaikutuksen NSC-124854 on Fen1 toimintaa. Fen1 (10 nM) inkuboitiin eri pitoisuuksien NSC-124854 (0,5-20 uM, kaistat 3-9, vastaavasti) ja

32P-leimattu 51-meeri flapped-DNA: ta. Kaista 1 esittää asentoa 51-mer leimatun oligonukleotidin ja kaista 2 esittää 11-mer pilkkoutuu läppä tuote. Paneeli

C

esittää vaikutuksen NSC-124854 DNA ligaasi I aktiivisuutta. DNA-ligaasi-I (5 nM) inkuboitiin eri pitoisuuksien NSC-124854 (0,5-20 uM, kaistat 3-9, vastaavasti), minkä jälkeen lisättiin 2,5 nM

32P-leimattu 63-meeri-nick-DNA: ta. Kaista 1 esittää 23-mer leimatun oligonukleotidin (koloja tuote) ja kaista 2 esittää 63-mer ligatoitu tuote. Tiedot edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

pienmolekyylisalpaaja- NSC-124854 lohkot yhden nukleotidin (SN) – ja pitkän patch (LP) -BER toimintaansa rekonstruoitu

in vitro

määritys

perustuen molekyyli- telakka-analyysi, NSC-124854 on ennustetaan muodostavan polaarisella (H-joukkovelkakirjat) vuorovaikutukset aminohappotähteitä Lys81 ja Arg89 ja ei-polaarisella (van der Waalsin) vuorovaikutukseen aminohappotähde Asp17 pinnalla Pol-β [48], [49]. Nämä tähteet ovat lähellä APC sitovan taskun (aminohappotähteet Thr79, Lys81 ja Arg83) (Fig. 1

B

). Näitä ennustettuja kontaktit ehdottaa useita suoria yhteyksiä NSC-124854 ja Pol-β, joka voi mahdollisesti jäljitellä vuorovaikutusta APC Pol-β. Koska nämä tiedot viittaavat siihen, että NSC-124854 yhdistettynä TMZ mahdollisena kemoterapeuttisen hoidon strategia paksusuolisyövän, suoritimme tutkimuksen määrittää teho ja rajoitukset tämän strategian.

Vaikka me määritetään spesifisyyden NSC- 124854 Pol-β aktiivisuus, kuten on esitetty kuviossa. 3 ja 4, se oli tutkittava vaikutus tämän yhdisteen kun täydellinen BER järjestelmän sn ja LP-BER on koottu. Nämä kokeet antavat biokemiallisia todisteita tehoa NSC-124854. Käytimme 63-mer

32P-leimattua U-DNA substraattina (Fig. 5

) SN-BER. Koska Fen1 vaaditaan LP-BER aktiivisuutta ja voivat stimuloida Pol-β toimintaa säikeen-siirtymä synteesi [50], [51], annoimme samaa strategiaa määrittämiseksi vaikutuksen NSC-124854 on LP-BER (Fig. 5

B

). Sen jälkeen APE1 viillon, odotettu 23-mer tuote syntyy (Fig. 5

C

; vertailla kaista 1 ja 2). Tulokset osoittivat tehokasta 1-nt sisällyttäminen (24-mer tuote) Pol-β, joka ligatoitiin DNA-ligaasi-I tuottaa 63-mer korjata tuotteen (Fig. 5

C

, kaista 5). Lisäämällä Fen1 stimuloitujen Pol-β toimintaa juosteen-siirtymä synteesi (Fig. 5

C

, kaista 4), joka myös liitettiin DNA-ligaasi-I tuottaa 63-mer korjata tuotteen (Fig. 5

C

, kaista 6). Lisääminen NSC-124854 esti Pol-β-suunnattu 1-nt lisäys (24-mer tuotteen puuttuessa Fen1) (Fig. 5

C

, vertaa kaista 3 7) sekä juoste tilavuus synteesi, kun läsnä on Fen1 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5

C

, vertaa kaista 4 kaistaa 8-11, vastaavasti). Lisäksi täydellinen korjaamiseen sn ja LP-BER sub-väyliä lisäämisen jälkeen DNA-ligaasi Olin myös estänyt NSC-124854 annoksesta riippuvalla tavalla (Kuva. 5

C

, vertaa kaistoja 12 -15 ja 16-19, vastaavasti).

