Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kasvutekijät aktivoivat ErbB-reseptoreita on kuvattu eturauhasen kasvaimia. Androgeeniriippuvaista eturauhassyövän solulinja, LNCaP, ilmaisee ErbB-1, ErbB-2 ja ErbB-3 reseptorityrosiinikinaaseihin. Aiemmin on osoitettu, että NRG aktivoi ErbB-2 /ErbB-3-heterodimeerien aiheuttaa LNCaP solukuoleman, kun taas EGF aktivoi ErbB-1 /ErbB-1 tai ErbB-1 /ErbB-2-dimeerien indusoida solujen kasvua ja selviytymistä. Lisäksi osoitettiin, että PI3K-estäjien tukahdutettu tämän solukuoleman viittaa siihen, että androgeenien riistää LNCaP, NRG aktivoi PI3K-riippuvaisen reitin liittyy solukuolemaan.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksen osoitamme, että NRG indusoi autophagy LNCaP-soluissa, käyttäen LC3 merkkiaineena. Kuitenkin autophagy aiheuttama NRG voivat olla puutteellisia, koska p62 tasoa nostaa. Olemme myös osoittaneet, että NRG- aiheuttama autophagy on riippumaton nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) eston jälkeen NRG aiheuttaa Akt ja S6K aktivointi. Mielenkiintoista on, että esto reaktiivisen hapen (ROS), jonka

N

-acetylcysteine ​​(NAC), esti NRG aiheuttama autophagy ja solukuolemaa. Tutkimuksemme myös tunnistettu JNK ja Beclin 1 tärkeinä komponentteina NRG aiheuttaman autophagy ja solukuolemaa. NRG aiheuttama nousu JNK fosforylaatioon joka inhiboitui NAC. Lisäksi estäjä JNK esti NRG aiheuttama autophagy ja solukuolemaa. Lisäksi soluissa, jotka yliekspressoivat Bcl-2 tai soluja, jotka ilmentävät sh-RNA vastaan ​​Beclin 1, vaikutukset NRG, eli induktio autophagy ja solukuoleman, estyi.

Johtopäätökset /merkitys

Siten , LNCaP-soluissa, NRG-indusoi epätäydellinen autophagy ja solukuoleman, jotka riippuvat ROS tasoilla. Nämä vaikutukset NRG välittyvät signalointireitin, joka aktivoi JNK ja Beclin 1, mutta on riippumaton mTOR eston.

Citation: Schmukler E, Shai B, Ehrlich M, Pinkas-Kramarski R (2012) Neureguliini Edistää Keskeneräinen autophagy eturauhassyöpäsolujen joka on riippumaton mTOR Pathway esto. PLoS ONE 7 (5): e36828. doi: 10,1371 /journal.pone.0036828

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 05 tammikuu 2012; Hyväksytty: 06 huhtikuu 2012; Julkaistu: toukokuu 14, 2012

Copyright: © 2012 Schmukler et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Israel Science Foundation (avustus nro 732/08), jonka Israel terveysministeriön (avustus nro 3942), jonka Israel Cancer Association (avustus nro 4914422) ja jota Kauffman Eturauhassyöpä Research Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

eturauhasen syöpä on yksi miesten yleisin syöpä. Eturauhasen solun kasvu säätelevät hormonit, kasvutekijät ja niiden reseptoreihin. Yleisimpiä ryhmä reseptorien liitetty ihmisen syövissä on ErbB-alaryhmä reseptorityrosiinikinaaseja [1], [2], [3]. Tämä perhe sisältää neljä reseptorien ErbB-1-erbB-4. Ottaa huomioon, että ErbB-1-reseptorin (tunnetaan epidermaalisen kasvutekijän reseptori, EGFR), aktivoidaan EGF: n ja EGF: n kaltainen ligandeja, ErbB-3 ja ErbB-4-reseptorit aktivoituvat NRG /neureguliini isoformeja ja ErbB-2-reseptori ei ole tunnettuja ligandia [4]. Nämä reseptorit ilmentyvät eturauhasen epiteelin, kun taas, erbB-1 ligandit ilmentyvät strooman ja NRGs ilmaistaan ​​strooman ja pohjapinta ja erittävien epiteelin [5].

aktivointi erbB-1 signalointi EGF: n ja EGF-kaltaiset kasvutekijät on tärkeä rooli eturauhassyövän solujen lisääntymisen ja lisäksi EGF viljelmiin syöpäsolujen stimuloi niiden kasvua [6]. Lisäksi erbB-2 yliekspressio on yhteinen tapahtuma, joka näyttää valikoivaa etua useille syöpäkasvainten kuten eturauhassyövän [3], [7]. Normaalisti, ErbB-2 on ilmaistu eturauhasen epiteelisolujen [7], [8]. Korkeampi ErbB-2 verrattuna normaaleihin kudoksiin on havaittu eturauhasen kasvaimissa [9], [10]. Lisäksi, yliekspressio ErbB-2 ja ErbB-3 on osallisena neoplastisessa transformaatiossa eturauhassyövän [11]. Vaikka tarkkaa roolia näiden onkogeenien ja kasvutekijöiden eturauhasen syöpä on edelleen epäselvä, yliekspressio ErbB-1 ja erbB-2 on liittynyt huonoon ennusteeseen ja etäpesäkkeiden [12].

