Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset tutkimukset korostavat tärkeää roolia MikroRNA (miRNA) kehittämiseen keuhkosyöpään. Tärkein sääntelyviranomaisten miRNA biogeneesiä ovat ribonukleaasit Drosha, Dicer ja Ago2. Tässä roolia ytimen proteiineja miRNA biogeneesin koneita vasteen ihmisen ei-pieni ja pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat käsittely ionisoivalla säteilyllä arvioitiin. Huomasimme, että Drosha ja Dicer ilmaistiin korkeammalla tasolla säteilyresistenteille mutta ei herkille solulinjoissa. Kuitenkin alas-säätely joko Dicer tai Drosha ei ollut vaikutusta solujen herkkyys säteilylle. Puuttuvat osat RNA aiheuttama hiljentäminen monimutkainen Ago2 ja Tudor stafylokokkinukleaasin myös ei herkistää soluja saman kohtelun. Täten modulaatio miRNA biogeneesiä koneiden ei ole riittävä lisäämään radioherkkyyttä keuhkojen kasvaimet ja muut strategiat torjuntaan tarvitaan keuhkosyöpä.

Citation: Surova O, Akbar NS, Zhivotovsky B (2012) Knock-Down ja Core proteiinit sääntely MicroRNA biogeneesin ei vaikuta herkkyys Lung Cancer Cells ionisoivaa säteilyä. PLoS ONE 7 (3): e33134. doi: 10,1371 /journal.pone.0033134

Toimittaja: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 marraskuu 2011; Hyväksytty: 05 helmikuu 2012; Julkaistu: 30 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Surova et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Ruotsin Research Council, Ruotsin ja Tukholman Cancer Societies, Ruotsin Childhood Cancer Foundation, Ruotsin Society for Medical Research, Venäjän ministeriön korkea Opetusministeri (11.G34.31.0006), EY: n FP- 6 (Chemores) sekä FP7 (APO-SYS) ohjelmia. OS tukivat apurahan Ruotsin instituutin ja Karoliinisen Instituutin ja NA korkeakouluopintojen komission Pakistanin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä (LC) on johtava syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa sekä naisten että miesten. On olemassa kahta päätyyppiä tämän neoplasian, pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), jotka poikkeavat huomattavasti niiden histopatologisia ominaisuuksia ja vastauksia hoitoa. Ionisoivan säteilyn, yksin tai yhdessä leikkauksen tai kemoterapiaa, on tehokas hoito moniin syöpiin, mukaan lukien LC. Kuitenkin sekä luontainen ja hankittu kasvaimen radioresistance huomattavasti vähentää tehoa sädehoitoa NSCLC ja SCLC ja usein johtaa taudin uusiutumiseen ja etäpesäkkeitä. Siksi on erittäin tärkeää tutkia molekyylitason mekanismit vastus LC-solujen säteilylle.

MikroRNA (miRNA), ei-proteiinia koodaavan, yksijuosteiset RNA: t 19-25 nukleotidia, muodostavat uuden luokka geenin sääntelyviranomaisten ja on raportoitu olevan keskeinen rooli syövän muutos [1]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat poikkeava ilmentyminen miRNA LC [2] – [5]. Tuotanto miRNA esitetään useita proteiineja kollektiivisesti kutsutaan miRNA koneita. Poikkeava ekspressio komponenttien miRNA kone on tuumorigeneesiin, mukaan lukien LC [6], [7]. Up-regulation Dicer vuonna keuhkoadenokarsinooma ja tehtävä kehityksessä perifeerisen adenokarsinoomien on raportoitu [7]. Korkea ekspressio muiden RNA-indusoidun hiljentäminen kompleksi (RISC) proteiinit, hauras X kehitysvammaoireyhtymästä liittyvä proteiini 1 (FXR1), Tudor-SN (TSN) ja proteiini aktivaattori interferoni-indusoidun proteiinikinaasi (PACT), on osoitettu in SCLC [7]. Toinen ryhmä on kuvattu yhdistyksen alentamisella Dicer ilmaisun ja huonon ennusteen LC potilailla [8]. Siten lisätutkimuksia tarvitaan edelleen valaista roolia miRNA koneiden molekyylitason patogeneesin LC. Äskettäin mahdollinen terapeuttinen vaikutus Dicer ehtyminen on kemo- ja leviämisen rintasyöpäsolujen on raportoitu. Koputus-alas Dicer siRNA johtanut huomattavaan G1 pidätyksen ja lisääntynyt herkkyys DNA-vaurioittava aine, sisplatiini, että rintasyövän MCF-7 [9]. Perustavaa laatua ja useita biologisia rooleja miRNA eri soluprosessien, moduloinnin proteiinien ilmentymisen mukana miRNA biogeneesissä voisi olla lupaava terapeuttinen lähestymistapa edelleen kliinisissä sovelluksissa. Toistaiseksi ei ole tietoja roolin miRNA tuottavien proteiinien resistenssin /herkkyys LC solujen käsittelyä. Siksi tutkimme onko ehtyminen ydinproteiineiksi mukana miRNA biogeneesissä vaikuttaa vastus LC sädehoitoon. Yllättäen knock-down ilmentymisen Drosha, Dicer, Argonaute2 ja Tudor-SN by RNA-interferenssi ei lisännyt herkkyyttä NSCLC solut, jotka olivat resistenttejä käsittely ionisoivalla säteilyllä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja Hoidot

