Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suurin ongelma syöpätutkimuksessa on puute mukautuva malli myöhässä etäpesäke. Tässä osoitamme, että syöpäsolut tukahdutti SISgel, geelin muodostavan normaalia ECM saadun materiaalin Ohutsuoli submukoosassa (SIS), vuonna kylkeen ksenografteissa osoittavat ominaisuudet tukahduttaminen ja uudelleen aktivointi, jotka ovat hyvin lähellä normaalia myöhässä etäpesäkkeiden ja ehdottaa näiden tukahdutetaan solujen voi toimia uutena mallin kehittämiseksi terapeuttisten kohdistaa micrometastases tai tukahdutetaan syöpäsoluja. Co-injektion SISgel tukahdutti pahanlaatuinen fenotyyppi erittäin invasiivisen J82 virtsarakon syöpäsoluja ja erittäin metastaattinen JB-V virtsarakon syövän solut nude hiiren kylkeen ksenograftit. Solut voivat jäädä toteuttamiskelpoinen enintään 120 päivää muodostamatta kasvaimet ja näytti paljon hyvin erilaisia ​​ja vähemmän epätyypillisten kuin kasvaimet soluista yhteistyössä ruiskutetaan matrigeeliin. Vuonna 40% SISgel ksenograftien talous lähti kasvuun vuonna pahanlaatuiseen fenotyyppiin ajan jälkeen tukahduttaminen tai lepotilamuotoja vähintään 30 päivää ja oli todennäköisempää implantaatioon 3 miljoonaa tai enemmän soluja. Tavallinen tyyppi I kollageeni ei tukahduttaa pahanlaatuinen kasvain, ja kasvaimet kehittyi suunnilleen yhtä hyvin kollageenin kuin Matrigel. Selvä signaali geenien ilmentyminen yli erilaiset solulinjat eivät ole pitäneet transcriptome mikrosiruanalyysillä, mutta sen sijaan, Reverse Phase Protein analyysi 250 proteiinien yli 4 solulinjoista tunnistettiin integriiniin sitoutuvan Kinase (ILK) signalointia, joka funktionaalisesti vahvistettiin ILK-estäjä. Ehdotamme, että syöpäsolut tukahdutettiin SISgel voisi toimia mallina lepotilan ja uudelleen herääminen jotta tunnistamiseksi terapeuttisia kohteita hoitoon micrometastases.

Citation: Hurst RE, Hauser PJ, Kyker KD, Heinlen JE , Hodde JP, Hiles MC, et al. (2013) tukahduttamiseksi ja aktivointi pahanlaatuisen fenotyypin soluväliaineen ksenograftimalleja Virtsarakon syövän: malli Kasvainsolun ”lepotilan”. PLoS ONE 8 (5): e64181. doi: 10,1371 /journal.pone.0064181

Editor: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2012 Hyväksytty: 12 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 24, 2013

Copyright: © 2013 Hurst et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat, osittain tutkimusapurahoja R01CA75322, R01DK69808, avustusta Cook Biotech ja avustusta Stephenson Cancer Center (REH); R01 CA136944 ja R43 CA135867 (MAI) ja R43CA139804 (PJH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Robert Hurst, Paul Hauser, Kim Kyker ja Michael Ihnat ovat osakkeenomistajilta DormaTarg, Inc. Michael Hiles ja Jason Hodde työskentelee Cook Biotech. Mikään muu kirjoittajat ovat kilpailevia intressejä. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

ilmentäminen pahanlaatuinen fenotyyppi ei ole välitöntä eikä edes väistämätön seuraus mutaation tuumorisuppressorigeeneille tai onkogeenien. On ollut pitkään tunnettua, että ilman remodeling solunulkoisen matriisin (ECM), syöpäsolut eivät pysty muodostamaan kasvaimia [1], [2], ja että ECM itsessään sisältää elementtejä sekä antagonistinen ja agonistinen pahanlaatuisen fenotyypin [1]. Tärkeys ECM on viime aikoina tullut yhä ilmeisemmäksi, kun ilmiö lepotilan metastaattisen solujen on tunnustettu [3] – [5], ja että ensimmäinen sitoutunut askel etäpesäke on vuotaminen mikrometastaattisessa solujen paikallisesta estävä tekijöitä, jotka suosivat jatkoi lepotilamuotoja [6], [7]. Lisäksi havainto, että solujen epänormaali genomien näihin kasvaimeen liittyviä antigeenejä histopatologisesti normaalissa uroteeliin [8], tai soluja, joiden p53 mutaatioita ominaista primaarikasvaimen löytyvät histopatologisesti normaalissa suun limakalvojen [9] osoittaa, että syöpäsolut voivat naamioitua normaalit solut . Tukahduttaminen pahanlaatuisten ominaisuuksien solujen mahdollisuuksia kasvainten muodostumiseen voi hyvinkin taustalla latenssiaika primaarituumorin kasvun sekä viivästyneen paikallisten ja distaalinen uusiutumisen. Ehkä ”lepotilamuotoja” voisi osaltaan siitä syystä, että vaikka uudempia ”kohdennettu” hoitoja ja miljardeja dollareita syöpätutkimuksessa, yleinen syöpään erityinen selviytyminen on muuttunut vain vähän [10], [11]. Dormant soluja ei ole edes tunnustettu mahdollisena kohteena viime aikoihin asti [12], ja selvästi tällaiset solut ovat resistenttejä tavanomaisille kemoterapiaa sillä hyvin rajallinen teho adjuvanttihoitoa [3], [13]. Mitä tarvitaan, on malli järjestelmä, jolla voidaan tutkia mekanismeja tukahduttaminen ja aktivointi syöpäsolujen ECM, joka voidaan käyttää myös tunnistamaan ja testata lääkkeiden, jotka on kohdistettu ECM-tukahdutetaan syöpäsoluja.

