Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kuolleisuus pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on korkea johtuen syntymistä hoidon resistenssin joka johtaa paikallisiin ja alueellisiin uusiutumisen, jotka voivat olla peräisin myös resistenttien syövän kantasolut (CSCS) tai solujen epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme mahdollisuutta käyttää ilmentymiseen solun pinnalla CD44 ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), jotka molemmat on käytetty kantasolujen merkkiaineita, tunnistaa alapopulaatioiden sisällä HNSCC solulinjoja, jotka eroavat toisistaan ​​fenotyypin ja hoito herkkyys. Kolme alapopulaatioita, joka koostuu CD44

korkea /EGFR

alhainen, CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

alhainen soluja, vastaavasti, kerättiin fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu. CD44

korkea /EGFR

harvaan osoitti kara-muotoinen EMT-kaltainen morfologia, kun taas CD44

harvaan hallitsi mukulakivikadut muotoinen soluja. CD44

korkea /EGFR

harvaan rikastettiin soluja G0 /G1 ja oli suhteellisen alhainen proliferaationopeus ja korkea maljaustehokkuus. Käyttämällä reaaliaikainen PCR array, 27 geenejä, joista 14 liittyi EMT fenotyypin ja kaksi stemness, havaittiin ilmentyä erilailla CD44

korkea /EGFR

alhainen solujen verrattuna CD44

alhainen soluja. Lisäksi CD44

korkea /EGFR

alhainen solut osoittivat alhainen herkkyys säteilylle, sisplatiini, setuksimabi ja gefitinibi, ja suuri herkkyys dasatinibille suhteessa sen CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

alhainen kollegansa. Lopuksi tuloksemme osoittavat, että yhdistelmä CD44 (korkea) ja EGFR (matala) solupintailmentymi- voidaan tunnistaa hoidon kestävä alapopulaatio kanssa EMT fenotyypin HNSCC solulinjoissa.

Citation: La Fleur L, Johansson AC, Roberg K (2012) CD44

korkea /EGFR

alhainen alaryhmässä sisällä pään ja kaulan alueen syöpä Solulinjat Näyttää epiteelin-mesenkymaalitransitioon Fenotyyppikuvaus ja kestävyys hoito. PLoS ONE 7 (9): e44071. doi: 10,1371 /journal.pone.0044071

Toimittaja: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 01 elokuu 2012; Julkaistu: 25 syyskuu 2012

Copyright: © La Fleur et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Ruotsin laryngoskoopin Foundation, säätiö Signhild Engkvist, säätiö Åke Wiberg, Ruotsin Cancer Society (2008/552, 2010/545), maakäräjien Östergötland ja tutkimuksen rahastojen Linköpingin yliopistollisen sairaalan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan alueen syöpä on maligniteetti, että huolimatta edistysaskeleet terapiassa edelleen liittyy vakavia kuolleisuuteen. Kuolleisuus on edelleen korkea johtuen syntymistä paikallisten ja alueellisten toistuminen ja kehittäminen imusolmuke etäpesäke ja joskus etäinen etäpesäke. Vakiohoito pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) potilasta on sädehoito, usein yhdessä leikkauksen. Sädehoitoa on viime aikoina tullut osa edenneen kasvaimia, ja sisplatiini on yleisin aine yhdessä säteilyä. Viime vuosina esto epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) signalointia käyttämällä anti-EGFR-vasta-aineet (esim. Setuksimabi ja panitumumabipitoisuus) tai EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittorit (esim. Gefitinibi ja erlotinibi) on tullut uusi hoitostrategia; kuitenkin toistaiseksi setuksimabi on ainoa EGFR kohdistetun hyväksytty lääke hoitoon HNSCC. Radio- ja /tai kemoterapian resistenssin ja kasvaimen uusiutumisen ovat tärkeitä kliinisiä ongelmia hallinnassa HNSCCs ja tarve entistä tehokkaampien hoitomenetelmien kehittäminen on kiireellinen [1].

