Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mahalaukun syöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti. Tunnistaakseen uusia syöpä biomarkkereita on tarpeen vähentää kuolleisuutta kehittämällä uusia seulontamäärityksiin ja varhaisen diagnoosin sekä uusi tavoite hoitoja. Tässä tutkimuksessa, teimme proteomiikka analyysi noncardia mahalaukun neoplasioihin yksilöiden Pohjois Brasiliasta. Proteiinit analysoitiin kaksiulotteisella elektroforeesilla ja massaspektrometrialla. Tunnistamiseksi differentiaalisesti ilmennettyjen proteiinien, käytimme tilastollisia testejä bootstrapping resampling hallita tyypin I virheen useita verrattuna analyyseihin. Havaitsimme 111 osallistuvien proteiinien mahasyövän. Laskennallinen analyysi paljasti useita proteiineja mukana energian tuotantoprosessien ja vahvisti Warburg vaikutus mahasyövässä. ENO1 ja HSPB1 ilmentyminen arvioitiin edelleen. ENO1 valittiin koska sen rooli aerobinen Glykolyysivaiheen jotka voivat myötävaikuttaa Warburg vaikutus. Vaikka havaitsimme kaksi sääteli täplät ENO1 että Proteomiikan analyysissä, keskimääräinen ilmaus ENO1 pienennettiin mahalaukun kasvaimet Western blot. Kuitenkin keskimääräinen ENO1 ilme näyttää lisäävän enemmän invasiivisia kasvaimia. Tämä puute korrelaatio proteomic ja western blot -analyysit voi johtua läsnäolosta muiden ENO1 paikkoja, jotka muodostavat hieman vähennetty ilmaus, mutta joilla on merkittävä vaikutus keskimääräisen proteiinin ilmentymisen. Vuonna neoplasioihin, HSPB1 indusoidaan solustressiä suojaa soluja apoptoosia vastaan. Esillä olevassa tutkimuksessa, HSPB1 esitetty kohonnut proteiinin ja mRNA: n ekspression osajoukko mahasyövän näytteitä. Ei kuitenkaan yhdistys välillä havaittiin HSPB1 ilmaisun ja kliinis ominaisuudet. Täällä tunnistimme useita mahdollisia biomarkkereita mahasyövän yksilöissä Pohjois Brasiliasta. Nämä biomarkkerit voivat olla hyödyllisiä arvioitaessa ennustetta ja ositusta hoito jos validoitu suurempi kliinisessä tutkimuksessa sarjaa.

Citation: Leal MF, Chung J, Calcagno DQ, Assumpção PP, Demachki S, da Silva IDCG, et al. (2012) Differential proteomiikan analyysi Noncardia mahasyövän yksilöiltä Pohjois Brasilia. PLoS ONE 7 (7): e42255. doi: 10,1371 /journal.pone.0042255

Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 09 helmikuu 2012; Hyväksytty: 3. heinäkuuta 2012 Julkaistu: 30 heinäkuu 2012

Copyright: © Leal et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; Dr. Chammas, Dr. Smith ja tri Burbano) ja Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; Dr. Leal, Dr. Chung ja Dr. Calcagno ) avustuksina ja apurahoja. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Yleinen suhteellinen 5 vuoden pysyvyys on tällä hetkellä alle 20% [2]. Pohjois Brasilia, GC on toiseksi yleisin kasvain miehillä ja kolmas naisilla [3]. Para State, Pohjois Brasilia, 5 vuoden pysyvyys on noin 9-10% [4].

Kaksi tärkeintä tuumorikohdat GC ovat cardia (proksimaalinen) ja noncardia (distaalinen). Cardia GC vaikuttaa viisi kertaa enemmän miehiä kuin naisia ​​[5]. Lisäksi ilmaantuvuus cardia GC ovat suhteellisen korkealla ammattiluokat [6]. Sen sijaan noncardia GC on uros-naaras suhde oli noin 02:01 ja esiintyvyys nousee progressiivisesti iän myötä, jonka huippu esiintyvyys välillä 50 ja 70 vuotta [7]. Riskitekijöitä noncardia GC sisältävät

Helicobacter pylori

infektio, alhainen sosioekonominen asema, tupakointi, saanti suolaista ja savustettua ruokaa, ja alhainen kulutus hedelmiä ja vihanneksia [8]. Viime vuosikymmeninä, ilmaantuvuuden noncardia GC on merkittävästi vähentynyt kehittyneillä alueilla maailmassa. Kuitenkin tämä alatyyppi muodostaa edelleenkin suurin osa GC tapauksista maailmanlaajuisesti ja on edelleen yleinen monissa maantieteellisillä alueilla, kuten Kiinassa, Japanissa, Itä-Euroopassa ja Keski /Etelä-Amerikka [8]. Ymmärrys GC biologian ja tunnistaminen syövän biomarkkereiden ovat tarpeen vähentää kuolleisuutta läpi syöpä seulontoihin riskiryhmien, lisätä varhainen diagnoosi, ja kehittää uusia kohde hoitoja.