Aiemmin osoitettu että fenotyyppi virtsarakon syövän solujen oli aivan erilainen 3-ulotteinen organotyyppisessä viljelmässä, kun kasvatettu normaalilla soluväliaineen valmisteen (SISgel) verrattuna, että havaittu syöpää moduloidun salliva soluväliaineen valmisteen (Matrigel) [14]. SISgel on geelin muodostava materiaali on saatu soluton sian ohutsuolesta submucosa, kun taas Matrigel on tyvikalvon valmiste, joka on saatu hiiren sarkooma [15]. Kun kasvanut Matrigelillä virtsarakon syövän solut kertasi fenotyyppi raportoitu alkuperäisestä kasvaimesta. Jyrkästi, useimmat pahanlaatuinen ominaisuudet menetetään, kun soluja kasvatettiin SISgel [14]. Johdetut solulinjat papillomas viljelty SISgel muodostettu kerrosrakenne muistuttaa normaalia uroteelin, kun taas solulinjat, jotka ovat peräisin korkeamman luokan kasvaimia muodostettu noninvasiivinen kerros soluja [14]. Nämä havainnot ehdottivat, että syöpäsolujen kasvun normaaleilla ECM voisi tarjota mallin tutkia ilmiö tukahduttaminen maligniteetin normaalilla ECM ja sen roolia etäpesäkkeitä ja uusiutumisen.

Tässä tiedonannossa selvitimme onko fenotyyppinen tukahduttaminen nähty organotyyppisessä kulttuuri virtsarakon syövän solujen SISgel havaitaan myös

in vivo

. Positiiviset tulokset tukevat käyttöä SISgel mallina tutkimuksia lepotilassa tai tukahdutetaan kasvainsolun fenotyypin ja mekanismeja, joilla normaalit ECM kohdistaa estävä vaikutus kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeitä. Havainnot viittaavat vahvasti siihen, että vuorovaikutukset syöpäsolujen normaalin ECM tärkeä rooli toistuminen ja etäpesäke ja edelleen ehdottaa, että kohdistaminen tukahdutetaan solujen voisi olla tähän asti hyödyntämättä pisteen haavoittuvuuden syöpähoidon.

Tulokset

fenotyyppi yksi aggressiivinen virtsarakon syövän solulinjat kasvatettiin SISgel, kollageenin ja Matrigel viljelmässä on esitetty kuviossa. 1. invasiivisia, aggressiivinen fenotyyppi Matrigelillä ja kollageeni havaitaan. Matrigelillä solut hyökkäsi, mutta edessä, kuten kliinisissä kasvaimia. Kollageeniin, yksittäisten solujen hyökkäsi, kun taas jotkut solut pysyi geelin pintaan, ja ne, jotka hyökkäsi oli mesenkymaaliset ulkonäkö. Solut kasvatetaan Matrigelillä osoitti myös eri kokoja ja ydinvoiman suuntaviivat osoittavat aggressiivinen fenotyypin. Tämä fenotyyppi on selvästi ristiriidassa, että havaittu SISgel, jossa solut eivät hyökätä ja muodostivat kerroksen päälle geelin. Solut osoittivat epiteelin fenotyyppi, ja ytimet olivat yhdenmukaiset ja järjestetään osoittaa normalisoidun fenotyypin.

Huomaa menetys hyökkäyksen ja entistä hallitumpi ulkonäkö soluja kasvatetaan SISgel. Kaikki suurennokset ovat 200X. Kuvat edustavat vähintään 4 kokeiluja.

vieressä selvitettävä, tukahduttaminen pahanlaatuinen ominaisuudet nähdään 3-ulotteinen kulttuuri havaittiin myös

in vivo

in kylkeen ksenografteissa. Tyypillisiä tuloksia käyttäen J82-solut kuviossa. 2. fluoresenssi kuvaa solujen vain injektion jälkeen on esitetty kuviossa. 2A. Ulkonäkö kasvain, joka kasvoi solut samanaikaisesti ruiskutetaan matrigeeliin on esitetty kuviossa. 2B. Kuva. 2C osoittaa tyypillisen tuloksen solujen yhteistyössä ruiskutetaan SISgel. Solut pysyvät tasaisella paikalla, että hehkuu heikosti alle jännittävä valaistus mutta joita ei yleensä muodosta kasvava kasvain ja pysyy näkyvissä viikkoja. Joissakin osa näistä SISgel ksenograftien, kuitenkin solut paeta tukahduttaminen ja alkaa kasvaa aktiivisena kasvain, kuten on esitetty kuviossa. 2D. Kuten näkyy alla, osa, joka pääsee uudelleen aktiivisesti kasvua riippuu solujen lukumäärä pistetään.