Autophagy, prosessi säännelty liikevaihdon soluaineksista, on tärkeää normaalin kasvun ohjaus, mutta se voi olla viallinen sairauksissa [13], [14]. Under rajoitettu ravintoaineiden tai kasvutekijöiden olosuhteissa, tämä prosessi on välttämätöntä turvata energian tuotannon solujen eloonjäämistä [15]. Autophagy voi toimia myös mekanismi, jonka avulla solut eroon viallisen organellit ja kierrättää proteiinit [16]. Toisaalta, autophagy voi johtaa ei-apoptoottisia tyyppi solukuoleman (tyypin II solukuolema) on rooli solukuolemaprosesseissa ja kuoleman myrkyllisiä ärsykkeisiin [17].

muodostuminen autophagosomes ohjataan useat ATG proteiineja. Atg8 proteiini (ihmisen homologi on MAP-LC3) liittyy autophagosomal kalvon ja toimii merkkiaineena autophagosome muodostumisen [18]. Muodostumista autophagosome edellyttää myös luokan III-inositoli-3-kinaasi (PI3K) [19]. Autophagy välittämä PI3K riippuu vuorovaikutuksesta jälkimmäinen atg6 proteiinia, joista Beclin 1 on ihmisen homologi [20]. Beclin 1 on osoitettu toimivan kasvainsuppressorigeenin säätämällä prosessin autophagy [21]. Sen vaikutuksen anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2 [22] estää autophagy [23]. Down-regulation of Bcl-2 voidaan selvästi edistää autophagy [24], mikä viittaa siihen, että Beclin 1-välitteisen autophagy saattaa estää sen vuorovaikutuksen Bcl-2. Viime aikoina useat tutkimukset tunnistaa Bcl-2 vuorovaikutuksessa domain Beclin 1 (BH3 domain) [25], [26], [27].

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että NRG (ErbB3 ja ErbB4 ligandi) inhiboi kasvu androgeeniriippuvaista LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa, kun viljellään täydellisessä elatusaineessa [28], kun taas ilman androgeenin, NRG indusoiman kuoleman LNCaP-solujen [29]. Mielenkiintoista on, että PI3K-inhibiittori (3-metyyliadeniini), joka estää myös autophagy, esti NRG solukuolema, mikä viittaa siihen, että NRG voi aiheuttaa autophagic solukuolemaa näissä soluissa [29]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme käsitelleet hypoteesia, että NRG välittää autophagy LNCaP-soluissa ja tutkittiin signalointireittejä, jotka välittävät NRG indusoi autophagy ja solukuolemaa. Käyttämällä LC3 markkerina, me osoitamme, että NRG lisää LC3-II-tasoja. Kuitenkin tasot p62 /SQSTM1 proteiinia, jotka sitovat LC3 ja hajotetaan autophagy [30], ei vähentää NRG käsittely, mikä osoittaa, että autophagy aiheuttama NRG on epätäydellinen.

osoittavat myös, että esto reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) by

N

-acetylcysteine ​​(NAC) estää NRG välittämä autophagy ja solukuoleman. Tuloksemme osoittavat, että NRG aktivoi luokan I PI3K, Akt, mTOR ja pS6K reitti, joka on tunnettu autophagy estävä reitti, jota ei ole estetty NAC. Lisäksi osoitamme, että NRG indusoi JNK aktivointi, joka estyy NAC. Lisäksi JNK estäjä, Beclin 1 hiljentämisen ja Bcl-2 yliekspressio, esti NRG aiheuttama autophagy ja solukuolemaa. Siten ehdotamme mallia, jonka NRG aiheuttama autophagy ja solukuolemaa LNCaP liittyy Beclin 1 ja JNK signalointireitteihin ja on riippumaton PI3K /Akt /mTOR-signalointireitin estyminen.