GC, kuten muut neoplasioista , ajatellaan johtuvan yhdistelmästä ympäristötekijöiden ja kertymistä yleistynyt ja geneettisen ja epigeneettiset muutokset, jotka vaikuttavat onkogeenien, kasvainten synnyssä, ja ohjata perimän epävakaisuuden. Useita geenejä /proteiineja on ehdotettu GC biomarkkereita. Vuonna monivaiheinen mahasyövän, korjauksilla onkogeenien MYC, KRAS2, CTNNB1, erbB2: n, FGFR2, CCNE1 ja HGFR, sekä kasvaimen vaimentimet TP53, APC, RB, DCC, RUNX3 ja CDH1 on tähän mennessä raportoitu (katso arvostelua [9], [10]). Vaikka vapauttaminen näiden geenien /proteiinien on intensiivisesti tutkittu GC, täydellisempi profilointi on välttämätöntä ymmärtää syövän synnyn prosessia.

Viime vuosikymmenellä biotieteiden syvästi vaikuttanut kehitykseen ”omiikka” teknologiat (genomiikka, transkriptomiikka, proteomiikka ja metabolomiikka) ja jotka pyrkivät kuvaamaan yleiskuva biologisten järjestelmien ja ymmärrystä elävän solun [11]. Koska proteiinit ovat viime kädessä vastuussa pahanlaatuinen fenotyyppi, proteomiikka analyysit saattavat heijastaa toiminnallista tilaa syöpäsolujen, ja siksi on selviä etuja genomiikan ja transkriptomiikan tutkimuksissa [12]. Lisäksi proteiinit ovat tällä hetkellä tärkein tavoite molekyylejä syöpälääkkeiden [13].

Jotkut proteomic perustuvat tutkimukset aiemmin tehtävä ihmisten ensisijainen mahalaukun kasvaimet (katso katsaus [14]). Kuitenkin suurin osa näistä tutkimuksista analysoidaan kasvainten yksilöiden Aasian väestöstä ja siten eivät välttämättä heijasta erillisiä biologisista ja kliinisistä käyttäytymistä keskuudessa GC prosesseja. GC on merkitty globaali vaihtelut esiintyvyys, etiologia, luonnollisen, ja hallinta [15]. Vaikka noin 90% vatsan kasvaimet ovat adenokarsinoomat [7], useat tekijät johtavat biologisesti ja kliinisesti GC osajoukot: edeltävä tuumorigeenisia olosuhteet, kuten

Helicobacter pylori

gastriitti ja muiden kroonisten mahalaukun patologioiden; sijainti primaarikasvaimen (mahansuuta ja noncardia alue); alatyyppiä adenokarsinooma (hajanainen, suoliston, tai sekoitettuna [16]); etnisyys viheliäisten väestöstä (eriasteisesti herkkyys ja aggressiivisuus kasvaimet); ja ennakoiva biomarkkereiden (erbB2) [15]. Näin ollen termi ”mahalaukun syöpä” käytetään kuvaamaan useita kasvaimiin, jotka vaikuttavat vatsan alueella.

Tässä tutkimuksessa vertasimme ilmentymisen profiili noncardia GC ja vastaavan ei-neoplastisia mahalaukun kudosta yksilöitä Pohjois Brasilia (kaikki

H. pylori

infektio), ja tunnistaneet proteiini allekirjoitus, joka on ilmennetty eri ryhmien välillä, jonka kaksiulotteinen elektroforeesi (2-DE) menetelmällä. Seuloa proteiinit liittyvät etenemistä mahasyövän, myös verrattuna ei-neoplastisen mahalaukun kudoksia GC näytteitä yksilöiden ja ilman imusolmukemetastaaseja. Valinnassa ilmentyvät eri proteiineja, käytimme tilastollista paramet- reista testi bootstrapping rs. Olemme sitoutuneet kattavan laskennallisen analyysin kudoksen proteomic tietojen löytää reittejä ja verkkojen mukana mahalaukun onkogeneesiin ja etenemistä. Mahdollisia yhdistysten kesken enolaasi 1 (ENO1) ja lämmön shock 27 kDa proteiini 1 (HSPB1) geenin ja proteiinin ilmentyminen, ja kliinis ominaisuudet arvioitiin myös yksilöillä Pohjois Brasiliasta. Nämä kaksi proteiineja on raportoitu usein kuin vapautettiin molekyylien edellisessä GC proteomic tutkimukset muulla väestöllä. Kuitenkin niitä ei koskaan arvioitiin Brasilian väestöstä.

