Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä etäpesäke on monimutkainen prosessi, jossa solu-vuorovaikutuksiin välittämiä solun adheesiomolekyylien. Tässä tutkimuksessa määritetään tartuntalujuuden välillä endoteelisolujen yksikerroksisen ja kasvainsolujen eri metastasoituneen potentiaalit käyttämällä atomivoimamikroskopialla. Osoitamme, että repeämä voimat reseptori-ligandi joukkovelkakirjojen kasvaa sulkeutuminen nopeutta ja välillä 20 ja 70 pN. On osoitettu, että kaikkein invasiivisia solulinjoissa (T24, J82) muodostavat voimakkaimman sidoksia endoteelisolujen. Käyttäen ICAM-1 alustojen ja monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen ICAM-1, me osoittavat, että ICAM-1 toimii keskeinen reseptori endoteelisoluissa, ja että sen vuorovaikutus ligandien kanssa, ilmaistaan ​​kasvaimen solut korreloivat repeämä voimat saadaan eniten kohdunkaulan syöpä soluja (T24, J82). Saat vähemmän invasiivisia syöpäsolujen (RT112), endoteelin ICAM-1 ei näytä mitään merkitystä adheesioprosessia. Lisäksi yksityiskohtainen analyysi jakelun repeämä voimien viittaa siihen, että ICAM-1 on vuorovaikutuksessa ensisijaisesti yhdellä ligandin T24 syöpäsolujen ja kaksi ligandien J82 syöpäsoluja. Mahdollisia laskuri reseptorit nämä vuorovaikutukset ovat CD43 ja MUC1, kaksi tunnettua ligandien ICAM-1, jotka ilmentyvät nämä syöpäsolut.

Citation: Laurent VM, Duperray A Sundar Rajan V, Verdier C (2014) Atomic Force Microscopy paljastaa rooli endoteelisolujen ICAM-1 ilmentäminen Virtsarakon syövän Cell noudattaminen. PLoS ONE 9 (5): e98034. doi: 10,1371 /journal.pone.0098034

Toimittaja: Andrew Pelling, University of Ottawa, Kanada

vastaanotettu: 21. 2014; Hyväksytty: 28 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 23, 2014

Copyright: © 2014 Laurent et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: lähteet rahoituksen, jotka ovat tukeneet työtä ovat Nanotieteet Foundation, ANR Transmig, La Ligue contre le syöpä, LabeX Tec21. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Liima vuorovaikutuksia syöpäsolujen endoteelin kanssa ovat keskeisiä tapahtumia etäpesäkkeiden prosessiin (eli dispersio syöpäsolujen yhden elimen muihin kehon osiin) [1], [2]. Aikana muodostumista ja kasvainten kasvua, syöpäsolujen onnistuvat pakenemaan primaarikasvaimista ja tunkeutuvat verenkiertoa, mikä voi matkustaa pitkiä matkoja. Kaukaisiin sivustoja ihmiskehoon, syöpäsolut vuorovaikutuksessa endoteelin kiinni ja lopulta ekstravasoitumaan eli kulkeutua endoteelin muodostamaa rajaa. Leukosyyttien ja syöpäsolut käyttävät samanlaisia ​​mekanismeja vuorovaikutuksessa endoteelisolujen (EC), mutta vaikka ilmiöt pito- ja leukosyyttien läpi endoteelin on erityisen tutkittu tulehduksen aikana, harvat tulokset ovat saatavilla roolista keskeisten molekyylien mukana tarttuvuus ja transmigraatio syöpäsolujen [1], [3], [4], [5].

Samalla tavalla leukosyyttihoukutteluna, tethering ja liikkuvan kasvainsolujen (TCS) endoteeliin on osoitettu joillekin syöpäsolut ja välittyvät selektiinit. Tämän ensimmäisen vuorovaikutus, luja liitos tapahtuu, välittyy useiden solun adheesiomolekyylien kuuluvat integriiniperheeseen [6], sekä Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) ja verisuonten Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM-1) immunoglobuliinien perheen, mikä johtaa kasvaimen invaasiota [7], [8]. VCAM-1 ilmentyy endoteelin stimulaation jälkeen, ja on vuorovaikutuksessa α4β1-integriinin, kun taas ICAM-1 on ilmaistu hankittua, leukosyyttien ja jotkut Ahkerien, ja voidaan voimistuvan tulehduksellisten sytokiinien. ICAM-1 on osallisena valkosolujen tarttumisen endoteeliin kautta vuorovaikutus LFA-1 ja Mac-1 leukosyyttien integriinien (β2-integriinin). TCs puuttuu β2 integriinien, mutta neutrofiilien voi toimia siltana Ahkerien ja hankittua, LFA-1 leukosyyttien sitoutumiseen ICAM-1 ilmentyy sekä endoteelin ja TCs [5]. Lisäksi, ICAM-1 on reseptori muita molekyylejä, kuten CD43 [9] ja MUC1 [10], joka on ilmaistu noin Ahkerien.