HNSCC muun epiteelin syövät, on hyvin heterogeeninen taudin [2], [3]. On tiedetty jo pitkään, että on olemassa alapopulaatioita solujen kasvain, joka eroavat toisistaan ​​suhteessa tuumorigeenisyyteen ja metastaattisen potentiaalin [4] – [6]. Toistuva kasvaimet ovat usein hoidon kestäviä ja voivat olla peräisin myös resistenttien syövän kantasolut (CSCS) tai tuumorisoluissa epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi. EMT on prosessi, jossa epiteelisolujen menettävät polariteetti ja solu-solu yhteyttä ja hankkia vaeltava mesenkymaalisten fenotyypin ja on osoitettu, että EMT voisi edistää kantasolujen ominaisuuksia. Lisäksi

in vitro

herkkyys HNSCC solulinjat syöpälääkkeiden, mukaan lukien EGFR: n estäjien ja sisplatiini, on osoitettu olevan vaikutusta ilmentymistä EMT liittyvien geenien [7], [8]. In HNSCC [9] sekä monissa muissa syövissä esimerkiksi aivo-, eturauhas-, keuhko-, paksusuoli-, haima-, maksa-, melanooma ja ihon kasvaimet [10] – [15], läsnä ollessa CSCS on raportoitu. Prince et al osoittivat, että CD44 +, mutta ei CD44- soluja eristettiin primäärisistä HNSCC näytteistä voi johtaa kasvaimia hiirissä [16]. Korkea ilmentyminen solun pinnalla CD44 on myös käytetty markkerina CSCS in HNSCC solulinjoissa [17], [18]. Äskettäin julkaistiin, että EGFR ollut läsnä pinnalla normaalien ja syövän keratinosyytit täyttävät kriteerit kantasoluja, kuten liikkumattomuus, pallo muodostumista kyky ja ilmaus kantasolujen merkkiaineita, vaikka keratinosyytit näytetään EGFR oli eriytetympää fenotyyppiin [19 ]. Tämä viittaa siihen, että on alhainen EGFR ilmentyminen solun pinnalla voidaan käyttää markkerina CSCS epiteelin kasvaimissa.

Useimmat perinteiset syövän hoidot eivät ota huomioon sitä mahdollisuutta, että alapopulaatiot syöpäsolujen olemassa ja että ne voivat esiintyä vaihtelevissa herkkyys kohti erityistä käsittelyä. Todellakin, leukeemiset kantasoluja on osoitettu olevan vastustuskykyisiä standardin sytotoksisten hoitojen [20], [21], ja molemmat glioblastooma kantasolujen ja rintasyövän-aloittamiseksi solut ovat säteilyresistenteille [22], [23].

Tässä tutkimuksessa selvitetään olemassaoloa ja ominaisuuksia alaryhmien solujen kolmesta HNSCC solulinjoissa, LK0827, LK0863 ja LK0923. Perustuen solun pinnalla ilmentymistä CD44 ja EGFR, kolme populaatiot tunnistettiin ja analysoitiin suhteessa CSC ja EMT ominaisuudet sekä radio-, sisplatiini, setuksimabi, gefitinibi ja dasatinibi (multi-BCR /ABL ja Src tyrosiinikinaasiestäjä) herkkyys.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tuore HNSCC kasvainbiopsioissa otettiin näytteet kasvain kokoelman (nro 416, National board of terveyttä ja hyvinvointia Ruotsissa) osoitteessa Department of ENT – Head and Neck Surgery, Linköpingin yliopistollisen sairaalan (hyväksytty maakunnan Ethical Review Board Linköpingin yliopistossa). Cultures Tässä tutkimuksessa käytetyt (LK0923, LK0827 ja LK0863) olivat peräisin tämän kokoelman ja noudattaen eettisen linjan. Kirjallinen suostumus on saatu kaikille osallistujille mukana tässä tutkimuksessa. Kaikki data-analyysi liittyy Näistä viljelmistä suoritettiin anonyymisti.

Solut ja viljelyolosuhteet

HNSCC solulinjat LK0923 (kurkunpään syöpä), LK0827 (kielen syöpä) ja LK0863 (kurkunpään syöpä), olivat perustettu tuoreista HNSCC kasvain näytteet laitoksella ENT – Head and Neck Surgery, Linköpingin yliopistollisen sairaalan kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. Välittömästi sen jälkeen poiston, kasvaimen näytteet upotettiin Ca

2 + – ja Mg

2 + vapaata fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS-A). Kudos pestiin, hakattu 1-2 mm paloiksi ja laitettiin dosviljelypulloihin kasvinviljelyä. Sen jälkeen kasvualusta (Keratinosyyttien-SFM; GIBCO, Invitrogen Corporation, Paisley, UK), jota on täydennetty antibiooteilla (penisilliini 50 IU /ml, streptomysiiniä 50 ug /ml), fungitsonia (0,25 ug /ml) ja 20% naudan sikiön seerumia (FBS ; kaikki GIBCO) lisättiin ja kasvaimen kudosviljelmiä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 kostutetussa ilmassa. Fibroblastit saastuttamatta viljelmät poistetaan jatkuvasti ero trypsinisaatiolla (0,25% trypsiiniä + 0,02% EDTA [etyleenidiamiinitetraetikkahappo]). Perustettu soluviljelmiä kasvatettiin keratinosyyttispesifisestä SFM täydennetty antibiooteilla ja 1% FBS, antanut uutta kulttuuri media kahdesti viikossa ja alaviljelmä yhtymäkohdassa käyttämällä 0,25% trypsiiniä + 0,02% EDTA viikoittain jakosuhde on noin 01:02. Solut seulottiin ajoittain mykoplasmakontaminaation käyttäen DAPI värjäyksessä ja /tai Universal Mycoplasma Detection Kit (ATCC, Manassas, VA, USA). Kulttuureissa kohdat 8-15 käytettiin kokeissa.

