Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikainen tutkimus on ehdottanut, että tietyt kasviperäisiä polyfenolit, eli ursolic (UA), joka on raportoitu olevan antituumoriaktiivisuuksia, voidaan käyttää herkistämään kasvainsolujen sädehoitoa estämällä johtavia reittejä sädehoitoa vastus. Tämä koe suunniteltiin tutkimaan vaikutuksia ja mahdollisia mekanismi säteilylle herkäksi by UA in BGC-823-solulinja ihmisen adenokarsinooman mahasyöpä

in vitro

. UA aiheutti sytotoksisuutta annoksesta riippuvalla tavalla, ja käytimme osa-sytotoksisuutta pitoisuus UA testata radioenhancement tehoa UA mahasyövän. Radioherkkyyttä määritettiin klonogeeniset -eloonjäämiskoe. Eloonjääntifraktio yhdistetyn ryhmän säteilytys ja sub-sytotoksisuus UA merkittävästi vähentynyt verrattuna säteilytys ryhmään. Parantunut säteilylle herkäksi tehokkuus liittyi parannettu G2 /M pidätys, lisääntynyt reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), alassäädetty Ki-67 tason ja parani apoptoosin. Lopuksi kuten UA oli voimakasta kasvua estävän vaikutuksen ja synergistinen vaikutus, sitä voitaisiin käyttää mahdollisena lääke herkistävä soveltamiseksi sädehoidon.

Citation: Yang Y, Jiang M, Hu J, Lv X, Yu L Qian X, et al. (2015) Enhancement Säteilyn tehosteiden ursolic in BGC-823 Human Adenokarsinooma mahasyövän Cell Line. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10,1371 /journal.pone.0133169

Editor: Jian-Hua Mao, Lawrence Berkeley National Laboratory, University of California, Berkeley, Yhdysvallat |

vastaanotettu 26. tammikuuta 2015 Hyväksytty: 24 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 15 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoittajat: tukemana avustuksia National Natural Science Foundation of China (Grant nro 81172094), Top Six Talents Project Jiangsun maakunnassa (Grant nro 2011ws005), sekä Lääketieteen Science and Technology kehittämishankkeet Nanjing (Grant nro ZKX10011). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta lasku esiintyvyys, mahasyövän pidetään edelleen yhtenä tärkeimmistä syistä syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Leikkaus on edelleen tukipilari tahansa parantavaa hoitoa; kuitenkin noin kaksi kolmasosaa potilaista diagnosoitu mahalaukun syöpä on leikkaushoitoon paikallisesti edenneen ja /tai etäpesäkkeitä. 5 vuoden eloonjäämisaste potilaiden, joilla oli diagnosoitu kehittyneitä paikallista alueellista mahasyövän ja ovat läpikäyneet parantava resektio pysyvät alhaisina, koska suuri riski paikallisen uusiutumisen eikä etäispesäkkeitä vaikka resektio uskottiin olevan parantava. [1] näkökulma satunnaistetussa Intergroup (INT) -0116 tutkimuksessa (556 potilasta) ja retrospektiivinen Korean kokemus (990 potilasta) vähensi paikallisessa uusiutumisriski kanssa postoperatiivisen alueellisten säteilyllä yhdessä kemoterapian ja korkeampi eloonjäämisaste adjuvanttia käsivarteen. [2] Sädehoito on main paikallista alueellista ohjaus modality varten voida leikata mahasyövän. [3] The National Kattava Cancer Network (NCCN) ohjeissa suositellaan sädehoito kuin tavallinen hoito mahasyövän potilailla, joilla on suuri riski toistumista; [4] on kuitenkin kaksi suurta rajoituksia liittyy hoitoon mahasyövän säteilyä: (1) luontainen tai hankittu resistenssi sädehoidon; (2) epäspesifinen myrkyllisyys kohti mahalaukun limakalvon ja ympäröivien normaaleissa kudoksissa. [2,5]

Vastatakseen näihin rajoituksiin, tieteellinen yritetty etsiä tehokas sädeherkistäjä yrteistä alhaisempi myrkyllisyys ja suurempi tehokkuus. Viimeaikainen tutkimus on ehdottanut, että monet kasviperäisiä polyfenoleja, kuten kurkumiini, flavopiridolin, emodiini, ursolic ja jne, voidaan käyttää herkistämään kasvainsolut kemoterapia-aineiden ja sädehoidon estämällä johtavia reittejä resistenssiin. [6,7, 8] Näitä aineita on myös havaittu olevan suojaava terapia-liittyvät toksisuudet. [5] Ursolic happo (UA), pentasyklinen triterpeeni happoa, jota pidetään yhtenä lupaavimmista chemopreventive aineena syövän, on osoitettu kysymään antitumor aktiviteetteja, kuten estämällä kasvaimen aloittamista ja edistämiseen. [9,10] Se indusoi myös kasvaimen solujen erilaistumista asetuksella ilmentymisen differentiaatiospesifisiä geenejä hiiren F9 teratokarsinoomasolua. [11] lisäksi on ollut näyttöä siitä UA tuotettu antiangiogeenisen vaikutuksen poikasen chorioalantoic kalvo ja anti-invasiivisen toiminnan HT1080 ihmisen fibrosarkoomasoluissa. [12,13]