Cancer etenemistä liittyy muutoksia ilmaus joitakin liima- molekyylejä. Jotkut teokset tutkivat suhde N-kadheriiniekspressiota ja etenemisen kasvaimen pahanlaatuisuuden [11], [12]. Kasvua syöpäsolun invasiivisuus on yhdistetty kytkentä E-kadheriinin N-kadheriinin ja ekspression lisääntymisen noin integriinin alayksiköiden [13]. Määrällisesti näkökulmasta vertailua liiman ominaisuuksien ei-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen epiteelisolujen virtsarakon soluja ovat osoittaneet, että tehostettu N-kadheriinin tason T24 pahanlaatuisten solujen seurasi muutokset sitoutumatonta ominaisuuksien yksittäisten N-kadheriinimolekyylien [14] . Lisäksi ICAM-1 ilmentyminen on liitetty tuumorien aggressiivisempaa fenotyyppi [15], [16]. Kuitenkin ligandit osallistuvat yrityksen tarttumisen TC ei ole vielä niin selvästi määritelty kuten leukosyytit, ja kvantifiointia tällaisen liiman välisen vuorovaikutuksen EC ja syöpäsolut ei ole tutkittu toistaiseksi.

kvantitatiivista tietoa soluadhesiivisen voimat voidaan saada käyttämällä eri voima spektroskopiatekniikoilla: bio-membraanivoima anturi [17], optiset pinsetit [18] ja atomivoimamikroskooppi (AFM) [19]. Kaikki nämä tekniikat toimivat optisen mikroskoopin alla, jotta visualisoida solut ja mittaamaan samanaikaisesti adheesiovoimat muutamasta pN muutamia satoja pN tai enemmän. Tässä työssä päätämme käyttää yksisoluiset voima spektroskopia moodin AFM tutkia solu-vuorovaikutuksiin osallistuvat tarttuvuutta Ahkerien ECS. Toisin kuin muut menetelmät tarttumislujuus tämä tekniikka mahdollistaa mittausten tekemiseksi kokoonpano lähellä

in vivo

tilanteessa. Syöpäsolu on kiinnitetty pehmeä ulokkeen ja saatetaan kosketukseen EY-yksikerroksisen ja voima signaali tarkkaillaan ansiosta AFM ulokkeen taipuma [19], [20]. Signaali mahdollistaa myös havaita tapahtumia, kuten mahdollinen breakups reseptori-ligandi joukkovelkakirjoja sekä globaalin tartuntalujuus solutasolla.

määritys solu-vuorovaikutuksiin suoritettiin eri ulokkeen takaisinveto nopeudet tutkia, miten repeämä voima (mukana solu-solu liimasidosten) on muutettu. Olemme tutkineet suhde mitatun reseptori-ligandi-joukkovelkakirjojen ja vastaava metastaattisen potentiaalin ihmisen virtsarakon syövän soluissa, jotta voidaan määrittää liima allekirjoitus kuten syöpäsoluja. Lopuksi osoitamme, että ICAM-1 reseptorin EC toimii keskeisenä välittäjänä liiman vuorovaikutusta kaikkein invasiivisen syöpäsoluja. Havaintomme osoittavat, että invasiivisia virtsarakon syövän solut ovat vuorovaikutuksessa ansiosta yksi tai kaksi ICAM-1-ligandien: CD43 ja MUC1 ovat hyviä ehdokkaita, kuten on osoitettu virtaussytometrialla kokeissa. Tämä tieto tällaista vuorovaikutusta on välttämätöntä ymmärtämiseksi syöpäsolun tarttumisen endoteeliin, mekanismi johtaa ja metastaasit.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja soluviljelmä

Kolme virtsarakon solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa: RT112, T24 ja J82 (ATCC, Rockville, MD). Nämä solulinjat ovat etenemistä hyvin huonosti eriytetty fenotyypit ja nouse pinnallinen invasiivisia epiteelin ihmisen virtsarakon syöpään. RT112 syöpäsolut ovat kohtalaisen eriytetty ja on ominaista Sytologisten luokan 2 (tai erilaistuminen) [21]. T24 ja J82 syöpäsolut ovat heikosti erilaistunutta ja tunnettu siitä, että sytologista luokka 3. erottaa syöpäsolujen HUVEC, syövän solut transfektoitiin plasmidilla, jotka ekspressoivat GFP: tä (vihreä fluoresoiva proteiini – pEGFP). Ihmisen verisuonten navan endoteelisoluja (HUVEC) hankittiin Promocell (Heidelberg, Saksa). Syövän soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 ilmakehässä RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia, 100 UI /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (täydellinen RPMI). Hankittua pidettiin Promocell viljelyalustassa. ECS levytettiin valmiissa elatusaineessa lasipeitinlevyille päällystetty kollageeni I (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Ranska) ja jäljellä 3 päivää levitä saavuttamiseksi yhtymäkohta. Sillä AFM kokeissa viljelyalustaa täydennettiin HEPES (20 mM, pH 7,4).

