Krooninen sairaus

tiivistelmä

Side väestöstä (SP) ja ABC transporter ilmaisun rikastamiseksi kantasolujen lukuisissa kudoksissa. Tutkimme jos tämä fenotyyppi ominaista ihmisen virtsarakon syövän kantasolut (CSCS) ja pyritty tunnistamaan sääntelymekanismeja. Keskittyminen ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpä (NMIBC), useita ihmisen solulinjoja käytetään luonnehtimaan SP ja ABC transporter ilme.

In vitro

ja

in vivo

fenotyyppiset ja toiminnallinen arvioinnit CSC käyttäytymisestä tehtiin. Expression of oletetun CSC markkeri ABCG2 arvioitiin kliinisissä NMIBC näytteistä (n = 148), ja rooli MAPK signalointia, keskeinen mekanismi virtsarakon tuumorigeneesiä, tutkittiin. Tulokset osoittivat, että ABCG2 kuljettaja oli pääasiallisesti ilmaistiin ja oli säädellään ylöspäin SP fraktiosta 3-kertaiseksi (ABCG2

hi) verrattuna ei-SP (NSP) jae (ABCG2

alhainen). ABCG2

hi SP soluilla rikastamista kantasolujen merkkiaineita (Nanog, Notch1 ja Sox2) ja kolminkertainen kasvu pesäkkeitä muodostavien tehokkuus (TAE) verrattuna ABCG2

alhainen NSP soluja.

In vivo

, ABCG2

hi SP soluja rikastetaan tuumorikasvulle verrattuna ABCG2

alhainen NSP soluja, sopusoinnussa CSCS. Perk oli konstitutiivisesti aktiivinen ABCG2

hi SP-soluissa ja MEK esto esti myös ABCG2

hi SP fenotyyppi ja merkittävästi tukahdutti TAE. Lisäksi tutkimaan kliinistä NMIBC näytteitä, ABCG2 ilmaisu korreloi lisääntynyt uusiutuminen ja laski ilman taudin etenemistä. Lisäksi Perk ilmaisu myös korreloi vähentynyt ilman taudin etenemistä, kun taas positiivinen korrelaatio osoitettiin edelleen välillä ABCG2 ja Perk ilme. Lopuksi vahvistamme ABCG2

hi SP rikastaa varten CSCS ihmisen NMIBC ja MAPK /ERK-reitin on sopiva terapeuttinen kohde.

Citation: Hepburn AC, Veeratterapillay R, Williamson SC, El-Sherif A, Sahay N, Thomas HD, et ai. (2012) Side Population in Human Non-Muscle Invasiivinen virtsarakon syövän rikastaa syövän kantasolut, joita ylläpidetään MAPK Signalling. PLoS ONE 7 (11): e50690. doi: 10,1371 /journal.pone.0050690

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas M. D Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 23 lokakuu 2012; Julkaistu: 30 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Hepburn et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat JGW Patterson Foundation ja NHS johtokunta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) virtsarakon on maailmanlaajuinen vuosittainen ilmaantuvuus yli 350000 uutta tapausta ja 145000 kuolemantapausta [1]. Yhdysvalloissa se on viidenneksi yleisin maligniteetti osuus on yli 70000 uutta tapausta vuodessa ja arvioitu vuosittainen kulutus on $ 3.5 miljardia syövän hoitoon [2], [3]. Vaikka 85%: lla potilaista esiintyy vähemmän aggressiivisia kuin lihas invasiivisia virtsarakon syöpä (NMIBC), niillä on suuri riski toistumista ja ne, joilla epäsuotuisa ominaisuudet, kuten multifokaalinen sairaus, korkea laatu kasvaimet, tai ilman samanaikaista karsinooma in situ (CIS) , on erityinen riski taudin etenemisen. Rakonsisäinen Bacille Calmette-Guerin (BCG) voi vähentää etenemisen riskiä 27% potilailla, joilla on suuri riski NMIBC [4], mutta ne, jotka eivät reagoi tyypillisesti tehdään sairaalloinen leikkaus poistaa virtsarakon. Potilailla, jotka esittävät kanssa, tai edistystä, lihasten invasiivisia virtsarakon syöpä (MIBC), mahdollisuus selviytyä yli 5 vuotta hoidon jälkeen on noin 50-60% [5], [6]. Tämä tausta osoittaa, että uudet hoitomenetelmät vastaan ​​NMIBC tarvitaan kiireesti hävittämiseksi taudin ennen invasiivisen fenotyyppi kehittyy [7].