(A) Solut havaittiin 24 tunnin kuluttua implantaatiosta. (B) solujen yhteistyötä ruiskutettiin matrigeelin havaittu 60 päivän jälkeen osoittaa aktiivisesti kasvavien kasvain. (C) solut yhteistyössä ruiskutettiin SISgel jälkeen havaittiin 50 päivää osoittaa soluista on eläviä, mutta eivät kasva osaksi kasvain ( ”hehkuva spot”). (D) solut yhteistyössä ruiskutetaan SISgel että karannut Alkuperäisten tukahduttaminen esitetty 60 päivän kuluttua injektion. Solut jäi hehkuva paikalla (katso C) 45 päivää, sitten jatkettiin nopea kasvu kasvain. Kasvu määritettiin kaksi peräkkäistä koko kasvaa.

kasvaimia, jotka on muodostettu solujen yhteistyötä injektoitu matrigeeliä, kollageeni I tai karannut solujen yhteistyötä injektoitu SISgel tutkittiin histopatologisesti yhdessä yhden täplät tukahdutetaan fluoresoivien solujen joka epäonnistui kehittyä kasvava kasvain. Nämä tulokset, jotka esitetään kuviossa 3, vahvistaa, että solut vaimennetaan SISgel. Kuva. 3A esittää tyypillistä jakso JB-V soluja, jotka kasvoivat kasvaimeen seuraavat yhteistyössä injektion matrigeeliä. Ulkonäkö on, että aggressiivinen kasvain lukuisia apoptoottiset kappaleet ja mitoottisia. Solut ovat selvästi pleiomorphic ja erittäin anaplastinen, alueet coagulative kuolion ovat läsnä ja useimmat alukset näkyvät epänormaali. Histopatologisen yhden tukahdutti laikkuja solujen yhteistyössä ruiskutettiin SISgel esitetty selvästi kuvassa. 2C on esitetty kuvassa. 3B. Toisin kuin aktiivisesti kasvavien kasvainten solut ovat enemmän eriytetty, vähemmän anaplastinen tai pleiomorphic normaali esiintyy alusten, hyvin harvat mitoottisia, ja mimal todisteita apoptoottisten tai nekroottisten alueilla. Kuva. 3C esittää leikkausta yhdestä kasvaimia, jotka kasvoivat SISgel kauden jälkeen lepotilan 8 viikkoa. Kasvain on histopatologisesti samanlainen kuin kuvio. 3A ja vahvistaa, että kun kasvaimia paeta tukahduttaminen, ne uudelleen aggressiivista fenotyypin. Kuva. 3D osoittaa, että solut yhteistyössä ruiskutettiin kollageenin muodostavat myös aggressiivinen-näkymisen kasvain jolla on samanlaiset ominaisuudet kuvioihin 3A ja 3B. Trichrome värjäys kollageenin kaikissa kudoksissa paljasti, että kun näistä kasvaimista tai laikkuja tukahdutetaan solut kerättiin alkuperäisen kollageenia yhteistyössä injektio väliaine oli hävinnyt (ei esitetty). Ainoa havaittavissa kollageenia kuvassa. 3B oli alusta. Kuva. 4 kontrastit ilmaus leviämisen merkki, Ki67 ja mesenkymaaliset merkki, vimentiinistä vuonna kylki ksenografteissa ja vahvistaa histopatologiselle arvioinnissa esitetty kuvassa. 3. Kuten esitetty, hyvin harvat solut tukahdutettu solukudosviljelmiä ovat solusyklin, ja on hyvin vähän vimentiinista ilme. Sen sijaan aktiivisesti kasvavien kasvainten ominaista korkea ekspressiotaso sekä, mikä osoittaa, aggressiivisesti kasvavat fenotyyppi. Kasvaimet alkaen J82 solut hyvin samanlaisia ​​kuin esitetty JB-V soluja kaikissa suhteissa.