Virtaussytometria ja fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) B

Solut irrotettiin käyttäen Accutasella (PAA Laboratories, Pasching, Itävalta) ja alistettiin suoraan immunofluoresenssivärjäyksen. Soluja inkuboitiin 10% FBS PBS-A 4 ° C: ssa, minkä jälkeen pestiin PBS-A 1% FBS ja inkuboitiin vasta kohti CD44 (APC-CD44; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA; 01:10 ) ja EGFR (PE-EGFR; Abcam, Cambridge, MA, USA, 01:10) tai isotyyppikontrollivasta-aineiden (APC hiiren IgG2b, Becton Dickinson and PE rotan IgG2a, eBioscience, San Diego, CA, USA, vastaavasti). Solut pestiin, suspendoitiin PBS-A ja johdetaan 50 pm suodattimien (Becton Dickinson). Näytteet analysoitiin FACS Aria (Becton Dickinson, FACS Aria tilauksesta järjestelmä) ja soluja korkea CD44 ja alhainen EGFR solupintailmentymi- (CD44

korkea /EGFR

alhainen), solujen korkea ilmentyminen sekä markkereita ( CD44

korkea /EGFR

korkea), ja soluja, joilla on alhainen CD44 pinta lauseke (CD44

matala) kerättiin.

Proliferaatiomääritys ja hoito herkkyys

Heti solulajittelussa FACS, alapopulaatioiden ympättiin 12-kuoppalevyille. Kun 10 päivän viljelyn solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA), värjättiin kristallivioletilla (0,04% vuonna 1% etanolia) ja sen jälkeen liuotetaan 1% natriumdodekyylisulfaattia (SDS). Optinen tiheys 550 nm: ssä mitattiin käyttäen Victor-levylukijaa (EG G Wallac, Upplands Väsby, Ruotsi).

määrittämiseksi hoitovaste, solut ympättiin 12-kuoppaisille levyille ja sen jälkeen 24 h säteilytettyä (4 Gy) kanssa 4MeV fotonien tuottama lineaarikiihdytintä (Clinac 4/100, Varian, Palo Alto, CA, USA) tai altistunut sisplatiinin (2 ug /ml, 1 h), setuksimabi (Erbitux®, 30 nM, Merck KGaA, Darmstadt, Saksa), gefitinibi (Iressa®, 50 nM, AstraZeneca, London, UK) tai dasatinib (Sprycel®, 10 nM, Bristol-Myers Squibb, New York, NY, USA). Vaikutus hoitojen arvioitiin toisensa jälkeen 9 päivää viljelmässä käyttäen kristalliviolettimäärityksellä määritystä edellä kuvatulla tavalla.

Solusyklianalyysiä

48 h kuluttua solujen lajittelu FACS, solut kolme alapopulaatioiden oli irrotettiin käyttäen 0,25% trypsiiniä ja 0,02% EDTA: a, pestiin ja suspendoitiin uudelleen propidiumjodidilla (PI) liuosta (0,4 mg /ml PI, 1 mg /ml natriumsitraattia, 60 ug /ml tritsmaemäsliuoksen, 1,7 mg /ml spermiinin tetrahydrochloride ja 0,01% Nonidet P40; kaikki Sigmalta). Näytteet analysoitiin virtaussytometrialla, ja solusyklin analyysi suoritettiin käyttäen ModFit (Verity Software House, Topsham, ME, USA).