Atomic Force Microscopy

Käytimme Nanowizard II AFM (JPK Instruments, Berliini, Saksa) on asennettu Zeiss mikroskooppi (Carl Zeiss, Jena, Saksa). Tämä kokoonpano sallii suorittaa AFM mittauksia ja samanaikaisesti tarkkailla soluihin käyttäen faasikontrastimikroskoop- tai fluoresenssi tiloissa. Tämä AFM on myös varustettu ”CellHesion” moduuli (JPK Instruments, Berliini, Saksa). Tämä moduuli mahdollistaa pitkän kantaman pystysuora siirtymä vaiheessa jopa 100 mikrometriä, mikä tekee voima spektroskopia mahdollisin kuten solu-vuorovaikutuksiin. Samanaikaisesti pystysuora piezotranslator (PIFOC, Physik Instrumente, Karlsruhe, Saksa) on asennettu mikroskoopin tavoite siirtää tavoite samanaikaisesti mikroskoopin vaiheessa ja keskittyä soluilla suorittaessaan AFM mittauksia. Kaikki mittaukset tehtiin 37 ° C: ssa käyttäen Petri lautasen Lämmitin (JPK Instruments, Berliini, Saksa).

Konsolitarvikkeet pinnoite

Soft ulokkeet olivat V-muotoisia ilman vihjeitä (MLCT- O, Bruker, Ranska). Ne kalibroida terminen vaihtelut analyysimenetelmä [22] ja näytteille jousivakio lähellä 0,01 N /m. Jotta syöpäsolujen tarttumista ja ulokkeen, jälkimmäinen on funktionalisoitu käyttäen biotiini-conA (Interchim, Montluçon, Ranska) [23]. Huuhtelun jälkeen PBS: llä, ulokkeet inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa biotiini-BSA: ta (Interchim, Montluçon, Ranska) (0,5 mg /ml), huuhdeltiin jälleen PBS: llä ja sitten inkuboitiin streptavidiini (Interchim, Montluçon, Ranska) (0,5 mg /ml) 10 minuutin ajan. Lopuksi ulokkeet huuhdeltiin PBS: llä ja asettaa osaksi biotiini- conA pudota 10 minuutin aikana huuhdellaan PBS: llä. Tämä molekyyli sallii sitoutumisen syöpäsolujen ulokkeiden voimalla suurempi kuin solu-solu irrotusvoimamit- tutkimuksessamme: biotiini-conA tarttuu syöpäsolun kalvon irtoaminen voimalla 2 nN [20], kun taas irtoaminen voimassa oleva välisessä vuorovaikutuksessa syöpäsolun ja EY on luokkaa 1 nN.

syöpäsolun kaapata

Syöpäsolut kasvatettiin viljelypulloissa, sitten irrotettiin juuri ennen AFM kokeita käyttäen trypsiini /EDTA-liuosta (0,05% trypsiiniä ja 0,53 mM EDTA). RPMI seerumia lisättiin soluihin estää Trypsiinin vaikutuksen. Lopuksi solut sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen alustaa ilman seerumia. Syöpäsolut talletettiin petrimaljaan johon EY yksikerroksista oli kasvatettu, ja asettui muutaman sekunnin. Solujen talteenotto koostui paikannus ulokkeen kärki edellä syöpäsolun (koska syöpäsolut olivat loisteputki, ne voitaisiin erottaa hankittua, katso kuva 1), on kosketuksissa solun aikana kymmenen sekuntia voimalla 1 nN. Sitten ulokkeen kanssa jää solun vedettiin hitaasti vakionopeudella ja solu pidettiin viljelyalustassa levätä 15 minuuttia. Seuraavaksi 1 ml RPMI 1640 -alustaa, jossa on seerumia lisättiin. Kenno oli sitoutunut tiukasti ulokkeen ja sen jälkeen käytetään koetin tarttuvuus hankittua.

A) valokuva ulokkeen liitteenä loisteputki syöpäsolu yläpuolella HUVEC yksikerroksista. Valkoinen mittakaavajana vastaa 20 um. B) Piirros lähestymistapa sisäänvetäytymistä menetelmää ja tyypillistä palautusvoima käyrä kannalta piezo siirtymä. Syöpäsolun lähestyy EY yksikerroksista vakionopeudella. Sitten solu koskettaa n aikana 10 sekunnin (alle 1 nN kohdistetun voiman) luomaan useita bond komplekseja päälle tartunta-alueella. Ulokkeen vedetään vakionopeudella, jotta irrottaa liimasidosten. Palautusvoima käyrä osoittaa voima hyppää vastaava repeämä voima (f) joukkovelkakirjoja. Liima energia (varjostettu alue) edustaa irtoamista työtä ulokkeen täysin irrottaa solun alustasta. Irtoaminen voima on voima, joka tarvitaan venyttää syöpäsolun ja EY kunnes joukkovelkakirjojen alkavat irrota. Huomaa, että jotkut voima hyppyjä voi seurata tasanne vastaa lieassa muodostumiseen.