Viimeaikaiset edistysaskeleet syövän biologian ovat olleet luonnehdinta syövän kantasoluja (CSCS), pieni alaryhmässä kasvainsolujen, jotka ovat kasvaimen aloite- ja ajaa tuotantoa muun syövän. CSCS on kuvattu yhä enemmän tuumorikohdissa, kuten verta muodostavien, rinta-, paksusuoli-, melanooma ja eturauhasen [8] – [12]. On käymässä selväksi, että on tärkeää kohdistaa näihin soluihin, koska ne määrittävät hoitovastetta [13]. Kategorisointi ja valinta puolen väestöstä (SP) fenotyyppi virtaussytometrialla [14] rikastaa varten CSCS lukuisissa kasvaimissa [15] – [18]. Viimeaikaiset esittely SP virtsarakon syövän edellyttää lisätutkimuksia sen mahdollisen roolin kuvaavat CSCS [19].

patogeneesi virtsarakon syöpä näyttää liittyy läheisesti erillisiä molekyyli polkuja [20], [21]. Yli 70% NMIBCs satama aktivoivat mutaatiot fibroblastikasvutekijäreseptori 3 (FGFR3), joka johtaa konstitutiiviseen MAPK signaloinnin [22], [23]. Lisäksi ylössäätöä EGFR /erbB-perheen reseptorien lisääntymiseen liittyvien luokan ja vaiheet virtsarakon syöpään [24], [25]. Merkitystä, SP fenotyyppi välittää ATP-sitova kasetti (ABC) perheen transporter proteiinien [14], ja rintasyöpä kestävä proteiini-1 (BCRP1) /ABCG2 kuljettajan on osoitettu olevan tärkein välittäjä tässä fenotyypin [26]. Erityisesti ABCG2 puolestaan ​​säätelevät MAPK [27] ja rooli MAPK /ERK signalointireitille säätelyssä SP on ehdotettu (Tsichuda ym 2008).

Koska ensimmäinen askel tiedottamisessa suunnittelu uusien hoitomuotojen varten NIMBC, pyrittiin kuvaamaan CSCS ihmisen virtsarakon syövän käyttäen SP valinta ja tutkia sääntelyn kautta MAPK /ERK signalointi akselilla.

RT112, RT4, J82 ja 253JB-V solut värjättiin Hoechst 33342 väriainetta yksinään tai läsnä reserpiini ja analysoitiin virtaussytometrialla mittaamalla Hoechst sininen vs Hoechst punaisen fluoresenssin. SP oli aidatulla ja edusti prosentteina koko elinkelpoisten solupopulaation seuraavien PI syrjäytymisen (keskiarvo ± SE).

suhteellinen mRNA ilmentymä ABCA2, ABCG2, MRP1 ja P-glykoproteiinin määritettiin SP ja NSP jakeet RT112 (A) ja RT4 (B) soluihin käyttäen reaaliaikaista PCR. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo kolmen erillisen kokeen kukin suoritettiin kolmena kappaleena (keskiarvo ± SE). * P 0,05 (Opiskelijan kaksisuuntainen

t

-testi). Inhibitiotutkimuksissa tehtiin RT112 (C) ja RT4 (D) soluihin käyttäen ABCG2-spesifinen estäjä fumitremorgin C (FTC) ja P-glykoproteiinin estäjä verapamiili.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja Soluviljely

Ihmisen virtsarakon syövän solujen RT4, RT112 ja J82 saatiin American Type Culture Collection (ATCC) ja niitä viljeltiin RPMI 1640: ssä (Sigma), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1 % L-glutamiinia – kutsutaan koko median (FM). Erittäin metastaattinen ihmisen TCC solulinjaa 253JB-V oli jalomielinen lahjoitus Prof. Colin Dinney [28] ja viljeltiin MEMalpha alusta täydennettynä 5% FBS. Kaikki solut kasvatettiin 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO

2. MEK1 /2 spesifinen estäjä, U0126 (Cell Signalling Technology), ja rEGF (Sigma) käytettiin tutkimuksissa moduloida MAPK signalointia. Ohjaus solut vertailussa mukana kulttuureja -peruselatusaineessa (BM) puuttuu FBS ja FM.

Hoechst Dye ulosvirtausaika Pitoisuus

Solut värjättiin Hoechst 33342 väriaine muunnetuissa aikaisemmin kuvatun protokollan [14] . Lyhyesti, Hoechst 33342 väriainetta (2,5 ug /ml) lisättiin yksin tai, kun läsnä on reserpiinin (50 uM), verapamiilia (50 uM) tai fumitremorgin C (10 uM), ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 90 min ja ravistettiin 30 minuutin välein. Solunpintamarkkeria tehdään noudattaen Hoechst 33342 väriaine värjäys suoritettiin anti-ABCG2-FITC (klooni 5D3, Millipore) co-merkinnät jäillä 20 minuutin ajan. Normaalin hiiren IgG-FITC käytettiin isotyyppikontrolli (Upstate). Propidiumjodidia (PI) (2 ug /ml) porteilla eläviä soluja. Analyysi ja lajittelu tehtiin sijoitukset FACSDIVA virtaussytometrillä (Becton Dickinson).