kuitenkin ennen tutkimusta on vielä osoitettava, onko UA voi parantaa säteilyn vaikutuksia pahanlaatuinen kasvain . Koe suunniteltiin tutkimaan vaikutuksia ja mahdollinen mekanismi in vitro säteilylle herkäksi by UA in BGC-823-solulinja ihmisen adenokarsinooman mahasyöpä antaa teoreettisen tuen kliiniseen käyttöön.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

BGC-823-solut saatiin Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, Kiina) ja tallennetaan RPMI 1640 väliaineessa 10% vasikan seerumia, 37 ° C: ssa vedellä kyllästettyä ilmapiiri 5% CO

2.

Cell sytotoksisuusmääritys

sytotoksisuus määritettiin MTT-määrityksellä suoritetaan julkaistu aiemmin [14]. Tämän havainnollistamiseksi, solut maljattiin 8 x 10

3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla UA (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50 ug /ml) 48 h vähintään kolme jäljitellä kuoppiin. Kuhunkin kuoppaan lisättiin sitten 20 ui MTT: n, joka on valmistettu sekoittamalla 5 mg MTT 1 ml normaalia suolaliuosta, ja niitä inkuboitiin vielä 4 tuntia. Kunkin kaivon alusta korvattiin 150ul DMSO. Absorbanssi määritettiin mikrolevylukijalla (BIP-RAD) aallonpituudella 490 nm. Sokeakoekuoppaa kaivoja käytettiin nollaamista absorbanssi. Inhibitionopeudesta (IR%) laskettiin käyttäen tausta-korjattu absorbanssi seuraavalla yhtälöllä:

IC

50 määriteltiin pitoisuus, joka vaaditaan 50% solujen kasvun esto.

Solun ryhmittely ja in vitro ionisoivan säteilyn

Solut jaettiin satunnaisesti 4 ryhmään: kontrolliryhmään (A), UA ryhmä (B), sädehoitoa (RT) ryhmä (C), ja yhdistetyt ryhmä (D ). BGC-823-soluja viljeltiin 6-kuoppalevyille, ja sitten ryhmän B ja D käsiteltiin UA, kun taas ryhmän C ja D säteilytettiin käyttäen 6-MeV elektronisuihkun lineaarikiihdytin (Elekta, Ruotsi).

klonogeeninen -eloonjäämiskoe

radioherkkyyttä määritettiin klonogeeniset -eloonjäämiskoe. Solut (500-2 tuhatta per kuoppa) maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten soluja käsiteltiin UA (0, 6,25 ja 10 ug /ml) 24 tunnin ajan ja altistetaan sitten kasvavia annoksia RT (0, 2, 4, 6 ja 8Gy). 10-14 päivän inkuboinnin pesäkkeitä koostui yli 50-solujen havaittiin. Pesäkkeet pestiin huolellisesti, värjättiin etanolilla /kristalliviolettia väriaine, ja sitten laskettiin. Maljaustehokkuus (PE) laskettiin (keskiarvo pesäkeluvut /soluja kylvetään), ja eloonjääntifraktio (SF) laskettiin [tarkoittaa pesäkeluvut /(solujen ympätty × PE)], jossa PE määriteltiin (keskiarvo pesäkeluvut varten un-säteilytettyjä ehkäiseminen /kylvettyjen solujen). D

0-arvot laskettiin usean kohde yhden osuman malli [S = 1 – (1-e

-D /D0)

N], joka edustaa keskimääräinen annos on tappava altistus. Herkistävä lisälaite suhde (SER) laskettiin D

0 suhde yhdistelmähoidon ja RT yksin.