Tulokset

NRG indusoi Autophagy, joka estää 3-metyyliadeniini (3-MA) ​​LNCaP-solut

LNCaP on androgeeni-reagoiva eturauhassyövän solulinjaa, joka ilmentää ErbB-reseptorit [29]. Aikaisemmin osoitimme, että NRG indusoi solukuolemaa, joka inhiboitui 3-MA, PI3K-estäjä [29], ja on kaspaasi riippumaton (ei esitetty ja [29]). Lisäksi osoitettiin, että NRG aiheuttaa morfologisia muutoksia LNCaP jotka estävät 3-MA (Video S1 ja [29]). Esillä olevassa tutkimuksessa olemme analysoineet vaikutuksia NRG on autophagy ja solukuolemaa LNCaP kasvatettu ilman androgen jäljittelevää. Sen määrittämiseksi, autophagy induktio, käytimme LC3 proteiinin markkerina. Kuten kuviossa 1A on esitetty, LNCaP-soluja käsiteltiin NRG 14 h ja 24 h, osoittivat parannettu konversio LC3-I LC3-II, joka inhiboitui 3-MA, joka osoittaa, että itse asiassa NRG indusoi autophagy LNCaP-soluissa. Edelleen osoittamiseksi autophagy induktio, käytimme LNCaP-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti GFP-LC3 ekspressiovektoriin. Kuten kuviossa 1B on esitetty, NRG indusoitu parannettu autophagosome muodostumista, mikä heijastuu parannettu välimerkein värjäytymisen GFP-LC3. Positiivisena kontrollina, soluja käsiteltiin rapamysiinin, joka myös indusoi autophagy LNCaP-soluissa (kuvio 1 B). Siten LNCaP solut reagoivat NRG lisääntynyt autophagy induktion. Lisätutkimuksia autophagy aiheuttama NRG selvitimme ilmentymisen taso p62 /SQSTM1. P62 /SQSTM1 proteiini sitoutuu LC3-II ja hajotetaan autophagy [30]. Yllättäen NRG hoito ei tehostanut p62 hajoaminen osoittaa, että autophagy aiheuttama NRG voivat olla puutteellisia. Kontrollina soluja käsiteltiin Earlen tasapainotettua suolaliuosta (EBSS), ja tasot LC3-II: n ja p62 määritettiin immunoblot-(kuvio S1). Kuten on esitetty, EBSS aiheuttama LC3-II korkeus ja p62 hajoamista odotetusti. Huomattavaa on, että 3-MA vähensi LC3-II tasot NRG käsitellyissä soluissa sekä p62 tasojen puuttuessa NRG. Selitys näille tuloksille ei vielä tunneta.

(A) LNCaP-soluja käsiteltiin 100 ng /ml neureguliini (NRG) läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 mM 3-metyyliadeniini (3-MA) ​​ja osoitettu aika. Kokosolulysaateille valmistettiin ja alistettiin immunoblot-analyysi anti-LC3 ja anti-p62-vasta-aineita.

Ylähavas

edustavia tuloksia.

Ala-paneeli,

densitometrinen analyysi on esitetty kertainen induktio kontrolliin verrattuna käsittelemättömissä soluissa (n = 3, keskiarvo ± S.D; * p 0,05). (B) LNCaP-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti LC3-GFP käsiteltiin 50 nM rapamysiinin yli yön tai 100 ng /ml NRG 5 tuntia. Soluja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja tumat värjättiin bisdenzimide (Hoecsht 33258). Kiinnityksen ja värjäys, solut valokuvattiin käyttäen Nikon optisella fluoresenssimikroskooppia Malli TE-2000S (60-kertainen suurennus).

Ylähavas

, edustaja kuvia.

Ala paneeli

, autophagy kvantifioitiin laskemalla LC3 pisteiden solua kohti käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Tuloksena on esitetty on tyypillinen kaksi toisistaan ​​riippumatonta koetta. 70-80 solut analysoitiin käsittelyä kohti; tiedot esitetään keskiarvona ± SD (*

p

0,05).

NRG aiheuttama Autophagy on epätäydellinen

NRG hoito indusoi autophagy vaan myös johtaa kasvaa P62 tasoja, mikä osoittaa, että autophagy aiheuttama NRG on epätäydellinen (kuvio 1). Edelleen vahvistaa nämä tulokset, LNCaP-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti LC3-GFP-fuusioproteiini oli joko käsitellään NRG 24 h tai inkuboidaan EBSS väliaineen useita tunteja. Solulysaatit immunoblotattiin anti-GFP-vasta-aineen havaitsemiseksi tasot GFP-merkityn LC3-I ja LC3-II. Kuten kuviossa 2A, sekä EBSS ja NRG aiheuttaa autophagy, kuten on päätelty kasvu LC3-II-GFP tasot verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Kuitenkin soluissa inkuboitu EBSS, LC3-II-GFP tasot vähenee ajan mittaan, kun taas solut, joita käsiteltiin NRG tasot LC3-II-GFP on suhteellisen korkea, vaikka 24 tunnin inkuboinnin. Lisäksi läsnä bafilomysiini A

1 (estäjä autophagosome-lysosomifuusio) kertyminen LC3-II-GFP on huomattavasti korkeampi EBSS käsitellyissä soluissa verrattuna NRG käsiteltyjen solujen (kuvio 2B). Yhdessä nämä havainto osoittaa, että NRG aiheuttama autophagy on epätäydellinen.