Ihmisen NSCLC solulinjat U1810, U1299 (molemmat UU kokoelma), A549, H661, H157, H23 (kaikki ATCC: ltä); ja SCLC-solulinjat H69 (ECACC), H82 (ATCC), U1906, U1690, U2020, U1285 (kaikki UU kokoelma) ylläpidettiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), glutamiini ( 2 mM), penisilliiniä (100 U /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml) (kaikki saatu Gibco) 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja 95%: n kosteudessa. Solut altistettiin säteilytys annoksella 8 Gy käyttäen

60Co lähde (Karolinska Biomics Center, Karolinska University Hospital) mainituilla ajanjaksoilla kuvassa legendoja.

Evaluation of Apoptosis

Apoptoosi määritettiin määrää solujen sub-G1 vaiheeseen. Solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), joka sisälsi 0,1% FBS: ää. Yhteensä 1 x 10

6 solua käytettiin analyysiin. Solut pelletoitiin 2000 rpm ja pestään kerran PBS: ssä. Pelletti suspensoitiin uudelleen 250 ui jää- kylmää PBS: ää ja sekoitetaan 2 ml: lla jääkylmää 70% etanolia tipoittain samalla vorteksoiden. Näytteitä pidettiin 4 ° C: ssa 24 h ja sen jälkeen pelletoitiin 2000 rpm: llä ja pestiin kaksi kertaa PBS: llä. Viimeisen pesun jälkeen solut suspendoitiin uudelleen 360 ui PBS: ää, joka sisälsi 100 ug /ml RNaasi-A: ta (Fermentas) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h. Neljäkymmentä ui propidiumjodidiliuoksella (varastossa 0,5 mg /ml) lisättiin näytteisiin jälkeen inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa kevyesti keinuvat ja valolta suojattuna. Solut analysoitiin virtaussytometrialla (FACScan, Becton Dickinson), ja tiedot arvioitiin käyttäen Cell Quest ohjelmistoa.

kaspaasi-aktiivisuusanalyysi

Solut pestiin jääkylmällä PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 25 ui PBS, hajotettiin pakastamalla nestetypessä, inkuboitiin kaspaasi-3-kaltainen substraattispesifisyys ja analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu [10]. Kaspaasiaktiivisuus ilmaistiin taitteeseen nähden kasvu asianmukaista valvontaa.

siRNA Transfektio

siRNA kohdistaminen ihmisen Dicer1, Drosha, Argonaute2 ja ei-kohdistaminen siRNA negatiivisena kontrolli saatiin Thermo Scientific Dharmacon® ja säilytettiin pitoisuudessa 20 uM. Kaksikymmentäneljä tuntia ennen transfektiota solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille elatusaineeseen ilman antibiootteja. siRNA: t laimennettiin 100 ui RPMI 1640 -alustaa (Gibco) ja sekoitetaan 1 ui DharmaFECT®1 siRNA transfektioreagenssi (Thermo Scientific Dharmacon®). 20 minuutin kuluttua inkuboinnin kompleksit lisättiin soluihin antamaan lopullinen pitoisuus siRNA: iden keskipitkällä 50 nM. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen elatusaine vaihdettiin ja soluja säteilytettiin.

