Krooninen sairaus

tiivistelmä

yli-ilmentyminen TOP2A liittyy systeemisen etenemisen eturauhassyöpäpotilailla, ja korkeampi TOP2A löydettiin hormoni kestävät tapauksissa. Selvittämiseksi mekanismi, jonka korkea TOP2A edistää kasvaimen etenemistä muodostimme TOP2A yli-ilmentävät eturauhassyövän solulinjoissa. Osoitamme, että TOP2A edistää kasvaimen aggressiivisuus indusoimalla kromosomi uudelleenjärjestelyt geenien, jotka edistävät entistä invasiivisia fenotyyppi. Antiandrogeeni hoito yksinään oli tehoton tappaa TOP2A yli-ilmentävät solut, koska aktivoinnin androgeenireseptorin verkkoon. TOP2A myrkyt tappoi kasvainsolut tehokkaammin aikaisin etenemisen tietysti taas myöhemmissä vaiheissa ne antoivat enemmän hyötyä yhdistettynä antiandrogeeninen hoito. Mekanistisesti, huomaamme, että TOP2A parantaa androgeenin signaloinnin helpottamalla transkription androgeeniresponsiivinen geenien, mikä edistää kasvainsolujen kasvua. Nämä tutkimukset paljastivat suhde TOP2A ja androgeenireseptorin signalointireitin, joka edistää eturauhassyövän etenemistä ja antaa herkkyys hoitoja.

Citation: Schaefer-Klein JL, Murphy SJ, Johnson SH, Vasmatzis G, Kovtun IV (2015 ) Topoisomeraasi 2 Alpha Tekee yhteistyötä androgeenireseptorin myötävaikuttaa Eturauhassyöpä Progression. PLoS ONE 10 (11): e0142327. doi: 10,1371 /journal.pone.0142327

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 19 lokakuu 2015; Julkaistu: 11 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Schaefer-Klein et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Waterman biomarkkereiden Discovery apurahan ja Center yksilöllisten lääketieteen Mayo Clinic. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

DNA topoisomeraasi 2 alfa (TOP2A) on olennainen tumaentsyymi, tarvitaan resoluutio topologinen stressi liittyvät DNA: n replikaatiota. TOP2A esittelee ohimenevä kaksinkertainen katkeamisen (DSB) on DNA: n ATP-riippuvainen tavalla, jotta muutoksia DNA rakenteeseen ja poistaa yli-käämin [1,2]. TOP2A toiminto on ratkaisevan tärkeää monissa biologisissa prosesseissa, kuten replikaatio, transkriptio, DNA: n korjaukseen ja kromosomin rakenne ylläpito. Se ilmaistaan ​​korkeilla tasoilla jakamalla soluissa sen taso tiedetään säänneltävä solusyklin ja sitä käytetään usein proliferatiivista merkki [3,4]. Poikkeavuuksia TOP2A proteiinin liittyy kromosomi epävakautta [5]. TOP2A uskotaan olevan tärkeä rooli decatenation Checkpoint mitoosin aikana, mekanismi vastaa oikein kromosomi eriytymistä [6-8]. Korkea TOP2A indikaattorina enemmän aggressiivista käyttäytymistä ja pitkälle raportoitiin useita syöpiä [9,10]. Kohdistaminen TOP2A ja myöhemmän soluproliferaation, on käytetty terapeuttisen lähestymistavan rutiininomaisesti käsitellä joitakin pahanlaatuisia kasvaimia [11]. Lääkkeet, jotka kuuluvat luokkaan TOP2A myrkyt muodostavat suurimman osan hyväksytty kliiniseen käyttöön aineita. Etoposide ja doksorubisiinin tavoite molemmat TOP2 entsyymin isomuotoja, A ja B, häiritsemällä niiden DNA pilkkominen /ligaatiolla sykli, joka indusoi DNA DSB: t ja laukaista solukuoleman [12,13]. Toinen luokka TOP2 kohdistaminen yhdisteiden, TOP2 katalyyttinen estäjiä, eivät indusoi muodostumista proteiini-kytketyt DNA DSB mutta toimivat kuin kilpailuun estäjiä TOP2 ATPaasiaktiivisuus [12]. Tehoa TOP2A myrkkyjä uskotaan riippuu tasosta TOP2A proteiini [5] ja sen entsymaattinen aktiivisuus [14]

. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että kohonneet TOP2A osuus suurempi herkkyys solujen TOP2A myrkkyjä etoposidin ja doksorubisiini [15,16]. Aktiivisuus TOP2A entsyymin säätelee translaation jälkeisiä modifikaatioita [14-22]. Fosforylaatio TOP2A tähteiden katalyyttisen domeenin sisällä vaikuttaa sen entsymaattinen aktiivisuus [17, 21]; ja mutaatiot joitakin näistä alueista ilmoitettiin osuus vastus kasvainsolujen TOP2A myrkkyjen [14]. Vaikka tasot TOP2A proteiinia ja sen aktiivisuuden katsotaan suuria tukijoita herkkyys kasvainsolujen TOP2A myrkkyjä, TOP2A on myös osoitettu liittyvän vastustuskyvyn kemoterapiaa, sekä

in vitro

ja

in vivo

mekanismien kautta vaihtumisen solunsisäisten jakelun ja apoptoosin estäminen [23,24]. Korkea proteiinin DLX4 oli osoitettu stimuloivan korjaus DNA: n DSB aiheuttama doksorubisiinille tekee huumeiden tehoton [25].