(A) LNCaP stabiilisti ilmentävät LC3-GFP käsiteltiin 100 ng /ml NRG 24 h tai inkuboidaan EBSS väliaineena ilmoitettuina ajankohtina aikoja. Kokosolulysaateille valmistettiin ja alistettiin immunoblot-analyysi anti-GFP-vasta-ainetta. (B) LNCaP-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti LC3-GFP käsiteltiin 100 ng /ml NRG 24 h tai inkuboidaan EBSS väliaineen 2 ja 4 tuntia. Käsittelyt tehtiin läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 nM bafilomysiini-A1 (Bafilo-A1). Kokosolulysaateille valmistettiin ja alistettiin immunoblot-analyysi anti-GFP-vasta-ainetta.

Ylähavas

, edustaja blot.

Ala paneeli

, Densitometrinen analyysi esitetään kertaiseksi induktio valvomisessa käsittelemättömät solut (vasen kaavio; *, p 0,05 ja **, p 0,02 kontrolliin verrattuna) tai erotus mitattujen arvojen kanssa tai ilman 10 nM Bafilo-A1 kussakin ryhmässä (oikea kaavio; *, p 0,05 ja **, p 0,02 verrattuna NRG tretment) (n = 3 tarkoittaa ± SD).

NRG aiheuttama autophagy ja solukuolema LNCaP estyy vähentäminen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tasot

aiemmin osoitettiin, että autophagy induktio riippuu muodostumista ja kertymistä ROS [23], [31] , [32], [33]. Siksi luonnehtia vaikutus ROS on NRG-välitteisen autophagy ja solukuoleman, LNCaP-soluja stimuloitiin NRG läsnä ollessa tai poissa ollessa yleisen antioksidantti

N

-acetylcysteine ​​(NAC) [34 ], ja LC3 ja p62-tasot määritettiin immunoblottauksella (Fig. 3A). Pre-inkubointi NAC estivät täysin NRG aiheuttamaa LC3-II korkeus, mikä osoittaa, että NRG aiheuttama autophagy on ROS-riippuvainen. Seuraavaksi tutkittiin, NAC voi suojata NRG-solukuolema. LNCaP-soluja, jotka on esikäsitelty NAC ja ilman NRG hoitoa, ja solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen metyleenisinen fluoresenssi. Kuten on osoitettu kuviossa 3B, kun läsnä on NAC estää vähentää solujen elinkelpoisuuden aiheuttama NRG. Kaksi muuta havaitsemismenetelmät solukuoleman (Hoecsht eksluusio määrityksessä ja virtaussytometria) tukee edelleen näitä tuloksia. NRG aiheuttama tehostettu solukuolemaa, kuten ilmeistä lisääntyminen Saharan G1 väestöstä (kuvio 3C) tai suuri osa Hoecsht-positiivisten solujen (kuvio 3D). Tämä solukuolemaa inhiboitui merkittävästi NAC. Lisäksi NAC hoito esti NRG aiheuttaman elimellisen muutoksen (S5). Näin ollen meidän havainnot osoittavat selvästi, että NAC estää LC3-II kertymistä, solukuoleman ja morfologisia muutoksia aiheuttama NRG LNCaP-soluissa.

(A) LNCaP-soluja käsiteltiin 100 ng /ml NRG kanssa tai ilman 10 mM

N

-acetylcysteine ​​(NAC) 24 tuntia. Kokosolulysaateille valmistettiin ja alistettiin immunoblot-analyysi anti-LC3 ja anti-p62-vasta-aineita.

Vasen paneeli,

edustavia tuloksia.

Oikea paneeli,

densitometrinen analyysi on esitetty kertainen induktio kontrolliin verrattuna käsittelemättömissä soluissa (n = 6; keskiarvoina ± S.D; * p 0,05). (B) LNCaP-solut testattiin solujen elinkelpoisuus käyttäen metyleenisinen fluoresenssi. Soluja käsiteltiin 100 ng /ml NRG läsnä tai poissa ollessa 10 mM NAC. Metyleenisini analyysi suoritettiin 60 tuntia myöhemmin. Tulokset esitetään% valvonnan, ja ovat keskiarvo ± S.D 4-6 määrityksen (** p 0,0001). Tämä koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. (C) LNCaP-soluja käsiteltiin 100 ng /ml NRG kanssa tai ilman 10 mM NAC. Solut kerättiin 60 tuntia myöhemmin ja analysoitiin niiden DNA-sisällöstä virtaussytometrialla. Solujen prosenttiosuus eri solusyklin vaiheissa on esitetty. (D) LNCaP-soluja käsiteltiin 100 ng /ml NRG läsnä tai poissa ollessa 10 mM NAC 60 tuntia. Solut värjättiin fluoresoivalla DNA väriaine bisbenzimide (Hoecsht 33258, 1 ug /ml) määrän arvioimiseksi kuolla soluja. Sen jälkeen värjäystä solut valokuvattiin käyttäen Olympus optinen käänteinen faasikontrastimikroskoopissa Malli IX70 (20-kertainen suurennus, asteikko baareja, 50 mikrometriä).