Force spektroskopia: analyysi syöpäsolu-EY vuorovaikutus

Ensinnäkin syöpäsolu oli ylhäällä EY. Ulokkeen alennettiin tasaisella hitaalla nopeudella (1 mikrometriä /s) laittaa syöpäsolun kosketuksessa EY (edellä ydin). Puristusvoiman 1 nN sovellettiin n aikana 10 sekunnin (kuvio 1A), jotta voidaan luoda sidoksia ja lisääntymään hyvä pysyvyys. Lopuksi syöpäsolun vedettiin nopeudella, joka vaihtelee välillä 0,5 pm /s 20 pm /s. Mittaus ulokkeen taipuma aikana pystysuoran liikkeen kirjattiin eri vaiheissa (kuvio 1 B). Tyypillisesti yhden syöpäsolu-EY pari, jono viiden voiman käyrät saatiin viidessä eri vetäytymisen nopeuksilla (saa levätä noin 1 minuutti välissä käyrä). Sitten syöpäsolu jätettiin odottamaan aikana kymmenen minuuttia ja siirtyi toisen yläpuolella EY mitata sekvenssin viiden voiman käyriä uudelleen. Lopuksi, kukin syöpäsolun käytettiin kolme tai neljä kertaa, siis viisitoista tai kaksikymmentä tällaista voimaa käyrät (N = 15 tai N = 20) saatiin. Mittaukset kerättiin sitten eri syöpäsolulinjoissa aikana samanlaisia ​​kokeita. Luonnos tyypillinen palautusvoima kannalta piezo siirtymä on esitetty kuvassa 1C. Pienin piste käyrällä on irronnut voima eli voima, joka tarvitaan erottamaan syöpäsolu Euroopan yhteisöstä. Irrotusvoima on tuettu kennon muovattavuuden, vaan myös useissa ja vahvuus liimaliitokset on muodostettu solujen välillä. Eri hyppyjä voimassa vastaavat peräkkäisten breakups joukkovelkakirjojen mukana aikana solu-solu vuorovaikutusta [24], [25] ja siksi edustaa repeämä voimat (so reseptori-ligandi sidoksia). Huomaa, että voima hyppy voi seurata tasanne voimassa vastaten lieka muodostumiseen, jonka laajentaminen on tasangolla pituus. Sisäänvetoarvoa käyrä myös tietoa tarttumista energiaa, joka on työtä tarpeen irrottaa syöpäsolun (varjostettu alue kuviossa 1C). Tähän sisältyy työtä venyttää solujen sekä työn rikkoa molekyylisidokset [25]. Kaikki nämä parametrit (irrotusvoimamit-, repeämä voima, tarttuvuus energia) saadaan voima käyrä käyttäen Image Processing Software (JPK väline, Berliini, Saksa). Kunkin sarjan ehtoja, AFM suoritettiin kokeita noin 9 kertaa 3 eri päivinä. Ellei toisin mainita, tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Kaikki tilastolliset testit suoritettiin käyttäen R-ohjelmiston (2.14 release). Koska data korreloidaan, käytimme Yleistynyt Linear Mixed Model (GLMM). Erot, jotka on laskettu käsittelemättömien ja anti-ICAM-1-käsitellyissä soluissa testattiin sekoitettu funktio afex paketin R-ohjelmisto.

Inhibition of ICAM-1 ligandien hankittua

Ihmisen monoklonaalinen vasta-aine ICAM-1 [27]: tä käytettiin 30 ug /ml pitoisuudessa. Ennen AFM kokeissa EC inkuboitiin 15 minuuttia, kun läsnä on vasta-aineen 37 ° C: ssa. Sitten solut huuhdeltiin kahdesti PBS: ssä ja inkuboitiin 2 ml: ssa viljelyalustaa.

immobilisointi ICAM-1: n ja BSA

20 ul: n alikvootti rekombinantti-ICAM-1 (RD Systems, Lille, Ranska) (25 ug /ml) 0,1 M NaHCO

3 (pH 8,6) adsorboitiin yön yli 4 ° C: ssa keskellä peitelasi. Sitoutumattomat proteiinit poistettiin pesemällä PBS: llä ja 2 ml täydellistä RPMI-1640 väliaineessa lisättiin sitten ICAM-1 päällystetty astia ennen AFM kokeita.