RNA ja Reaaliaikainen PCR-analyysi

Yhteensä-RNA uutettiin käyttäen High Pure RNA Kit (Roche) ja käänteinen puhtaaksi käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita (Promega) ja Superscript III käänteistranskriptaasia entsyymi (Invitrogen). Reaaliaikainen PCR suoritettiin SYBR Green perusseosta sisältävien Rox ™ ja UDG (Invitrogen) käyttäen ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Sillä alukesekvensseissä katso taulukko S1. Ekspressiotasot normalisoitiin GAPDH siivous geenin.

(A), FACS-lajiteltu soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille tiheyteen 1 x 10

2 solua /kuoppa, ja pesäkkeet laskettiin sen jälkeen, kun 2 viikkoa . Pesäkettä muodostavaa tehokkuutta (TAE) laskettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo (± SE) kolmen erillisen kokeen kunkin tehdään kolmena kappaleena. * P 0,05 (Opiskelijan kaksisuuntainen

t

-testi). (B) Cell cycle profiilit RT112 ABCG2

hi SP ja ABCG2

alhainen NSP solujen kasvaen S-vaiheeseen ABCG2

hi SP jae. (C) Serial valinta, alakulttuuri ja sytometrinen fraktioimalla välillä RT112 SP ja NSP soluja. SP ja NSP solut lajiteltiin RT112 viljeltiin kahden viikon ajan, restained Hoechst 33342 väriaine ja analysoida uudelleen virtaussytometrialla. Tämä prosessi toistettiin 4 kertaa.

(A) 1 x 10

3 ABCG2

hi SP ja ABCG2

alhainen NSP lajiteltu RT112 solut injektoidaan subkutaani- nude-hiiriin ja seurattiin kasvaimen kasvua. (B) immunohistokemiallinen värjäys leikesarjojen, kasvaimista peräisin hiiristä injektoitiin 1 x 10

3 ABCG2

hi SP ja jäljellä solupelletteihin hiiristä injektoitiin 1 x 10

3 ABCG2

alhainen NSP lajitellut RT112 soluja, H 64 solun pesäkkeet koska ne edustavat varhain epäonnistuneen pesäkkeitä. Pesäkkeitä muodostavien tehokkuus (CFE,%) laskettiin [(no. Pesäkkeiden /no. Solut ympätään) x 100].

Cell Cycle

FACS lajitellut solut värjättiin DAPI solun syklin analyysi käyttäen CyStain DNA 2step kit (Partec). Propidiumjodidia (2 ug /ml) porteilla eläviä soluja. Syrjiä ydin- roskia ja kaksoispiikki, solut eroteltiin FSC ja SSC. Virtaussytometria solusyklin ohjelmisto (CellQuest Pro, BD Biosciences) käytettiin laskettaessa DNA-pitoisuutta ja laskea subG1, G1, S-vaiheen ja G2M vaiheen tilastoja.

In vivo

Tumourigenicity

eläinten kokeet suoritettiin ja suorittaa normin sääntelyn ohjeita. Kaksikymmentä kolme naispuolinen kateenkorvattomia CD1 karvattomia hiiriä (Charles River, UK) ruiskutettiin RT112 SP ja NSP lajitellut solut oikeaan kylkeen ihonalaisen kudoksen. Kasvainten kasvua seurattiin kaksiulotteinen mittaus elektronisella liukumitalla kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa

2

×

b /2

, jossa

on lyhin ja

b

suurin. Hiiret Kokeet lopetettiin, kun kasvaimet kasvoivat enintään 750 mm

3. Kasvaimet poistettiin ja puolittaa Immunohistokemiallisten tutkimusten ja reaaliaikainen PCR tutkimuksia.

Immunohistochemitry

Formaliinifiksoidusta parafiiniin upotettu arkistomateriaalia potilailta, joille suoritetaan endoskooppinen resektio virtsarakon kasvain tai radikaali cystectomy avattiin immunohistokemiallista tutkimuksiin asianmukaiset tietoon perustuva suostumus ja eettisen hyväksynnän. Kaikkiaan 148 NMIBC tapausta värjättiin anti-ABCG2 (1:250; klooni BXP-21, Millipore) ja anti-p-ERK (1:100, E-4, Santa Cruz Biotechnology) ennen inkubointia toissijainen biotinyloidulla vuohen anti -hiiri IgG vasta-ainetta (DAKO). Immunoreaktiivisuus visualisoitiin käyttäen Vectastain Avidin Biotin Complex Kit (Vector Laboratories) ja 3’3′-diaminobenzidetetrahydrochloride. Pisteytys alun perin arvioitiin prosenttiyksiköllä ja tahra intensiteettiä. Kuitenkin valtaosa ytimien ilmaistuna yhtenäisen epiteelin värjäytymisen yhdellä intensiteetti, heterogeenisten värjäytymistä esiintyy vain muutamissa tapauksissa. Näissä sydämiä, intensiteetistä, 50% alueen värjäys otettiin pisteet. Immunovärjäyksen tarkasteli ja teki itsenäisesti kolme arvioijat, jotka sokaissut kliinisten tietojen antaa keskimääräiset tulokset värjäytymisintensiteettiä poissa (0), heikko (1), kohtalainen (2) tai vahva (3). Ksenografteja värjättiin myös anti-Nanog (1:5000, Cell Signalling), anti-Notch 1 (1:500, C-20, Santa Cruz Biotechnology) ja anti-Sox2 (1:500, Millipore).

Western-blottaus

Solut hajotettiin SDS-näytepuskurissa (0,125 M Tris, pH 6,8, 2% SDS: ää, 10% glyserolia, 10% β-merkaptoetanolia ja 0,01% bromifenolisinistä) ja analysoitiin SDS-PAGE 12% polyakryyliamidigeeleillä, jonka jälkeen se siirretään nitroselluloosalle Hybond ™ kalvo (Fisher Scientific). Vasta-aineita käytettiin jäljempänä mainittujen pitoisuuksien: anti-ERK 1:500 (K-23, Santa Cruz Biotechnology) ja anti-fosfo-ERK 1:500 (E-4, Santa Cruz Biotechnology). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (DAKO) käytettiin 1:500 ja detektoitiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssidetektiolla kit (Fisher Scientific).

Tilastollinen analyysi

reaaliaikainen PCR tutkimuksia, kaksi -Tailed pariksi

t

-testi määrittämiseen käytettiin tilastollista merkittävyyttä tasolla P 0,05. Immunohistokemiaa eroja taajuutta ja ilmaus ABCG2 tutkittiin käyttäen Mann-Whitney

U

testi arvioida korrelaatiot patologinen syövän luokan ja vaiheen. Elossaololuku analysoitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmä log-rank testaus ja monimuuttuja-analyysi suoritettiin käyttäen Coxin suhteellisten riskien mallia. Pearsonin korrelaatio käytettiin korreloida ABCG2 ja Perk ilme. Kaikki testit tehtiin SPSS versio 11.0 tietokoneohjelmiston (SPSS, Inc.). Kaikki testit olivat kaksipuolisia ja

P

arvo 0,05 otettiin osoittamaan tilastollista merkittävyyttä.

(A) Western blot-analyysi suoritettiin fosfo-ERK1 /2 ja ERK1 /2-vasta-aineita. (B) RT112 solut saatettiin FM yksin tai, kun läsnä on U0126 (10 uM) 30 minuutin ajan ennen värjäämistä Hoechst 33342. vaikutus U0126 on ”häntä” ja ”ylhäältä” loppuun osastoissa ABCG2

HISP

+ tutkittiin. (C) TAE on ABCG2

hi SP-soluja kasvavien pitoisuuksien kanssa UO126 ja eri kokoisia pesäkkeitä (≥1 mm, ≥2 mm ja ≥3 mm halkaisijaltaan).

(A) ABCG2 ilmentyminen normaalissa uroteeliin, huono laatu (LG) ja korkea laatu (HG) NMIBC on tyypillisesti epäspesifinen ja voidaan nähdä ydin- ja sytoplasman. (B) Korrelaatio ABCG2 immunovärjäys intensiteetin arvosanalla ja vaihe NMIBC. (C) Kaplan-Meier käyrät havainnollistaa tulokset ABCG2 intensiteetti (0, 1, 2 ja 3) ja toistuminen ja ilman taudin etenemistä (p 0,001, Log Rank analyysit). (D) Kaplan-Meier käyrät havainnollistaa tulokset Perk intensiteetti (0, 1, 2 ja 3) ilman taudin etenemistä (p 0,001, Log Rank analyysit). (E) Korrelaatio ABCG2 ja Perk lauseke (p = 0,005, Pearsonin r = 0,99).