Vasen paneeli

, edustaja kuvia.

Oikea paneeli

, prosenttiosuus kuolevat solut arvioitiin laskemalla Hoecsht-positiivisten solujen lukumäärään verrattuna koko solut kussakin kentässä (10-15 kentät kunkin hoitoon, 100-200 solua per kenttä). Tulokset esitetään keskiarvona ± SD (** p 0,0001).

NRG aiheuttama LC3-II Korkeus ja Cell Death LNCaP-soluissa on riippumaton Akt /mTOR-signalointireitin

sen määrittämiseksi signalointireitiksi johtaa NRG aiheuttama autophagy ja solukuolemaa, ensin tutki Akt /mTOR signalointireitin. LNCaP-solut ilmentävät PTEN mutaatio, joka johtaa Akt aktivointi [35], [36]. Akt aktivoi mTOR, joka on tunnettu negatiivinen säätelijä autophagy [37], [38]. Siten oli järkevää tutkia fosforylaation ja aktivaation näiden proteiinien. LNCaP-soluja käsiteltiin NRG 24 tuntia ja aktivointi Akt ja mTOR tutkittiin käyttäen anti-fosfo-Akt ja anti-fosfo S6K vasta-aineita. Kuten kuvassa 4A on esitetty, pohjapinta taso fosforyloidun Akt ja S6K havaittiin ohjaus käsittelemättömissä soluissa, mutta NRG hoito lisäsi tasolla fosforyloidun Akt ja S6K. NAC, joka estää NRG aiheuttamaa autophagy, ei ollut vaikutusta fosforylaation tasoja ei Akt eikä S6K. Nämä tulokset voi ehdottaa, että NRG aiheuttama autophagy on riippumaton mTOR eston. Tutkimaan edelleen signalointireitille mukana NRG aiheuttaman autophagy LNCaP-soluissa, tutkimme seuraavaksi aktivoinnin Erk ja JNK, kaksi tunnettua mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasien (MAPK), jotka ovat alavirran signalointia komponentteja ErbB- reseptorien [39]. Spesifisen anti fosfo-proteiinin vasta-aineita Erk1 /2 ja JNK käytettiin. Kuten kuviossa 4 on esitetty, NRG indusoi fosforylaation lisääntymiseen ja Erk1 /2 ja JNK. NAC, joka estää NRG aiheuttamaa autophagy, ei ollut vaikutusta Erk1 /2 fosforylaation, mikä osoittaa, että Erk aktivointia ei ole mukana NRG aiheuttaman autophagy tai että NAC toimii alavirtaan Erk aktivointia. Toisaalta, JNK fosforylaatiota vähensi voimakkaasti läsnä NAC, mikä osoittaa, että JNK voi olla mahdollinen välittäjäaine NRG aiheuttama autophagy.

(A) LNCaP-soluja käsiteltiin 100 ng /ml NRG kanssa tai ilman 10 mM NAC 24 tuntia. Kokosolulysaateille valmistettiin ja alistettiin immunoblot-analyysiin, jossa mainituilla vasta-aineilla. (B) densitometrinen analyysi useita toistoja on esitetty kertainen induktio ohjaus käsittelemättömistä soluista. Välineet kaistojen intensiteetti oli standardoitu kokonaispainoon verrattuna fosforyloimattoman proteiinin signaalit (Tiedot ovat keskiarvo-kertainen induktio ± SD; * p 0,05).

Koska NRG indusoi S6K fosforylaatiota, mutta indusoi myös autophagy, me seuraava verrattuna autophagy aiheuttama mTOR Inhibitiovyöhykkeiden autophagy aiheuttamien NRG. MTOR-estäjä, rapamysiini, aiemmin osoitettu aiheuttavan autophagy mukaan vähen- tämisessä mTOR toimintaa [37], [40]. Olemme havainneet, että rapamysiini hoito sekä NRG indusoi autophagy, arvioituna lisääntynyt LC3-II /LC3-I-suhde (kuvio 5A ja B) ja tehostetun LC3 puncta muodostumiseen (kuvio 1 B). Kuitenkin odotetusti, S6K fosforylaatio nostettiin seuraavat NRG hoitoa, mutta supistuisivat rapamysiini hoitoa. Lisäksi, NAC hoito esti autophagy aiheuttama rapamysiinin ja NRG, mutta se ei ollut vaikutusta NRG aiheuttamaa S6K fosforylaatio. Kiinnostavaa kyllä, rapamysiini hoito vaikka estivät solujen kasvua [29], ei ollut mitään vaikutusta solujen morfologia, kun taas NRG aiheutti dramaattisen elimellisen muutoksen kuten aikaisemmin on kuvattu [28], [29], ja kuten on osoitettu kuviossa 5C ja kuviossa S1 (pyöreä ja irrotettuja soluja ). Nämä tulokset osoittavat, että NRG aiheuttama autophagy eroaa autophagy laukaisi rapamysiini. Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus NRG ja rapamysiinin yhteistyön käsittely autophagy-inducion LNCaP-soluissa (kuvio 5D). Kuten on esitetty, yhdistetty hoito indusoi korkeampia LC3II verrattuna kunkin hoito yksinään, viittaa siihen, että rapamysiinin ja NRG saattaa toimia eri signaalinvälitysreittien kautta aiheuttaa autophagy.