Paneelit

A ja B

edustavat protokollia sn ja LP-BER, vastaavasti. Paneeli

C

näyttää Autoradiogrammissa kuvataan vaikutuksia vaihtelevien pitoisuuksien NSC-124854 on sn ja LP-BER toimintaa. Kaista 1 esittää 63-mer

32P-leimattua U-DNA: ta, kaista 2 on esitetty 23-mer jälkeen tuote APE1 viilto, kaista 3 on esitetty 1-nt muodon, Pol-β, kaista 4 osoittaa juosteen-siirtymä tuotteiden lisäämisen jälkeen Fen1. Kaistat 5 ja 6 esittävät 63-mer ligatoitu tuote sn ja LP-BER toimintaa, vastaavasti. Lane 8-19 esittää vaikutuksen NSC-124854 on tukos 1-nt (24-mer tuote) sisällyttäminen. Kaistat 8-11 kuvaavat NSC-124854 välittämää lohkon säikeen-siirtymä synteesi. Lisäksi kaistat 12-15 ja kaistat 16-19 osoittavat vaikutuksen NSC-124854 on tukos sn ja LP-BER toimintaansa annosriippuvaisesti. Data on esimerkkinä kolmesta eri kokeissa.

ilmentäminen villityypin APC aiheuttaa resistenssiä TMZ kohtelu, joka poisti hoito NSC-124854

Aiemmissa tutkimuksissa olemme ovat osoittaneet, että APC vuorovaikutuksessa Pol-β ja Fen1 ja estää sn ja LP-BER toimintaa [14], [45], [46], [52] – [54]. Olemme myös osoittaneet, että HCT-116-solut (ilmentävät villityypin APC) ovat herkempiä methylmethane naatti (MMS) ja TMZ hoitoja kuin HCT-116-APC (KD) soluja (tippuu alas APC pSiRNA) [36], [45], [46]. Tässä tutkimuksessa määritimme herkkyys TMZ läsnäollessa NSC-124854 useisiin koolonsyöpäsolulinjaa (HCT-116, HCT-116-APC (KD), HCT-116 + CH3, Caco-2, HT29, SW480, LoVo ja RKO) käyttäen klonogeeniset määritystä [18], [36], [46]. IC

50 tulokset osoittivat, että kaikki solulinjat testattiin osoitti suurempi herkkyys yhdistelmähoitoa NSC-124854 Temotsolomidilla (taulukko 1). IC

50 tiedot osoittivat, että NSC-124854 pystyi parantamaan kasvua estävää vaikutusta TMZ sekä HCT-116 ja HCT-116-APC (KD) solulinjoissa; Kuitenkin vaikutus oli suurempi HCT-116 kuin HCT-116-APC (KD) soluja (taulukko 1). Nämä tulokset vahvistavat aiempien havaintojen, että villityyppinen APC estämällä BER reitin herkkyys kasvaa DNA-alkylaying lääkkeitä [36], [46], [54]. Kuitenkin muut solulinjat, jotka ekspressoivat joko villityypin tai katkaistun APC, kuten RKO (310 kDa), SW480 (147 kDa), Caco-2 (150 kDa), LoVo (120 kDa) ja HT29 (110 ja 200 kDa) eivät osoittaneet suoraa korrelaatiota roolin APC herkkyydessä näiden lääkkeiden. Nämä tulokset viittaavat siihen, että geneettiset tekijät muut kuin mutaatioita

APC

geeni voi myös olla merkitystä määritettäessä herkkyyttä NSC-124854 ja TMZ eri koolonkarsinoomasoluissa. Yksi kriittiset parametrit tälle ero herkkyys ohjaa ero tilan MMR toimintaa, jota käsitellään jäljempänä.

Yhdistelmähoito NSC-124854 parantaa kasvua estävä temotsolomidin vaikutusta MMR puutteesta ja MMR-taitavia koolonsyöpäsoluihin

