Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vahva ja johdonmukainen suhde säteilytys nuorena ja myöhemmin kilpirauhassyöpä tarjoaa erinomaisen mallin tutkimiseen säteilyn syövän syntymistä ihmisessä. Meillä on siis arvioitu ero geenien ilmentyminen kilpirauhasissa suhteessa jodi-131 (I-131) annosten Tshernobylin onnettomuudesta. Kuusikymmentä kolme 104 papillaarisen kilpirauhassyövän diagnosoitu vuosien 1998 ja 2008 Ukrainan-amerikkalainen kohortti yksittäisten I-131 kilpirauhasen annosarvioita oli pariksi RNA yksilöitä tuore kasvain (T) ja normaalin (N) kudos, jonka Tšernobylin Kudospankki ja tyytyväinen laadunvalvontakriteerit. Ensin hybridisoitiin 32 satunnaistettiin RNA näytteen paria (T /N) 64 koko genomin mikrosiruja (Agilent, 4 × 44 K). Associations of ero geenien ilmentyminen (log

2 (T /N)) annoksen arvioitiin käyttäen Kruskall-Wallis ja kehitys testit lineaarinen sekoitettu regressiomallien. Vaikka yksikään geenien kesti korjauksen väärien löytö korko, valitsimme 75 geenien kanssa

a priori

todisteita tai P Kruskall /P suuntaus 0,0005 tehtävän hyväksynnän qRT-PCR jäljellä 31 RNA näytteen paria ( T /N). QRT-PCR tiedot analysoitiin käyttäen lineaarista sekoitettu regressiomallien että mukana säteilyannos kategorisena tai järjestysluku muuttuja. Yksitoista 75 qRT-PCR analysoidaan geenien (

ACVR2A

,

AJAP1

,

CA12

,

CDK12

,

FAM38A

,

GALNT7

,

LMO3

,

MTA1

,

SLC19A1

,

SLC43A3

,

ZNF493

) varmistettiin on tilastollisesti merkitsevä ero annos-ilmentymisen suhteen. Tutkimuksemme on ensimmäisten joukossa tarjota suoraa ihmisen tietoa pitkän aikavälin ero geenien ilmentyminen suhteessa yksittäisiin I-131 annosta ja tunnistaa joukko geenejä potentiaalisesti tärkeä säteilyn karsinogeneesissä.

Citation: Abend M, Pfeiffer RM, Ruf C, Hatch M, Bogdanova TI, Tronko MD, et al. (2012) Jodi-131 annosriippuvainen gene expression in kilpirauhassyövän ja Vastaavat Normaali kudokset Tshernobylin onnettomuuden jälkeen. PLoS ONE 7 (7): e39103. doi: 10,1371 /journal.pone.0039103

Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerchen (CNR), Italia

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 16 toukokuu 2012; Julkaistu: 25 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Abend et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli ensisijaisesti tukevat Saksan puolustusministeriö. Lisärahoitusta myönnettiin myötävaikuttanut Intramural tutkimusohjelma, Division of Cancer Epidemiology and Genetics, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat vakuutamme täten, että yksi yhteistyössä kirjailijat äskettäin palveluksessa NOVA Research Yritys ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Coauthor oli töissä Säteily Epidemiology Branch /National Cancer Institute (REB /NCI) ennen kuin hän muuttui NOVA Research Company, jossa hän työskentelee nyt. Tuolloin Säteily Epidemiology Branch /National Cancer Institute (REB /NCI) hän teki hänen panos.

Johdanto

Yksi tärkeimmistä terveysvaikutuksia 1986 Tšernobylin ydinvoimalan onnettomuus on dramaattinen kasvu kilpirauhassyöpä ilmaantuvuus keskuudessa, jotka olivat lapsille tai nuorille ajankohtana [1], [2]. Lukuisat epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä johtuu pääasiassa jodi-131 (I-131) altistuminen onnettomuuden kilpirauhanen [3] – [7]. Eroista huolimatta tutkimuspopulaatiossa malleja, ja dosimetriset lähestymistavat, ilmoitetaan suhteellisen riskin (RR) yksikköä kohti absorboituneen säteilyn harmaa (Gy) niille alttiiksi lapsuudessa ovat hämmästyttävän samankaltainen useimmissa tutkimuksissa (3-6 per Gy) ja yhteensopiva riskejä arvioidaan kilpirauhassyöpä lapsuudesta altistumisesta ulkoisen säteilyn [3] – [8].