Plating tehokkuuden määritys

Heti kun solujen lajittelu FACS, soluja ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja 10 päivän viljelyn jälkeen solut kiinnitettiin 4% PFA ja värjättiin kristallivioletilla (0,04% vuonna 1% etanolia). Pesäkkeiden lukumäärä, jotka sisältävät vähintään 32-solut laskettiin valomikroskoopilla.

immunofluoresenssi

epiteelisolujen fenotyyppi varmistettiin immunofluoresenssivärjäyksen on sytokeratiineja kuten aikaisemmin on kuvattu [25]. Soluja viljellään lasipeitinlevyjä kiinnitettiin 4% PFA, inkuboidaan 0,1% saponiinia ja 5% vasikan seerumia PBS-A seurasi inkubointi primaarisessa vasta-kohti yleiseurooppalaisen sytokeratiini (1:50; Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle, UK) 0,1% saponiinia ja 5% vasikan sikiön seerumia PBS: ssä-A: ssa yön yli. Toissijaisena vasta- aineena vuohen anti-hiiri AlexaFluor 488 konjugoitu vasta-aine (1:400, Molecular probes; Invitrogen, Paisley, UK) käytettiin. Solut asennettu Vectashield väliaineessa (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) ja tutkittiin Olympus Vanox AHBS3 fluoresenssimikroskoopilla. Kuvat kerättiin käyttäen Olympus DP50 kamera.

Custom RT

2 Profiler ™ PCR array

ilmentymistä 87 geenien yhdistetään pääasiassa EMT, stemness, ja apoptoosin analysoitiin käyttämällä mukautettua -made PCR array Kilven SABiosciences (Frederick, MD, USA). PCR-reaktio suoritettiin valmistajan protokollan.

Kokonais-RNA uutettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen, Solna, Ruotsi), ja cDNA hankittiin käyttäen RT

2 First Strand Kit (SABiosciences) . DNA: n ja RNA: n kontaminaation arvioitiin käyttäen genomista DNA: ta kontrolli ja positiivinen PCR-kontrolli, vastaavasti. Keskimääräinen viisi siivous geenien (beeta-2-mikroglobuliinin [B2M], hypoksantiini phosphribosyltransferase 1 [HPRT1], ribosomaalinen proteiini L13a [RPL13A], glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi [GAPDH], ja beeta-aktiini [ACTB]) käytettiin normalisoida Ct-arvoja. Tiedot laskettiin käyttäen vertailevaa Ct tapa esittää tiedot kuin kertainen ero ilmentymistason suhteessa vertailunäytteen [26].

Quantitative real-time PCR (qPCR) B

Yhteensä-RNA uutettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen, Solna, Ruotsi) tai High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Mannheim, Saksa), ja cDNA saatiin käyttämällä High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, Tukholma, Ruotsi). MRNA ilmaus CDH1, CDH2, Nanog, SOX1, TWIST1, FOXC2, FN1 ja MMP7 analysoitiin käyttäen 7 500 Fast Real-Time PCR-järjestelmä ja FAM /MGB koettimia (Applied Biosystems). Kaikki reaktiot suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. GAPDH: ta monistettiin sisäisenä standardina ja tiedot laskettiin käyttäen vertailevaa Ct menetelmällä.

Western blot-analyysi

alikvootit 50 ug proteiinia tehtiin Western blot -analyysillä, kuten on kuvattu muualla [27] . Käytetyt vasta-aineet olivat: hiiren anti-Nanog (1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), hiiren anti-SOX1 (1:10000; R Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), hiiren anti-CD44 ( 1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA) ja kanin anti-EGFR (1:1000, Santa Cruz), jota seurasi HRP (piparjuuriperoksidaasi) konjugoitua vuohen anti-kani-vasta-aine (1:1500, Santa Cruz) tai HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (1:1500, Santa Cruz). Yhtä suuri kuin lastaus varmistettiin reprobing kalvot kanssa HRP-konjugoitua anti-aktiini-vasta-aine (1:2000, Santa Cruz).

Tilastollinen analyysi

Data arvioitiin tilastollisesti käyttämällä yksisuuntaista ANOVA seurasi by Bonferronin monivertailutestillä. Taso merkitys asetettiin p≤0.05.

Tulokset

tunnistaminen alaryhmien solujen HNSCC solulinjoissa

Jotta voitaisiin tunnistaa alapopulaatioiden eri fenotyyppejä, pinta ilmentymistä CD44 tutkittiin kolmessa HNSCC solulinjoissa (LK0923, LK0827 ja LK0863) virtaussytometrialla. Vuonna LK0923 ja LK0827 solulinjoissa, kaksi erillistä alaryhmää soluja, joilla on joko korkea tai matala CD44 solupintailmentymi-, havaittiin; ei kuitenkaan niiden kantojen voitiin havaita LK0863 solulinjassa (kuvio 1A). CD44

pieni alaryhmä oli runsaammin verrattuna CD44

korkea alaryhmä (72,3% ± 9,1 vs. 23,6% ± 9,2 vuonna LK0923; 68,9% ± 9,6 vs. 27,6 ± 9,3 in LK0827).