Vastustuskyky TOP2A myrkkyjä, havaittiin kliinisesti tulenkestävät kasvaimissa [26], ja kehittäminen toissijaisten syöpien, kuten myelooinen leukemia, seurauksena

de novo

uudelleenjärjestelyjä [12,27], ovat merkittäviä rajoituksia anti-TOP2A hoitoa. Lisätutkimuksia täysin ymmärtää tekijöitä ja mekanismien kasvaimen vaste TOP2A estävä huumeita tarvitaan.

TOP2A usein yli-ilmennetään aggressiivinen eturauhassyöpä (PCA). Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet positiivista korrelaatiota ilmentymisen tason TOP2A ja Gleason (GS) [28,29]. Karsinoomat kanssa korkein ilmentymä TOP2A olivat huonosti eriytetty [28]. Kohonneita TOP2A todettiin myös hormoni-resistenttejä PCa GS 8-10 [29]. Ryhmämme on havaittu, että yli-ilmentyminen TOP2A oli merkitsevästi yhteydessä suurentunut riski systeemisen etenemisen PCA potilailla [30]. TOP2A proteiini taso oli vahvin ennustaja tuloksen yhteydessä

ERG

ilmaisun [31].

TMPRSS2-ERG

fuusio, yleisin uudelleenjärjestelyn havaittu PCa vaikuttaa jopa 60%: ssa tapauksista [32,33]. Mekanismi taustalla sukupolvi

ERG

fuusio on tutkittu [34,35]. Haffner et ai. ovat osoittaneet, että androgeenireseptorin (AR) ja TOP2B ovat yhteistyössä rekrytoidaan säätelyelementit androgeeniresponsiivinen geenien transkription ja laukaista muodostumista DNA: n DSB. Nämä tauot uskotaan olevan erittäin recombinogenic ja kun korjataan tulos tuotannossa

de novo

-fuusiogeenit, kuten

TMPRSS2-ERG

[35]. Samoin TOP2B rekrytoimista muu steroidi reseptoreihin: estrogeenireseptori kohdegeenien kun estrogeeni signalointi [36,37]. Vaikka TOP2A ja B proteiineilla on samanlainen solutoiminnoille ratkaisemisessa DNA overwinding tuomalla DSB, ei tutkimuksessa raportoitu yhteistyötä TOP2A kanssa transkription koneiden analogisella tavalla TOP2B. Vaikka raportoitiin korrelaatio korkea TOP2A ja huono tulos syövän, takana oleva tarkka mekanismi aggressiivisemman fenotyypin liittyvän TOP2A ei ole tiedossa. TOP2 myrkkyjä, kuten mitoksantroni ja doksorubisiini, toisinaan määrätty hoitoon kastraatio vastustuskykyisten metastasoitunut PCa osoitettiin tarjota vain lievittävän etuja [38]. Toisaalta, standardi apuaine androgeenien puute hoitoa oli tehokas vain potilaiden ryhmässä, joiden kasvaimet ilmaisivat korkeaa TOP2A ja ovat positiivisia

ERG

fuusio [30,31]. On yhä epäselvää, ovatko nämä potilaat voivat hyötyä hoidon TOP2A estäjiä käytettäessä liitännäishoitona. Tässä tutkimuksessa kehitimme solumallin tutkia roolia TOP2A kasvaimen etenemiseen ja arvioida sen vaikutusta solun herkkyyttä hormonaalista ja kemoterapiaa. Osoitamme, että TOP2A ajaa PCa kohti invasiivisia fenotyyppi aiheuttamalla DNA uudelleenjärjestelyjä. Tarjoamme myös näyttöä mekanismin aikaan liittyvät herkkyys eturauhasen syöpäsolujen TOP2A myrkkyjä. Osoitamme, että kehittyneempien eturauhaskasvainsoluissa, kestävät androgeeniablaatio, voidaan eliminoivat tehokkaammin yhdistämällä hoidon antiandrogeeninen ja doksorubisiini. TOP2A häiritsee anti-androgeenihoito kasvaa herkkyys AR signaloinnin helpottamalla sen transkription aktiivisuus androgeeniresponsiivisen elementtejä.