Methods

Kliiniset näytteet

Proteiiniprofilointi analyysiä, noncardia GC näytteet ja vastaavat ei-neoplastisia mahalaukun kudoksesta (kaukainen sijainti primaarituumorin; kontrolliryhmän) kerättiin 15 potilasta. Muita pariksi näytteitä otettiin mukaan western blot ja reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR) analyysit. Dissected kudosnäytteitä oli snap-jäädytettiin nestetypessä sen jälkeen, kun kirurginen leikkelyn ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Kaikki mahalaukun näytteet saatiin kirurgisesti João de Barros Barreto yliopistollisen sairaalan (HUJBB) Parán valtiossa, Pohjois-Brasiliassa. Vuonna Pará valtiossa, ihmisen väestö koostuu Etnisten risteyttämällä kolme alkuperä ryhmää: Euroopan (lähinnä edustaa Portugali), afrikkalaiset, ja Amerindians [17]. Kaikilla potilailla oli negatiivinen historiaa altistumisen joko kemoterapian tai sädehoidon ennen leikkausta ja ei ollut muita yhteistyössä esiintyminen diagnosoitu syöpiä. Kirjallinen suostumus hyväksynnällä eettisen komitean HUJBB saatiin kaikille potilaille ennen näytteen keräämistä.

Kaikki näytteet luokitellaan Laurén [16] ja kasvaimia lavastettuja käyttäen standardia kriteerit TNM lavastus [18] . Läsnäolo

H. pylori

, I-luokan karsinogeeniksi, maha- näytteissä havaittiin PCR-määritys varten ureaasin geenin [19] ja sen virulenssitekijä vakuoleja sytotoksiini (CagA) [20], käyttämällä DNA puhdistettiin samanaikaisesti proteiinien ja mRNA. Kussakin PCR kokeessa, positiivinen ja negatiivinen kontrolli otettiin mukaan.

pienentämiseksi näyte heterogeenisyys, 2-DE-analyysi mukana vain noncardia GC ja mahalaukun näytteiden esittäminen

H. pylori

infektio CagA +, joka näyttää olevan yleisiä väestöstä (julkaisematon data). Taulukko 1 esittää kliinis ominaisuuksia käytettyjen näytteiden proteiinien profilointia varten.

Protein, mRNA: n ja DNA: n puhdistus

Yhteensä proteiinin, mRNA: n, ja DNA: ta samanaikaisesti eristettiin mahalaukun kudosnäytteistä käyttämällä AllPrep DNA /RNA /proteiini-Kit (Qiagen, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Proteiini Pelletti liuotettiin puskuriin, joka sisälsi 7 M ureaa, 2 M tioureaa, 4% CHAPS, 50 mM DTT: tä, 1% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma) ja 0,5% kutakin fosfataasilla Inhibitor Cocktail 1 ja 2 (Sigma-Aldrich, USA ). Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä (Sigma-Aldrich, USA). RNA-pitoisuus ja laatu määritettiin käyttämällä NanoDrop spektrofotometrillä (Kisker, Saksa) ja 1% agaroosigeeleillä. Näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

2-DE proteomiikka profilointi

Proteiinit erotettiin 2-DE [21]. Proteiini näytteet (300 ug) ladattiin IPG nauhat (pH 3-10 L, 18 cm, GE Healthcare, USA). Liuskat rehydratoitiin 12 tunnin ajan 50 V, isoelektrinen fokusointi suoritettiin käyttäen seuraavaa ohjelmaa: 200 V 2 tuntia, 300 V 30 min, 500 V 30 min, 1000 V 1 h, 8000 V 1,5 tuntia ja 80000 Vh. Kohdennettua liuskat pelkistettiin 50 mM DTT: tä ja alkyloidaan 100 mM jodiasetamidia puskurissa, joka sisälsi 6 M ureaa, 50 mM Tris-HCI (pH 8,8), 30% glyserolia, 2% SDS: ää, ja jäljittää bromifenolisineä. Sekundaariseen elektroforeesi, käsiteltyä liuskat lastattiin päällä 12,5% SDS-PAGE (200 mm) yhdessä PeppermintStick ™ fosfoproteiinista Molekyylipaino Standards (Invitrogen, USA). Kaikissa kokeissa, GC ja pariksi kontrollinäytteiden suoritettiin samanaikaisesti. Kaikki 2-DE-geeleissä tehtiin kahtena kappaleena.

proteiinit 2-DE-geelit visualisoitiin käyttäen SYPRO® Ruby Gel Stain (Invitrogen, USA) noudattaen valmistajan suosituksia. Kuvia geelit värjättiin SYPRO® Ruby skannattiin 582 nm: n virityksellä ja 610 nm 30 bandpass emissiosuodatinta on Typhoon Trio Imager (GE Healthcare, USA). Sillä paikalla poisto ja myöhemmät massaspektrometria analyysi, geelit visualisoitiin Coomassie Brilliant Blue G250 värjäystä.