Western Blot Detection

Solut hajotettiin käyttämällä Complete lyysipuskuria (Roche) plus proteaasiestäjäseostabletit (PIC, Complete-M, Roche). Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce). Sekoittamisen jälkeen Laemmli-puskurissa, näytteille suoritettiin SDS-PAGE ja Western-blottauksella. Immunodetektioon seuraavia vasta-aineita käytettiin: anti-Dicer, anti-pilkottiin PARP, anti-pilkottiin kaspaasi-3, anti-pilkottiin kaspaasi-9 (jotka kaikki saatiin Cell Signaling Technology), anti-Ago2, anti-Drosha (molemmat Millipore), anti-XPO5, anti-PRKRA (PACT) (molemmat Abnova), anti-FXR1 (Santa Cruz Biotechnology), anti-β-aktiini (Sigma-Aldrich), ja anti-GAPDH (Trevigen). Piparjuuriperoksidaasi-leimattua anti-hiiri- tai anti-kani-vasta-aineita (Pierce) ja tehostetun kemiluminesenssin kit (Western blot detektioreagenssia, GE Healthcare UK Limited) käytettiin havaitsemiseen tunnustettu proteiineja. Densitometri-analyysi kvantifiointiin suhteellinen taso proteiinin ilmentymistä suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

reaaliaikaiset kvantitatiiviset PCR

RNA eristetty soluista käyttäen PureLink ™ RNA Mini Kit (Invitrogen). Käänteiskopioitiin cDNA näytteitä käytettiin templaatteina. Argonaute2 (Ago2 vasemmassa ctaccttcccctggaggtctg ja Ago2 oikeassa cgacctagcagtcgctctga) ja 18S ribosomaalisen RNA: n (18S-1 cgctactaccgattggatggtt ja 18S-2 agtcaagttcgaccgtcttctc) alukkeita (Invitrogen) on suunniteltu vastaamaan kohde cDNA-sekvenssi. Kaksikymmentä ng käänteistranskriboitua cDNA template sekoitettiin SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) ja monistettiin käyttäen 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) seuraavan ohjelman: 40 sykliä, joissa kukin sykli koostuu denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 15 s ja pariutumis /pidennys-vaihe 60 ° C: ssa 1 min.

Statistical Evaluation

tulokset kolmen erillisen kokeen ilmaistiin keskiarvona ± SEM Tilastollinen arviointi suoritettiin käyttäen ei-pariksi t-testiä.

Tulokset

proteiinien ekspressio Osallisena miRNA biogeneesin NSCLC ja SCLC

Jotta voitaisiin tunnistaa molekyylitasolla tavoitteet säteilylle herkäksi LC solujen kesken osallistuvien proteiinien miRNA biogeneesissä teimme proteiinin ilmentymisen analyysi seitsemän keskeisen miRNA koneen komponenttien paneelia NSCLC ja SCLC (kuusi solulinjoissa kussakin paneelissa). Kunkin LC alatyypin solulinjoista valittiin perustuu niiden radioherkkyyttä mitattuna osa elossa altistumisen jälkeen 2 Gy (SF2) on klonogeeniset -eloonjäämiskoe, ja ryhmitelty säteilylle (RS) kanssa SF2 0,3 Gy tai säteilyresistenteille (RR), jossa SF2 ≥ 0,3 Gy [11] – [14]. Pohjapinta taso kaikkien proteiinien (Drosha, Dicer, exportin-5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), proteiini aktivaattori interferoni-indusoidun proteiinikinaasi (PACT), hauras X kehitysvammaoireyhtymästä liittyvä proteiini 1 (FXR1) ja Argonaute2 (Ago2) arvioitiin Western blot kaikissa valituissa solulinjoissa ennen säteilytystä (kuvio 1A). Molemmat RNaasi III entsyymejä (Drosha ja Dicer) ilmaistiin suhteellisen korkealla tasolla NSCLC soluissa verrattuna SCLC. jäsen, karyopherins proteiini perhe, XPO5, joka on mukana tumasta miRNA, ilmentyi korkeammalla tasolla H661 taas alhainen ilmaisun nähtiin H69 ja U1690 verrattuna jäljellä solulinjojen. ilmentymistaso TSN, PACT, FXR1 ja Ago2 proteiinit eivät vaihdelleet syvästi joukossa erilaisia ​​solulinjoja, lukuun ottamatta H69, jolla oli pienempi ilmentyminen kaikkien tutkittujen proteiinien. kuten paneeli koostui sekä RS ja RR solujen H23 solulinja valittiin edustaja säteilylle soluja, ja U1810 ja H661 käytettiin edustajat säteilyresistenteille solujen lisätutkimuksiin. Densitomet- analyysi proteiinin ilmentymisen paljasti, että Dicer, Drosha ja XPO5 ilmaistiin korkeammalla tasolla RR soluissa verrattuna RS, vaikkei ollut mitään selkeää korrelaatiota ekspressiotasoja Ago2, TSN, PACT ja FXR1 ja SF2-arvot (kuvio 1 B) .