BSA-pinnoite protokollan ui alikvootti BSA 100 ug /ml PBS: ssä adsorboitiin 30 minuuttia 37 ° C: ssa keskellä petrimaljaan. Sitoutumattomat proteiinit poistettiin pesemällä PBS: llä ja 2 ml täydellistä RPMI-väliainetta lisättiin sitten BSA päällystetty astia ennen AFM kokeita.

virtaussytometrinen analyysi ICAM-1, MUC1 ja CD43 ilmentymisen ja immunofluoresenssivärjäyksen

Expression tasoja ICAM-1 (EY: n pinnalla), MUC1 ja CD43 (on syöpäsolun pinnalla) analysoitiin virtaussytometrialla (Accuri C6 virtaussytometrillä, BD Bio-tieteet). Kvantifiointi tehtiin mittaamalla geometrinen fluoresenssikeskiarvo. Immunofluoresenssivärjäystä, lasipeitinlevyille päällystettiin 25 ug /ml ihmisen fibronektiiniä. Solut kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä, ja käsitellään epäsuoran immunofluoresenssimikroskopialla.

mittaamiseksi ekspressiotasot ICAM-1 ja MUC1, EC tai syövän soluja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen kanssa ja sitten FITC-konjugoidun (vuohi anti-hiiri-IgG) sekundaarisella vasta-aineella (Jackson ImmunoResearch, USA). Ensisijainen aineet ovat ihmisen monoklonaalinen vasta-aine ICAM-1 [26] tai anti-MUC1 monoklonaalinen vasta-aine C595 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). Anti-MUC1-vasta-aine tunnistaa tetrapeptidi motiivi proteiinissa ydin MUC1-molekyylin.

CD43 ilmentymisen tasolla, syövän soluja inkuboitiin monoklonaalisella vasta-aineella CD43-kloonin L10 leimattu FITC: tä (Invitrogen, USA), joka reagoi solunulkoisen domeenin.

tulokset

Adhesion eri syöpäsolulinjojen

arvioida, syöpäsolun invasiivisuus liittyy liimausominaisuutensa, suoritimme voima spektroskopia mittaukset kohdistaminen vuorovaikutusta syöpäsoluja (eri invaasiokyvyn) ja hankittua. Syöpäsoluja johtuvat seuraavista solulinjoista: RT112, T24 ja J82. RT112 solut ovat vähemmän invasiivisia soluja kun T24 ja J82-solut ovat invasiivisia niitä [21]. Force käyrät tehtiin välillä syöpäsolu kiinnitetty ulokkeen kärkeen ja monokerroksella hankittua levitettiin lasikannella. Kuvio 2 esittää tyypillistä voima käyrät saatu vuorovaikutukset kolmen syöpäsolutyyppien (T24, J82 ja RT112) kanssa hankittua. Jokainen vetäytymisen käyrä (takaisinveto nopeus V = 5 mikrometriä /s) osoittaa useita repeämä liittyvien tapahtumien peräkkäisten rikkoutuminen joukkovelkakirjojen mukana aikana solu-solu vuorovaikutusta. Mielenkiintoista, vähemmän invasiivisia soluja (RT112) esittää pienempiä repeämä voima vaiheita verrattuna kaikkein invasiivisia soluja (T24, J82). Lisäksi irrotusvoima, joka on pienin piste (kuviot 2A-B-C) käyrän on pienempi RT112 soluja. Kuviot 2A-B-C osoittavat myös jakeluun repeämä voimien havaita syöpäsolujen vuorovaikutus hankittua at V = 5 mikrometriä /s. Nämä suuruudet [10-70 pN] ovat alueella tyypillisiä voima-arvot on saatu reseptori-ligandi joukkovelkakirjat [23], [27], [28], [29]. On huomionarvoista, että kolme solutyyppejä osoittaa erilaisia ​​voima-arvot: paljastavat keskimäärin repeämä voima 29,6 ± 0,8 pN for RT112, 34,0 ± 0,9 pN varten T24 ja 44,2 ± 1,1 pN varten J82 (V = 5 mikrometriä /s). Huomaa, että keskimääräinen repeämä voimat ovat pienempiä RT112 soluja, jotka ovat vähemmän invasiivisia laji.

Tyypillinen voima kaaret jälkeen 10s-kontakti TC ja EY muuttamisesta HUVEC yksikerroksisen. Todennäköisyys histogrammit kerätyillä repeämä joukot f varten J82 (A), T24 (B) ja RT112 soluja (C) V = 5 mikrometriä /s. Vertical nuolet tarkoittavat esimerkkejä voima hyppää vastaa hajoamiseen reseptori-ligandi sidoksia.