MMR proteiinit ovat osallisena kemoterapeuttisen vasteen koolonkarsinoomasoluissa, ja vika MMR proteiini (t) on läsnä perinnöllinen polypoottinen peräsuolen syöpä (HNPCC) [55]. Kaksi MMR proteiinien yleisimmin mutatoitunut ihmisen syövissä, MLH1 ja MSH2. MMR-puutteelliset solut ovat usein resistenttejä DNA-alkylointiaineita [55]. Voit selvittää roolin MMR yhdistelmässä vaikutus NSC-124854 Temotsolomidilla on kasvun estäminen, käytimme useita MMR-taitavia ja MMR-puutteellinen koolonsyöpäsolulinjaa. HCT-116, HCT-116-APC (KD), ja RKO solulinjat ovat puutteellisia MMR puutteen vuoksi ilmentymisen hMLH1 keskeinen entsyymi tämän reitin [56], kun taas LoVo solut ovat MMR puutosta puuttumisen vuoksi MSH2 ilme [57]. HCT-116 + CH 3 solu on tehty MMR-taitavia ottamalla käyttöön yhden kopion kromosomi 3 kätkeminen

hMLH1

geeni [58]. Temotsolomidi tiedetään aiheuttavan resistenssiä MMR-vajaiden solujen [26]. Aiemmissa tutkimuksissa on ehdotettu, että häiriöt ryhmäpoikkeusasetuksen reitin voi poistaa lääkeresistenssin aiheuttama MMR-puutos [59]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme määritettävä, onko hoitoa TMZ herkistää MMR-taitavia solujen suhteellisesti enemmän kuin MMR-vajaiden solujen, ja onko saarto BER reitin NSC-124854 voidaan poistaa TMZ vastustuskykyä MMR-vajaiden solujen. Kuten odotettua, MMR-taitavia solulinjoissa SW480 (IC

50 108,1 ± 3,2 uM), HCT-116 + CH 3 (IC

50 130,7 ± 4,3 uM) ja Caco-2 (IC

50 449,2 ± 42,4 uM), paitsi HT29 (IC

50 962,7 ± 62,7 pM) oli suurempi herkkyys TMZ verrattuna MMR puutteesta solulinjoja HCT-116 (IC

50 739,0 ± 25,9 pM), HCT-116- APC: n (KD), (IC

50 877,7 ± 49,2 uM), LoVo (IC

50 838,8 ± 53,1 pM) ja RKO (IC

50 1572,6 ± 89,9 uM) (taulukko 1). Lisäksi yhdistelmähoito NSC-124854 vähentää entisestään IC

50 temotsolomidi- kaksinkertaiseksi kaikissa seitsemässä solulinjat asemastaan ​​riippumatta MMR (taulukko 1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmähoito NSC-124854 Temotsolomidilla voisi olla hyödyllinen kemoterapeuttinen strategia hallinta sekä MMR-puutteellinen ja MMR-taitavia Kolorektaalituumorien.

Yhdistelmä NSC-124854 Temotsolomidilla voidaan käyttää mahdollisena kemoterapeuttisen lähestymistavan lisätä paksusuolen kasvaimen kasvua

in vivo

varmistamiseksi edelleen

in vitro

tulokset yhdistelmän tehoon hoidossa NSC-124854 ja TMZ jolla on hyvin tunnettu ja erityinen tavoite Pol-β vähentää annoksia TMZ joka poistaa haittavaikutuksia ja samanaikaisesti poistavat MMR-vastus, teimme

in vivo

ksenografti- jossa käytettiin vakava yhdistetty immuunivajaisiin ( SCID, puuttuvat toiminnalliset T- ja B-solut) hiiren, kuten on kuvattu kuviossa 6

. Meidän valinta naarashiirillä perustui tuoreessa tutkimuksessa kuvataan, että arvioitu uutta tapausta paksusuolen syöpä vuonna 2009 ennustetaan olevan korkeampi naisilla kuin miehillä [60]. Valitsimme annoksella 20 mg /kg kehon painoa TMZ varten näissä kokeissa, joka on 10- ja 4-kertaa pienempi kuin suurin siedetty annos hiirillä ja ihmisen, vastaavasti [61] – [65]. Myös 10 mg /painokilo NSC-124854 on yli 20-kertaa pienempi kuin sen IC

50 viljelmässä (taulukko 1). Vaikka emme ole määritelty suurin siedetty annos (MTD) NSC-124854 hiirillä, valittu pitoisuus on hyvin paljon turvallisempi alueella.

Panel

osoittaa kaavioesitys tutkimussuunnitelma. Paneeli

B

esittää muutosta kasvaimen tilavuuden klo 42

toinen koepäivää. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD neljästä kuuteen eläintä kussakin ryhmässä. *, Merkittävästi erilaiset kuin kontrolli;

†, merkittävästi erilainen kuin NSC-124854. P 0,05.

Nämä lääkkeet annettiin vatsaonteloon (

i.p..