Tulokset

Generation eturauhassyövän solulinjoissa, jotka yliekspressoivat TOP2A

Oletimme, että korkea TOP2A, jotka ylittävät normaalisti läsnä pyöräily soluissa, aiheuttaa pysyviä sukupolven DNA: n DSB joka myöhemmin johtaa genomista uudelleenjärjestelyä liittyy muodostumiseen aggressiivisemman fenotyypin (S1A kuvio). Tutkia osuus TOP2A eturauhasen syövän synnyn ja tutkia etuja terapeuttinen kohdistaminen tämän proteiinin PCA potilaille ryhdyimme kehittämään PCa solulinjoja vakaasti yli-ilmentävät TOP2A. Vaikka TOP2A ilmentyy erittäin syöpäsoluissa

in vivo

, yrittää ektooppisesti ilmaista tätä proteiinia

in vitro

ovat hävinneet, koska samanaikainen apoptoosin induktion [39].

In vivo

aikana syövän etenemisen, solut ovat kehittäneet mekanismeja kiertää ohjelmoidun solukuoleman liittyy korkea TOP2A. Esimerkiksi, CKS2 proteiinia, koholla PCa, eläinmalleissa ja PCa solulinjojen osoitettiin suojaavan soluja apoptoosin [40]. Siten voittaa indusoiman apoptoosin korkeita TOP2A, ensin luotu PCa LNCaP vakaa klooneja yliekspressoivat CKS2 (S1B kuvio), ja kloonit, joilla on alentunut tasoon kaspaasi-3 (S1C kuvio), merkittävä efektori kaspaasi apoptoottisen reitin [41] . Expression kaspaasi-3 oli ilmoitettu kadonneeksi tai pienentää PCA [42]. Katalyyttisesti aktiivinen muotoja kaspaasi-3, silloin kun se transfektoidaan soluihin, jotka on erityisesti esitetty inhiboivan solukuolemaa laukaisee DNA-vaurioita vastaus [43]. Kiertämisyritykset TOP2A aiheuttaman apoptoosin yli-ilmentävät CKS2 epäonnistui pelastamaan mitään TOP2A yli-ilmentävät solulinjat. Kolme kloonia, joilla on alentunut taso kaspaasi-3 valittiin, kun integraatio TOP2A cDNA: n ja käytettiin seuraavissa kokeissa. T14 klooni osoitti korkeimman TOP2A proteiinia ja sitä käytettiin TOP2A korkea ekspressöija, kun T25 ja T33 oli endogeenistä tasoa TOP2A ja käytettiin negatiivisina kontrolleina (S1D kuvio).

Korkeammalla TOP2A kasvaa invasiivisuus kasvainsolujen

Yhteenvetona tapahtuvat muutokset

in vivo

upon PCa etenemistä, me jatkuvasti viljellään klooneja tutkimaan, miten tasolle TOP2A vaikuttanut solutoiminnoille. Kloonit talteen eri kohtia ja analysoidaan. Koska ilmaus TOP2A tiedetään korreloivan leviämisen [4] ensin tutkittu leviämisen hinnat. Ei ole merkittävää eroa leviämisen hinnat välillä havaittiin TOP2A korkeampi ilmentäjänä klooni (T14) ja alempi ilmentäjänä klooneja (T33 ja T25) (kuvio 1A). Proliferaationopeudet ei muuttunut merkittävästi kasvaessa kulkua joko kloonin viittaa siihen, että kohonneet TOP2A eivät vaikuta kasvaimen kasvua

sinänsä

kulttuuriin. Korkeammalla TOP2A ei kuitenkaan vaikuta liikkuvuuteen ja invasiivisuus LNCaP klooneja. Vanhempien LNCaP, TOP2A korkean ja matalan ekspressoivat varhaisen ja myöhäisen kohtia verrattiin Boyden kammiossa määrityksissä. Sekä varhainen (P23) ja myöhäinen (P46) kohdat TOP2A yli-ilmentävät T14 klooni osoitti suurempaa liikkeen kalvon läpi kuin niiden sovitettu kontrolli klooneista tai vanhempien LNCaP-soluja (kuvio 1 B). Vastaavasti soluja korkea TOP2A osoitti enemmän invasiivisia ominaisuuksia kuin heidän kollegansa kanssa endogeenisen proteiinin taso. Morfologia vaeltaneet solut läpi päällystetyn kalvon vaihteli T14 ja T33 klooneja. TOP2A yli-ilmentävät T14 soluja levittää epäsäännöllisten kiukkuinen muodot ja pidempi prosessit muistuttavat mesenkymaalisten fenotyyppi, ottaa huomioon, että T33 solut näyttivät ohuemmiksi ja pyöreämpiä, lyhyet prosesseja (kuvio 1 C).