(A) LNCaP-soluja käsiteltiin joko 100 ng /ml NRG tai 50 nM rapamysiini (rapa) 24 tunnin ajan, kun läsnä tai poissa ollessa 10 mM NAC. Kokosolulysaateille valmistettiin ja alistettiin immunoblot-analyysi anti-LC3, anti-fosfo-S6K ja anti-S6K vasta-aineita. (B) densitometrinen analyysi kuvatut tulokset A on yhtä kuin kertainen induktio ohjaus käsittelemättömien solujen (n = 3, keskiarvo ± S.D). (C) Kuvat ovat solumorfologian seuraavista hoidoista NRG ja rapamysiinin näkyvät (Olympus, 20-kertainen suurennus). (D) LNCaP-soluja käsiteltiin joko 100 ng /ml NRG, 50 nM rapamysiini tai molemmat 24 tuntia. Kokosolulysaateille valmistettiin ja alistettiin immunoblot-analyysi anti-LC3 vasta-aineita. Tämä koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin.

NRG aiheuttama Autophagic solukuoleman LNCaP Riippuu JNK aktivointi

Koska mTOR koulutusjakson ei ole mukana NRG aiheuttaman autophagy ja solukuoleman, etsittiin muita mahdollisia välittäjiä. Päätimme tutkia osallistumista JNK, koska NRG aiheuttama JNK fosforylaatio, joka estyi NAC. Siksi me ensin tutkittiin, mikä vaikutus JNK estäjän SP600125 on NRG aiheuttama autophagy (kuvio 6A). Kuten on esitetty, kun läsnä on SP600125, NRG aiheuttama autophagy estyi, kuten on päätelty laski LC3-II /LC3-I suhteen. Silti SP600125 hoito ei vaikuttanut P62 tasoilla. Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus JNK estäjän solujen elinkelpoisuus käyttäen Hoecsht eksluusio ja metyleenisininen värjäys määritykset (Fig. 6B ja C, vastaavasti). Kuten on esitetty, kun läsnä on JNK-inhibiittori, NRG-solukuolema estyi; mikä osoittaa, että JNK aktivaatio NRG voi olla tärkeä induktion autophagy ja solukuolemaa LNCaP-soluissa.

(A) LNCaP-soluja käsiteltiin 100 ng /ml NRG 24 tuntia tai ilman 20 uM SP600125. Kokosolulysaateille valmistettiin ja alistettiin immunoblot-analyysi anti-LC3, anti-p62, anti-p-JNK ja anti-JNK-vasta-aineita.

Vasen paneeli,

edustavia tuloksia.

Oikea paneeli,

densitometrinen analyysi on esitetty kertainen induktio kontrolliin verrattuna käsittelemättömissä soluissa (n = 5 tarkoittaa ± S.D; * p 0,05). (B) LNCaP-soluja käsiteltiin 100 ng /ml NRG läsnä tai poissa ollessa 20 uM SP600125 60 tuntia. Solut värjättiin fluoresoivalla DNA väriaine bisbenzimide (Hoecsht 33258, 1 ug /ml) määrän arvioimiseksi kuolla soluja. Sen jälkeen värjäystä solut valokuvattiin käyttäen Olympus optinen käänteinen faasikontrastimikroskoopissa Malli IX70 (20-kertainen suurennus, asteikko bar, 50 mikrometriä).

Vasen paneeli

, edustavat kuvat näkyvät.

Oikea paneeli

, prosenttiosuus kuolevat solut arvioitiin laskemalla Hoecsht-positiivisten solujen lukumäärään verrattuna koko solut kussakin kentässä (10-15 kentät kunkin hoitoon, 100-200 solua per kenttä). Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D (** p 0,0001). (C) LNCaP-solut testattiin solujen elinkelpoisuus käyttäen metyleenisinen fluoresenssi. Soluja käsiteltiin 100 ng /ml NRG läsnä tai poissa ollessa 20 uM SP600125. Metyleenisini analyysi suoritettiin 60 tuntia myöhemmin. Tulokset esitetään% valvonnan, ja ovat keskiarvo ± S.D 4-6 määrityksen (** p 0,0001). Tämä koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin.