Kuva-analyysi ja spot tunnistaminen

Gel kuvat analysoitiin kanssa PDQuest Advanced ohjelmistoversion 8.0 (Bio -Rad, USA), mukaisesti valmistajan protokollaa. Automaattinen paikalla tunnistus kussakin geeli varmistettiin silmämääräisesti. Joitakin kohtia käytettiin maamerkkejä yhdenmukaistaa kuvia. Paikalla intensiteetit normalisoitiin tasoittaa koko tiheydet kunkin geelikuva käyttämällä Local regressiomallin. Normalisoitu proteiini paikalla volyymit proteomeja verrattiin joukossa koeryhmän välillä.

Loimme kaksi analyysien tunnistaa ilmentyvät eri paikkoja: (1) vertailu proteiinin ilmentymisen välillä kasvain ja sovitettu hallinnan käyttämällä pariksi T-testi; (2) vertailu proteiinin ilmentymisen keskuudessa vertailunäytteet GC ilman imusolmukkeiden etäpesäke, ja GC kanssa imusolmukkeiden etäpesäke käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysi itsenäiseen näytteiden (yksisuuntainen ANOVA). Lisäksi post-hoc vertailut tehtiin Tukeyn testi normaalijakautuneita muuttujia ja Games-Howell varten jakaumat jossa yhtäläiset varianssit ei voitu olettaa. Parametrinen testit suoritettiin analyysejä bootstrapping, joka on rs menetelmällä. Käynnistysprosessi menetelmä [22] säädetään kriittinen säädetty p-arvo, joka ohjaa tyypin I virhe (väärä positiivinen), vähentää yli-fit bias ja hyväksyminen tarkkuus arvioita. Käynnistysprosessi tekniikka voi saada tarkempi ja vähemmän konservatiivinen familywise virheprosentti (FWER) kuin standardimenetelmin (esim Bonferronin säätö) varten multicomparison analyysit [23]. Suoritimme kaikki analyysit tunnistaa eri tavalla ilmaistuna proteiinien perustuu 1000 bootstrap näytteistä. Kaikissa analyyseissä, luottamusväli (CI) oli 95% ja p-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

proteiinin tunnistaminen massaspektrometrialla, me suodattaa pois merkittävän paikkoja esittämällä kertainen muutos alle 1,5-kertaiseksi tiheys kahden koeryhmän välillä. Nämä paikat havaittiin alle 30% näytteistä ryhmässä [24].

Massaspektrometria-analyysi

täplät kohteisiin manuaalisesti leikattiin myöhempää massaspektrometriaa analyysi [25]. Lisäksi tyhjä geeli palasia spot-vapaa alue, ja viite täplät (tunnetaan merkki proteiineja 2-DE) leikattiin, toimi säätimet trypsiinihajotuksen, ja ajettiin rinnakkain proteiinitäplien kiinnostava. Jälkeen värinpoisto ja pesun jälkeen geeliä hiukkaset saatettiin geelissä pilkkomalla 20 ng /ul trypsiini Gold (massaspekrometria Grade, Promega Corporation, USA) 25 mM ammoniumbikarbonaattia 37 ° C: ssa yön yli. Digestoidut peptidit otettiin talteen, laitettiin Speed-vac sentrifugin kuiviin ja rekonstituoitiin 15 ui 0,1% muurahaishappoa vedessä. Peptidi seos analysoitiin käyttäen C18 ultra-suorituskyvyn nestekromatografialla (UPLC, NanoAcquity, Waters, USA), joka on kytketty ESI-kvadrupoli TOF massaspektrometrillä (ESI-QTOF Ultima, Waters /Micromass, USA). Gradientti oli 0-80% asetonitriiliä 0,1% muurahaishappoa yli 20 tai 10 min. Kaikki MS /MS-spektrit etsittiin vastaan ​​IPIhuman 379 tietokannassa MASCOT hakukoneen (Matrix Science), hyväksyi yhden jäi tryptisiin pilkkominen ja karbamidometyyli (C) kiinteinä muutos ja hapetus (M) muuttuja muutoksia. Peptidi toleranssi oli ± 0,1 Da ja MS /MS toleranssi oli ± 0,1 Da. Korkein luottamus tunnistaminen oli tilastollisesti merkitsevä haun tulokset ja proteiinia tunnisteiden perustuivat vähintään 2 peptidin osumia.