A) Leviämisen klooneja vakaasti yli-ilmentävät TOP2A (T14) ja sovitettu kontrolli solujen endogeenisen tason TOP2A (T25 ja T33). Lisääntyminen määritettiin 96 tunnin kuluttua solujen pinnoitus. B) motiliteettia TOP2A klooneja eri passage ja vanhempien LNCaP määritetään käyttämällä Boyden kammion määritystä. C) Kuvia solujen invasiivisen fenotyyppi 72 tunnin leviämisen. P tarkoittaa siirrostusjärjestysluku; OD, au mitataan optinen tiheys mielivaltaisina yksikköinä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD, joka perustuu 3 riippumattoman kokeen. * P 0,00001, ja ** p 0,0001, n = 3.

herkkyys solujen yli-ilmentävät TOP2A hoitoihin muutoksiin pitkäaikaisessa leviämisen

Luja eturauhaskasvaimissa

in vivo

tiedetään kehittävän resistenssin androgeenien puute hoidon ajan [44]. Ei kohdennettu hoito olemassa näille potilaille. Me siis tutkittu kuinka herkkyys syntyy TOP2A yli-ilmentävät kloonit antiandrogeenit, TOP2A myrkyt ja kahden lääkkeiden muuttunut ajan. Varhaisessa kohtia korkea TOP2A-ekspressöija T14 solut olivat paljon herkempiä doksorubisiinia kuin niiden vastine T25-soluissa (kuvio 2A). Ero katosi korkeammilla kohtia kuin soluja kasvatettiin viljelmässä, jossa T14 soluja tulossa vastustuskykyisiä anti-TOP2A käsittely (kuvio 2B). Samanlainen suuntaus havaittiin hoitojen antiandrogeeni Casodex (kuvio 2A ja 2B, alapaneelit). Oli johdonmukaista merkittävä ero herkkyydessä casodex välillä T14 ja T25 klooneja varhaisen kohtia. Vaikka pieni (noin 10-15%) valitun annoksina, tämä ero ei havaittu korkeampi kohtia, samanlainen kuvio herkkyyden esitetty doksorubisiinin (kuvio 2B, yläpaneeli). Erot vastauksena eivät liittyneet muutoksia tason TOP2A proteiinin näiden solujen lisääntymisen jälkeen viljelmässä säilytti korkeampi TOP2A (kuvio 2C). Siten nämä tiedot osoittavat, että solut alussa kanavien yli-ilmentämään TOP2A ovat herkempiä hoitoja, sekä anti-TOP2A huumeiden ja antiandrogeenit. Tuore tutkimus on osoittanut, että DLX4, usein yli-ilmennetään rinta- ja munasarjasyövän syöpiä, stimuloi korjaus DNA: n DSB aiheuttama TOP2A myrkkyjä, mikä vähentää solujen herkkyyttä hoitoon [25]. Siksi verrattuna tasoon DLX4 normaalissa eturauhasessa epiteelisoluissa ja syöpäsolujen syöpää eri GS (S2 Kuva). Microarray ilmaisun analyysi [30] osoitti, ettei induktio DLX4 PCA, mikä osoittaa, että DLX4 ei olla osasyynä vastustamista TOP2A myrkkyjä PCA.

A) Survival of TOP2A kloonien varhaisen passage vastauksena doksorubisiinihoidon (yläpaneeli) ja Casodex (alapaneeli). B) Survival of TOP2A klooneja myöhään kulku vastauksena doksorubisiinihoidon (yläpaneeli) ja Casodex (alapaneeli). C) Western blot, joka osoittaa tasoa TOP2A vuonna syntyy vakaa klooneja aikaisin ja myöhään kohtia. Havaitseminen ydinaseiden proteiini TBP käytettiin tarkistaa yhtä suuri kuormitus. D) kvantifiointi TOP2A ilmaisun perusteella Western blot C. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD, joka perustuu 3 riippumattoman kokeen. P-arvot ovat kuten, ei riittävä ei ole merkittävä.

Seuraavaksi testasimme, onko solu tappaminen olisi tehokkaampi, jos näiden kahden lääkkeitä levitettiin. Vuoden ensimmäiset hoito vakioannosta doksorubisiinin ja kasvavia pitoisuuksia casodex osoittanut mitään hyötyä tappaa soluja korkeatasoinen TOP2A verrattuna endogeeninen kontrolli (kuvio 3A ja 3B, ylälevyissä). Itse asiassa alussa passage T14 klooni osoitti enemmän vastusta tätä rykmentin verrattuna T25 (kuvio 3A, yläpaneeli). Sitä vastoin hoito vakioannosta 50 uM casodex, joiden soveltaminen yksin johti 90% solujen eloonjääminen (kuvio 2), osoitti tehokkaamman tappamisen myöhään passage solujen yli-ilmentävät TOP2A verrattuna aikaisin kulku ja alhaisen ilmentävät ohjaus T33 klooni ( kuvio 3B, alapaneeli). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmähoito kohdistaminen AR ja TOP2A in TOP2A erittäin ilmentävät solut voivat olla hyödyllisiä kehittynyt kasvaimia.