Beclin 1 on välttämätön ja Bcl-2-resistenssin NRG aiheuttama Autophagy ja Cell Death

Beclin 1, osa luokan III PI3K: monimutkainen, on merkittävä tunnettu säätelijä autophagy [41], [42]. Määrittää osallistumista tämän väylän NRG aiheuttama autophagy, LNCaP-solut transfektoitiin sh-Beclin 1 tai valvontaa salattu sh-RNA ekspressiovektorit. Kuten kuviossa 7A, NRG hoito parantaa autophagy kontrollisoluissa. Kuitenkin sh-Beclin 1 transfektoituja soluja, NRG-välitteinen autophagy väheni kontrolliin verrattuna soluihin. Nämä tulokset osoittavat, että Beclin 1-proteiini on osallisena NRG välitteisen autophagy LNCaP-soluissa.

(A) LNCaP-solut transfektoitiin Beclin 1 sh-RNA: ta (3 ug) tai kontrolli salattu sh-RNA: ta (3 ug) ja inkuboitiin normaalissa väliaineessa 72 tuntia. Solut käsiteltiin sitten 100 ng /ml NRG vielä 24 tuntia. Kokosolulysaateille valmistettiin ja alistettiin immunoblot-analyysi anti-LC3 ja anti-Beclin 1-vasta-aineita.

Vasen paneeli

, edustava koe esitetään.

Oikea paneeli

, määrällisesti tulokset näytetään. Tulokset on esitetty kertainen induktio kontrolliin verrattuna käsittelemättömiin soluihin (n = 3, keskiarvo ± S.D; * p 0,05). (B) Naiivi tai Bcl-2-GFP: tä stabiilisti ilmentäviä LNCaP-soluja käsiteltiin 100 ng /ml NRG varten osoitetun ajanjaksoja. Kokosolulysaateille valmistettiin ja alistettiin immunoblot-analyysi anti-LC3 ja anti-Bcl-2-vasta-aineita.

Vasen paneeli

, edustaja blot on esitetty.

Oikea paneeli

, määrällisesti tulokset on esitetty kertainen induktio kontrolliin verrattuna käsittelemättömiin soluihin (n = 3, keskiarvo ± S.D; * p 0,05). (C) Naiivi ja Bcl-2-GFP: tä stabiilisti ilmentäviä LNCaP-solut testattiin solujen elinkelpoisuus käyttäen metyleenisinen fluoresenssi. Soluja käsiteltiin 100 ng /ml NRG ja metyleenisininen määritys suoritettiin 60 tuntia myöhemmin. Tulokset esitetään% valvonnan, ja ovat keskiarvo ± S.D 4-6 määrityksen (** p 0,0001). Tämä koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin.

jäsenet Bcl-2 anti-apoptoottisia perheen aiemmin osoitettu estävän autophagy edistävää aktiivisuutta Beclin 1 [23]. Se ilmeni myös, että aikana autophagy vuorovaikutus Bcl-2 anti-apoptoottisten proteiinien ja Beclin 1 estyy. Olettaen, että Beclin 1 on mukana NRG aiheuttama autophagy ja solukuolemaa, me arveltu, että yli-ilmentyminen Bcl-2 suojaisi LNCaP-solujen NRG-indusoidun autophagy ja solukuolemaa. Näin ollen, seuraavan kerran tutkittiin, mikä vaikutus Bcl-2-GFP ilmentymisen vaikutus NRG-välitteisen autophagy LNCaP-soluja (kuvio 7B). Kuten on esitetty, autophagy naiivi LNCaP-solujen lisääntynyt sen jälkeen, kun 16 tuntia ja 24 NRG hoitoa, kun taas LNCaP-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät Bcl-2-GFP: n, NRG hoito ei ollut vaikutusta tasoilla autophagy induktion. Lisäksi Bcl-2-GFP: n yli-ilmentävät LNCaP-solut olivat resistenttejä NRG solukuolema kuin naiivi LNCaP-soluja (kuvio. 7C). Yhdessä tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että lisäksi JNK aktivointi, Beclin 1 on myös olennaisen tärkeää autophagic prosessia edistetään NRG.