Dot plot analyysi LK0923, LK0827 ja LK0863 solujen yhteistyötä värjättiin APC-konjugoitu anti-CD44-vasta-aine ja PE-konjugoidun anti-epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) vasta-aine. Punaisia ​​alueet edustavat CD44

korkea soluja, ja kolme laatikkoa näyttää gating eri alapopulaatioista josta solut eristettiin lisäkokeita varten. B: Light mikroskooppi kuvat CD44

alhainen, CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

korkea /EGFR

heikkoihin (3 päivää lajittelun jälkeen) ja lajittelemattoman LK0923, LK0827 ja LK0863 solu kulttuureissa.

puute EGFR solun pinnan ilmentyminen on liittynyt stemness [19], solut co-värjättiin anti-CD44 ja anti-EGFR-vasta-aineita, jonka jälkeen CD44

korkea ja CD44

heikkoihin analysoitiin suhteessa niiden EGFR. Mielenkiintoista, osa LK0923 ja LK0827 CD44

korkea väestö osoitti alempaa EGFR verrata solujen CD44

harvaan (kuva 1A). Siten CD44

korkea alaryhmä edelleen jaettu kahteen ryhmään, joka perustuu niiden EGFR, jolloin kolme kannan osiin; CD44

alhainen, CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

korkea /EGFR

alhainen. Nämä alapopulaatioiden, määritellään gating kuviossa 1A, kerättiin FACS tarkempaa analysointia varten. Osuus kunkin lajitellaan väestöstä kussakin solulinjassa on kuvattu taulukossa S1. Vuonna LK0923 ja LK0827 solulinjat, kolmen populaation poikkesivat toisistaan ​​suhteessa solujen morfologia (kuvio 1 B). Vaikka solujen CD44

korkea /EGFR

harvaan osoitti kara-muotoinen EMT kaltainen morfologia, CD44

harvaan hallitsi mukulakivikadut muotoinen soluja. Näin ollen CD44

korkea /EGFR

suuren kannan sisälsi sekä cobblestone- ja kara-muotoinen soluja. Vuonna LK0863 solulinjassa, jossa ei erillistä populaatioiden havaittu perustuu CD44 pinnalla ilmaisua, solujen CD44

alhainen, CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

korkea /EGFR

heikkoihin eivät eronneet toisistaan ​​morfologisesti (kuvio 1 B).

karakterisointi CD44

alhainen, CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

korkea /EGFR

alhainen osapopulaatioiden

edelleen karakterisoimiseksi lajitellun väestö voisi LK0923 solulinjan, joka näkyy selvimmin CD44

suuren kannan, käytettiin. Yhteensä EGFR ja CD44 ilmentymisen kolmeen alaryhmään analysoitiin western-blotilla. CD44

korkea /EGFR

alhainen soluilla oli hyvin alhainen ilmentyminen koko EGFR verrattuna muihin kahteen alaryhmään ja CD44

harvaan ei CD44 ekspressio havaittiin (kuvio 2A).

V: Expression of CD44 ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) on lajitellun alapopulaatiot (β-aktiini käytettiin latauskontrollina). B: proliferaatio korko osapopulaatioiden. Data edustaa keskiarvoa ± SD kolmesta kokeesta kolmena kappaleena, * p≤0.05. C: Cell cycle jakelu vertailu CD44

alhainen ja CD44

korkea /EGFR

alhainen soluja. Tiedot yhdestä edustava koe kahdesta esitetään. D: Plating tehokkuus, joka arvioidaan pesäkkeenmuodostusta lajitellun osapopulaatioiden. Data edustaa keskiarvoa ± SD kolmen kokeen kahtena * p≤0.05.

Tutkia epiteelin fenotyypin lajitellut populaatioiden immunofluoresenssivärjäyksen yleiseurooppalaisen sytokeratiini suoritettiin. Tämä analyysi osoitti vahvempaa värjäytymistä CD44

alhainen solujen verrattuna kahteen CD44

korkea populaatiot kuuden päivän kuluttua eristyksen, mutta sen jälkeen vielä 30 vuorokauden viljelyn ero ei ollut niin merkittävä, mikä osoittaa, että kaksi kaikkein EMT-like populaatioiden muuttui soluihin entistä epiteelin ilmiasuun ajan (kuva S1).