A) Survival of TOP2A kloonien varhaisen kulku vastauksena yhdistelmähoitoon: top paneelin vakioannosta doksorubisiinin ja kasvavia pitoisuuksia Casodex; pohjapaneeli-vakioannosta casodex ja kasvavien pitoisuuksien doksorubisiinin. B) Survival of TOP2A klooneja myöhään kulku vastauksena yhdistelmähoitoon, huumeet ja pitoisuudet ovat niin on. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD, joka perustuu 3 riippumattoman kokeen. P-arvot ovat kuten, ei riittävä ei ole merkittävä.

perehtyä mahdollista vuorovaikutusta TOP2A toimien ja androgeenireseptorin signalointiverkolla seuraavan kerran verrattuna tasoja AR kloonien yli-ilmentävät TOP2A niille klooneissa endogeenisen tason TOP2A. Soluja kasvatettiin median kanssa kuin riisuttu seerumia sisältävä perustaso androgeenien ilman ylimääräisiä täydentämistä. Yhteenlaskettu AR proteiinin tasot verrattiin välillä T14 ja T25 klooneja varhaisen ja myöhäisen kohtia (kuvio 4A). T14-soluja sekä kanavien osoitti merkittävästi korkeammat tasot AR kuin vastaava ohjaus T25-soluissa (kohonnut 3 ja 8-kertaiseksi vastaavasti) mikä viittaa osallistuminen TOP2A induktioon AR ilmentymisen transkription tasolla. Tasot TOP2A proteiinin pysyi korkeampi T14-soluissa kullakin kulku otetaan kokeessa (kuvio 2C, S3C ja S3E kuvassa). Sen varmistamiseksi, että TOP2A proteiini oli funktionaalinen määritys käyttäen TOP2A spesifisiä DNA-templaatti tehtiin. Entsymaattinen aktiivisuus mitattiin proteiinin uute saadaan T14-soluissa oli korkeampi kuin T25-solujen (S3 kuvassa). Kun säädetty määrä kokonaisproteiinista, se oli 6 kertaa suurempi (S3B kuvio), sopusoinnussa korkeampi TOP2A in T14 verrattuna T25 soluihin. Yhteensä entsyymiaktiivisuus säilyi koholla, sopusoinnussa korkeampi TOP2A proteiinia, myöhemmissä kohdissa T14 soluja (S3D kuvio), joka vahvistaa, että TOP2A pysyi toiminnallinen, ja ei ollut mutaatioita aktiivisessa käyttöön kun eteneminen Tämän kloonin.

Western blot, joka osoittaa kokonaistaso AR TOP2A klooneja eri kohtia (kuten), yläpaneelissa. Kvantifiointi AR ilmaisun normalisoida beta aktiini tasolle, alapaneelin. B) Western blot, joka osoittaa induktio AR tason (top) kun hoito TOP2A clones.with 5 nM R1881. Vastaavat kvantifiointi TOP2A tasot normalisoitiin TBP latauskontrollina näkyy (alhaalla); nt on ei-käsitelty, t on käsitelty; solujakojen ovat samat kuin. C) Kaaviokuva promoottori-alue

KLK3

(PSA) geenin käytetään CHIP määrityksessä. DtFw ja DtRv kuvaavat kantoja eteenpäin ja taaksepäin alukkeiden vastaavasti distaalinen promoottorialue; PxFw ja PxRv-asemista eteen- ja taaksepäin-alukkeita proksimaalisen promoottorin. D) CHIP analyysi TOP2A kloonien stimuloidaan 5 nM R1881 3 tuntia. Rikastuminen AR ja TOP2A klo distaalisessa ja proksimaalisessa promoottorialueet KLK3 geenin (ja keskijohdon paneelit) ja niiden poissaolo koodausalue GAPDH-geenin (alapaneeli) näkyvät. M on DNA koko markkeri, HG-on ihmisen genomista DNA: ta käytettiin positiivisena kontrollina PCR-monistus, EL1 ja EL2 ovat peräkkäisiä eluutio fraktiot (puskureita on kuvattu menetelmät).