(A) Western blot -analyysi tason proteiinin ilmentymisen Drosha, Dicer, exportin 5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), proteiini aktivaattori interferoni-indusoidun proteiinikinaasi (PACT), hauras X kehitysvammaoireyhtymästä liittyvä proteiini 1 (FXR1) ja Argonaute 2 (AGO2) paneelissa NSCLC (U1810, U1299, A549, H661, H157, H23) ja SCLC (U1285, H82, H69, U1690, U1906, U2020 ) solulinjat. (B) densitometrinen analyysi suhteellisten tasojen proteiinin ilmentymisen H23, H1299, U1810 ja H661 solulinjoissa. Solulinjat jaettu mukaan radioherkkyyttä mitattuna osa elossa 2 Gy (SF2). Tasainen panostus varmistettiin anti-β-aktiini vasta-aineita. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

Vaikutus ionisoivan säteilyn on miRNA Machinery NSCLC

tutkimiseksi edelleen roolin miRNA koneen komponenttien vaste LC solujen säteilytys, kaksi RR solulinjoja (U1810 ja H661) ja yksi RS rivi (H23) paneelista NSCLC tehtiin gammasäteilyä ja proteiinien ilmentyminen analysoitiin 6, 24 ja 48 tuntia käsittelyn jälkeen. Kuten odotettua, massiivinen apoptoottista solukuolemaa havaittiin H23 6 h kuluttua ionisoivaa säteilyä, arvioituna katkaisulla PARP, kun taas H661 ja U1810 hoitovaste myöhempinä ajankohtina 24 ja 48 tuntia, vastaavasti (kuva 2). Ei näkyviä muutoksia ilmentymisen tahansa tutkittu proteiinien havaittiin joko RR- tai RS-soluja, mitattuna Western blot 6, 24 ja 48 tuntia sen jälkeen, kun IR-hoidon (kuvio 2). Näin ollen gamma-säteilytys ei vaikuta ilmaus ytimen proteiinien miRNA koneen NSCLC riippumatta RR- tai RS-fenotyypin näiden syöpäsoluja.

lohkaisu PARP ja tason ilmentymisen Drosha, Dicer, exportin 5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), proteiini aktivaattori interferoni-indusoidun proteiinikinaasi (PACT), ja hauras X kehitysvammaoireyhtymästä liittyvä proteiini 1 (FXR1) in U1810, H661 ja H23-soluja havaittiin Western pyyhin 6, 24 ja 48 tuntia jälkisäteilytys 8 Gy. Tasainen panostus varmistettiin anti-β-aktiini vasta-aineita. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Knock-down Core osallistuvien proteiinien ensimmäinen askel miRNA biogeneesin ei riitä herkistää NSCLC-solujen Säteilytys

Koska taso proteiinin ilmentyminen vähintään kolmen miRNA koneiden osat, Dicer, Drosha ja XPO5, positiivisesti korreloi radioresistance NSCLC solujen korkea niiden ilmentyminen voi myötävaikuttaa kasvaimen soluihin ”hoitovasteen on miRNA-ohjattu tavalla. Tutkia tätä mahdollisuutta päätimme tutkia mahdollisuuksia herkistävä vaikutus alas-säätely Dicer ja Drosha proteiinien U1810 solulinjassa. Ydin- ribonukleaasi Drosha ja sytoplasmista ribonukleaasi Dicer ovat kaksi tärkeintä sääntelyviranomaisten ensimmäisen vaiheen miRNA tuotantoa ja edistää lohkaisu pitkä ensisijainen selostukset hiusneula välituotteita (pre-miRNA) ja myöhemmät lohkaisu kypsiksi miRNA. Siten poistamalla jompikumpi näistä kahdesta ydinproteiineiksi odotimme vähentää miRNA tuotantoa ja vaikuttavat radioresistance NSCLC-solujen.