Adhesion energia- ja irtoaminen voima (solutasolla) B

Tärkeä näkökohta luonnehtimaan vuorovaikutusta syöpäsolujen ECS on tarttuvuutta energia, joka koskee koko solun kosketuspinta. Tarttumista energia saadaan integroimalla alueen alapuolella käyrä F (z), jossa F on voima ja z on piezo siirtymä. Perustana linja on valittu lopullinen raja-arvo, kun kaikki joukkovelkakirjat irrotetaan. JPK ohjelmiston avulla valita tämän arvon ja suorittaa sitten yhdentymistä. Siksi tutkimme tarttumista energia sekä irtoaminen voima (itseisarvo pienin voimaan kelautumisvoima käyrä, katso kuvio 1 B) versus vetäytymisen nopeus (V). Kuten kuviossa 3 on esitetty, nämä kaksi parametria kasvaa sulkeutuminen nopeutta. Mitä tulee tartunta energia, kaikkein invasiivisia J82-solujen läsnä suurempia arvoja verrattuna T24 tai RT112 soluja. Lisäksi tämä ero on vahvistettu irrotusvoima arvoja, jotka ovat korkeampia J82-solujen verrattuna T24 ja RT112 soluja. Joka tapauksessa, voimia, tai tarttumista energiat ovat aina pienempiä ja vähemmän invasiivisia RT112 solu.

Plot tarttuvuuden energia (A) ja irtoaminen voima (B) vs. sulkeutuminen nopeuden jälkeen 10s-välisen kontaktin TC ja EY: n on HUVEC yksikerroksisen. Kolme syöpäsolulinjoista: T24 (avoin ympyrä), J82 (täydellinen neliö) ja RT112 (täysi kolmio). Data piirretään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Linja on vain opas silmään.

vaikutus sulkeutuminen nopeus repeämä voima

repeämä voima Teoreettisesti on osoitettu riippuvan logaritmi lastausmääriä että konsoli [30]. Tutkia allekirjoitus kunkin tasyöpäsolulinja, yksi on analysoida voiman spektrit kolme syöpäsolutyyppien aikana vuorovaikutuksen EC (kuva 4). Nämä spektrit hetkellä voima-arvot riippuen takaisinveto nopeudella tai vastaavasti lastaamiseen r

f (N /s), joka vastaa tuotteen takaisinveto nopeus V (m /s) kertaa jousivakio k (N /m) ulokkeen, eli r

f = kV. Force arvot nousevat asteittain sulkeutuminen nopeus ja vaihtelevat 20,8 ± 0,7 pN ja 47,4 ± 1,9 pN for RT112 solujen välillä 27,1 ± 1,1 pN ja 52,4 ± 2,0 pN varten T24 soluja, ja välillä 31,6 ± 1,0 pN ja 65,8 ± 1,6 pN varten J82 solut. Kolmen syöpäsolun riviä, keskimäärin repeämä voima vastaan ​​logaritmi takaisinveto nopeus kasvaa, mutta ei ole lineaarinen.

suhde repeämä voimaa ja takaisinveto nopeus jälkeen 10s-kontakti TC ja EY muuttamisesta HUVEC yksikerroksista. Kolme syöpäsolulinjoista: T24 (täysi ympyrä), J82 (täydellinen neliö) ja RT112 (täysi kolmio) vuorovaikutuksessa endoteelin. Data piirretään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Linja on vain opas silmään.

mittaus erityisiä ja epäspesifinen adheesiovoimat syöpäsoluja

Aikaisemmassa tutkimuksessa osoitimme, että ICAM-1 oli mukana TC ekstravasaatio [4]. Testata tietyn välinen tartunta syöpäsoluja ja ICAM-1-molekyylit, suoritimme voima spektroskopia kokeiden välillä syöpäsolu kiinnitetty kärkeen AFM ulokkeen ja immobilisoitua ICAM-1-molekyylien lasiastiassa. Kuten on esitetty kuviossa 5, nämä mittaukset osoittavat, että repeämä voimat ovat hyvin lähellä niitä on jo saatu syöpäsolu-EY vuorovaikutus [28]. Arvot ovat välillä [20-70pN] varten takaisinveto nopeuden välillä 0,5 pm /s ja 20 pm /s. Vertaamaan näitä arvoja ei erityisiä adheesiovoimille, me mitattiin myös repeämä väliset voimat Ahkerien ja BSA-päällystetty pinta. Voima taso osallistuvat epäspesifisten tartunta on välillä [10-45pN], joka on paljon vähemmän tärkeä, noin 40%: sta 70%: n erityinen sitova.

repeämä voima vs. vetäytymisen nopeus T24-soluissa vuorovaikutuksessa joko päällystettyä substraattia tai EC (ympyrä). Substraatti päällystetään BSA 100 ug /ml (neliöt) tai rekombinantti-ICAM-1 25 ug /ml (timantti). Data piirretään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Linja on vain opas silmään.