Tulokset

SP Solut ja ABC Transporter Expression voidaan tunnistettu ihmisen virtsarakon syövän solut

Tutkimme läsnäolo SP kahdessa NMIBC solulinjoissa (RT112 ja RT4) ja kaksi MIBC solulinjoissa (J82 ja 253JB-V). Sen jälkeen värjäys Hoechst 33342, SP tunnistettiin kaikissa neljässä solulinjoissa erillisenä hännän ulottuu kantaväestön jolle on ominaista alhainen fluoresoiva profiilia kahta aallonpituutta analyysissä (kuvio 1). Avainnuksen strategia sitoutunut seurasi kuvaamalla tavalla Golebiewska et. al. [29] (kuvio S1). Erottelun yhden ja elinkelpoisten solujen on ratkaisevan tärkeää riittävän SP luonnehdinta. Mediaani (± SE) osuus kunkin koko solupopulaation osuus SP oli 12,8% (± 1,2%) vuonna RT112, 15,3% (± 1,1%) vuonna RT4, 2,7% (± 0,9%) vuonna J82, ja 1,0 % (± 0,5%) in 253JB-V. Yleiseurooppalainen ABC transporter estäjä reserpiini todentaa SP fenotyyppi estämällä Hoechst ulosvirtausta ja estämällä alhainen punainen /sininen värjäys fenotyyppi, joka luonnehtii SP-soluissa.

arvioitiin ABC transporter ekspressiomalleja virtsarakon syövän solulinjoissa käyttäen reaaliaikaista PCR. Heterogeeninen ilmaisuja useiden monilääkeresistenssitiloja geenit osoitettu MIBC solulinjoissa J82 ja 253JB-V. Kuitenkin NMIBC solulinjoissa RT4 ja RT112 korkeampi ilmauksia ABCG2 havaittiin (kuva S2).

ABCG2 on merkittävästi rikastettu sisällä NMIBC SP solut ja ylläpitää tätä Fenotyyppikuvaus

seuraavaksi keskittyneet NMIBC sairaus ja tutki suhteellinen mRNA ilmaus neljä ABC kuljettajat (ABCA2, ABCG2, MRP1 ja P-glykoproteiini) RT112 ja RT4 SP ja NSP jakeet käyttäen reaaliaikaista PCR (kuvio 2A ja 2B) kantavassa tulokset osoittivat, että sen lisäksi, ABCG2 on tärkein ABC transporter in NMIBC, sen ilme oli suurempi SP-soluissa verrattuna NSP soluihin. Avainroolia ABCG2 tuottamisessa SP fenotyyppi varmistettiin täydellinen menetys SP väestöstä hoidon jälkeen kanssa ABCG2-spesifinen estäjä fumitremorgin C (FTC) verrattuna puute hoidon vaikutusta P-glykoproteiinin estäjä verapamiili (kuvio 2C ja 2D). Sitä vastoin P-glykoproteiini oli kaikkein differentiaalisesti ilmaisi ja toiminnallisesti asiaankuuluvat ABC transporter että MIBC solulinjassa J82 (kuva S3). Lisäksi olemme vahvistaneet, että NMIBC soluissa SP jae liittyi vain korkeimmat ABCG2 (ABCG2

hi) lauseke (kuva S4).

SP Solut rikastamiseksi kantasolujen toiminto

in vitro

vieressä vertasi klonogeeniset potentiaalia RT112 ABCG2

hi SP ja ABCG2

alhainen NSP soluja. ABCG2

hi SP soluilla kolminkertainen nousu keskiarvo (± SE) pesäkkeitä muodostavien rikastamiseen 56,7% (± 1,6%) 18,2% (± 0,2%) ABCG2

pieni NSP soluja (kuvio 3A) . Samanlaisia ​​kasvu ABCG2

hi SP kyky muodostaa klooneja verrattiin ABCG2

alhainen NSP solujen osoitettiin lisäksi NMIBC solulinjan RT4 (kuva S5). Sen jälkeen Avainnuksen elinkelvottomien solujen avulla propidiumjodidin, solusyklin analyysi paljasti, että suurempi osa ABCG2

hi SP soluja S-vaiheessa verrattuna ABCG2

alhainen NSP soluja, keskimääräinen (± SE) arvot 19% (± 5%) verrattuna 5,5% (± 1) ja S-vaiheen ja 68% (± 8%) verrattuna 94% (± 1%) ja G1-vaiheen, vastaavasti (kuvio 3B).

pitävät kyky ABCG2

hi SP solujen kiinnittyä uudelleen alkuperäiseen fenotyyppiset spektrin vanhemman RT112 solulinja, suoritimme sarja kulttuureissa ja valikoimat SP ja NSP jakeet ennen uudelleen värjäyksen Hoechst 33342 ja Analysoimme virtausesteet taussytometria (kuvio 3C). Tulokset osoittivat, että sen jälkeen, kun ensimmäinen kierros valinta, kulttuurin ja virtaussytometria, johdetut viljelmät sekä SP ja NSP solut kukin johtivat jälleen samanlainen jakeluun SP ja NSP soluja. Jos tämä prosessi sitten jatkettiin toistuvien valinta, erillinen kulttuuri ja virtaussytometria lajittelu, osuus solujen SP alakulttuurien jotka sijaitsivat SP murto nousi jokaisen kierroksen, kun oli heikkenee huomattavasti SP jae peräisin olevien solujen NSP alakulttuurit.