TOP2A moduloi AR signalointi

Korkeammalla AR havaittiin TOP2A yliekspressoivat soluissa (kuvio 4A). Selvittämiseksi mekanismi, jolla TOP2A voivat edistää transkription säätelyyn, käsittelimme solut synteettisellä androgeenireseptorin R1881 ja verrattiin ydin- tason AR. AR siirtyy tumaan, ligandin sitoutumisen transkription säätelemiseksi reagoivien geenien [45]. Havaitsimme merkittävästi suuremman ydinvoiman AR vastauksena androgeenistimulaation vuonna TOP2A yliekspressoivat T14 soluja varhaisen (s.24) kulku verrattuna T25-soluissa (kuvio 4B). Taso ydin- AR näissä soluissa lisääntyi 5 kertaa käsittelyn jälkeen. Late passage (s.55) solut yli-ilmentävät TOP2A todettiin hiukan kohonnut AR, ei niin dramaattinen kuin niiden esiasteet at passage 24. Aktivoitu AR tunnistaa ja sitoutuu palindromisiin androgeenireseptorin vaste-elementin (ARE) sekvenssit proksimaalisessa geenit aiheuttaa niiden transkriptio [45,46]. Tuloksemme viittaavat siihen, että TOP2A toimii AR aktivoimaan transkription reagoivien geenien. Virallisesti testata tämän teimme kromatiinin immunosaostus käyttäen aluetta, joka vastaa proksimaalisen ja distaalisen ovat promoottori eturauhasen-antigeenin (PSA) (KLK3 geeni, kuvio 4C), joka on hyvin tunnettu transkription kohteena AR [46]. Vasta-aineita, jotta TOP2A ja AR, pystyivät kaapata DNA-fragmentteja, jotka sisältävät ovat KLK3 promoottori käsittelyn jälkeen R1881 (kuvio 4D). Ei ollut eroa sitoutumiseen TOP2A tai AR Ares välillä T14 ja T25 klooneja. Sitoutumiseen tiettyyn koska ei rekrytointi joko TOP2A tai AR riippumattomille sekvenssin havaittiin (koodaava alue GAPDH-geenin, käytettiin kontrollina. Tämä tulos osoittaa, että samoin kuin sen homologin TOP2B, TOP2A on rekrytoidaan steroidi säätelyelementtejä stimuloida transkriptiota ja ehdottaa synergistinen toimia androgeenin signalointi eturauhaskasvainsoluissa.

TOP2A edistää tuotannon DNA uudelleenjärjestelyjä PCA soluissa

Suuret kromosomi uudelleenjärjestelyt havainnoidaan yleisesti PCa [47,48] ja uskotaan pelata rooli kasvaimen aloittamista ja etenemistä. Osoitamme tässä, että muoti samanlainen TOP2B, TOP2A rekrytoimista ARE stimuloimaan transkriptiota. Olipa toistoa tätä prosessia johtaa asteittainen kertyminen DNA uudelleenjärjestelyjä ei tutkittu. tämän testaamiseksi mate pari breakpoint sekvensointi suoritettiin [49,50] eri kohtiin korkean ja matalan ilmentävien TOP2A klooneja. Vanhempien LNCaP satama useita genomisen muutoksia, jotka sisältävät toiselle siirtäminen, ja kopioluvun muutoksia (S4A kuvio). Solut valitaan jälkeen integrointi vektoreita, jotka kantavat siRNA että kaspaasi-3 ja cDNA TOP2A verrokkeja suurempi määrä kromosomaalisten muutosten (S4b kuvio). Tämä ei ole yllättävää, koska käsittelyt todennäköisesti johti solujen valinnan, joilla on alentunut kyky apoptoosiin. T25 klooneja, jotka ilmentävät endogeenista taso TOP2A ei osoittanut muutosta määrä genomista-järjestelyn leviämisen (kuviot 5A ja 6A). Kokonaismäärä muutoksia T25-soluissa eri kohtia oli sama kuin esiastesolujen kätkeminen alennettu kaspaasi-3 (kuvio 6A). Sen sijaan T14 soluja yliekspressoivien TOP2A osoitti progressiivista uudelleenjärjestelyjä yhä passage (kuviot 5B ja 6B). TOP2A itse geenin vaikutti myös vuonna T14 myöhässä passage (taulukko 1). Kuitenkin häiriintyminen yhden alleelin ei johda merkittäviin lasku proteiinin ilmentymistä, mikä viittaa siihen, että eksogeeninen integroitu kopio geenistä pääasiassa ajo ilme.