Ominaisuudet tunnistettu histopatologisesti esitetään seuraavasti. Alueet pahanlaatuisia soluja on esitetty mustalla ja alueet coagulative kuolion on esitetty keltaisella. Mustat nuolet kuvaavat apoptoottisia kappaleita. Keltaiset nuolet tunnistaa mitoottisiin lukuja. Tällä zoomaustaso kuvassa nämä ovat vaikea erottaa, mutta havaittiin alle suuren tehon. (A) Soluja yhteistyössä ruiskutetaan matrigeeliin että välittömästi esitti pahanlaatuisen kasvun kuvio. Patologisen kuvaus totesi laajoja alueita coagulative kuolion kanssa akuutin tulehduksen (pieni, tiheä solut ovat neutrofiilejä), joiden pinta-ala on erittäin epätyypillisten solujen paljastava merkitty ydinvoiman pleomorfisimia, kaikki alustavat korkealuokkaisesta neoplasia. (B) Soluja yhteistyössä ruiskutetaan SISgel, joka jäi tukahdutettu tai lepotilassa fenotyyppiä. Tämä dia luettiin soluiksi, joilla on kohtalainen solun atypia ja pleomorfisimia minimaalisella näyttöä coagulative kuolion, mitoosin ja apoptoosin. (C) Solut yhteistyössä ruiskutetaan SISgel että aluksi esitti tukahdutetaan fenotyyppi 8 viikkoa, mutta sitten uudelleen kasvua pahanlaatuiseen fenotyyppiin. Tämä luettiin sisältävän alueen coagulative kuolion kanssa akuutin tulehduksen ja pesäkkeet selvästi epätyypillinen soluja yhdessä näkyvä mitoosia ja apoptoosin. Jotkut kentät sisälsi Monitumaisia ​​kasvain jättisolut yleensä osoitus korkealaatuisesta neoplasia (D) Solut yhteistyössä ruiskutettiin Kollageeni I osoittavat pahanlaatuinen kasvumalli kaltaisia ​​havainnollistettu kentät A ja C. Kaikki kuvat ovat 400X.

JB-V soluja yhteistyössä ruiskutetaan matrigeeliin ja merkitään Ki67 (A) ja vimentiinista (C). JB-V solujen yhteistyötä pistetään SISgel ja tukahdutetaan fenotyypin merkitty Ki67 (B) ja vimentiinista (D). Controls jättämällä pois primaarinen vasta-aine (ei esitetty) olivat täysin negatiivisia sekä markkereita. Kuvia 200X.

Kaplan-Meier-käyrät tiedoista on esitetty kuviossa. 5A päätepiste on alkamassa kasvaimen kasvua; joka on tässä tapauksessa ”Survival” lasketaan selviytyminen tukahdutetaan fenotyypin. Koska kaikki kokeet sisälsivät matrigeelin positiivisia kontrolleja kanssa samaan soluun numerot samoissa suhteissa kuin käytettiin SISgel, Fig. 5A yhdistää kokeilee erilaisia ​​solujen määrä. Kun yhteistyössä ruiskutettiin matrigeeliä, solujen kehittynyt kasvaimia 30 päivän kuluessa 100% eläimistä, jopa niin vähän kuin 250.000 solua. Jossa SISgel, tämä ei selvästikään ollut kyse, ja vain noin 40%: lla eläimistä lopulta kehittyi kasvava kasvaimia viiveen jälkeen neljän ja niin kauan kuin 18 viikkoa. Ero käyttäytyminen solujen välillä yhteistyössä ruiskutetaan matrigeeliin ja SISgel oli tilastollisesti erittäin merkitsevä (p 0,0001). Yhteensä 70 -ksenografteja valmistettiin SISgel. 60%: lla eläimistä, joilla ei ole kasvainta kehittyi, monet istutettiin soluja jäi vihreää fluoresoivan täplän, vaikka joissakin tapauksissa paikalla ei enää ollut havaittavissa useita viikkoja. Kaksi ksenografteissa, jossa implantoidut solut oli ilmeisesti hävinnyt, kasvaimia ilmestyi uudelleen yksi eläin 12 viikon kuluttua ensimmäisestä injektiosta, kun taas toisessa eläimessä yhä kasvain selvästi muodostaviksi 15-16viikko. Vaikka vähintään 95% soluista oli loisteputki valmistettuna, kahdessa tapauksessa, uudelleen uutena kasvaimet eivät ilmaista GFP osoittamalla tavalla brutto tutkimus, ja toisessa, brutto tutkimus osoitti mosaiikki fluoresoiva ja ei-fluoresoivia soluja. Uudelleen syntyminen pahanlaatuisen fenotyypin riippuu solujen määrä, joissa on enemmän kasvaimia todennäköisempiä, kun yli 3 miljoonaa solua injektoidaan kuin silloin, kun alle 3 miljoonaa solua injektoitiin (p 0,0001) (Fig. 5B). Ei ollut havaittavia eroja käyttäytymisessä JB-V ja J82-solujen (p-arvot eloonjäämiskäyriä olivat kaikki suurempi kuin 0,2), vaikka JB-V-solut oli valittu olemaan erittäin metastaattinen ja kasvaa edullisesti virtsarakon [ ,,,0],16].

(A) SISgel vs Matrigel. (B) vähintään kolme miljoonaa solua implantoitiin vs. vähemmän kuin kolme miljoonaa solua.