tutkimus säteilyn syövän syntymistä ihmisessä voi hyödyntää tapauksia, joissa suhteet ovat vahvoja ja johdonmukaisia, kuten tilanteessa, jossa kilpirauhanen säteilytetään nuorena. Mahdollisuus molekyylitason tutkimuksen säteilyn liittyvien kilpirauhassyöpä helpotetaan resursseja Tšernobylin Tissue Bank (CTB), joka kerää järjestelmällisesti biologisia näytteitä potilaista, joilla on Tšernobylin liittyvää kilpirauhasen patologian [9]. Aiemmin jälkeinen Tshernobylin raportoidut tutkimukset geneettisten erojen säteilyperäisten ja satunnaista kasvaimia, mukaan lukien erityiset

RET /PTC

geenin uudelleenjärjestäytymistä [10] – [12]. Kuitenkin myöhemmät analyysit hyödyntäen CTB näytteiden johtuvan yhdistysten nuorempien Tšernobylin altistuneet potilaat sijaan niiden säteilyaltistuksen [13], [14]. Viimeaikaiset tutkimukset käyttäen CTB materiaaleja ja korkean kapasiteetin teknologiat ovat tunnistaneet uuden ”säteily-erityinen” geenejä [15] – [20]. Ehkä vaikuttavin havainto perustuu kertomuksen, jossa verrataan alttiina ja valottamattomat papillaarinen kilpirauhassyövän (PTC) tapaukset pienten alkamisiällä Ukrainasta todettua kromosomin bändi 7q11 perustuu vertailevaan genomiseen hybridisaatioon, vahvistettu riippumattomia tapauksissa fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio (FISH) ja kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) [20]. Kuitenkin löydöksiä geeni tasolla ovat yleensä epäjohdonmukaisia ​​eri tutkimuksissa mahdollisesti johtuen pienestä otoksesta, käyttö valvonnan eri populaatioiden puute menetelmiin validointi riippumattomia näytteitä, ja erilaisia ​​analyyttinen lähestymistapoja. Vielä tärkeämpää on, mikään edellisistä tutkimuksista oli henkilökohtaiset säteilyannokset olettaen, että kaikki paljaat tapaukset saivat saman annoksen. Riippuen todellinen annos-ilmaisun suhteen, tämä olettamus voi aiheuttaa vääriä positiivisia tai vääriä negatiivisia yhdistysten.

lisätä ymmärrystä molekyyli seurauksista I-131 altistuminen, arvioimme ensimmäistä kertaa ero geeniekspressiota kilpirauhasen kudos, joka määritellään eron geeniekspressiotasot välillä kasvain ja vastaavassa normaalissa kilpirauhaskudokseen suhteessa yksittäisiin I-131 kilpirauhasen annosarvioita. Oletimme, että jos annosriippuvaista geeniekspressiomalleja kasvainkudoksessa todella vastaavat tärkeä tapahtuma säteilyn karsinogeneesissä sijaan pitkäkestoinen vaikutus säteilyaltistuksen, ne pitäisi poiketa malleja havaittu normaalia kudosta; siksi lähestymistapamme analysoida ero annos-ilmentymisen suhteet kasvaimen suhteessa pariksi normaaliin näytteitä. Tutkimuksemme käytetään RNA yksilöitä CTB potilaiden, joille tehtiin kilpirauhasleikkaus kilpirauhasen syövän Ukrainan-amerikkalainen kohorttitutkimuksen koostumus on noin 13000 Ukrainan asukkaiden 18 vuotta aikaan onnettomuuden yksittäisten radioaktiivisuuden mittauksia kahden kuukauden kuluttua onnettomuus [21].

nykyisessä tutkimuksessa, ensin suoritetaan alustava näyttö puolessa tapauksista tunnistaa lupaavia geenin ehdokkaita, jotka ilmentyvät eri tuumorin ja normaalin kudosnäytteiden nähden I-131 yksikköinä on koko genomin RNA mikrosiruja (vaihe I). Sitten validoitu alkuun ehdokkaita kasvain ja normaali kudosnäytteiden jälkipuoliskolla tapauksista käyttäen qRT-PCR (vaihe II). Validoidussa ehdokkaiden olemme lisäksi tunnusomaista suhde geenin ilmentymisen erikseen kasvaimen ja normaalin kudoksen.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja Kudosnäytteiden