bioinformatiikan analyysi

Tunnistetut proteiinit (alkaen vain paikkoja, missä yhden proteiinin tunnistettiin) olivat luokiteltu ryhmiin subsellulaarisen kompartmentalisaatio biologisen prosessin, ja molekyyli toiminta tietojen perusteella selityksin Gene ontologia (GO) konsortion tietokannat (https://www.geneontology.org/). Tämä luokitus analyysi suoritettiin käyttäen DAVID toiminnallinen käsinkirjoitustyökalun (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [26]. Sijainti kromosomissa tunnistettu proteiinien käyttökerroista BioMart tiedon louhinta työkalu suoraan Ensembl tietokannasta (https://www.ensembl.org/biomart/martview).

PANTHER-järjestelmä (www.pantherdb.org/) , MetaCore ohjelmistot (GeneGo Inc.), ja kekseliäisyyttä Pathways Analysis 9.0 (IPA, kekseliäisyyttä Systems Inc.) käytettiin koulutusjakson, verkko, ja toiminta-analyysejä erilaisesti ilmaisi proteiineja. Kaikki ilmoitetut reittejä ja biologiset prosessit on jaoteltu niiden GO rikastamiseen pisteet antamat ohjelmistopaketteja kuten -Log (p-arvot) ja False Discovery Rate (FDR) on 0,05%.

valvomatta klustereiden analyysi suoritettiin käyttäen Pearsonin korrelaatio normalisoitu (z-score) arvot kaikista merkittävistä ilmentyvät eri proteiineja (yksilöllinen tunnus by spot) 30 näytteen analyysissä asetettu. Lämpö kartat luotiin käyttäen Heatmap rakentaja (https://ashleylab.stanford.edu/tools_scripts.html) järjestää proteiinin ilmentymisen profiilit ja näytteiden perusteella niiden samankaltaisuus. Kukin värillinen soluun kaksiulotteinen kartta edustaa proteiinin ilmentymisen arvo näytteen. Yhä positiivisia arvoja osoitetaan punaiset yhä tehokkaampia, ja yhä negatiiviset arvot vihreät yhä tehokkaampia. Dendrogrammissa päällä lämmön kartan osoittavat klusterointi näytteiden ja puolella klusteroinnin proteiinin ilmentymisen.

ENO1 ja HSPB1 ilmaisun

Proteiinia ja mRNA käytetään ENO1 ja HSPB1 ilmaisu analyysit puhdistettiin samanaikaisesti proteiinin käytetyn näytteen 2-DE-geeleissä.

western blot-analyysi, alennetaan proteiinia (20 ug ENO1 ja 30 ug HSBP1) kustakin näytteestä erotettiin 12,5% homogeeninen SDS sivun geeli ja elektro-blotattiin PVDF-kalvolle (Hybond-P, GE Healthcare, USA). PVDF-membraani blokattiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 0,1% Tween 20, 5% vähärasvaista maitoa ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa vastaavan ensisijaisen vasta-aineita anti-ENO1 (sc-100812, 1:3000, Santa Cruz Biotechnology, USA ), anti-HSBP1 (sc-13132, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA), ja anti-ACTB (Ac-74, 1:3000, Sigma-Aldrich, USA). Perusteellisen pesemisen jälkeen peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-ainetta inkuboitiin 1 h huoneen lämpötilassa. Immunoreaktiivisia kaistoja visualisoitiin käyttämällä Western blotting Luminol reagenssia ja kuvat hankittiin käyttämällä ImageQuant 350 digitaalinen kuva-järjestelmä (GE Healthcare, Ruotsi). ACTB käytettiin lastaus vertailukontrollina.

RT-qPCR analyysi, komplementaarinen DNA syntetisoitiin käyttäen High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Puola) mukaan valmistajan protokollaa. Kaikkien reaaliaikainen RT-qPCR määritykset suoritettiin kolmena kappaleena sekä kohdegeenin (

ENO1

: Hs00361415_m1;

HSPB1

: Hs03044127_g1, Applied Biosystems, USA) ja sisäisen valvonnan (

ACTB

: Hs03023943_g1;

GAPDH

: Hs99999905_m1, Applied Biosystems, USA) käyttäen alukkeita ja Taqman. Suhteellinen kvantitointi (RQ) geenin ilmentymisen laskettiin Pfaffl menetelmällä [27]. Kontrollinäyte nimettiin kalibroijana jokaisen pariksi kasvain.

Tilastollinen analyysi ENO1 ja HSBP1 ekspressiotietojen

Ensin arvioitiin normaalijakaumaa kaikki tiedot käyttämällä Shapiro-Wilk normaaliuden testi määrittää myöhempää käyttöä sopivien testien tilastollista vertailua.