A) Late kulkua T25 klooni, joka ilmensi endogeenisen tason TOP2A . B) Myöhäinen kulkua kloonin T14 yli-ilmentävät TOP2A. Harmaa pisteitä (lukemaa) osoittaa taajuus jakelu lukee 30KB ikkunat ja raja-arvot kaikille kromosomeja (numerot on merkitty). X-akseli ulottuu pituus kromosomin, Y-akseli esittää useita lukee jokaisen ikkunan. Ikkuna laskee näkyvät mukaan ennusteen mukaan CNV algoritmilla. Harmaat pisteet ovat normaaleja, punaisia ​​pisteitä vastaavat poistot ja siniset kohdat osoittavat voittoja. Viivat yhdistävät bioinformatically tunnistaa raja-arvoihin. Leveydet linjat korreloi määrä liittyvän mate-pari lukee. Väri yhdyslinjat ilmaisee polariteetin liittyi kromosomi. Sisäiseen kromosomi tapahtumien punainen osoittaa eteenpäin niin kappaletta, vihreä tarkoittaa inversio yhden kumppanin ja sininen näyttää inversio molemmille. Väliselle kromosomaalisen tapahtumia, punainen yhdistää p-puolelta palan suurempi kromosomin q-puolella pala pienempi kromosomin eteenpäin, vihreä yhdistää q-puolen palan suurempi kromosomin p-puolella pala pienempi kromosomin eteenpäin suuntaan, sininen yhdistää p-puolelta palan suurempi kromosomin p-puolella pala pienempi kromosomin vastakkaiseen suuntaan ja magenta yhdistää q-puolen palan suurempi kromosomin q-puolella pala pienempi kromosomi päinvastaisessa suunnassa. Musta osoittaa tasapainoinen translokaatioita. Blue arrowheads osoittavat valitun DNA uudelleenjärjestelyjä hankittuihin upon lisääntymistä (puuttuu vastaavien solujen aikaisempien kulkua.

A) kokonaismäärä breakpoints läsnä T25-soluissa eri kohtia. LNCaP /Casp on johdannainen LNCaP solulinjan pysyvästi ilmentäviä siRNA kaataa kaspaasi 3. B) DNA muutoksiin saama TOP2A yli-ilmentävät T14 soluja upon lisääntymistä. Luvut esittävät muutoksia havaittiin lisäksi, jotka läsnä hallita T25 klooni. C) Kaaviokuva osoittaa ehdotettu roolia TOP2A eturauhasen syövän etenemisessä ja kestävyys androgeeniablaatio hoidon.

Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että genominen aiheuttamien muutosten korkeita TOP2A johtaa hankitaan enemmän aggressiivinen fenotyyppiä ja saattavat myös myötävaikuttaa vastustuskyvyn kehittymistä ainoana lääkkeenä hoitoja.

keskustelu

Vaikka eturauhasen parannuskeinoja suurin osa GS 7-10 potilailla systeemisen etenemisen ja kuoleman leikkauksen jälkeen on edelleen suurempi yli 15%. Osaa näistä potilaalla ilmenee levitetään tauti [44] ja jotkut, kun alkuperäisen parannus androgeenideprivaatio hoidon edistymistä kastraatio vastustuskykyisiä tilaan [51]. Huolimatta edistysaskeleita potilaiden hoitoon kastraatio resistenttejä [52, 53], saavuttaminen pitkän aikavälin selviytymisen edelleen ongelma. Ymmärtäminen mekanismeista kestävyys ablaatio on kriittinen. Yksi ehdotetuista mekanismeista on kehittäminen lisääntynyt herkkyys alhainen androgeeneinä ablaation jälkeen johtuen AR vahvistus tai nousua sen ilmaisun [54,55]. Tämän mukaisesti Tutkimuksemme osoitti, että TOP2A, usein yli-ilmentynyt PCa tapauksissa on suuri riski etenemisen, ohjaa ekspressiota AR. Tuloksemme viittaavat siihen, että androgeeniablaatio hoito saattaa olla vähemmän tehokas, kun läsnä on korkea TOP2A proteiinin (kuvio 6C). Edelleen Hoitokokeissa tukevat käsitystä, että terapia yhdistelmää antiandrogeeni ja TOP2A myrkkyä tarjoaa vahvemman etua. Samalla osoitetaan, että kohdistaminen TOP2A myrkkyä yksin on tehokasta vain aiemmissa vaiheissa, ennen TOP2A perustuva DNA on tapahtunut muutoksia (kuvio 6C). Suostumuksella Näiden havaintojen hiljattain käyttäen erilaista mallia PCA on tunnistettu TOP2A kuin uusiutumista erityinen kasvaimen antigeeni [56]. Hiiri eturauhaskasvaimissa altistuessaan optimaalisia immunoterapia kehittynyt merkittävästi erilainen fenotyyppi, joka osoittaa korkea ilmaus TOP2A ja vastaus anti-TOP2A hoitoa. Tässä vaiheessa minimaalinen jäljellä tauti, TOP2A-positiivisten solujen näkyy kantasolun kaltainen fenotyyppi ja kohonneen invasiivisuus [56], joka on ominaisuus, ominaisuus TOP2A yli-ilmentäviä soluja mallimme. Toisessa tutkimuksessa käyttämällä syngeneeisissä hiirimallissa spontaanin PCa etäpesäkkeiden [57] kirjoittajat osoittivat, että korkea TOP2A korreloivat korkea metyylitransferaasi Ezh2, ja kohdentamiseen molemmat proteiinit yhdistettynä johti tehokkaaseen solukuolemaan.