knock-down of Dicer vuonna U1810 soluissa suoritettiin käyttäen RNA-interferenssi, jonka jälkeen solut altistetaan gamma-säteilytys ja analysoitiin 48 h kuluttua altistuksesta. Täydellinen vaimentaminen Dicer proteiinin ilmentyminen vahvistettiin Western blot ennen ja jälkeen säteilytyksen (kuvio 3A). Down-regulation of Dicer seurasi tuotannon vähenemiseen useita miRNA (miR1301, miR1249, miR1227, miR532-3p, miR625, miR1827, miR324-5p) arvioituna reaaliaikainen PCR (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin U1810 solut köyhdytettyä Dicer näytteillä voimakas vaste säteilylle samoin kuin villityypin soluissa. Ei ollut eroja pilkkomiseen PARP välillä valvonnan ja Dicer tippuu alas soluissa (kuvio 3A). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen säteilytyksen jälkeen oli sama kaikissa tutkituissa ryhmissä (kuvio 3B). Analyysi kaspaasien aktivaatio osoitti, että kaspaasi-3 ja -9 olivat yhtä käsitelty säteilytyksen jälkeen, ja että kaspaasi-3-kaltaisen aktiivisuuden oli lähes identtinen molemmissa villityypin ja Dicer-köyhdytettyä soluissa (kuvio 3A ja C). Samanlainen vaikutus radioresistance oli ilmeinen kun Drosha oli köyhdytetty U1810 soluissa. Ei muutoksia PAPR pilkkominen (Kuva 3D) tai apoptoottisten solujen määrässä (kuvio 3E) havaittiin keskuudessa valvontaa ja Drosha tippuu alas soluja 48 h kuluttua ionisoivaa radiaiton. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin seuraavat poistamista Dicer ja Drosha muista NSCLC solulinjojen (kuvio S1 ja S2). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että knock-down joko Dicer tai Drosha ei riitä herkistää NSCLC solujen gammasäteilyllä.

(A) taso Dicer ilmaisun lohkaisu PARP ja käsittelyn kaspaasi-3 ja – 9. U1810 transfektoiduissa soluissa (48 h) ja ohjaus (si scr) tai Dicer (siDicer) siRNA arvioi Western blot 48 tuntia säteilytyksen jälkeen. Tasainen panostus varmistettiin anti-GAPDH vasta-aineita. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (B) havaitseminen apoptoottisen solukuoleman U1810 mittaamalla osa-G1 väestön transfektion jälkeen (48 h) ja valvontaa tai Dicer siRNA ja sädehoidon (48 h). (C) kaspaasi-3-kaltaisen aktiivisuuden (kertaiseksi kontrolliin) in U1810 soluissa hoidon jälkeen joko säteilytys yksinään tai yhdessä transfektion valvonta- tai Dicer siRNA (yksityiskohdat katso materiaalit ja menetelmät). (D) taso Drosha ilmentymisen ja pilkkominen PARP U1810 transfektoiduissa soluissa (48 h) ja ohjaus (si scr) tai Drosha (siDrosha) siRNA analysoitiin Western blot 48 tuntia hoidon jälkeen säteilytyksen. Tasainen panostus varmistettiin anti-GAPDH vasta-aineita. Kaikki tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (B) Apoptoottista solukuolemaa U1810 mitattuna analyysin osa-G1 väestön transfektion jälkeen (48 h) ja valvontaa tai Drosha siRNA ja sädehoidon (48 h). Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SEM. kolmen itsenäisen kokeen.

Down-regulation of pääkomponentit RNA aiheuttama hiljentäminen Complex (RISC) ei Kiinnitetään NSCLC-solujen Säteilytys

Koska ehtyminen ytimen proteiineja ensimmäinen askel miRNA biogeneesiä ei vaikuttanut radioherkkyyttä NSCLC, on mahdollista, että RNA-interferenssi-välitteisen knock-down joko Dicer tai Drosha johtaa merkittävään vähentämiseen, mutta ei koko menetys, kypsä miRNA pitkistä puoli- elämän kypsien molekyylejä. miRNA ovat stabiileja, kun ne otetaan efektori monimutkainen. Siksi päätimme estää toisen vaiheen miRNA biogeneesiä mukaan knock-alas kahden pääkomponenttien RISC, Argonaute2 ja Tudor-SN, ja siten vahvistaa niiden roolia radioresistance LC soluja. Efektiivinen alassäätöä ilmentymisen Ago2 että U1810 solulinjassa varmistettiin mittaamalla sen mRNA ilmaisu, joka vähentää jopa 95% transfektion jälkeen anti-Ago2 siRNA (kuvio 4A). Kuitenkin, apoptoottisen vasteen (arvioitu PARP lohkominen ja käsittely kaspaasi-3 ja -9) näytteillä Ago2-köyhdytettyä solut säteilytyksen jälkeen oli yhtä vahva kuin villityypin U1810-soluja (kuvio 4B). Lisäksi ei ollut merkittäviä muutoksia prosenttiosuus Saharan G1 väestölle tai kaspaasi-3 jälkeen ionisoivaa säteilyä, vaikka molemmat parametreja hieman väheni Ago2-alassäädetty solujen verrattuna villityypin soluissa (kuvio 4C ja D).