Testasimme myös, onko geeli yhteistyössä injektoitu kasvainsoluja oli dominoiva syöpäsolun fenotyyppi saavutettu viljelmässä. Taulukossa 1 on yhteenveto kasvainten kasvua mukaisesti ECM jona ne viljelmässä sekä joka ECM oli yhteistyössä ruiskutetaan kylkeen kanssa kasvainsolujen kasvun jälkeen ECM kulttuuriin. ECM yhteistyössä ruiskutetaan eläimiin kanssa virtsarakon kasvainsolut säätelevät onko kasvaimia muodostunut, ja fenotyyppi perustetun ECM johon soluja kasvatettiin valtasi yhteistyössä ruiskutetaan ECM. Kuten odotettua, solut, jotka olivat yhteistyössä ruiskutettiin matrigeelin tasaisesti muodostunut kasvava kasvaimia, riippumatta siitä, miten ne oli kasvatettu kulttuuriin. Co-injektion SISgel tukahdutetaan virtsarakon syövän solut, jotka olivat olleet aktiivisesti kasvava ja täysin ilmentävät pahanlaatuinen fenotyyppi Matrigelillä

in vitro.

Mielenkiintoisesti solut kasvatetaan Matrigelillä ja yhteistyötä ruiskutettiin pelkästään viljelyalustassa eivät kyenneet kasvain muodostuminen, mikä edelleen tukee että paikallinen matriisi on tärkeämpää kuin fenotyyppi solut, kun ne injektoidaan. Ei kokoero, kasvu tai kokonaispaino selvästi oli havaittavissa välillä kasvainten muodostettu soluihin, joita oli viljelty tukahduttava fenotyypin SISgel, mutta jotka samanaikaisesti injektoitiin matrigeeliä verrattuna soluihin, joita oli kasvatettu Matrigel tai muovista ja ne yhteis- ruiskutetaan matrigeeliin.

Koska pääkomponentti SISgel on kollageeni I [17], myös yhteistyössä ruiskutetaan J82 solut, jotka oli kasvatettu muovinen kollageeni I toisin SISgel, kollageeni I kasvaimet kasvoi nopeasti; ja kahdeksan 12 eläimen kolmessa eri kokeessa kasvaimet kasvoivat ajassa perustettu Matrigel. Samoissa kokeissa yksikään 12 eläinten yhteistyötä ruiskutettiin SISgel kehittyi kasvaimia. Ero solujen yhteistyötä injektoitu kollageeni ja SISgel oli erittäin merkitsevä (p = 0,0013), mutta ero solujen yhteistyötä injektoitu kollageeni ja Matrigel ei ollut (p 0,05).

Tutkimme myös mekanismi tukahduttamista vertaamalla geenin ilmentymisen ja proteiinin ilmentymisen profiilit soluja kasvatettu SISgel samaa soluja kasvatettu Matrigel. Microarray tutkimukset olivat pääosin epäinformatiivisia, mikä viittaa siihen, että ilmiö tukahduttaminen ei säännellä geenin ilmentymisen tasoa. Vaikka 243 geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä J82 solut kasvatetaan SISgel vs. Matrigelillä ja 214 olivat erilailla ilmaisseet JBV soluja kasvatettiin samoissa olosuhteissa, oli hyvin vähän päällekkäisyyttä. Vain 11 geenit olivat yhteisiä kaksi listaa, eikä niitä ole esiintynyt johdonmukaisesti ilmennetty eri puolilla matriisit samaan suuntaan molemmissa solulinjoissa. Tutkiminen ontologioista geenin sarjat osoittivat, että geenit ilmentyvät differentiaalisesti kahden solulinjoja kasvatetaan Matrigelillä tai SISgel olivat erilaisia ​​ontologioista. Olemme päätellä, että puute johdonmukaisen geeniekspression allekirjoitus eri solulinjoja viljellään eri matriisi valmistelu osoittaa, että ilmeinen fenotyyppiset erot on seurausta differentiaalikaavojen proteiinitasolla mieluummin kuin geenin ilmentymisen sääntely.

Käänteinen Phase Protein Array (RPPA) proteiinin analyysi 250 avain viestintäproteiinit tunnistivat (Fig. 6A) johdonmukainen allekirjoitus kaikissa 4 solulinjoissa. Pathway analyysi IPA käyttämällä geeniä nimet osoitti seuraavat olivat erittäin merkittävästi mukana. PI3K /AKT Signaling (p = 1,00 x 10

-8, mTOR, GSK3A, GSK3b, TNNB1, EIF4E), insuliini reseptorisignalointi (p = 1,70 x 10