arvioitiin kantasolujen merkki ilmaisun RT112 ABCG2

hi SP ja ABCG2

alhainen NSP soluissa reaaliaikainen PCR (Kuva S6A). ABCG2

hi SP solut osoittivat lisääntyneen ilmentymisen Nanog, Notch1 ja Sox2 verrattuna ABCG2

alhainen NSP soluja. Lisäksi ilmaus virtsarakon tyvisolusyöpä markkereita, kuten CK14, CD44, CD49f (α6 integriini) ja CD104 (β4 integriini) liittyy myös rikastumista CSCS, tutkittiin (kuvio S6b). Kaikki tyvisolusyöpä markkereita ilmaistiin ABCG2

hi SP-soluissa mutta samanlaisia ​​ekspressiotasot havaittiin myös ABCG2

alhainen NSP soluja.

SP Solut rikastuttaa Suur Kasvainten käynnistävän Kyky

in vivo

tutkimiseksi vertaileva kykyä ABCG2

hi SP ja ABCG2

alhainen NSP soluja muodostamaan toteuttamiskelpoinen kasvaimia

in vivo,

lajitellaan soluja kustakin alaryhmästä olivat injektoidaan ihonalaisesti CD1 nude-hiiriin ja implantin valvomia kasvua. Rapid kasvaimen kasvua havaittiin 5 5, 5 5, ja 3 3 eläinten istuttamisen jälkeen 10

3, 10

4, ja 10

5 ABCG2

hi SP-soluissa. Kuitenkin ABCG2

lowNSP kasvaimen kasvua oli käytetty loppuun laimentamalla kylvö numeroita 10

3-soluissa, kun taas 5 5 hiiren Siirto tehty 10

3 ABCCG2

hi SP solut kasvoivat kasvaimia (taulukko 1). Tutkitaan mediaani kasvaimen tilavuus ajan paljasti räjähdysmäinen kasvu sisällä ABCG2

hi SP soluympissä ryhmä toisin saaneilla ABCG2

pieni NSP soluja (kuvio 4A).

immunohistokemiallinen analyysi ABCG2 ilmaisun kasvaimissa muodostivat injektion jälkeen 1 x 10

3 ABCG2

hi SP soluja verrattuna jäljellä solupellettien (joka ei liittynyt mitään aktiivisia kasvu) korjattu injektoitujen hiirien ABCG2

alhainen NSP lajiteltu RT112 soluja, osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä ABCG2

HISP verrattuna ABCG2

lowNSP johdettu kasvaimia (kuva 4B).

myöhemmin havaittu olevan ilmentymisen ABCG2 (kuvio 4C) ja tunnustettu alkion /pluripotenttien kantasolujen merkkiaineita Nanog, Notch1 ja Sox2 (Kuva 4D-F), joka on liitetty kasvainten synnyssä [30], käyttäen reaaliaikaista PCR kasvaimissa muodostunut injektion jälkeen ABCG2

hi SP-soluissa verrattuna jäljellä solupelletteihin korjattu hiiristä pistetään ABCG2

alhainen NSP soluja. Nämä

in vivo

tulokset olivat yhdenmukaiset saatu vanhemman

in vitro

viljellyissä soluissa (kuvio S6A) korkea ilmentymä kantasolujen merkkiaineiden ylläpidetään kasvaimia peräisin ABCG2

hi SP solut erottuva heikkoa ilmentymistä jäljellä ABCG2

alhainen NSP. Huomattavaa on, että valinta kasvain aloittamista solujen tämän

in vivo

määrityksessä johti rikastuminen näiden kantasolujen merkkiaineita, yli lähtötasolle

in vitro

, jossa erot olivat 11-kertainen, 80- kertainen, 44-kertainen ja 140-kertainen ABCG2, Nanog, Notch1 ja Sox2 ilme, vastaavasti (p 0,05). Lisäksi lisääntynyt Nanog, Notch1 ja Sox2 ilmentymisen ABCG2

hi SP hiiri ksenografteissa havaittiin myös immunohistokemiallisella analyysillä (Kuva 4G).