rooli ICAM-1-reseptorin

Kuten konfokaalimikroskopiaa kuvantaminen (kuvio 6A), ICAM-1 stimuloimaton hankittua on kohtalainen. FACS-analyysi (kuvio 6B) vahvistaa ICAM-1-ilmentymisen määrä, kun verrataan fluoresenssin tasoa käsiteltyjen solujen irrelevantilla vasta-aineella ja anti-ICAM-1-vasta-aine. Määrittää suhteellinen vaikutus ICAM-1-reseptoria solun soluadheesiota, selvitimme muuttaminen adheesiovoimille kun Estämällä tämän reseptorin spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella. Kuvio 7 esittää vaikutusta vasta-aine ICAM-1 aikana tarttumista kolmen syöpäsolutyyppien kanssa hankittua. Mielenkiintoista, esto n ICAM-1 johti merkittävään pienenemiseen repeämä voimia entistä invasiivisia soluja vain. Sillä T24-soluja, voima keskiarvot vaihtelivat välillä 27,1 pN ja 52,4 pN (eri nopeuksilla) tukkimatta ICAM-1-reseptorin, mutta välillä 14,4 pN ja 35,7 pN, kun esto ICAM-1 (kuvio 7A). Tämä vaikutus on myös selvästi näkyvissä laatikon viiksi-juoni ssa saadun takaisinveto nopeudella 5 mikrometriä /s (kuvio 7 B). Anti-ICAM-1-vasta-aine indusoi merkittävän vähenemisen repeämä voimassa T24 (kohteesta 34pN 21,8 pN, katso kuvio 7B), ja arvo 21,8 pN (+/- 0,7), joka saatiin sen jälkeen, käyttäen vasta-ainetta on verrattavissa repeämä voima arvo 23.3pN (+/- 1,6) saatu T24-BSA tarttuvuus (katso kuva 7G). Näin ollen, kun esto ICAM-1, repeämä voima taso on tyypillinen ei-spesifisen tarttumisen. Tämä esto näyttää olevan käytännössä täydellisiä T24 soluja. Saat J82 solut, voima keskiarvot vaihtelevat 31,6 pN ja 65,8 pN tukkimatta ICAM-1 ja välillä 17,7 pN ja 58.1 pN kun esto ICAM-1. Tämä vaikutus anti-ICAM-1 on selvästi nähtävissä ruutuun-parta-käyrän 7D: keskiarvo pienenee 44,2 pN 30,4 pN klo takaisinveto nopeudella 5 mikrometriä /s. Lopuksi, adheesiota RT112 solujen hankittua ei ole vähentynyt, kun läsnä on anti-ICAM-1-vasta-aine: keskimääräiset arvot vaihtelevat 20,8 pN ja 47,4 pN ottaa huomioon, että ne ovat välillä 21,1 pN ja 58,6 pN, kun esto ICAM-1. Tämä ei merkittävää vaikutusta anti-ICAM-1-vasta-aine on vahvistettu laatikon viiksi koealojen (Kuva 7F): vasta-aine ei aiheuta mitään vähenemisen repeämä voimassa. Siksi merkittävä väheneminen sitovia voimia invasiivisia soluja (esim. 35% J82 ja T24-solujen) on määrällisesti täällä riippumatta nopeus, kun taas ei muutu, kun kyseessä on vähemmän invasiivisia RT112 solu. Tämä osoittaa selvästi, että ICAM-1 ilmaiseman hankittua on keskeinen rooli yrityksen tarttuvuutta enemmän invasiivisia soluja (J82 ja T24).

A) Konfokaalimikroskopia kuva EY yksikerroksisen värjättiin ICAM-1 ( vihreä). HUVEC kiinnitettiin PFA. Ytimet värjätään sinisellä avulla DAPI. B) kvantifiointi ICAM-1 tasot FACS-analyysillä (katkoviiva) verrattuna irrelevantilla vasta-aineella (yhtenäinen viiva).

repeämä voima vs. sulkeutuminen nopeus jälkeen vuorovaikutusta syöpäsolun ja EY käsitelty anti ICAM-1-vasta-aine tai ei. Vastaavat box-viiksi tontteja osoittavat repeämän asevoimamme takaisinveto nopeudella 5 mikrometriä /s. (A, B) T24-EY (C, D) J82-EY ja (E, F) RT112-EY. Vertailun vuoksi repeämä voima rasiakuvaajan näkyy myös, että T24-BSA vuorovaikutus (paneeli G). For paneelit A, C ja E, linja on vain opas silmään. Data piirretään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Tähdet edustavat p-arvo GLMM tilastolliset testit väliin parametrit lasketaan käsittelemättömien ja anti-ICAM-1-käsiteltyjä soluja (* p≤0.05).