seurauksena neljän peräkkäisen seulonta tutkimukset, 110 yleisiä ja tapaus kilpirauhasen karsinoomat diagnosoitiin Ukrainan-amerikkalainen kohortti vuosien 1998 ja 2008 laboratorion morfologia Endokriiniset instituutin Endocrinology and Metabolism (IEM, Kiev, Ukraina) [3]. Kansainvälinen Pathology paneeli, perustettiin puitteissa CTB projektin, tarkistetaan kaikki patologinen diagnoosit. Voit vähentää fenotyyppinen heterogeenisyys tapauksissa me ulkopuolelle 5 follikulaarisen ja 1 medullary kilpirauhasen karsinoomat johtaen 104 PTC analyysikelpoisia; Näiden 74 (71%) oli varastoitu RNA erät kasvaimen ja /tai normaalin kudoksen CTB. Tapaukset mukana ja jotka eivät sisälly geeniekspression analyysit olivat samanlaiset monissa ominaisuuksia, myös I-131 annosta ja siten Tutkimuksemme otos on todennäköisesti puolueeton. Kaikki kudosnäytteet otettiin leikkauksen jälkeen potilaat allekirjoitti tietoisen suostumuksen muotoja hyväksyi laitoksen tarkastuslautakunta (IRB) ja IEM ja koordinointikomitean Center of CTB hankkeen (Imperial College Research eettiselle toimikunnalle, London, UK). Vuosikatsaus koko projektin saatiin myös IRB National Cancer Institute Yhdysvalloissa.

yksityiskohtaiset toimintatavat keräämistä, dokumentointi, ja käsittely jäädytettyjen kasvain ja normaali kilpirauhasen kudosnäytteitä ovat saatavilla CTB verkkosivuilla [22] ja kehitettiin yhdessä laboratorion morfologia Endokriiniset ja IEM ja Walesin Cancer pankin.

Dosimetria

dosimetriset menetelmiä on kuvattu muualla [23] – [ ,,,0],25]. Lyhyesti, yksittäiset I-131 kilpirauhasen annokset ja niiden epävarmuudet arvioitiin yhdistelmästä kilpirauhasen radioaktiivisuuden mittausten tietoja ruokavalion ja elämäntapojen, ja ympäristön siirtomalleja käyttäen Monte-Carlo käsittävää 1000 realizations per yksilö [23]. Analyysia varten käytimme aritmeettinen keskiarvo kunkin yksilön 1000 realisaatiot parhaana arvion I-131 annoskorjattujen kilpirauhasen massojen tyypillinen Ukrainan väestöstä [3].

RNA ja laadunvalvonta

Täydelliset tiedot RNA saa CTB verkkosivuilla [22]. Lyhyesti, jäädytetyt kilpirauhaskudokseen homogenisoidaan käyttämällä kudosta lyser (Qiagen, Hilden, Saksa). RNA uutetaan käyttäen Qiagen sarakkeessa-pohjaisissa järjestelmissä. RNA jäädytettiin -80 ° C: ssa standardin 5 ug eriä 20 ul: aan. Laatu ja määrä eristetyn kokonais-RNA mitataan spektrofotometrisesti (NanoDrop, PeqLab Biotechnology, Erlangen, Saksa) ja RNA eheys arvioidaan 2100 Agilent Bioanalyser (Life Science Group, Penzberg, Saksa). Meidän analyysi, käytimme vain RNA näytteitä suhteella

260 /A

280 ≥ 2,0 (Nanodrop) ja RNA eheys numero (RIN) ≥7.5 tai ≥5.5 varten koko genomin microarray ja qRT-PCR-analyysit, vastaavasti (IMGM Laboratories, Martinsried, Saksa).

Vaikka CTB edellyttäen 137 RNA yksilöille 71 yksilöiden PTC pystyimme käyttämään 126 pariksi (kasvain /normaali) RNA näytteitä vastaa 63 yksilöitä (kuva 1 ). Yksitoista RNA yksilöt kahdeksan henkilöä ei otettu puuttuvien täydentäviä kudokseen (n = 5) tai johtuen ei ole meidän laatukriteerit edellä määritellyt (n = 6).

Koko genomin Microarray Analysis (vaihe I)

Genome laaja ilmaisun profilointi suoritettiin käyttäen Agilent oligo mikrosiru (4 × 44 K-muodossa) yhdistettynä yhden värin perustuvan hybridisaation pöytäkirja 64 pariksi RNA näytteitä 32 satunnaisesti valittua yksilöitä (puolet näytteen sarja) . Jotta varmistetaan, että yksilöt valitaan microarray geenien ilmentymisen analyysi (n = 32) ja ne jäljellä validointi analyysiä qRT-PCR (n = 31) olivat samankaltaisia, olemme vahvistaneet, että jakaumat sukupuolen, iän, asuinpaikan, ja I- 131 annosta olivat samanlaisia.