ENO1

mRNA-tasoja ja HSPB1 ilmaisun tietoja ei ollut normaalisti jakautunut ja transformoitiin (z-pisteet) analysoitavaksi. Parilliset T-koe suoritettiin vertaamaan keskiarvoa ENO1 ja HSPB1 proteiinin ilmentymiseen ja vertailuryhmän välillä GC näytteitä. Liitot välinen kliinis parametrien ja keskiarvo ENO1 ja HSPB1 ilmaisun arvioitiin käyttäen T-testi riippumaton näytteitä. Chi-square test (χ

2) käytettiin myös arvioimaan suhdetta ekspressiotietojen ja kliinis tekijöistä. Korrelaatio ENO1 ja HSPB1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen (Western blot ja 2-DE-analyysit) analysoitiin Spearman testi. Kaikissa analyyseissä, CI oli 95% ja p-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset ja keskustelu

proteomiikan analyysi mahalaukun kudoksesta

Analysoimme proteomiin 15 noncardia GC näytettä – 6 ilman imusolmuke etäpesäke ja 9 kanssa imusolmuke etäpesäke – ja 15 sovitettu kontrollisilkkipaperia (taulukko 1). Käyttäen 2-DE kanssa pl erilaisia ​​3,0-10 ja molekyylien välillä 10 kDa ja 120 kDa, noin 1000 paikkoja havaittiin selvästi geeli- ja myöhemmin analysoitiin ero proteiinin ilmentymisen. Kuvassa 1 esitetään edustavat geeli kuvia täplien ja niiden proteiinipitoisuus ID. Jotkin proteiinit heijastuu useita paikkoja todennäköisesti johtuu posttranslational muutos johtaa siirtymiä 2-DE geeli. Tiedot proteiinin tunnisteiden, teoreettinen pl-arvo, molekyylipaino, proteiinin pisteet, sekvenssi kattavuus, määrä Hyväksytty peptidien, samoin kuin keskimääräinen suhteellinen muutos ja p-arvot on esitetty lisätaulukot S1 ja S2. Nämä taulukot osoittavat myös, jotka proteiinit on aiemmin havaittu GC proteomic tutkimuksissa.

Proteiinit ratkaistiin yli pl alueella 3-10, jonka jälkeen 12,5% SDS-PAGE ja värjättiin SYPRO® Ruby. Tunnistetut proteiineja, jotka osoittivat merkittävästi muuttunut ilmentyminen mahasyövän on merkitty kunkin proteiinin tunnukset.

Vaikka jotkut proteomic perustuvat tutkimukset aiemmin tehtävä ihmisten ensisijainen mahalaukun kasvaimet, tietojemme mukaan vain kolme tutkimusta keskittyvät noncardia GC [28], [29], [30]. Useimmat GC proteomic tutkimuksissa tunnistettujen ilmentyvät eri proteiineja perustuu ainoastaan ​​kertainen muutos kahden olosuhteissa [24], [28], [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Muut aikaisemmat GC proteomic tutkimuksissa tilastollisia analyysejä verrata proteiinin ilmentymisen ryhmien välillä [29], [36], [37], [38], [39], mutta ilman valvontaan tyypin I (väärä positiivinen) virhe. On mielenkiintoista huomata, että olemme verrattuna proteiinin profiloinnin kasvainten ja ei-neoplastisia näytteitä parametriset testit, joissa bootstrap differentiaalisesti ekspressoidun proteiinin tunnistaminen. Uudelleennäytteistämisen menetelmiä, joita käytetään yleisesti microarray tutkimuksissa [40], on käytetty tekemään p-arvon oikaisut useita testausmenetelmiä, jotka ohjaavat FWER ja otettava huomioon riippuvuus välisellä testisuureen [41]. Tavoitteena on luoda monta sarjaa alkulatauksen näytteiden resampling kanssa vaihdot alkuperäisestä data [22].

vertailu kasvain ja valvonnan näytteitä pariksi T-testi ja käyttö bootstrap paljasti 133 paikkoja, jotka oli merkittävästi muuttunut yli 1,5 kertainen muutos. Jälkeen Mascot tietokantahaku käyttämällä saatua MS tiedot, 97% täplät tunnistettiin. Näistä paikoista, 18% havaittiin useampia kuin yksi proteiinia. Analyysit täplien ainutlaatuisen tunnistettuja proteiineja osoitti, että 33 täplät 26 proteiinit olivat säädelty ja 72 56 proteiinit säädellä vähentävästi GC näytteissä verrattuna ei-kasvainkudoksessa.