(A) taso Argonaute2 (AGO2) mRNA U1810 transfektoiduissa soluissa ohjaus (pikasulun) tai AGO2 siRNA normalisoidaan 18S ribosomaalisen RNA. Tulokset ovat keskiarvo ± SEM. Kolmen riippumattoman kokeen. (B) lohkaiseminen PARP ja käsittely kaspaasi-3 ja -9 U1810 transfektoiduissa soluissa (48 h), jossa ohjain (si scr) tai AGO2 siRNA, ja sitten säteilytettiin 48 tuntia. Tasainen panostus varmistettiin anti-GAPDH vasta-aineita. Kaikki tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (C) havaitseminen apoptoottisen solukuoleman U1810-soluissa transfektion jälkeen (48 h), jossa ohjaus- tai AGO2 siRNA ja käsittelemällä sen jälkeen säteilytys (48 h). (D) kaspaasi-3-kaltaisen aktiivisuuden (kertainen lisäys kontrolliin) in U1810 soluissa hoidon jälkeen joko säteilytys yksinään tai yhdessä transfektio valvontaa tai AGO2 siRNA. Kaikki tulokset ovat keskiarvo ± keskiarvon standardipoikkeama. kolmen itsenäisen kokeen.

Lopuksi sama joukko kokeita, jotta knock-alas ilmaisun toisen RISC komponentin, Tudor-SN. Sen lisäksi toimivat komponenttina moniproteiinikompleksin mukana miRNA toimintaan, TSN tiedetään toimivan transkription aktivaattorin ja onkogeenin moniin syöpiin. Lisäksi se lohkaistaan ​​apoptoosin aikana. Vaikka merkittävä alas-säätely TSN ilmaisun käyttämällä siRNA saavutettiin U1810 soluissa, kuten Western blot analyysi, tippuu alas solut osoittivat samanlaisia ​​lohkaisu PARP kuin villityypin upon ionisoivalla säteilyllä (kuvio 5A). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen ei ollut eroa ohjaus ja TSN tippuu alas ryhmät säteilytyksen jälkeen (kuvio 5B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kahdessa muussa solulinjoja NSCLC paneelista (A549 ja H661) jälkeen alas-säätely TSN (kuvio 5C ja D).

taso Tudor-SN ilmentymisen ja pilkkominen PARP U1810 (A), A549 (C) ja H661 (D), jotka on transfektoitu (48 h), jossa ohjain (si scr) tai Tudor-SN (si TSN) siRNA analysoitiin Western blot 48 h säteilytyksen jälkeen. Tasainen panostus varmistettiin anti-GAPDH vasta-aineita. (B) apoptoottiset solukuoleman U1810-soluissa transfektion jälkeen, jossa on TSN siRNA ja säteilytys. Kaikki tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Keskustelu

Sädehoito on merkittävä terapeuttinen ase LC. Kuitenkin tehokkuuden tällaista hoitoa rajoittaa alkuperäisen tai hankittu radioresistance kasvainsolujen. NSCLC on ominaista alhainen tuumorivasteita säteilytys ja 5 vuoden eloonjäämisaste vain 7%: sta 10% [15]. SCLCs aluksi vastata hyvin perinteisiin kemo- ja sädehoidon, mutta kehittää osti kemo- ja radioresistance yli seuraavien 3-12 kuukautta, ja koko 5 vuoden pysyvyys on vain 5% [16]. Mekanismit johtavat radioresistance näiden kasvainten eivät ole vielä täysin ymmärretty.