-8 BRAF, RB1, mTOR, GSK3b, CTNNB1 ) ja ILK Signaling (p = 9,12 x 10

-8 mTOR, insuliinireseptorisubstraatti 1, GSK3A, GSK3b, CTNNB1). Toiminnallista roolia ILK vahvistettiin käyttäen pieni molekyyli ILK: n estäjän, joka osoitti, että inhibitio ILK J82-solut on kasvatettu Matrigel tuotti invasiivisen fenotyypin hyvin samanlainen kuin havaittiin, kun soluja kasvatettiin SISgel kuten on esitetty kuviossa. 7. Tyypillinen invasiivisia kasvain kaltainen fenotyyppi nähdään kuvassa. 7A kanssa J82 soluja kasvatettu Matrigel. Sen sijaan invasiivisen fenotyypin poistetaan, kun 10 uM QLT0267 lisätään elatusaineeseen solujen kasvatettu Matrigel (Fig. 7B). Fenotyyppi on samanlainen kuin havaittiin, kun soluja viljellään SISgel (Fig. 1), paitsi, että useita kerroksia on muodostettu.

symboli (V) ilmaisee vasta-aineen validoitu osoittaa yhden ainoan vyöhykkeen Western blot. ”P” tarkoittaa, että vasta-aine on vastaan ​​fosforyloidun proteiinin muoto, jossa aminohappoasemassa ja identiteetti tarjotaan. Kaksi mTOR merkinnät edustavat kaksoiskappaleet. Täydellinen luettelo käytetyt vasta-aineet aikaan analyysin palvelee Taulukko S1.

J82 soluja kasvatettiin Matrigelillä viisi päivää ilman ILK-estäjä (ylhäällä) tai 10pM QLT0267 ILK-estäjä (alapaneeli). Huomautus tukahduttamista hyökkäystä. Kaikki suurennokset ovat 200X. Kuvat edustavat 3 kokeita.

Keskustelu

Kun syöpäsolu hankkii tarvittavat mahdollistaa syöpää aiheuttavia mutaatioita tai metastaattinen solu pakenee liikkeestä on kuitenkin normaalissa ympäristössä, joka ei ole salliva kasvaimen kasvun takia useita, tarpeeton säätimet, jotka toimivat erottaa ja estää replikaation epiteelisolujen [1], [2], [7]. Escape from nämä normaalit kontrollit todennäköisesti on ensimmäinen, joka on sitoutunut askel muodostumista ensisijainen, paikallisesti toistuvat, ja etäpesäkkeitä. Ehdotamme, että kulttuuri esitetty malli aiemmin [14] ja ksenograftimallia esitetään tässä edustaa uutta mallia tutkimiseksi tärkeitä ilmiöitä tukahduttaminen maligniteetin ja lepokauden, ja tunnistaa uusia hoitoja hyökätä etäpesäke ja toistuminen sen haavoittuvimpien pisteen.

Tämä malli mittaa useita olennaisia ​​osia tukahduttaminen ja regenerointi, joita havaitaan kliinisesti. Pahanlaatuinen fenotyyppi virtsarakon syövän solulinjoista on tukahdutti SISgel

in vitro

, ja

in vivo

kun istutettiin SISgel in kylkeen ksenografteissa. Ei vain solujen yhteistyötä pistetään SISgel eivät kasva välittömästi kasvaimia (Fig. 2), mutta histopatologisesti ne ovat olennaisesti normalisoitu yli aktiivisesti kasvavaan fenotyyppiin (Fig. 3B vs Kuviot. 3A, C ja D). Lisäksi useimmat solut eivät ole solusyklin ja ilmentyminen vimentiinista vähentää huomattavasti yli mitä näkyy aktiivisessa kasvuvaiheessa kasvaimia (Fig. 4). Tämä ei ole vain yleinen kasvua estävä vaikutus on SISgel koska aikaisempien tutkimusten mukaan syöpäsolut ympättiin SISgel on suunnilleen sama määrä leviämisen kuin Matrigelillä, ja vasta kun ne alkavat konfluentteja tekee nopeus leviämisen hidas rajusti [13 ]. Solut yhteistyössä ruiskutettiin SISgel voi pysyä tukahdutetaan viikkoja tai jopa kuukausia, pitkän ajan kuluttua SISgel imeytyy vain nousta kasvava kasvaimia, kuten tapahtui noin 40%: n implantit SISgel. Lopuissa 60%, solut joko pysyi elinkelpoinen vihreänä fluoresoivan täplän tai katosi kokonaan. Kolme havainnot viittaavat siihen, että uudelleen ilmaantuminen kasvain johtuu pieni solupopulaation sijasta suurin väestö. Ensimmäinen, uudelleen syntyminen korreloi positiivisesti solujen määrän istutettiin (Fig. 5B). Toiseksi, kahdessa tapauksessa GFP-leimatun ihmisen syöpäsoluja ilmeisesti kadonnut, mutta myöhemmin alkamista seuraavien injektion paikalla ilmestyi ja kasvoi kasvain. Lopulta kaksi uudelleen liityvät kasvaimet eivät ilmaista GFP, ja yksi oli mosaiikki GFP-proteiinia ekspressoivien ja ei-ilmentävien solujen. Koska vähintään 90-95% injektoidusta solujen ilmaisi GPF, The findins ehdottaa uudelleen liityvät kasvaimia peräisin kloonaamalla tai hyvin pieni määrä soluja, jotka joko kokeneita poistaminen GFP-geenin sen sijoittautumiskohdan genomissa tai ei koskaan hankittu yksi aluksi. Sen sijaan välitön, nopea kasvaimen kasvua Matrigel ehdottaa selviytymisen ja kasvun suurin solujen näissä salliva olosuhteissa ja on luonnostaan ​​merkittävä osa pistetään solujen.