Chemicals, sarjat, ja ohjelmisto koko genomin mikrosirulla määritys toimittivat Agilent Technologies, Waldbronn, Saksa. 500 ng kokonais-RNA: näytettä kohti (johon on lisätty sisäinen merkintöjä kontrolli) pantiin RT-IVT reaktio ja cDNA muunnettiin sitten leimatun cRNA in-vitro transkription vaihe (yksi väri Quick-Amp -leimauskittiä). Laatu leimatun ei-hajanainen cRNA analysoitiin (RNA 6000 Nano LabChip kit), ja cRNA puhdistettiin ja määrällisesti (NanoDrop ND-1000 Spetralphotometer). Lopuksi, 1,65 ug kutakin leimattua cRNA näyte oli hajanaista ja valmis yksivärinen perustuvat hybridisaatio (geenien ilmentymisen hybridisaatiokitissä). Hybridisaatio tapahtui 65 ° C: ssa 17 tuntia eri mikrosiruja, joka koostuu 41000 kohdegeenin-koettimien (~20,000 geenit) ja tuhansia valvonta- koettimia. Kolmen pesun tiukentuvista, fluoresoiva signaali voimakkuudet havaittu Agilent DNA-siru skanneri ja uutetaan kuvia käyttämällä Agilent purkuohjelmassa. Rikvantiilin normalisointi levitettiin tietoja.

Vaihe I: Tilastollinen analyysi Microarray Data ja valinta Gene Ehdokkaita Independent Validation

Analysoimme ero geeniekspression kasvain verrattuna normaaliin kudokseen, joka on saatu vähentämällä log

2 muuttaneet anturi signaalit normaalista kudoksesta (N) vastaavasta kasvainkudoksen (T), log

2 (T) -log

2 (N), suhteessa I-131 annosta arvioi. Tämä lähestymistapa vähentää vaihtelua geeniekspression. Käytimme epäparametrinen Kruskall-Wallisin testiä (P Kruskall) vertailla ero geenien ilmentyminen kolmessa eri annosta luokat (≤0.30, 0,31-1,0, 1,0 Gy) kanssa katkaisurajapisteet suunnilleen vastaa kolmannekseen annosjakauman kesken tapauksissa ja lineaarinen regressio malleja, joissa suuntaus testi (P ​​lineaarinen) jatkuvaan annoksen. Vain ne geenitranskriptien että oli puhelun ”läsnä” vähintään 50% RNA yksilöitä kasvain ja normaali kudos sisällytettiin analyysiin ero geenien ilmentyminen (~15,000). Me korjattu monimuuttujille käyttämällä vääriä löytö määrä (FDR) [26]. Koska yksikään P-arvot pysyivät merkittävästi jälkeen FDR korjauksen, me hyväksyi seuraavat kriteerit valita lupaavia ehdokkaita validointi ja pitoisuuden määrittäminen qRT-PCR: (P Kruskall ≤0.001) tai (0,001 P Kruskall ≤0.01 ja P lineaarinen ≤0.01 ) tai (0,01 P Kruskall 0,05 ja P lineaarinen ≤0.001). Kaiken kaikkiaan 106 ehdokasta pois noin 2500 ilmentyvät eri geenitranskriptien suhteessa annokseen tyytyväinen valintakriteerit. Olemme edelleen kaventuneet tämän luettelon 41 geenejä, jotka osoittivat alimman P-arvot (P Kruskall 0,0005 tai P lineaarinen 0,0005) ja oli ainakin kaksinkertainen ero (lisäys /vähennys) ero geenien ilmentyminen välillä korkeimman suhteessa alimpaan annos luokka. Ylimääräinen 34 geenejä P Kruskall 0,005 sisällytettiin validointi, koska oli näyttöä kirjallisuudessa geenimonistusmääritystä (kopioluku muutos, CNA 3) tai vahva ylä- /alassäätöä muissa tutkimuksissa kilpirauhassyövän säteilytetty populaatiot [19], [27]. Siten 75 geenit valittiin validointi avulla qRT-PCR (taulukko S1). Lisäksi arvioimaan välisen sopimuksen koko genomin microarray ja qRT-PCR mittauksia, meillä oli qRT-PCR (Applied Biosystems, Darmstadt, Saksa) näiden geenien joukossa 32 sisältyviä yksilöitä vaiheen I

Vaihe II: kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

validoida meidän microarray havaintojen arvioimme geeniekspressiota qRT-PCR (TaqMan aluke koetin määritykset) 62 pariksi RNA yksilöitä jäljellä 31 henkilöä. Kaikki kemikaalit qRT-PCR käyttäen TaqMan kemiaa toimittivat Applied Biosystems, Darmstadt, Saksa. Teknisistä syistä johtuen yksittäisten pohjamaali koetin määrityksissä olivat joko ajaa 96-kuoppaisen qRT-PCR alustalla tai jollakin muulla alustalla kutsuttu matalan tiheyden array (LDA). Kaksikymmentä neljä 75 geenien mitattiin kaksinkertaisina, koska käytettävissä oleva tila alustoilla ja parantamiseksi tilastotieto. 0,75 ug RNA: aan kutakin yksittäisen käänteiskopioitiin käyttäen kaksivaiheista PCR-protokolla (High Capacity Kit). 50 ui cDNA (joka vastaa noin 0,25 ug RNA) sekoitettiin 50 ul 2 x RT-PCR master mix ja pipetoidaan 2 8 täyttöä satamissa LDA. Kortit sentrifugoitiin kahdesti (1200 rpm, 1 min, Multifuge3S-R, Heraeus, Saksa), sinetöity, ja siirretään 7900 qRT-PCR väline. QRT-PCR ajettiin kaksi tuntia jälkeen qRT-PCR-protokolla 384 hyvin LDA muodossa. Taqman kemia 96-alustaa käytettiin samalla tavoin, paitsi tilavuus reaktiota kohden säädettiin 20 ui. Kaikki tekniset menettelyt qRT-PCR suoritettiin mukaisesti vakiotoimintamenettelyt toteutettu laboratoriossamme vuonna 2008, kun liittovaltion Institute of Radiobiologia tuli akkreditoitu DIN EN ISO 9001/2008.