Lisäksi lajiteltu populaatiot viljeltiin 30 päivän ajan ja sen jälkeen tarkasteltiin niiden heterogeenisyys viljelmän. Cultures peräisin CD44

korkea /EGFR

korkea koostui 51% CD44

alhainen ja 42% CD44

korkea soluja, kun taas CD44

korkea /EGFR

harvaan koostui 10% CD44

alhainen ja 82% CD44

korkea soluja. Sen sijaan CD44

harvaan sisälsi vain CD44

alhainen solujen 30 päivän kuluttua lajittelun. Yhdessä sekä CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

korkea /EGFR

heikkoihin olisi kyky kerrata heterogeenisuus viljelmän mutta vaihtelevassa määrin.

Seuraavaksi proliferaationopeus ja solusyklin jakautumisen kolmen osapopulaatioiden tutkittiin. Soluissa CD44

suuren kannan havaittiin alhaisempi proliferaationopeus verrattuna CD44

pieni soluja (kuvio 2B). Lisäksi siellä oli suurempi määrä solujen G0 /G1 faasin CD44

korkea /EGFR

harvaan verrattuna CD44

harvaan (60% ja 40%, tässä järjestyksessä; kuvio 2C ).

arvioimiseksi maljaustehokkuus kolmen tutkitun alapopulaatioista solut ympättiin alhainen tiheys ja sen jälkeen 10 päivää määrä muodostuneiden pesäkkeiden määritettiin. CD44

harvaan osoitti merkitsevästi vähemmän maljaustehokkuus verrattuna kahteen muuhun kannan osiin (kuvio 2D).

Yhteenvetona todettakoon, että CD44

korkea /EGFR

harvaan koostuu useammasta solut G0 /G1, mistä seuraa alhaisempi leviämisen nopeus, mutta on korkeampi maljaustehokkuus ja luultavasti korkeampi klonogeeniset potentiaali.

CD44

korkea /EGFR

harvaan osoittaa säätelyä EMT- liittyvien geenien

jotta seulomiseksi erot lajitellun osapopulaatioiden sisällä LK0923 solulinjassa ilmaus valikoima liittyvien geenien stemness, EMT ja apoptoosin tutkittiin käyttäen reaaliaikaista PCR array. Analysoida eroja alaryhmien hierarkkisessa klusterin analyysi suoritettiin (TIGR Multiexperiment katsoja 4), joka paljasti eroja 28 geenejä (kuvio S2). Suurin ero geenien ilmentyminen havaittiin välillä CD44

korkea /EGFR

alhainen ja CD44

alhainen alapopulaatioita, kun taas CD44

korkea /EGFR

korkea soluja, yhdenmukaiset morfologisiin analyysi osoitti yhtäläisyyksiä sekä kahden muun alaryhmiin. Verrattaessa CD44

korkea /EGFR

harvaan kuin CD44

harvaan, erot mRNA-tasolla voitiin havaita 27 geenejä, joista 20 oli voimistunut ja 7 vaimentua (taulukko 1). Näiden 27 differentiaalisesti ilmentyvien geenien 14 voi liittyä EMT fenotyypin (VIM, MMP2, MMP7, TIMP1, TWIST1, COL3A1, CDH1, CDH2, ITGA5, FN1, FOXC2, WNT5A, WNT5B ja SPARC). Mielenkiintoista, CD44

korkea /EGFR

alhainen solujen osoitti myös säätelyä kaksi kantasolujen geenejä, Nanog ja SOX1.

reaaliaikainen PCR array tiedot varmennettiin analysoimalla mRNA ekspressio CDH1 (E-kadheriinin), CDH2 (N-kadheriinin), VIM (vimentiinistä), FN1 (fibronektiini 1), TWIST1, FOXC2 ja MMP7 mukaan qPCR (kuvio 3A). MRNA: n ekspression tason edellä mainitut tekijät määritettiin myös LK0827 ja LK0863 populaatioissa. Samanlainen kuin mitä löydettiin LK0923, CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

korkea /EGFR

alhainen populaatiot LK0827 solulinja osoitti selvä EMT fenotyypin (kuvio 3B). Toisaalta, että LK0863 solulinjassa ole eroja mRNA: n ilmentymisen havaittiin välillä lajiteltu populaatioiden (kuvio 3C). Lisäksi ero ilmentymisessä N-kadheriinin, vimentiinistä ja fibronektiiniä 1 todennettiin proteiini tasolla LK0923 Western blot -analyysillä (kuvio 3D).