esto ERK Signalling vaimentaa SP Cancer Stem Cell Function

Tutkimme mahdollista roolia MAPK sääntelyssä SP fenotyypin NMIBC RT112 soluissa. Expression of ERK, JNK ja p38 sekä PI3K /Akt ja STAT signalointireitteihin määritettiin reaaliaikainen PCR (Kuva S7A). EGFR, ERK1 ja ERK2 ilmaisun sekä ABCG2

hi SP ja ABCG2

alhainen NSP solujen dokumentoitu paljon suurempina pitoisuuksina kuin muut signalointi komponentteja, mikä viittaa siihen, että nämä entsyymit olivat todennäköisesti merkittävä rooli MAPK signalointia RT112 soluja. Entsymaattinen aktivointi myöhemmin tutkittava ja Perk vahvistettiin olevan konstitutiivisesti korkeammalla tasolla ABCG2

hi SP-soluissa (kuvio 5A). Lisäksi kohonnut Perk ilmentyminen oli myös nähtävissä ABCG2

hi SP ksenografteja (kuvio S7b). Edelleen testata merkitystä MAPK /ERK-reitin mahdollisena tavoite RT112 ABCG2

hi SP, toiminnalliset vaikutukset U0126, tietyn inhibiittorin MEK1 ja MEK2, arvioitiin. Solut esikäsitellään U0126 30, 60 tai 120 minuuttia ei ollut havaittavaa fosforyloitu ERK ilmentymistä, mikä vahvistaa estyminen ERK aktivaation jopa EGF: n läsnäollessa stimulaation (kuvio S7C). Lisäksi ei ollut merkittävää muutosta PI-positiivisten solujen kanssa hoitoon U0126 (p = 0,38) seuraavat värjäystä Hoechst 33342 (kuvio S7D). Olemme jakanut ABCG2

HISP osa soluihin yläosassa hännän ja solujen sijaitsee lopussa häntää (kuvio 5B), koska se on raportoitu, että solujen kärki SP hännän, joka on korkein Hoechst 33342 ulosvirtaus kapasiteetti (Hoechst

alhainen), korkeasti rikastetun kantasolu väestöstä [31]. Hoito MEK inhibiittorin oli merkittävä inhiboiva vaikutus solujen sijaitsee takapäässä ABCG2

HISP, vähentää ABCG2

HISP 2,5-kertainen (5,8%: sta 2,3%). Sen sijaan, inhibiittori pienentänyt ABCG2

HISP ei-loppupää 1,5-kertainen (2,8%: sta 1,9%). Nämä tiedot osoittavat, että U0126 on myös kohdistaa sen vaikutus ABCG2

hi Hoechst

alhainen soluja. Hoito U0126 myös aiheutti annoksesta riippuvan inhibition CFE vuonna RT112 ABCG2

hi SP ja ABCG2

pieni NSP soluja (kuvio S7E). Kuten olemme osoittaneet, että ABCG2

hi SP solut voivat aiheuttaa sekä SP ja NSP soluja (kuvio S7F) ja ABCG2

alhainen NSP soluilla on hyvin alhainen Perk, tukahduttaminen ABCG2

alhainen NSP solu CFE näyttää olevan välillisiä kautta vaikutuksia U0126 on ABCG2

hi SP-soluissa. Huomattavaa on, että etuoikeutettu esto suurempia pesäkkeitä, enemmän osoitus CSC kasvua nähtiin läsnäolo pesäkkeiden ≥3mm estyi kokonaan 10

-6 M (kuvio 5C). Nämä tiedot osoittavat, että ABCG2

hi SP osa on ainakin osittain ylläpitämä MAPK /ERK-reitin, joka puolestaan ​​olemme osoittaneet säilyttää ABCG2

alhainen NSP soluja.

Expression of ABCG2 kliinisen virtsarakon syövän korreloi Grade, Stage, uusiutuminen ja Progression Free Survival ja Perk Expression