Keskustelu

Eturauhasen syöpiä yleensä aloittaa androgen-herkkien vaurioita mutta usein kehittyy androgen-tunteeton vaurioita kanssa eteneminen vaiheissa. LNCaP androgeeniriippuvaisissa ekspressoi korkeita ErbB-2 ja ErbB-3 verrattuna muihin ihmisen eturauhasen syöpäsolujen [28]. Lisäksi nämä solut eivät ilmennä NRG mutta ne TGF-α ja EGF, joka voi toimia autokriininen aktivaattoreina EGFR [28]. Aiemmin osoitettiin, että LNCaP-soluissa kasvatettu ilman androgen jäljittelevää, NRG mutta ei EGR indusoi solukuolemaa. Tämä vaikutus NRG solukuolemaan välittyy ErbB-2 /ErbB-3-heterodimeerejä [29]. Se osoitti myös, että solukuolema NRG estyy PI3K-estäjien, mikä osoittaa, että NRG voi aiheuttaa autophagic solukuoleman [29]. Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa, että NRG todellakin indusoi autophagy LNCaP-soluissa, käyttäen kahta määrityksiä: immunoblot-analyysi anti-LC3 vasta-aineita ja mikroskooppinen analyysi LC3-GFP värjäytyminen LNCaP-soluissa. Tämä vaikutus NRG myös esti 3-MA. Kuitenkin autophagy aiheuttama NRG on epätäydellinen, koska ei heikkene p62-proteiinin seuraavat NRG hoidon havaittiin. Näin ollen, NRG aktivointi ErbB2 /ErbB3-heterodimeerien aiheuttaa epätäydellinen autophagy ja solukuoleman LNCaP-soluissa.

reaktiivisen hapen (ROS) on osallisena signalointireittien aloitetaan reseptorityrosiinikinaasit, mukaan lukien ErbB-reseptorit [43], [ ,,,0],44]. Useita linja todisteet osoittavat, että reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) osansa autophagy. Ensinnäkin, ROS tarvitaan nälkään aiheuttama autophagy, ilmeisesti johtuen sääntelyä Atg4 toimintaa [32]. Toiseksi ROS itse voi aiheuttaa autophagy tietyissä solulinjoissa [31], [45]. Tuloksemme osoittavat, että NRG aiheuttama autophagy on herkkä ROS tasolle, koska läsnä ollessa yleisen antioksidantti NAC, NRG aiheuttama autophagy ja solukuoleman estyy.

Se oli aiemmin osoittaneet, että mTOR toimii negatiivisena säätelijänä autophagy tukahduttamalla aktiivisuus Atg13 /Atg1 kompleksin [46]. Täten kasvutekijöitä ja tiettyjen hormonien vaikutus perustuu niiden anti-autophagic vaikutus aktivoimalla luokan I PI3K /Akt /mTOR-reitin [47]. Toisaalta, pro-autophagic ärsykkeet, kuten ravinteita nälkään ja rapamysiini hoitoa, johtaa mTOR inaktivoitumisen seuraa autophagy induktion. Todellakin, mTOR rapamysiinillä aiheuttama autophagy LNCaP-soluissa. Samana solut, tuloksemme osoittavat, että NRG indusoi mTOR aktivaation kuin ilmeistä fosforylaatiota S6K, ja sen alkupään säädin Akt. Lisäksi se on aiemmin osoitettu, että NRG indusoi ErbB2 /ErbB3-heterodimeerin muodostumista ja I-luokan PI3K aktivaation LNCaP-soluissa [28]. Yhdessä näyttää siltä, ​​että NRG aktivoi anti-autophagic signalointireitin, eli ErbB /I-luokan PI3K /Akt /mTOR-reitin ja vielä edistää autophagy induktio LNCaP-soluissa. NAC, joka täysin estää NRG aiheuttama autophagy, ei vaikuta fosforylaation ole Akt eikä S6K. Siksi ehdotamme, että NRG aiheuttama autophagy on riippumaton mTOR eston.

NRG indusoi aktivoinnin eri signalointireittien. Se oli aiemmin osoittaneet, että LNCaP-soluissa, NRG aktivoi muun signaalinvälitysreittien myös MAP-kinaasien: Erk, p38, JNK ja PI3K signalointireitteihin [28]. Yritimme seurata signalointireitin johtavan NRG aiheuttamaa autophagy ja solukuolemaa. Tuloksemme osoittavat, että JNK on mukana NRG aiheuttaman autophagy ja solukuolemaa. Todellakin, Yhä useammat todisteet olemassa roolista JNK välittäjänä autophagy induktion seuraavista erilaisiin ärsykkeisiin [48], [49], [50]. Suostumuksella Näiden havaintojen osoitimme, että JNK fosforylaatio lisääntyy seuraavan NRG hoidon LNCaP. Huomasimme myös, että NAC, estäjä NRG aiheuttaman autophagy ja solukuolemaa, lohkot JNK fosforylaatio. Yhdessä ehdotamme, että JNK välittää pro-autophagic vaikutus NRG. Itse asiassa, kun läsnä on JNK-inhibiittori SP600125, NRG-solukuolema ja autophagy estyi.

ydintyminen ja kokoonpano autophagosome edellyttää aktivointi-luokan III PI3K kompleksi, joka koostuu PI3K (vps34 ), vps15, atg14 ja atg6 (Beclin 1 nisäkässoluissa) [19], [20]. Beclin 1-välitteinen autophagy säätelee negatiivisesti sen vuorovaikutus Bcl-2 anti-apoptoottisia proteiineja.