Solusyklianalyysiä

vaikutus solukierron analysoitiin käyttämällä propidiumjodidia /RNaasia (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) värjäys mukaan valmistajan ohjeiden. 2,5 x 10

5-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten soluja käsiteltiin UA (0 ja 10 ug /ml) 24 h, ja sitten altistettiin RT (0 ja 2Gy) 48 tuntia. Solut kerättiin trypsiinikäsittelyllä, kiinnitettiin 70% etanolilla -20 ° C: ssa, pestiin PBS: ssä, suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää, joka sisälsi 1 mg /ml RNaasi ja 50 ug /ml propidiumjodidia, inkuboitiin pimeässä 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ja analysoitiin virtaussytometrialla (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA).

mittaus apoptoosin

solut kvantifiointi apoptoosin soluissa arvioitiin käyttämällä anneksiini-V-FITC apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. 2,5 x 10

5-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten soluja käsiteltiin UA (0 ja 10 ug /ml) 24 h, ja sitten altistettiin RT (0 ja 2Gy) 48 tuntia. Solut kerättiin trypsiinikäsittelyllä ja suspendoitiin uudelleen 500ul: aan sitoutumispuskuria ja 5 ui anneksiini-V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), ja sitten 5 ui propidiumjodidia (PI) lisättiin. Analyysit suoritettiin virtaussytometrialla.

Detection reaktiivisten happilajien (ROS) sukupolven

pitoisuudet solunsisäisten ROS havaittiin käyttämällä kalvon läpäisevä fluoresoiva koettimia 2 ’, 7’-dichlorofluorescin diasetaatti (DCFH-DA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. 1 x 10

6 solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten soluja käsiteltiin UA (0 ja 10 ug /ml) 24 h, ja sitten altistettiin RT (0 ja 2Gy) 48 tuntia. Solut kerättiin trypsiinikäsittelyllä, suspendoitiin uudelleen DCFH-DA: ssa 30 minuuttia, pestiin seerumittomalla RPMI 1640, ja havaitaan sitten virtaussytometrialla. Keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus (MFI) edusti solunsisäisen ROS tasolla.

immunohistokemiallinen värjäys arvioimiseksi Ki-67 ilmentyminen

Ki-67-proteiinin ilmentymistä arvioitiin avidiini-biotiini-kompleksin immunohistokemiallista (ZSGB-BIO , Peking, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. 2 x 10

4 solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille peitelasilla jokaiselle hyvin, ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten soluja käsiteltiin UA (0 ja 10 ug /ml) 24 h, ja sitten altistettiin RT (0 ja 2Gy) 24 tuntia. Sitten kansi luistaa kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, inkuboitiin 0,5% Triton X-100 20min, pestiin PBS: ssä, ja inkuboitiin 3% H

2O

2 15min. Huuhtelun jälkeen PBS: llä kolme kertaa, solut, jotka oli kiinnitetty pääliliuskoille inkuboitiin Ki-67 monoklonaalisia vasta-aineita 60 min 37 ° C: ssa, ja pestiin sitten PBS: ssä uudelleen. Biotiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita 20 min on 20-37 ° C: ssa, pestiin PBS: llä ja neljä kertaa, sitten värjättiin DAB Värjäys Kit, pestiin vedellä, ja sitten vastavärjättiin hematoksyliinillä.

Tilastollinen analyysi

tiedot ilmoitettiin keskiarvona ± SD, ja keskimääräinen vertailut tehtiin yksisuuntaisella ANOVA. P 0.05 hyväksyttiin tilastollisesti merkitsevä. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS, v. 17,0.

Tulokset

sytotoksiset vaikutukset UA on BGC-823 solut

sytotoksinen vaikutus UA on BGC-823-soluissa arviointi perustuu MTT-määritystä. Huomasimme, että UA annosriippuvaisesti lisäsi sytotoksisuus mahalaukun syövän solulinja BGC-823 (kuvio 1). Puolen maksimaalinen estävä pitoisuus (IC

50) arvot BGC-823 oli 17.5ug /ml. Lievä sytotoksisuus ( 15%) UA varten BGC-823, 10 ug /ml, käytettiin seuraaviin suunnitellut kokeet, joilla voidaan kontrolloida radioenhancement vuoksi suoran sytotoksisen vaikutuksen.

48 tunnin kuluttua inkubaation UA ​​at ilmoitettuina pitoisuuksina, sytotoksisuus määritettiin MTT-määrityksellä. UA aiheutti sytotoksisuutta annoksesta riippuvalla tavalla, IC

50 UA varten BGC-823 on 17.5ug /ml, ja me on määritelty 10 ug /ml, kuten lievä sytotoksisuus (sub-sytotoksisuus) ( 15%) konsentraatio .

säteilylle herkäksi vaikutukset UA in vitro

Solun eloonjäämiskäyrien mitattuna klonogeeniset -eloonjäämiskoe havainnollistettiin kuvassa 2. verrattuna RT vain, SF

2 RT yhdistetyn UA merkittävästi vähentyneet BGC-823-solut, SER-arvot yhdistetyn ryhmät olivat 1,180-kertainen ja 1.315-kertaisesti. Nämä tulokset osoittivat, että UA parantaa säteilyn vaikutus BGC-823 annoksesta riippuvalla tavalla alueella hieman sytotoksisuutta pitoisuuksia.

radioherkkyyttä määritettiin klonogeenisten -eloonjäämiskoe. Eloonjääntifraktio yhdistetyn ryhmän merkittävästi vähenikin säteilytys ryhmän (** p 0,01).