miRNA on raportoitu olevan potentiaalisia diagnostisia tai terapeuttisia kohteita syövän hoidossa, mukaan lukien keuhkojen kasvaimet. On yhä enemmän näyttöä yhdistyksen välillä miRNA ilmentyminen kasvaimissa ja kemo- ja radioherkkyyttä, molemmat suhteen ennustamiseen ja moduloiva herkkyys [17] – [20]. Äskettäin julkaistun tutkimuksen NSCLC tunnistettu osajoukko miRNA osoittavat vahvaa muutoksia ilmaisun vastauksena säteilytys. Siten globaali miRNA vaste ei ole kaikissa tuumorisoluissa, mukaan lukien keuhkosyöpä, ja miRNA saattaa olla komponentteja soluvastetta sytotoksisten loukkaus [20]. Samanlaisia ​​havaintoja koskevat muutokset globaalissa miRNA ilmaisun raportoitu jälkeen syöpähoidon eri kemoterapeuttisten lääkeaineiden eri syövän solulinjoissa ja potilaan näytteitä [21]. Ilmaisu on miRNA käsittelykomponenteille osoitettiin vapautettiin eri ihmisen syövissä [8], [22], [23] ja siten saattaa lisätä kasvainsolujen ”hoitovasteen on miRNA-ohjattu muoti tai riippumatta RNA-interferenssi-reitin. Down-regulation Dicer MCF-7 rintasyöpä solulinjassa siRNA osoitettiin aiheuttavan G1 pidätystä ja lisäävät herkkyyttä DNA-vaurioittava aine, sisplatiini, mikä viittaa siihen, että yhdistelmä anti-Dicer strategia ja perinteinen kemoterapia voisi parantaa tehokkuutta syövän hoidossa [9]. Toinen tutkimus osoitti, että Dicer alassäätöä voi lisätä proliferatiivisia ja invasiivisen kyvyn kasvainsolujen in vitro ja samalla edistää ihonalaisen -tuumoriksenografti lisääntymistä in vivo 24. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että miRNA kone soittaa joko negatiivinen tai positiivinen rooli kasvaimen muutoksen ja hoitovaste eri syöpätyyppien. Esillä olevassa tutkimuksessa pyrittiin selvittämään roolin miRNA biogeneesin komponenttien modulaatio säteilyn vasteen NSCLC ja SCLC solulinjoissa. Jotta tiedettäisiin molekyylitason tavoitteet säteilylle herkäksi, proteiinin ilmentymisen analyysin seitsemästä ytimen proteiineja miRNA koneiden, Drosha, Dicer, XPO5, TSN, PACT, FXR1 ja Ago2, suoritettiin paneelissa NSCLC ja SCLC solulinjoissa. Meidän tulokset osoittivat korkeampi ilmentyminen Drosha ja Dicer proteiinien resistenttejä soluja säteilylle verrattuna herkkä linjat. Kuitenkin knock-down näiden kahden tärkeitä proteiineja ei vaikuttanut herkkyyttä NSCLC-solujen hoitoon gammasäteilyllä. Tämä saattaa osittain johtua siitä, että pitkän puoliintumisajan kypsän miRNA. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että RNA-interferenssi-välitteisen knock-alas Drosha, XPO5-5 tai Dicer johtaa merkittävään vähentämiseen, mutta ei koko menetys, kypsä miRNA [25] – [28]. Koska miRNA näyttävät olevan varsin vakaa, kun ne otetaan efektori monimutkainen, selvitimme mahdollisuutta lisätä radioherkkyyttä keuhkojen kasvainsoluja ehtyminen alavirran komponentteja miRNA biogeneesiä polku, eli kaksi RISC proteiineja, Ago2 ja Tudor-SN. Kuitenkin alassäätöä näiden proteiinien eivät vaikuta herkkyyttä NSCLC solujen käsittelyä. Joten, voi olla vaihtoehtoisia biogeneesin reitti (t), joka voidaan aktivoida, kun häiriöitä yhden useista vaiheista kanoninen miRNA biogeneesin prosessi. Jotkut miRNA havaittiin syntyvän kautta Dicer riippumattoman biogeneesin reitti: sen jälkeen, kun on käsitelty Drosha, pre-miRNA voidaan suoraan ladataan sitten ja lohkaistaan ​​sitten katalyyttinen keskus tuottaa välituotteena 3` pää, joka on edelleen leikattu [29]. Myös luokka ei-kanoninen miRNA jotka ohittavat Drosha mikroprosessori, mutta silti vaativat Dicer niiden biogeneesin [30]. On huomattava, että analyysi proteiinin ilmentymistä kaikkien keskeisten osien miRNA koneiden U1810 soluissa suoritetaan sen jälkeen alas-säätely Dicer, Drosha, TSN tai Ago2 paljasti, että kumpikaan knock-alamäkiä oli merkittävä vaikutus ilmaus muita proteiineja koulutusjakson eli havaitsimme ei lisätä ilmaus miRNA koneiden komponenttien seuraavat knock-alamäkiä (kuva S3). Toisaalta, tuoreessa tutkimuksessa suoritetaan kuolemattomaksi ja ensisijaisen endoteelisolujen osoitti, että maailmanlaajuinen suppressio miRNA ilmaisun saavutetaan säätely alaspäin joko Ago2 tai Dicer proteiinit käyttämällä siRNA lisännyt solukuolemaa säteilytyksen jälkeen [31]. Tämä osoittaa, että panos miRNA koneiston vastaus sädehoidon voisi hyvin riippua solutyypistä ja olla erilainen normaalissa ja syöpäsoluja.