vertailu kasvain ja kontrollinäytteiden yksisuuntaisella ANOVA paljasti 143 differentiaalisesti säänneltyä täplät ja 98% näistä tunnistettiin. Havaitsimme, että 94 paikkoja olivat yleisiä pariksi T-testi ja ANOVA analyysit. Mitä tulee täplien ainutlaatuinen yksilöity proteiini, havaitsimme, että 54-proteiinit alassäädetty ja 9 säädellään ylöspäin kasvain ilman imusolmuke etäpesäke suhteessa kontrolliin näytteitä. Havaitsimme myös, että 68-proteiinit alassäädetty ja 15 säädellään ylöspäin kasvaimista imusolmuke etäpesäke verrattuna kontrolliin näytteitä. Havaitsimme 38 proteiinit ilmentyvät eri välillä ei-neoplastisia näytteitä ja kasvaimia riippumaton imusolmuke tila.

Neljätoista proteiinit esitellään merkittäviä muutoksia välillä kasvaimia ja ilman imusolmuke etäpesäke (kuva S1). Ilmentyminen NNMT jatkuvasti lisääntynyt samalla ATP5H ja UQCRFS1 osoitti jatkuva väheneminen ei-neoplasia kasvaimien syntyyn kanssa imusolmuke etäpesäke. NNMT oli aiemmin raportoitu koholla ilmaisua GC verrattuna ei-neoplastisia näytteitä [24], [42]. Pelkistetty ilmaus ATP5H ja UQCRFS1 saattaa johtua alhaisempi riippuvuus oksidatiivisen fosforylaation energiantuotantoon, koska Warburg vaikutus pitkälle edenneessä (ks bioinformatiikka tuloksia alla).

toiminnallinen luokittelu ilmentyvät eri proteiinien GC

GeneGo biomarkkerit analyysi paljasti, että suurin osa tunnistettu proteiinien ennustettu merkkiaineita ruoansulatuskanavan sairauksien, mukaan lukien GC (kuvio 2A, edustaa kasvaimen versus nontumor vertailu). Tämä tukee nykyisten tietojen ja osoittaa, että havainnot tulisi tutkia tarkemmin tunnistaa tai vahvistaa kliinisesti merkittäviä tavoitteita diagnoosia ja /tai ennustetta GC.

A) rikastaminen GeneGo taudin käyttäen säädellään eri tavalla proteiinien välillä neoplastiset ja sovitettu ei-neoplastisia näytteitä; B) Cellular osastoja, C) Biologiset prosessit, D) Molecular toiminnot ja E) kromosomaalinen sijainti kaikkien tunnistettujen proteiinien.

Tunnistetut proteiinit ryhmiteltiin eri luokkiin perustuen toiminnallisen tiedon käytettävissä. Useimmat tunnistetuista proteiineista ovat solunsisäisiä organelle proteiineja ja ne olivat osa membraaniin sitoutuneen organelleja, erityisesti mitokondrioissa (kuvio 2B). Nämä proteiinit ovat osallisena pääasiassa solun aineenvaihduntaan ja hapetus vähentäminen (kuvio 2C). Vertailu kasvainten imusolmukemetastaaseja ja kontrollinäytteiden paljasti kuljetus ja perustamalla paikkaan rikastetun biologiset prosessit. Tätä ei havaittu vertailussa kasvainten ilman imusolmukemetastaaseja ja kontrollinäytteitä. Oksidoreduktaasi aktiivisuus seurasi koentsyymi sitova aktiivisuus oli suurin molekyylipaino toiminnot liittyvien proteiinien mahasyövän (kuvio 2D).

Mitä kromosomaalinen sijainti, useimmat proteiinit geenien koodaamien sijaitsee kromosomissa 1 (11 %), kromosomin 19 (8%), ja kromosomi 11 (7%) (kuvio 2E). Monimutkaiset karyotyyppejä mahalaukun kasvaimet ensisijaisesti ottaa nämä kromosomit, samoin kuin kromosomien 3, 6, 7, 8, 13 ja 17 (katso tarkastelu [9]). Gain ja menetys kromosomissa alueilla 1, 19 ja 11 olivat aiemmin raportoineet meidän tutkimusryhmä GC näytteissä [43], [44]. Niinpä nämä kromosomit voivat sisältää useita lokusten annostus herkkien geenien.