Solusykli jakelua ja apoptoosin induktion.

Sen tutkimiseksi, RT ja /tai UA hoito voi aiheuttaa jonkin häiriön solusyklin, analyysi BGC-823 soluja käsiteltiin 2Gy säteilytys ja /tai 10 ug /ml UA suoritettiin. Suhteessa kontrolliryhmään, 10 ug /ml UA yksin tuotti lähes mitään vaikutusta solusyklin. Kuitenkin yhdistetty ryhmä UA ja säteilytys indusoi solusyklin pysähtyminen G

1 vaihe (51.87% VS 60.28%, p = 0,13) ja G

2 /M vaiheessa (3,14% VS 13,67%, p 0,01, kuvio 3D).

UA lisääntynyt RT aiheuttamaa ROS muodostumista

on yleisesti hyväksytty, että solun tappaminen jälkeen altistuminen ionisoivalle säteilylle on osittain välittyy ROS. [16] ROS analyysi käyttäen DCF-DA tuotettu keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus (MFI), joka edustaa solunsisäisen ROS taso kunkin ryhmän (kuvio 4A ja 4B). Rahalaitoksille UA yksin ryhmä, RT yksin ryhmä ja UA + RT ryhmä kasvoi 1,15-kertaiseksi, 1,53-kertainen ja 2,09-kertainen verrattuna kontrolliryhmään. Taso ROS yhdistelmän ryhmä kasvoi merkittävästi suhteessa RT yksin ryhmä, paljastaen että lisäämällä UA RT aiheuttama enemmän ROS muodostumista kuin RT yksin.

pitoisuudet solunsisäisten ROS todettiin käyttäen kalvon läpäisevä loisteputki antureista 20, 70-dichlorofluorescin diasetaatti (DCFH-DA) virtaussytometrialla. Keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus (MFI) edusti solunsisäisten ROS tasolla. Rahalaitoksilta ero yhdistelmä ryhmä ja RT ryhmässä oli merkitsevä (P 0,01) (ns: ei merkittävää; **: P 0,01).

immunohistokemiallinen värjäys Ki-67

Ki-67 tunnettiin tuma-antigeeni, joka usein korreloi solujen lisääntymistä. Meidän kokeessa havaittiin positiivinen määrä Ki-67-proteiinin immunohistokemiallisella värjäyksellä, ja tulokset on esitetty kuviossa 5. Prosenttiosuus Ki-67-positiivisia soluja yhdistetyn ryhmän väheni merkittävästi verrattuna verrokkiryhmään, sekä sädehoidon ryhmä .

kuvio 5A osoitti kuvia tulokset Ki-67 immunohistokemiallisella värjäyksellä BGC-823-solulinja (suurennus: 10 x 40). Prosenttiosuus Ki-67-positiivisia soluja yhdistetyn ryhmän väheni merkittävästi verrattuna verrokkiryhmään, sekä sädehoidon ryhmä. Kuvio 5B osoitti, että ero kontrolliryhmän ja UA ryhmä oli ei-merkitsevä; Oli kuitenkin merkittävä väheneminen välillä yhdistelmä ryhmän ja RT ryhmä (** P 0,01).

Keskustelu

Tämä tutkimus tutki vaikutukset ja mahdollinen mekanismi UA kuten säteilyherkiste. MTT-määritystä ja klonogeeniset selviytymisen määrityksessä osoitti, että IR yhdistettynä UA oli ylivoimainen sytotoksisuuden kuin IR yksinään. Tämä vaikutus havaittiin molemmissa ryhmissä eri osa-sytotoksisuus pitoisuudet UA, 6.25ug /ml ja 10 ug /ml. Tällä annoksella UA oli lievä sytotoksisuus ihmisen adenokarsinooma mahasyövän solulinjan BGC823 ja ei ollut merkittävää sytotoksisuutta normaaliin mahalaukun solulinjaan. [17] Tämä osoitti, että UA oli lupaava säteilylle herkäksi

in vitro

.