Vaikka muita mekanismeja voidaan mukana tuottamassa lepokauden tai vaimennus [4], [5], [18] – [21], sitoutunutta vaihe näyttää paeta tukahduttava normaalista ECM [7], [22]. Havainnot vahvistavat aiemmat hypoteesi, että ECM kykenee estävä vaikutus

in vivo

perustuu menetys pahanlaatuisten kiinteistöjen SISgel

in vitro

[23]. Ehkäisevän vaikutuksen SISgel ei johdu hallitseva proteiini, kollageeni I, tai puuttuminen jonkin tekijän SISgel tarpeen pahanlaatuisia kasvanut, koska kasvainten muodostettu yhteistyössä ruiskutetaan kollageeni I kasvoi lähes yhtä hyvin kuin ne kasvoivat kun samanaikaisesti injektoida matrigeeliä . Tukahduttaminen SISgel näyttää olevan aktiivinen, ei passiivinen, että jotkut tekijä normaalissa soluväliaineen estää aktiivisesti pahanlaatuinen fenotyyppi, kuten ehdotettiin yli 15 vuotta sitten Renato Iozzo [1]. Aikaisemmin tutkimus meidän labs ehdotti, että toisin kuin rintarauhasen epiteelisolujen α6β4 integriinit eivät osallistuneet [24]. Microarray ja proteomic tutkimukset sekaantunut monimutkaisia ​​verkostoja, joihin TGF, cMYC ja sarjan transkriptiotekijöiden [23], [25], [26]. Koska johdonmukainen geeni allekirjoitusta ei voitu tunnistaa, on todennäköistä, että proteiini kytkin säätelee muuntamiseen pahanlaatuisia ja tukahdutetaan fenotyyppejä. RPPA Tulokset viittaavat siihen, että ILK signalointi on mukana, joka tukee havainto, että estävä ILK itsessään estää hyökkäystä. Lisätutkimuksia tarvitaan tunnistaa reseptorin ja yksityiskohtainen signalointimekanismeja.

Vaikka ilmiö tukahduttaminen maligniteetin on selvimmin liittyvät etäpesäkkeiden fenotyypiltään tukahdutti syöpäsolut todennäköisesti myös tärkeä rooli paikallisen uusiutumisen. Vaikka jotkut 80-85% virtsarakon syöpiä ovat aluksi ole lihas invasiivisia, paikallinen toistumisen määrä, jopa 70% joissakin tutkimuksissa [27], jossa on jonkin verran 15-25% etenee tappava lihasten invasiivisen sairauden [27] luo merkittävä kliininen ongelma. Toistuminen arvet, joissa marginaalit olivat kasvaimettomina todennäköisimmin ei johdu epäonnistumisen havaitsemaan Frank kasvainsoluihin alkuperäisessä histopatologisia arvioinnista, mutta on tulosta edistämistä tukahdutti solujen arpi microenvironment [28]. Lisäksi löytää solujen poikkeaviin DNA sisältöä ja biologisten merkkiaineiden ilmentymisen morfologisesti normaali uroteeliin [8] virtsarakon syöpä voimakkaasti tukee oletusta, että ECM-moduloitu tukahduttaminen pahanlaatuisen fenotyypin tapahtuu

in vivo

. Tunnistaminen ja kohdistaminen tällaisia ​​soluja voi olla merkittävä edistysaskel terapiassa virtsarakon syöpään. Samanlaisia ​​havaintoja pään ja kaulan okasolusyöpää ehdottaa ongelma voi olla yleisempää [9].

Vaikka tukahduttaminen maligniteetin normaalilla ECM todennäköisesti toimii yleisesti ja on tärkeää, että patobiologian ihmisen virtsarakon syöpä, ymmärrys tukahduttaminen mekanismi saattaa tunnistaa uusia tavoitteita valvonnan paitsi virtsarakon syövän, mutta muissa elimissä kanssa viivästyy micrometastases tai paikallisen uusiutumisen. Sekä

in vitro

ja

in vivo

malleja esitellään tässä pitäisi osoittautua hyödyllisiksi tunnistamisessa näitä mekanismeja ja tarjoamaan taipuisa malleja tunnistamiseksi uusia lääkkeitä kohdistaa syöpäsolujen tukahdutti normaalin soluväliaineen. Estäminen viivästynyt etäpesäke voisi pelastaa tuhansia henkiä vuodessa.