Lisäksi taso ja toimivuus TOP2A, soluvastetta sen estäjien on myös raportoitu riippuvainen aktiivisuus muita tekijöitä. DLX4, joka on homeobox-geenin, yli-ilmentynyt useissa syövissä [58], on osoitettu vähentävän herkkyyttä kasvainsolujen TOP2A myrkkyjä stimuloimalla korjaus DSB ei-homologisella lopussa liittymällä [25]. Tuloksemme osoittavat, että tämä ei ole PCA, koska taso DLX4 ei kasva kasvaimen, mutta pysyy samanlaisena kuin normaaleissa epiteelisoluissa (S2 kuvassa).

Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että on aikaikkunan aikana Eturauhassyövän eteneminen jossa anti-TOP2A hoito saattaa olla erityisen tehokasta. Olipa TOP2A myrkyt /estäjien tai immunoterapia on oltava hoidon valintaan klinikalla on vielä määrittämättä.

Lopuksi osoitamme tässä, että TOP2A yhteistyössä AR aiheuttavan kohdegeenien transkription (kuvio 6C). Taso AR itsessään on huomattavasti korkeampi TOP2A yli-ilmentävät solut stimulaation jälkeen androgeeniagonistia. Samanlaisia ​​sen isoformin TOP2B, TOP2A on co-rekrytoitiin ARE kanssa AR, ja todennäköisesti transkription aktivoimiseksi. Aiemmin TOP2B myös osoitettu aiheuttavan DNA: n DSB on säätelyalueita estrogeenin ja AR-kohdegeenien [35,36]. Vaikka tutkimuksessamme emme käsitellä tätä mahdollisuutta suoraan, emme tarkkailla kasvu useissa DNA uudelleenjärjestelyjä TOP2A yli-ilmentävät solut upon lisääntymistä. Ovatko ne ovat seurausta viallisen korjaus-DNA: n DSB: iden, joka esiintyy transkription säätelyelementtejä tai seurauksena yli TOP2A funktion replikaation aikana vielä tutkitaan tarkemmin. Olemme tunnistaneet muutamia jäsensi geenejä, jotka ovat mielestämme kuin ”TOP2A riippuvainen” (taulukko 1). Joka perustuu ennen liittyvien havaintojen funktio näiden geenien, muutokset ominaisuuksien TOP2A yli-ilmentäviä soluja ja niiden herkkyys hoitoja voidaan katsoa muutokset näissä DNA-alueet. Esimerkiksi Emi1 (FBOX5) (taulukko 1) vaikutti T14 soluissa viimeisin passage on tunnettu säätelijä mitoosi etenemisen [59,60]. Se on liitetty määritettäessä herkkyyttä doksorubisiinille [61]. Tässä tutkimuksessa ehtyminen Emi1 johti kasvaa herkkyyttä, sopusoinnussa tämän, meidän tiedot viittaavat siihen, että päällekkäisyyksiä havaittiin T14 soluissa myöhemmin kulku voi selittää laskua herkkyys doksorubisiinille (kuvio 2B). Häiriöt PARD3B geenin osoitettu ohjaamaan tiiviiden liitosten [62], voisi olla syynä kasvuun motiliteetin ja hyökkäys valmiuksia T14 soluja. Väheneminen ilmentyminen tai menetykseen Tango, homologin Tango6, hajotettiin TOP2A yli-ilmentävät solut, oli myös aiemmin osoitettu lisäävän maahanmuuttoa [63]. Funktio Tango6 ei ole tutkittu vielä, onko sen menetys voi olla samanlainen vaikutus PCa solujen ominaisuuksia vaatii lisätutkimuksia. Tulevaisuuden tutkimuksia tarvitaan tarkentaa tarkkaa toiminnallista osuutta hankitun genomista muuttuu.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja hoitoja

Cell viljelmiä pidettiin seuraavat ATCC suosituksia. LNCaP (ATCC) ja LNCaP pysyviä johdannaisia ​​kasvatettiin RPMI 1640 (Gibco, Life Technologies), kulttuurin täydennetty 100 yksiköllä /ml penisilliiniä, 1 mg /ml streptomysiiniä ja 10% FBS: ää. Androgen hoitoon kokeissa soluja viljeltiin samassa väliaineessa, mutta korvaamalla 10% FBS: ää 5% hiilellä suodatettiin FBS (One Shot, Life Technologies), 48 tunnin ajan ennen kuin lisättiin 5 nM R1881 (metribolone, RM10, TSZCHEM), ja sen jälkeen inkuboitiin vielä 48 tunnin ajan. Solut kerättiin kaapimalla ja proteiini eristettiin (Nuclear Extract Kit, Active motiivi) ja Western blot-analyysi.