) Viitenä peräkkäisenä päivänä. Kasvun inhibitio kasvaimia seurattiin jopa 42 päivää. Tulokset osoittivat kasvua tuumorin tilavuus kontrolliryhmässä ajassa riippuvalla tavalla kaikissa solulinjoissa,

eli

, HCT-116, HCT-116-APC: n (KD) ja HCT-116 + ch3. Kasvaimen määrä oli enintään 1120 mm

3 42 vuorokauden kuluessa ksenografti istutuksen, mikä on esitetty kuviossa 6

B

. Kasvain kasvu käsittelemättömän HCT-116-ksenografti oli suurempi kuin HCT-116-APC (KD) ja HCT-116 + CH3 soluja. Anti-kasvain vaikutus TMZ yksinään oli merkittävästi erilainen HCT-116 + CH 3-solut (MMR-taitavia) ja oli vähemmän ilmeinen HCT-116 ja HCT-116-APC (KD) solut (Fig. 6

B

). Hoidon NSC-124854: lla on myös vähensi kasvainten kasvua kaikki solulinjat, joka oli huomattavampi, kun se yhdistettiin temotsolomidia (Fig. 6

B

). Nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmähoito NSC-124854 parantaa terapeuttista tehoa temotsolomidin yhtä hyvin sekä MMR-puutteellinen ja MMR-asiantunteva ksenografti kasvainmuoto

in vivo

. Määrittää toleranssin lääkkeiden, me tallennettu kehon paino eläinten kahdesti viikossa, kunnes kokeen loppuun. Tulokset osoittivat samanlaisen vahvistuksen painon valvonta ja hoidetun ryhmän eläinten kanssa NSC-124854 ja temotsolomidin yksin tai yhdistelmänä (tuloksia ei ole esitetty). Siten näyttää siltä, ​​että 10 mg /kg kehon painoa NSC-124854 ja 20 mg /kg kehon painoa temotsolomidin olivat hyvin siedettyjä ja eivät aiheuta mitään ilmeistä haitallisia sivuvaikutuksia meidän koe-eläimillä.

keskustelu

Aiemmissa tutkimuksissa, Pol-β on käytetty kohteena kemoterapeuttinen lääkekehityksen [23], [34], mutta ei ulotu prekliinisessä tasolle. Teho Edellisen yhdisteiden on ollut vähemmän tehokkaita, koska ne vaativat hyvin korkeita pitoisuuksia halutun sytotoksisuus

in vitro

ja niitä ei testattu järjestelmällisesti

in vivo

. Lisäksi ne kohdistuivat pääasiassa estää SN-BER. Käyttö temotsolomidin ja pahanlaatuisten kasvainten hoidossa, muiden kuin glioblastooma ja melanooma on rajoitettu, erityisesti kolorektaalisen kasvainten, koska vähäisempi vaikutus kasvaimen kasvun estoa [39], [40]. Tässä tutkimuksessa käytimme rakennetta perustuva molekyyli lähestymistapa tunnistaa pieni molekyyli, joka voi jäljitellä vuorovaikutusta APC: Pol-β ja estää Pol-β-suunnattu BER, joita voidaan käyttää kemoterapeuttisena kohteena. Strategiamme molekyyli telakoinnin APC-sitova taskussa Pol-β oli tunnistaa pieni molekyyli, joka voi estää sekä sn ja LP-BER toimintaa ja osoittaa sytotoksisuutta sekä

in vitro

ja

vuonna vivo

määritykset pienemmillä pitoisuuksilla.

on huomattava, jos onnistuu, ehdotettu strategia on erittäin tehokas ehkäisyssä sekä MMR-taitavia ja MMR-puutteellisia kolorektaalisyövissä; Tämä on tärkeää, sillä MMR puutosta kolorektaalisyövissä aiheuttaa suuremman riskin vastustuskyvyn DNA-alkyloivat lääkkeet johtuen yli-ilmentyminen MGMT tai MMR-puutos [27] – [29]. Solut puutteellisia MGMT eivät pysty käsittelemään O

6MeG DNA-synteesin aikana, ja jos korjaamatta, G: C-G: T siirtyminen mutaatio tapahtuu [27]. G: t epäsuhta sitten korjataan MMR polku [28]. Jos O

6MeG ei korjata ennen uudelleen synteesin vaihe MMR, The tymiini on todennäköisesti sijoittaa uudelleen leesion vastakkaiseen. Uskotaan, että toistuva sykli turhaa MMR tulokset otetaan sukupolven kolmannen asteen vaurioita, todennäköisesti gapped DNA.