Materiaalit ja menetelmät

fluoresoiva proteiini ilmaiseminen virtsarakon syövän solut

JB-V solulinja oli peräisin J253 TCC (ATCC, Manassas, VA) C. Dinney [16] olevan erittäin metastaattinen. J82 linja on aggressiivinen TCC linjan saatu ATCC. Solut transfektoitiin pLEGFP-C1 retrovirus (Clontech, Mountain View, CA) valmistettu kotransfektoimalla pakkauksen solulinjan GP2-293 (Clontech, Mountain View, CA) ja VSV-G vektorin (Clontech, Mountain View, CA ), joka sisältää viruksen vaipan geenin. Supernatantti pakkauksen soluista, jotka sisältävät tartunnan virus kerättiin 24 tunnin välein 4 päivää. Fluoresoivat kohdesoluja tehtiin infektoimalla JB-V ja J82 uroteelin sinoomasolulinjoja 1 ml: lla tuoretta, viruksen sisältävä supernatantti /kuoppa, joka sisälsi 100000 kohdesolujen kanssa 8 ug /ml polybreeniä (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Jokainen hakemus viruksen supernatantti suodatettiin läpi 0,4 um: ruiskuun suodatin ennen hakemuksen kohdesoluihin. Supernatantti poistettiin ja tuoretta virusta elatusaineeseen, joka sisältää täydennetään kohdesoluihin 24 tunnin välein, kunnes 4 muutoksia median saatiin päätökseen. Virus sisältävä väliaine korvattiin Minimum Essential Medium, MEM, (Life Technologies, Carlsbad, CA), joka sisälsi 1% ei-välttämättömiä aminohappoja, 1% L-glutamiinia, 1% natriumpyruvaattia ja 10% vasikan sikiön seerumia, ja solujen annettiin kasvaa 90% konfluenssiin. Vakaa transfects valittiin kautta peräkkäinen lajittelu ja rikastaminen fluoresoivien solujen virtaussytometriaa käyttämällä.

solujen kasvun ECM

geelimatrikseista tehtiin kerrostamalla joko 0,8 ml jääkylmää Matrigel (Becton-Dickinson , Bedford, MA), SISgel tai tyypin I kollageenia (BD Biosciences, San Jose, CA) päälle polyetyleenitereftalaatti kalvoja 6-hyvin soluviljelmässä insertit (Falcon, Becton-Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ), joka annettiin sitten geeli 37 ° C: ssa. SISgel valmistettiin joko liuotettua ohutsuolen submukoosassa joko sisään- Cook Biotech (West Lafayette, IN) tai materiaalin valmistimme itsemme decellularized ohutsuolen submukoosassa vakiintuneilla menetelmillä [29]. Lyhyesti, maa SIS pilkottiin osittain pepsiinillä pH: ssa 2,8 4 ° C: ssa 12 päivää. Tämä merkitsee optimointia; liian vähän ruoansulatusta ja materiaali muodostaa hyytymiä sijasta geeliytymisen, ja liiallinen ruoansulatus tuottaa materiaalia, joka ei geeliä. Pepsiini inaktivoitiin nostamalla pH 10, ja inkuboimalla geeliä 4 ° C: ssa 2 tuntia, minkä jälkeen alentamalla pH arvoon 4 6 N HCI: lla. Tuote dialysoitiin 10 mM HCI: a ja steriloitiin CHCI

3, joka sitten dialysoitiin vastaan ​​10 mM HCl. Geelin muodostamiseksi, materiaali sekoitettiin 1/10

th tilavuus 10X fosfaattipuskuroitua suolaliuosta ja pieni määrä fenolipunaista avustamaan pH: n säätämistä. PH säädettiin arvoon 7,4 steriilillä 1 M NaOH käyttämällä visuaalinen väri standardi, joka tarkistetaan pH-mittarin. Kollageenigeelejä valmistettiin sekoittamalla rotanhäntäkollageenin, tyypin I 1/10

th tilavuus 10X PBS, pH: n säätämisen arvoon 7,4 ± 0,1, ja sitten kerrostamalla 0,8 ml päälle Transwell-irto kuten edellä on kuvattu. Solut kerrostettiin joko Matrigel, SISgel tai kollageenin, jonka pitoisuus on 5 x 10

5 solua /200 ui media, ja 2 ml Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies, Carlsbad, CA), joka sisälsi 1% penisilliini, streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia kerrostettiin alla transwell tukee 6-kuoppalevyillä, kuten on kuvattu [14]. Viljelmiä kasvatettiin 6 päivän ajan vaihtamalla kahden päivän välein. Viljelmät poistettiin siirtoaltaat, kiinnitettiin 1% formaliiniin jälkeen päälle levitetään agaroosi- tai SISgel alenemisen estämiseksi solujen leikkaus osiin. Osiot (5 um) värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. (https://www.affymetrix.com/browse/level_seven_software_products_only.jsp?productId=131414 categoryId=35623#)