A-C: Suhteellinen mRNA ekspressiotasot epiteelisolujen mesenkyymisoluyhteisviljelmissä siirtyminen liittyvien geenien; E-kadheriinin, N-kadheriinin, vimentiinin, fibronectin1, Twist1, FOXC2 ja matriksin metalloproteinaasi 7 (MMP7) (A) LK0923, (B) LK0827 ja (C) LK0863 alapopulaatiot. Ilmaisu tasot CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

korkea /EGFR

heikkoihin näkyvät täällä kertainen ero suhteessa CD44

harvaan (GAPDH käytettiin sisäinen standardi). D: Western blot-analyysi N-kadheriinin, vimentiinistä ja fibronectin1 in LK0923 populaatioissa (β-aktiini käytettiin lastaus valvonta).

säätelyä CSC markers Nanog (LK0923) ja SOX1 (LK0923 ja LK0827) in CD44

korkea /EGFR

alhainen solujen vahvistettiin mRNA tasolla (kuvio 4), mutta sitä ei voitu todentaa proteiinitasolla (tuloksia ei ole esitetty).

Suhteellinen mRNA ilmentymistasojen stemness geenien Nanog ja SOX1 in LK0923, LK0827 ja LK0863 -alapopulaatioiksi, tässä näkyy kertainen ero suhteessa CD44

harvaan (GAPDH käytettiin sisäisenä standardina).

lajiteltu alapopulaatioiden eronnut hoidossa herkkyyden

arvioimiseksi, jos erilainen kohtelu herkkyyden välillä on kolme alapopulaatioista, lajitellaan soluja altistetaan ionisoivalle γ-säteilytys (4 Gy), sisplatiini (2 ug /ml, 1 h) setuksimabi (30 nM), gefitinibi (50 nM) tai dasatinib (10 nM).

LK0923 CD44

korkea /EGFR

alhainen solujen osoittautunut erittäin vastustuskykyinen sisplatiinihoitoon verrattuna molemmat CD44

alhainen ja CD44

korkea /EGFR

korkea soluja (kuvio 5A). CD44

korkea /EGFR

pieni populaatio LK0827 ja LK0923 soluilla on huomattavasti suurempi vastustuskykyä sädehoidon verrattuna kahteen muuhun alapopulaatioiden taas LK0863 ei havaittu mitään eroja (kuviot 5A, 5B ja 5C). Lisäksi kun setuksimabi lisättiin CD44

korkea /EGFR

alhainen solujen LK0827 ja LK0923 ne osoittautuivat resistenttejä. Vuonna LK0923 mitään eroja osapopulaatioiden havaittiin jälkeen altistukseen, mutta LK0827 CD44

alhainen solut olivat huomattavasti herkempiä gefitinibin verrattuna CD44

korkea /EGFR

alhainen soluja.

hoito herkkyys CD44

alhainen, CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

korkea /EGFR

alhainen soluja, eristetty (A) LK0923, (B) LK0827 tai (C) LK0863 ja altistetaan säteilylle (4 Gy), sisplatiini (2 ug /ml, 1 h), setuksimabi (30 nM), gefitinibi (50 nM) tai dasatinib (10 nM). Data edustaa keskiarvoa ± SD kolmesta kokeesta kolmena kappaleena, * p≤0.05.

Yhdessä yleensä LK0827 ja LK0923 CD44

korkea /EGFR

alhainen solut osoittivat alhainen herkkyys säteilylle, sisplatiinin, setuksimabi ja gefitinibi suhteessa niiden CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

pieni vastineet (kuvio 5A ja 5B). Toisaalta, niiden todettiin olevan herkempiä hoidon multi-BCR /ABL ja Src tyrosiinikinaasin estäjä dasatinibia.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tutkimme mahdollisuutta käyttää pinnan ilmentyminen EGFR ja CD44 löytää populaatioiden solujen HNSCC solulinjoja, jotka eroavat toisistaan ​​suhteessa fenotyypin ja hoitoon herkkyys. Kolme populaatiot, joka koostuu CD44

alhainen, CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

korkea /EGFR

alhainen soluja, vastaavasti, analysoitiin sen jälkeen solu- lajittelu FACS. CD44

korkea /EGFR

harvaan satamiin useampia soluja G0 /G1, osoittaa alempaa leviämisen ja korkeammalla maljaustehokkuus verrattuna CD44

korkea /EGFR

korkea ja CD44

heikkoihin. Mukaisesti nämä tulokset, Le Roy et ai osoittivat yhteyden normaalin ja syövän keratinosyyttien kohtalosta ja epäsymmetrinen jakautuminen EGFR mitoosin aikana. Lisäksi ne määritellyt kolme väestön normaali ja syövän keratinosyyttiviljelmät: pieni mutta jatkuva altaan Rh123

– (rodamiini 123, merkkiaine puolella väestöstä) ja EGFR

– lepotilassa olevat solut, pieni mutta vaihteleva kooltaan normaali ja syöpä soluviljelmissä pooli Rh123