Ajoimme neljä RNA yksilöt rinnakkaiseen kolmella eri LDAs perustaa yläraja lineaarisen-dynaaminen alue kynnyksen sykliä (CT). Yläraja CT oli 30, joten käytetään vain CT-arvot 30 analysointia varten. CT-arvot normalisoitiin suhteessa mediaani-geenin ilmentymistä tutkittiin geenejä. Tämä lähestymistapa osoittautui vakaampi verrattuna käyttöön 18S rRNA kaksoiskappaleet täplikäs kummallakin LDA normalisointia varten. Keskimääräinen variaatiokerroin (CV) qRT-PCR mittaukset oli 2,5% ja 95% kolmena mittauksissa oli CV 4% (kuvio S1). Differential geenin ilmentyminen heijastaa kertamuutosta erot RNA kopioluvun kasvainkudoksessa suhteessa vastaavassa normaalissa kudoksessa (käytetty kalibraattori) laskettiin vähentämällä liittyvät CT-arvot (delta-delta-CT-lähestymistapa).

Luotettavuus ja tulosten vertailu eri tekniikoita vaiheen I ja vaiheen II

Molemmat menetelmät mitattuna 32 sisältyviä yksilöitä vaiheen I paljasti vertailukelpoisia tuloksia 70,6% (kuvio S2A). Mean ero geenien ilmentyminen koko perimän DNA microarray tarkastellaan vaiheen yksilöitä myös korreloivan hyvin qRT-PCR mittaukset tarkastellaan vaiheen yksilöitä (vertailu eri menetelmiä eri henkilöitä, r

2 = 0,81, kuva S2B). Lopuksi qRT-PCR mittaukset sisältyviä yksilöitä, jotka eivät sisälly I vaiheessa myös korreloi (r

2 = 0,98, kuva S3), joka tukee luotettavuus menetelmistä.

Vaihe II: Tilastollinen analyysi qRT-PCR

vahvista vaiheen havaintoja, vaihe II analyysit, joita vain henkilöt (n = 31) ei sisälly ensimmäisessä vaiheessa jälkeen teho tai log muutosta ja /tai poistettu harha-arvot valittujen geenien, normalisoitu CT-arvot kaikkien geenien normaalisti jakautunut. Ensin lasketaan jäämät vakio lineaarisia malleja asennettu geeniekspression arvoihin

y

säätämisen ikä kilpirauhasleikkaus (3 luokat), sukupuoli ja alue tai asuinvaltio (Chernigov, Zhytomyr, Kiev), (1) missä μ on yleinen keskimääräinen ekspressiotaso. Sitten arvioitiin suhdetta I-131 annosta ja geenien ilmentymiseen lineaarisia sekamalleja yksittäisiä yksilöitä kuin tulosmuuttujana. Nämä mallit muodostavat korrelaatioita kasvaimen ja normaalin kudoksen mittaukset samalla yksilön ja myös majoittaa kahden mittauksen samalle henkilölle samasta kudostyyppi.

mallit olivat (2) missä r

ij merkitsee jäljellä mallista (1) koehenkilöillä i (i = 1, 2, …, 31) j

nnen näytteen (j = 1, 2 kasvaimen ja normaali kudos), ja ε

ij on normaalijakaumaa virhetermi, että myös sisältää korrelaatiot alkaen toistuvissa mittauksissa samasta näytteestä. Annos vaikutus Tuumorinäytteissä kvantitoidaan annos

kasvain, ja annos vaikutuksen normaalissa kudoksessa saadaan annos

normaali. Arvioimaan eroja annoksen vaikutus kudoksen tyypin testasimme nollahypoteesi H

0: annos

kasvain = annos

normaali. Jälleen I-131 annosta käytettiin kahdella tavalla: 3 riippumatonta annosryhmissä, mikä johtaa 2 vapausasteen Wald testi P-arvo H

0, ja käyttämällä 3 määräsi annosryhmissä, joka vastaa 1 aste vapauden testi H

0.The tontteja osoittavat jäännöstermien ja varustettu annos rinteitä normaali ja kasvainkudoksen. Kertamuutoksia ilmentymisessä liittyy annos laskettiin kahtena voiman ero rinteillä, eli 2 (annos

kasvain – annos

normaali). Parametrit sekamalleja arvioitiin käyttäen rajoitettua suurimman uskottavuuden menetelmä sisällytetty PROC MIXED, SAS 9.1.3 [28].