Toinen raportti osoitti, että miRNA biogeneesin on maailmanlaajuisesti indusoituu DNA vaurion ataksia -telangiectasia mutatoitunut (ATM) kinaasi-riippuvaista tavalla hiiren alkion fibroblasteissa (MEF) käsittelyn jälkeen radioaktiivisen säteilyn lääke neocarcinostatin (NCS), joka generoi double-säikeen katkoksia (DSB: t). KH-tyyppinen liitos säätelijäproteiinia (KSRP) todettiin olevan keskeinen toimija, joka muuntaa DNA-vaurioita signalointi miRNA biogeneesin. ATM kinaasi suoraan sitoutuu ja fosforyloi KSRP, joka parantaa vuorovaikutuksen KSRP ja pri-miRNA ja lisääntynyt KSRP aktiivisuus miRNA käsittely [32]. Olipa KSRP aktivoituu ja edistää miRNA käsittely NSCLC kun alas-säätely ydinkomponentteihin miRNA koneiden ja hoito gammasäteilyn on vielä selvittämättä.

Lisäksi tiedetään, että suurin osa miRNA on kymmenistä satoja tavoitteita, ja että kohde-mRNA: iden voi sitoa useita miRNA. Ehkä suuruus väheneminen miRNA tuotannon ja toiminnan aiheuttamat poistamisesta yhden proteiinin peräisin miRNA koulutusjakson ei riitä vaikuta vastaavat elimistön vastustuskykyä LC solujen sädehoitoa. Toisin sanoen, on todennäköistä, että todellinen vaikutus radioresistance NSCLC-solujen kautta miRNA konetta ei voida saavuttaa poistamalla yhden proteiineja biogeneesiä koulutusjakson, ja näin edelleen tunnistaminen ja kohdistamista erityisesti miRNA mukana vastauksen LC solujen sädehoidon vaaditaan.

Yhteenvetona, esillä olevassa tutkimuksessa ilmaus joukon proteiineja, jotka liittyvät miRNA biogeneesissä arvioitiin ensimmäistä kertaa paneeliin ihmisen LC solulinjoissa. Vaikka ilmaus ytimen proteiinien miRNA koulutusjakson korreloi vastus solujen sädehoidon, knock-down näiden proteiinien ei riittänyt laukaisemaan herkistymistä LC solujen tämäntyyppisen hoidon. Tämä viittaa siihen, että keuhkojen kasvain radioresistance ei voida voittaa moduloimalla miRNA biogeneesiä koneita ja muita strategioita torjuntaan tarvitaan keuhkosyöpään.

tukeminen Information

Kuva S1.

ilmentyminen Dicer ja PARP pilkkominen A549 ja H661-soluja transfektoitiin kontrolli (si scr) tai Dicer (si Dicer) siRNA analysoitiin Western blot 48 h käsittelyn jälkeen säteilytyksen (A). Tasainen panostus varmistettiin anti-GAPDH vasta-aineita. (B) Apoptoottista solukuolemaa A549 ja H661-soluissa mitattuna analyysin osa-G1 väestön transfektion jälkeen (48 h) ja valvontaa tai Drosha siRNA ja sädehoidon (48 h).

Doi: 10,1371 /journal.pone. 0033134.s001

(TIF) B Kuva S2.

taso Drosha ja pilkkoa PARP A549 (A) ja H661 (C) solut jälkeen knock-down of Drosha. Tasainen panostus varmistettiin anti-GAPDH vasta-aineita. (B) prosenttiosuus apoptoottisten solujen A549 transfektoitu Drosha siRNA ja käsiteltiin säteilytys (48 h). (D) kaspaasi-3-kaltaisen aktiivisuuden (kertainen lisäys kontrolliin) in H661-soluissa hoidon jälkeen joko säteilytys yksinään tai yhdessä transfektio valvontaa tai Drosha siRNA.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0033134. S002

(TIF) B Kuva S3.

taso Drosha, Dicer, XPO5, TSN, PACT jälkeen knock-alas Dicer, Drosha, TSN ja Ago2 in U1810 soluissa. Tasainen panostus varmistettiin anti-GAPDH-aineita.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0033134.s003

(TIF) B

Kiitokset

Tekijät haluavat ilmaista kiitollisuutensa Hogir Salim, Dali Zong ja Birgitta Mörkin (Karolinska Biomics Center, Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet) tekniseen tukeen.