– /EGFR

+ (ehkä aktivoitu kantasolut), ja kolmas suuri allas Rh123

+ /EGFR

+ ohimeneviä vahvistava soluja. Rh123

– /EGFR

– kulttuuri koostui enemmän soluja G0 /G1 ja soluja, joilla on korkeampi klonogeeniset kyky [19].

kaksi kolmesta tutkittu solulinjojen, CD44

korkea /EGFR

alhainen soluilla selvä EMT kaltainen fenotyyppi kara-muotoinen morfologia sekä voimistumista EMT markkereita. Kuitenkin, ei ole selvää CSC fenotyyppiä voitiin havaita näissä soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että pinta ilmentymistä CD44 (korkea) ja EGFR (matala) tunnistaa solupopulaation kanssa EMT fenotyyppi. Tämä populaatio on rikastettu CSCS; kuitenkin ylimääräisiä markkereita tarvitaan spesifinen valinta CSCS.

Äskettäin Biddle

et al

esittänyt todisteita siitä, että sisällä HNSCC kasvaimia kaksi erillistä CSC fenotyyppiä olemassa, yksi CD44

korkea /epiteelin erityisiä antigeeni (ESA)

korkea ja yksi CD44

korkea /ESA

alhainen [28]. CD44

korkea /ESA

harvaan esittää EMT-fenotyyppi ja näyttää olevan ominaisuuksia samanlainen CD44

korkea /EGFR

harvaan kuvattu tässä tutkimuksessa. Molemmat CSC populaatiot kuvataan Biddle

et al

voisivat siirtää epiteelin tai mesenkymaaliset piirteitä liuottaa solun heterogeenisyys mutta CD44

korkea /ESA

harvaan vähemmän määrin (sisältää 50% bipotent soluista verrattuna 100% bipotent soluja CD44

korkea /ESA

korkea väestöstä). Sopusoinnussa niiden tulosten, 30 päivän kuluttua lajittelun CD44

korkea /EGFR

korkea solujen näyttää lisäkapasiteettia liuottaa solu- heterogeenisyys verrattuna CD44

korkea /EGFR

alhainen soluja.

yhteys CSCS ja EMT ovat tulleet selvemmin näkyviin viime vuosina. Vuonna 2008 Mani ym kuvattu, että induktio EMT nisäepiteelisoluissa johti soluissa saamassa kantasolujen ominaisuuksia [29], joka ilmiö on nähtävissä myös haiman syöpäsoluissa [30]. Vuonna HNSCC on osoitettu, että solut saadaan sferoidiviljelmiä, joka osoitti kantasolujen ominaisuuksia, oli myös EMT ilmiasuun koholla vimentiinista ja α-sileän lihaksen aktiini tasot [31].

tärkeys EMT hoidossa vastus on äskettäin kohdistettu tutkimus eri syöpien [32]. Sekä haimasyövän ja HNSCC on osoitettu, että solut EMT fenotyyppi ovat vastustuskykyisempiä sisplatiinihoitoon [7], [33], ja sama kuvio havaittiin, kun tutkitaan vastetta säteilylle [34], [35] ja setuksimabi [35]. Alapopulaatioiden sisällä LK0923 ja LK0827 solulinjat erosivat osalta hoitovastetta. CD44

korkea /EGFR

alhainen soluilla huomattavasti pienempi herkkyys sisplatiini (LK0923) ja sädehoidon (LK0923 ja LK0827) verrattuna CD44

alhainen ja CD44

korkea /EGFR

korkea soluja. Yhdessä meidän aiempien tutkimusten jossa säteilyresistenteille ja säteilylle HNSCC solulinjoja vertailtiin mikrosiruanalyysillä, monet tunnistettu avainsäätelijä geenit liittyvät EMT [36]. Yksi näistä keskeisten sääntelyviranomaisten FN1, oli merkittävästi yläreguloituja säteilyresistenteille kasvainsoluissa sekä mRNA ja proteiini tasolla. Samanlaisessa tutkimuksessa, jossa verrataan sisplatiini kestävä ja sisplatiinin herkkä HNSCC solulinjoissa, MMP7 oli osoitettu olevan biomarkkeri sisplatiinin resistenssin [37]. Mukaisesti nämä tiedot, hoito kestävät CD44

korkea /EGFR

harvaan sisällä LK0923 ja LK0827 solulinjat osoittivat kohonneeseen Sekä FN1 ja MMP-7. Yhteys välillä EMT ja säätelyä MMP-7 ilme on aiemmin kuvattu.