Tulokset

Ominaisuudet PTC asiat

63 tapausta tutkimuksessamme, 56% oli naisia ​​ja 54% oli asukkaat Chernigov alue (taulukko 1). Ikä onnettomuushetkellä vaihteli 0 18 vuotta (keskiarvo 7,9 vuotta) ja syöpiä diagnosoitiin +12,5-21,6vuotta onnettomuuden jälkeen (keskiarvo 16,5 vuotta). Mean I-131 kilpirauhasen annos oli 1,25 Gy vaihdellen 0,008 ja 8,6 Gy. Keinot 3 annosta luokat olivat 0,11, 0,57 ja 2,62 Gy, vastaavasti. Yleisin histologinen alatyyppi PTC sekoitettiin (48%) ja loput koostui follikulaarinen (25%), klassinen papillaarinen (19%), ja kiinteä aine (8%) alatyyppejä. Keskimääräinen suurimman kasvaimen halkaisija oli 16,0 mm, joiden valikoima 6,0-45,0 mm.

Whole Genome Microarray

19596-geenin mRNA: t (41079 selostukset) täplikäs koko genomin microarray, keskimäärin 73,4% (vaihteluväli: 63,3% -91,0%) oli erotettavissa taustan (ilmaistuna). Kokonaismäärä geenitranskriptien differentiaalisesti ilmaistuna suhteessa I-131-annos oli 2500; Näiden valitsimme 75 geenin ehdokkaita tehtävän hyväksynnän qRT-PCR (taulukko S1).

qRT-PCR

75 geenit analysoitiin, 15 kehittyneet ei vahvistus tonttien, 5 tuotti tuloksia 10 henkilöä, ja 6 näytteillä korkea vaihtelevuus todennäköisesti johtuu riittämättömästä pohjamaali sondirakenne tällaisen 26 geenejä epäinformatiivisia. 11 jäljellä 49 geenien annosriippuvaista ilmentyminen kasvainkudoksessa oli tilastollisesti merkitsevästi erilainen kuin annosriippuvaista ilmentymisen normaalissa kudoksessa, kun annos on käytetty kategorisena tai järjestysluku muuttujan lineaarinen sekamalleja (taulukko 2). Yhdistykset merkittävä sekä kategorinen ja järjestysluku annoksen havaittiin seuraavien 6 geeneistä:

ACVR2A

,

CA12

,

CDK12

,

FAM38A

,

LMO3

,

MTA1

(taulukko 2). Kolme geeniä (

SLC19A1

,

SLC43A3

,

ZNF493

) oli tilastollisesti merkitseviä eroja ero geenien ilmentyminen kategorisen annos (2 vapausasteen testit), mutta ei järjestysluku annos, mikä viittaa ei-lineaarinen annos-ilmaisun suhteita; ja kahden geenin (

AJAP1

,

GALNT7

) oli tilastollisesti merkitsevä ero annoksesta ilmentymisen suhde järjestysluku annoksen, mutta ei kategorisen annosta. Sillä

SLC43A3 of the assosiaatiot geenien ilmentymisen ja annos rajoittuivat kasvainkudoksen (2 vapausasteen testi) ja

FAM38A (

2 vapausasteen ja 1 vapausastetta testejä),

SLC43A3

(2 vapausasteen testi),

LMO3

(1 vapausasteen testi),

MTA1

(1 vapausasteen testi) normaaliin kudokseen (kuviot 2 ja 3). Sillä

CA12

,

GALNT7

,

LMO3

, ja

SLC43A3

on hyvä erotus ilmaisun välillä kasvain ja normaali kudos kullakin annostasolla sekä koska ehdotus on vastakkaiset suuntaukset annokseen. Useimmissa tapauksissa merkittäviä eroja annos-vaste kudoksen tyyppi näytti olevan johtuu heterogeenisyys annos-vaste kuvioita puuttuessa monotoninen annos-vaste joko kudos- tyyppi.