Yksityiskohtainen analyysi repeämä voimien

koska käytimme keskiarvot repeämä voimia, jotka voivat piilottaa monimutkaisuuden liimasidosten, yksityiskohtaisen tarkastuksen voiman hypyt (kuten kuvassa käyttäen histogrammit) suoritettiin saadakseen lisätietoja. Tämä analyysi on esitetty kuvassa 8, jossa TC-EC tai TC-substraattia (ICAM-1 tai BSA) voima hyppyjä tallennetaan ja esitetään käyttämällä histogrammeja, tietyllä nopeudella 5 um /s. Tarkastus histogrammin T24-hankittua repeämä voimat kuvassa 8A (ilman vaikutusta anti-ICAM-1) paljastaa Gaussin keskitetty 32,9 pN (+/- 5,8). Kiinnostavaa kyllä, tämä voimajakautuma löytynyt T24-EY vuorovaikutus on melko samanlainen kuin saatu vuorovaikutusta T24 ja ICAM-1 päällystetyn-alustan (eli keskiarvo = 28,8 pN +/- 5,1) (ks histogrammi kuvassa 8D ). Toisaalta, kun EC on käsitelty anti-ICAM-1-vasta-aine, huippu kuviossa 8A lähes häviää (pinta-ala käyrän jaetaan tekijällä kymmenen). Uusi huippu keskitetty 19 pN näyttää, samanlainen arvo 21,5 pN löytynyt T24 vuorovaikutuksessa BSA-päällystetylle pinnalle (kuvio 8E), joka johtuu ei-spesifisiä vuorovaikutuksia.

Effect of anti -ICAM-1-vasta-aine on syöpää EY vuorovaikutusta. Repeämä voima jakaumat ovat Gaussin yhden tai kaksi piikkiä paljastava läsnä reseptori /ligandi joukkovelkakirjoja tai ei erityisiä vuorovaikutuksia. Todennäköisyys histogrammit repeämä voima (V = 5 mikrometriä /s) (A) T24-HUVEC, (B) J82-HUVEC, (C) RT112-HUVEC. Mustat histogrammit edustavat vuorovaikutusta syöpää solu ja EY ilman vasta-ainetta taas punaisia ​​esittävät voimajakautumaa käytön jälkeen vasta-ainetta. Paneelit D (T24-ICAM-1) ja E (T24-BSA) esittävät repeämä voima todennäköisyydet T24 soluja kosketuksessa päällystettyjen kennojen. Lukumäärä N tapahtumia on ilmoitettu histogrammeja.

histogrammi J82-EY repeämä voimien paljastaa jakautuminen kahden Gaussin: kaksi piikkiä aluksi (42 PN 70 PN) kuin voidaan nähdä suuri kirjo voima-arvot. Inkuboinnin jälkeen vasta-aineen kanssa, viimeksi huippu (70 PN) katoaa kokonaan ottaa huomioon, että ensimmäinen (42 PN) lasketaan kertoimella 3 (kuvio 8B). Voimme päätellä, että ICAM-1 odotetaan vuorovaikutuksessa kahden ligandien J82 solun pinnalla, ja että vasta-aine estää sekä vuorovaikutuksia, mutta edullisesti yksi. Nämä joukkovelkakirjat voivat olla erityistä vuorovaikutusta kahdella eri ligandien esimerkiksi. Lisäksi (kuvio 8B), uusi alempi huippu esiintyy käytettäessä vasta-ainetta (≈28pN), jonka arvo on hyvin lähellä yhden löytynyt epäspesifisten joukkovelkakirjoja.

tapaus RT112 solu on erilainen, kuten voidaan nähdä kuviosta 8C. On vain yksi piikki, ja ilman, että vasta-aine sijaitsee samalla tasolla (28 pN ja 33 pN, ei merkittävää eroa). Lisäämällä anti-ICAM-1-vasta-aine ei muuta yleistä käyrä, siis ei ole selvää vaikutusta ei havaita RT112 soluja, mikä osoittaa, että ICAM-1 ei todennäköisesti ole mukana tässä liimauksena.

Analyysi ICAM- 1 ligandit (CD43 ja MUC1) ilmentyminen invasiivisia soluja T24 ja J82

Virtsarakon syöpäsolut eivät esittää yhteisen ICAM-1 ligandit, kuten LFA-1 tai Mac-1 [5]. Toisaalta, ilmaus MUC1 (Mucin 1) ja CD43 (leukosialiinin) äskettäin kuvattu ICAM-1-ligandien [31], [10], [9], [32]. Siksi me määrällisesti niiden ilmentymistä virtaussytometrialla. Tulokset kuvassa 9 osoittavat, että T24 ilmentävät vain CD43 ligandi kun J82 solut ilmentävät sekä CD 43 ja MUC1 ligandeja. Koskevat RT112 soluja, ne ilmaisevat vain CD43 ligandi.