Keski syövän sädehoidon maksimoi terapeuttista tehoa kasvainkudoksen minimoiden vahingot normaaleissa kudoksissa. Vaikka monimutkaisempiin suunnittelu ja viimeaikainen fyysinen tekniikat voivat turvallisesti lisätä säteilyannoksen kasvainkudoksen ja vähentää annosta ympäröiviin normaaleissa kudoksissa, [18] nykyinen sädehoidon tekniikoita silti voi välttää vahingoittamasta lähistöllä normaaleissa kudoksissa. Lisäksi radioterapeuttinen hyöty voidaan löytää tutkimalla biologisen vasteen kasvaimen mikroympäristön paljastaa, kuinka lisätä kasvaimen herkkyyttä säteilylle tai estää haittavaikutuksia säteilyn. [19]

Normaali ympäröiviin kudoksiin mahalaukun syövän, kuten suoliston ja mahalaukun, ovat herkkiä ionisoivalle säteilylle. Tämän seurauksena, ionisoivan säteilyn annos kohti tuumorikudosta on rajoitettava. Lisäksi päällekkäinen sivuvaikutukset ionisoivan säteilyn parantaa sädehoidon sivuvaikutuksia, ja jopa keskeyttää hoito. Sub-sytotoksisuus pitoisuus UA yhdistettynä ionisoiva säteily voi kuitenkin lisätä sytotoksisuuden ionisoivan säteilyn, kun taas alhainen pitoisuus UA on lähes vaaraton normaaleissa kudoksissa. Tämä strategia voi lisätä terapeuttisen indeksin kasvainkudoksen lisäämättä säteilyannos ja sädehoitoon sivuvaikutus.

Tunnistaa mekanismi säteilylle herkäksi UA, suoritimme analyysin moniportaisesti. Ensimmäinen, olemme analysoineet solusyklin jakautumisen. Sub-sytotoksisuus pitoisuus UA ei tuottanut mitään merkittävää vaikutusta solusyklin, kun taas vertaa ionisoivalla säteilyllä yksin, yhdistetty hoito tehostaa G

2 /M pidätykseen. Radioherkkyyttä Solujen korreloi solusyklin, ja korrelaatio on suurempi G

2 /M vaiheessa ja alempi S-vaiheessa. Tämä voi olla tärkein taustalla syy tehostetun säteilylle herkäksi havaittu tässä tutkimuksessa. Toiseksi, olemme analysoineet solunsisäisiä ROS tasoilla. ROS taso yhdistelmäryhmä huomattavasti verrattuna verrokkiryhmään, UA yksin ryhmä, tai jopa ionisoivan säteilyn ryhmässä. Lisäys UA ionisoivan säteilyn aiheuttaman enemmän ROS muodostumista. Ionisoiva säteily indusoi radiolyysiin vettä, joka syntyy ROS, kuten hydroksyyliradikaaleja ja superoksidi. Nämä ROS molekyylit oli tärkeä rooli ionisoivan säteilyn aiheuttama solujen vaurioita, kuten oksidatiivisen DNA-vaurioita, mikä saattaa johtaa sekä klonogeeniset kuolema ja apoptoosin. Kolmanneksi tässä tutkimuksessa, huomasimme, että prosenttiosuus Ki-67-positiivisia soluja yhdistelmän ryhmässä väheni merkittävästi verrattuna kontrolliryhmään tai sädehoidon ryhmä. Ki-67 on tunnettu solukierron liittyvän antigeenin ja käyttökelpoinen leviämisen markkeri. Ki-67-proteiinin taso korreloi korkeamman leviämisen ja etäpesäkkeitä kyky. [20,21]

Yhteenvetona esillä oleva tutkimus on ensimmäinen yritys osoittaa, että UA voisi synergoida ionisoivaa säteilyä vastaan ​​ihmisen mahasyövän solulinjoissa . Taustalla mekanismi parantunut säteilylle herkäksi teho voi olla tehostetussa G2 /M pidätys, lisääntynyt ROS ja alassäädetty Ki-67 tason. Kollektiivisesti UA oli voimakasta kasvua estävän vaikutuksen ja synergistinen vaikutus, sitä voitaisiin käyttää mahdollisena lääke herkistävä soveltamista sädehoidon. Se on kuitenkin epäilemättä, että lisää tutkimusta tarvitaan arvioimaan mahdollisuuksia ja etuja käyttämällä perinteisen kiinalaisen lääketieteen kuten säteilyherkistimet ennen varsinaista kliinisiä sovelluksia. Enemmän kokeita ja toistojen tarvitaan muissa elimissä ja eläinkokeissa jotta voidaan vahvistaa tehoa ehdotetun strategian.