Huom: Mean jäljellä geeniekspression poistamisen jälkeen iän, alue, ja sukupuoli on piirretty erikseen normaalia kudosta (vasen osa kuvaajasta) ja kasvainkudoksen (oikealla puolella kaavion) ​​vastaan ​​keskiarvo kolmen I-131 annosta luokat (0,11, 0,57, 2,62 Gy). Circles harmaa täytteet vastaavat tarkoittaa geeniekspression arvot normaalia kudosta ja neliöitä mustalla täytteet vastaavat tarkoittaa geeniekspression arvot kasvainkudoksessa. Virhe pylväät edustavat 95%: n luottamusväli. P-arvot yhdessä annoksen perustuvat 2 vapaus testi ja 1 vapaus suuntaus testi, vastaavasti, ja annetaan erikseen normaalin ja kasvainkudoksen pohjalle kunkin paneelin.

Huomautus: Mean jäljellä geeniekspression poistamisen jälkeen iän, alue, ja sukupuoli on piirretty erikseen normaalia kudosta (vasen osa kuvaajasta) ja kasvainkudoksen (oikealla puolella kaavion) ​​vastaan ​​keskiarvo kolmen I-131 annos luokat (0,11, 0,57, 2,62 Gy). Circles harmaa täytteet vastaavat tarkoittaa geeniekspression arvot normaalia kudosta ja neliöitä mustalla täytteet vastaavat tarkoittaa geeniekspression arvot kasvainkudoksessa. Virhe pylväät edustavat 95%: n luottamusväli. P-arvot yhdessä annoksen perustuvat 2 vapaus testi ja 1 vapaus suuntaus testi, vastaavasti, ja annetaan erikseen normaalin ja kasvainkudoksen pohjalle kunkin paneelin.

keskustelu

Koska suhde säteilytys nuorena ja riski kilpirauhassyöpä on vahva ja silmiinpistävän johdonmukainen, tämä kasvain tarjoaa erinomaisen mallin tutkimiseen säteilyn syövän syntymistä ihmisessä. Täällä, käytimme mittaukseen perustuvaa yksittäisten I-131 annokset arvioitu kohortin Ukrainan asukkaille, jotka olivat 18 aikaan Tshernobylin onnettomuuden ja RNA yksilöt tuore kilpirauhaskudokseen antamat CTB. Ensimmäistä kertaa olemme laatineet analyysin annoksesta riippuvaista geeniekspressiota papillaarinen kilpirauhassyövän suhteessa normaaliin kilpirauhaskudokseen samalta yksilöitä koko genomin ja vahvistettiin havainnot 11 geenien qRT-PCR RNA yksilöitä erilliset tapausten .

useita kohtia tulisi harkita verrattaessa meidän tuloksia aikaisempien tutkimusten. Transkription profilointi käyttäen mikrosiruja, joka mahdollistaa samanaikaisen arvioinnin tuhansia geenitranskriptien on käytetty laajalti saada tietoa molekyyli- muutokset ionisoivan säteilyn aiheuttama [29] – [35]. Kuitenkin oli ensisijaisesti soveltaa erilaisiin solutyyppeihin

in vitro

: soluviljelmissä ihmisen keratinosyyttien [31], lymfoblastoidisoluilla [34], jne. Muutamia tutkimuksia mukaan lukien eläinmalleissa tai saaneilla potilailla sädehoitoa tutkittiin geeniekspressiota pian sen jälkeen

in vivo

säteilytys [32], [33], [35]. Geenit, jotka osoittivat annoksesta riippuvia muutoksia altistus ionisoivalle säteilylle Näissä tutkimuksissa ovat todennäköisimmin hyötyä jo biologisia päätepisteitä ja /tai biologisten merkkiaineiden altistuksen. Niiden hyödyllisyys pitkällä aikavälillä syöpäriskin ihmisillä on vahvistamatta. Joiltakin Mekaaniset tutkimukset, joissa verrattiin geeniekspression säteilyperäisten syöpiä geeniekspression satunnaista syöpien tai vastaavassa normaalissa kudoksessa [15] – [20], mutta mikään näistä osallistuvien yksittäisten annosarvioita. Tutkimuksemme on pyrkinyt tämän aukon. Käyttämällä yksittäisiä I-131 annosarvioita, arvioimme annos kolmeen luokkaan, ilman oletuksia annos-vaste muoto ja olettaen lineaarinen annos-vaste. Koska eri radiobiological mekanismeja saattaa esiintyä yhä säteilyannoksia kuten solun tappaminen ja induktio pysyviä kromosomaalisen uudelleenjärjestelyjä, jotka itse ovat tunnettuja seuraamaan epälineaarisia suhde [36], [37], kaareva suhde ero geenien ilmentyminen on uskottava. Yhdenmukainen tämä ajatus, ainakin jotkut geenit (

SLC19A1

,

SLC43A3

,

ZNF493

) osoitti ehdotusta epälineaarisuus ero annos-vaste.