määrittämiseksi kliinistä merkitystä meidän

in vitro

ja

in vivo

solulinja havaintojen tutkimme ilmaus ABCG2 osissa ihmisen virtsarakon syöpä. Kudososat paneelin 148 NMIBC (taulukko S2 on esitetty kliiniset piirteet) käsiteltiin immunoreaktiivisuuden on ABCG2 (kuvio 6A). ABCG2 positiivisuus havaittiin 143 (97%) tapauksista, ja vertailun osa normaalia uroteeliin sisältyy joka osoittaa suurempaa intensiteettiä pohjapinta ABCG2 ilmaisun, joka on sopusoinnussa kehittyvillä näyttöä pohjapinta kantasolujen [32]. Keskimäärin Immunovärjäyksen intensiteetti pistemäärät ABCG2 osoitettiin liittyvän varhain invasiivisia vaiheessa, pTa (n = 87) verrattuna pT1 (n = 61), ja kasvaimen lisääntyvän, huono laatu (n = 93) verrattuna korkealaatuista (n = 55) (p 0,05) (kuvio 6B). Mediaani seuranta oli 59 kuukautta (inter-neljänneksessä alue = +48,3-96,3kuukautta), ja 31 tapauksessa (21%) osoitti taudin uusiutumisen ja 23 tapausta (16%) osoitti taudin etenemistä. Korrelaatiot aika uusiutumiseen ja etenemistä elinaika (PFS) paljasti pahemmin lisääntymiseen liittyvien ABCG2 ilme kuten havainnollistettu Kaplan-Meier käyrät ja Log-Rank analyysit (p 0,001) (kuvio 6C). Nämä korrelaatiot edelleen tilastollisesti merkitsevä, kun ositettu-luokan, vaihe ja läsnäolo CIS (p 0,001). Käyttämällä Cox Monimuuttuja-analyysissä, johon sisältyi muuttujien luokalla vaiheessa ja intensiteetti ABCG2 Immunovärjäyksen, paljasti, että ABCG2 ilme pysyi itsenäisesti ennusta sairauden etenemiseen (p 0,001; RR = 5,1; 95% CI = 2,6-9,9). Lisäksi kasvava Perk ilmentyminen liittyi myös pahemmin (log-rank p = 0,001) (kuvio 6D). Lisäksi positiivinen korrelaatio osoitettiin välillä ABCG2 ja Perk lauseke (p = 0,005, Pearsonin r = 0,99) (kuvio 6E).

Keskustelu

Viimeaikaiset edistysaskeleet eristämistä ja karakterisointia oletettujen CSCS ovat antaneet jännittäviä oivalluksia perusteella syövän synnyn ja lisännyt optimismia kehittämiseen paremmin kohdennettuja syövän hoidossa. Tutkimukset ovat esittäneet pakottavia tietoja, jotka osoittavat useat ihmisen syövissä noudattavat CSC mallia, jossa pieni solujen ala- populaation sisällä kasvain kykenee kasvain aloittamista ja vastaavat kasvaimen kasvun ja uusiutumisen [8], [9]. Olemassaolo solujen lisääntynyt kasvaimen aloittamista potentiaali on hiljattain kuvattu ihmisen virtsarakon syövän [33] – [35], ja SP on osoitettu virtsarakon syövän potilaiden näytteitä [19]. Tässä tutkimuksessa olemme tunnettu rakon CSCS käyttäen SP ja tutkia niiden modulaatiota MAPK /ERK signalointireitille.

Etsiessään CSC hierarkian ihmisen virtsarakon syövän, meidän

in vitro

tutkimukset osoittivat ABCG2

hi SP soluilla kolminkertainen kasvu pesäkkeitä muodostavien tehokkuutta. Näitä tietoja tukevat myös meidän

in vivo

tutkimuksissa jolloin ABCG2

hi SP soluja kasvain aloittamista verrattuna ABCG2

alhainen NSP soluja, jotka näkyvät menetys kasvaimen kasvua 1 x 10

3 solu laimennus. Nämä havainnot korostavat rikastuminen CSCS sisällä ABCG2

hi SP valintoja. Myöhemmät serial transplantations entisestään tukevat hierarkkista CSC suhde näissä kasvaimissa. Olemme kuitenkin ottaneet analogista lähestymistapaa suorittamalla sarja valintoja ja

in vitro

kulttuureissa ABCG2

hi SP ja ABCG2

alhainen NSP kulttuureissa osoittivat, että käytettäessä ABCG2

hi SP solujen kiinnittyä uudelleen alkuperäinen fenotyyppinen spektrin vanhemman RT112 solulinjassa. Serial valikoimat ABCG2

alhainen NSP solut osoittivat heikkeni mahdollisuudet uudistua molemmissa ryhmissä osoittaa laimentaminen kyky valita tai luoda CSCS.

ABCG2 on osoitettu olevan tärkein molekyyli tekijä SP fenotyypin [26]. Todellakin, löysimme SP NMIBC RT112 ja RT4 soluilla oli korkeampi ABCG2 mRNA ilmaisun, oli täysin kumottu ABCG2-spesifinen estäjä FTC ja sisälsi top 5% of ABCG2

hi ilmentävien solujen. Korrelaatio kliinisiin NMIBC tuloksiin paljasti ABCG2

hi immunovärjäyty- liittyvän huonompi kliinisiä tuloksia syövän uusiutumiseen ja etenemiseen, mikä osoittaa roolin CSCS virtsarakon syövän kehittymisessä. Mielenkiintoista, SP MIBC J82 solulinjan oli korkeampi P-glykoproteiinin ilmentymisen ja estyi verapamiili, P-glykoproteiinin-spesifinen estäjä. P-glykoproteiinin mRNA tasojen on todettu olevan koholla korkealaatuista rakkokasvaimista [36]. Lisäksi, molekyyli patologian NMIBC eroaa MIBC [20].