Verkot analyysi ilmentyvät eri proteiinien GC

Olemme sitoutuneet kattavan laskennallisen analyysin kudoksen proteomic tietojen löytää reittejä ja verkkojen mukana mahalaukun onkogeneesiin ja etenemistä. Taulukossa 2 esitetään pääasiallinen kanoninen reittejä käyttäen Ingenuity Pathway Analysis (IPA) tietokantaan. Pääasiallinen kanoninen pääsyväylistä mahasyövän prosessi oli mukana energia-aineenvaihduntaan reittejä kuten mitokondrioiden, pyruvaatti aineenvaihdunta, oksidatiivinen fosforylaatio, sitraatti ympyrä, ja glykolyysi /glukoneogeneesin. Esillä oleva tutkimus osoitti suuren määrän ero ilmaistaan ​​aineenvaihdunnan proteiineja, joita ei ole raportoitu aikaisemmin noncardia mahasyövän (taulukko S1 ja S2).

proteomiikka-analyysi paljasti, että monissa entsyymeissä ja sitraatti syklin ( Krebs sykli) ja oksidatiivisen fosforylaation oli säädellä vähentävästi GC soluissa. Nämä tiedot osoittavat mahdollisia muutoksia mitokondrioissa toiminta ja siirtyminen energiantuotannossa olevassa GC soluissa, mikä viittaa Warburg vaikutus [45]. Lisääntyvät kasvainsolut ohjelmoida niiden metaboliset reitit energian ja siten tukea nopeampaa solunjakautumisen stressaavissa metabolisen olosuhteissa, jotka ovat tyypillisiä epänormaalit kasvaimen microenvironment [46]. Jopa normaaleissa happipitoisuudet, kasvainsolut siirtyä ATP sukupolven kautta oksidatiivinen fosforylaatio ATP sukupolven kautta Glykolyysivaiheen, muuttaa useimmat saapuva glukoosia laktaatti [45]. On ehdotettu, että erittäin aktiivinen glykolyysi tuottaa biosynteettisiä etu kasvainsoluja. Glykolyysin tarjoaa riittävästi aineenvaihdunnan välituotteita välttämällä hapettamalla glukoosia, joka on välttämätön synteesi makromolekyylien, kuten lipidejä, proteiineja ja nukleiinihappoja, solunjakautumisen aikana [47], [48], [49].

laktaattidehydrogenaasin (LDH) ja pyruvaattidehydrogenaasin (PDH) kompleksit ohjaavat aineenvaihduntaa palorypälehappoa, muuntamiseen joko maitohappo tai asetyyli-CoA syöttämällä sitten sitraatti aikana. Alas-säätely alayksikköä LDH ja PDH kompleksit ehdottaa vähenemiseen pyruvaatti flux osaksi sitraatti sykli ja alenemisella oksidatiivisen fosforylaation ja hapen kulutusta, vahvistamalla glykolyyttisessä fenotyyppi. Muut alassäädetty proteiineja, kuten LiPF ja GOT1, korosta aktivointi muihin metaboliareitteihin kanssa heikentyvän sitraatin kierron ja oksidatiivisen fosforylaation. Useat aineenvaihdunnan muutoksia, jotka havaitsimme noncardia GC myös kuvata Cai

et al.

[36] on cardia GC proteomic tutkimuksessa, mikä viittaa siihen, että nämä aineenvaihdunnan muutokset eivät liity erityisesti GC alatyypin perustuu kasvaimen sijainnin.

Vuoteen PANTHER, kaikkein merkittävästi rikastettu polku on p53-reitin havaittu verrattaessa kasvain ja kontrollinäytteiden. Lisäksi sen funktio DNA-vaurioita vastaus ja apoptoosin, p53 on myös säätelijä solujen aineenvaihduntaa [50]. p53 edistää oksidatiivinen fosforylaatio [51], ja estää myös glykolyyttisen reitin jopa-ekspressiota sääteleviä TP53 aiheuttaman glykolyysin ja apoptoosin säädin (Tigar) [52]. Siksi menetys p53 myötävaikuttaa hankintaan glykolyyttisen fenotyypin. Menetys

TP53

lokus on yleinen löydös GC yksilöiden Pohjois Brasiliasta [53]. Lisäksi 20%: n GC analysoitiin 2-DE esitetään p53 immunoreaktiivisuus (tuloksia ei ole esitetty). P53 immunoreaktiivisuus riippuu yleensä kertyminen mutatoitunut proteiineja solussa, mikä johtaa pidemmän puoliintumisaika [54].

top verkostot molekyylivuorovaikutusten ja toiminnot tunnistettiin myös käyttämällä IPA ohjelmistoa (kuva S2 , taulukko 3, Subnetwork päässä MetaCoreTM analyysiä ei ole esitetty). Osoitimme useita eri säänneltyjen proteiinien mukana solun kokoonpano ja organisaatio ja tulehduksia. Solu kokoonpano ja organisaatio oli pääasiallisesti rikastetun verkko havaittu verrattaessa valvonnan ja kasvaimista imusolmuke etäpesäke.