11 geenejä, jotka on validoitu itsenäisessä tapauksessa asettamat qRT-PCR tutkimuksessamme (taulukko S2) sijaitsevat kaikki eri kromosomeissa ja kuuluvat eri biologisia polkuja, mukaan lukien soluadheesiota (

AJAP1

,

FAM38A

), energia-aineenvaihduntaan (

CA12

), transkription tai DNA: n metylaatio (

LMO3

,

ZNF493

,

MTA1

,

SLC19A1

), ja kasvu /erilaistuminen (

CDK12

,

ACVR2A

). Kaikki nämä reitit ovat sekaantuneet soluvasteiden ionisoivan säteilyn [31], [34]. Vielä tärkeämpää on, neljä geenejä (

CA12

,

GALNT7

,

LMO3

, ja

SLC43A3) B raportoitiin aiemmin Stein et al. voidaan yksiselitteisesti vapautettu jälkeisessä Tšernobylin kilpirauhassyövän [19] ja yksi geeni (

FAM38A

) aiemmin tunnistettiin Ory et al. in tutkimus kilpirauhassyöpäpotilailla säteilytys ensimmäinen ensisijainen syövän lapsuudessa [27]. Sen lisäksi löytää nämä viisi geenit ilmentyvät differentiaalisesti riippumaton sarja säteilytettyä tapauksissa olemme esittänyt todisteita siitä, että niiden ero ilme näyttää olevan annoksesta riippuvaista. Siksi nämä geenit ovat erityisen houkuttelevia ehdokkaita edelleen validointitutkimuksissa keskittyy mekanismeihin säteilyn syövän synnyn. Mikään lupaavia geenien tunnistettu tutkimuksessamme sijaitsi 7q11.22-11.23; voitto tällä geenivirhe kerrottiin nuorten ilmaantuvia jälkeinen Tshernobylin PTC [20].

Useita johtolankoja ilmi Tutkimuksemme jotka voisivat ohjata tulevia tutkimuksia säteilyn syövän synnyn. Annoksesta riippuvuutta ero geenien ilmentyminen havaitaan vuoden kuluttua altistus edustaa myöhässä ja /tai pitkäkestoinen säteilyn vaikutusta. Eräs mekanismi, jonka säteilyn aiheuttamista muutoksista voitaisiin jatkuu pitkään on perintönä DNA-vaurioiden [38]. On raportoitu, että ionisoiva säteily pystyy aiheuttamaan tietyn tyyppisen DNA-vaurioita, etenkin kopioluvun muutokset (CNAs) [39]. Lukuisat tutkimukset satunnaisia ​​syöpiä ovat vahvistaneet, että CNAs voi muovata kudokseen transcriptomes ja vaikuttaa geenin ilmentymistä [40]. Näin ollen, jos säteilyn aiheuttama CNAs säilyvät tuumorigeneesin, annoksesta riippuvainen ero geenin ilmentyminen saattaa osittain johtua annokseen liittyviä muutoksia CNAs. Tämä ajatus löytää jonkin verran tukea tutkimuksissa raportoiduista päällekkäisyys CNAs ja geenien ainutlaatuisesti vapautettiin jälkeisessä Tšernobylin kasvaimia [19] ja merkittävä yli-ilmentyminen yhden geenin useista tarkasteltu sai 7q11.22-7q11.23 alueella [20]. Toinen esiin nouseva mekanismi, jonka avulla säteily voi aiheuttaa pysyvää pitkäkestoisia muutoksia geenien ilmentyminen on epigenetiikka [41], [42]. Epigeneettiset muutokset vaikuttavat välillisesti DNA muuttamalla DNA: n metylaatio, kromatiinin remontin, ja microRNA (miRNA) ilmaisukeinoja eikä DNA rakenne. Meidän havainto aiheutti annoksesta riippuvaisia ​​tiettyjen geenien ilmentyminen (

FAM38A

,

SLC43A3

,

LMO3

,

MTA1

) normaalissa kilpirauhaskudokseen voi liittyä säteilyn aiheuttama epigenetic muutoksia. Lisäksi annosriippuvaista ilmentyminen muuttuu normaalissa kudoksessa saattaa tarjota lisämahdollisuuden arvioida yksilöllinen herkkyytensä säteilyaltistuksen [43], [44]. Samanaikainen arviointi geenien ilmentyminen, CNAs, ja epigeneettiset muutokset saattavat antaa vihjeitä monimutkaisia ​​ionisoivan säteilyn vaikutuksista ja säteilyn syövän syntymistä.

Tutkimuksemme on useita ainutlaatuisia vahvuuksia. Ensinnäkin, käytimme yksittäinen I-131 annosarvioita perustuu radioaktiivisuuden mittausten pian onnettomuuden jälkeen [3], [6]. Toiseksi tapausta esiintyi sisällä hyvin kuvattu kohortti seuloa kilpirauhassyöpä standardoitua protokollaa ja riippumatta annoksesta, minimoimaan mittaamatta sekoittavia.