Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelisolujen Adhesion Molecule (EpCAM) yli-ilmennetään monissa syövissä kuten munasarjasyöpä ja EpCAM yliekspressio korreloi vähentynyt potilaiden selviytymiseen. Se oli Tämän tutkimuksen tarkoituksena saavuttaa kohdennettu metylaatio EpCAM-promoottorin ja hiljaisuus EpCAM geenin ilmentyminen käyttäen muokattu sinkkisormen proteiini, joka sitoo spesifisesti EpCAM-promoottori fuusioituna katalyyttinen domeeni Dnmt3a DNA metyylitransferaasi. Osoitamme, että lyhytaikaista transfektiota tämän konstruktin lisäsi metylaatio EpCAM promoottorin SKOV3- soluissa 4-8% käsittelemättömissä soluissa 30%: iin. Jopa 48% metylaation havaittiin pysyvissä solulinjoissa, jotka ilmentävät kimeeristä metyylitransferaasi. Ohjaus vahvistivat, että metylaatio oli riippuvainen fuusio Sinkki sormen ja metyylitransferaasin verkkotunnuksia ja spesifisiä kohdealueen. Vakaa solulinjat denaturoidulla EpCAM promoottori osoitti 60-80% vähennys EpCAM ilmaisun määritetyn mRNA ja proteiini taso ja osoitti merkittävästi vähentynyt solujen lisääntymistä. Meidän tiedot osoittavat, että kohdennetun metylaatio EpCAM promoottori voi olla lähestymistapaa terapiassa EpCAM yli-ilmentäviä syöpiä.

Citation: Nunnatornin S, Reinhardt R, Ragozin S, Jeltsch A (2014) Kohdennettu metylointi epiteelisolujen Adhesion Molecule (EpCAM) Promoottori hiljentämään ilmaisunsa munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 9 (1): e87703. doi: 10,1371 /journal.pone.0087703

Editor: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, France

vastaanotettu: 29 lokakuu 2013; Hyväksytty lukien: 1. tammikuuta 2014; Julkaistu: 29 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Nunnatornin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on tukenut Sander Foundation ja DAAD (Deutscher Akademischer Austauschdienst). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä esiintyy vatsaonteloon munasarjat on seitsemäs yleisin syöpä naisilla ja toiseksi yleisin kuolinsyy maailmanlaajuisesti joukossa gynekologisten syöpien [1] – [3]. Useimmissa naiset, munasarjasyöpä on vaikea hoitaa viiden vuoden pysyvyys noin 20% vuonna syövistä diagnosoidaan pitkälle [4] – [6]. Platina-pohjainen analogit kuten sisplatiini tai karboplatiini ovat tärkeimmät tavanomaisen kemoterapian hoitava munasarjasyövän alkuvaiheessa [7]. Kuitenkin, niiden käyttö on estää hankittu tai luontainen vastus syöpäsolujen lääkkeen [8]. Huolimatta lisääntynyt ymmärrys etiologiassa munasarjasyöpä ei ole tapahtunut suuria muutoksia potilaiden selviytymiseen viimeisten 30 vuoden aikana, koska alkuvaiheessa munasarjasyöpä on oireeton ja ei ole tehokkaita kasvain erityistä ja herkkä markkereita seurata epiteelin munasarjasyöpä [9]. Näin ollen on olemassa välitön tarve uusille strategioita munasarjasyövän hoitoon.

munasarjasyöpä soluilla yli ilmentymisen epiteelisolujen adheesiomolekyyliin (EpCAM) verrattuna normaaliin munasarjan soluihin [10] – [14 ]. EpCAM (NCBI referenssisekvenssissä NM_002354.2; kutsutaan myös GA733, KSA, 17-1A-antigeenin tai CD326) on 40 kDa epiteelisolujen pintaglykoproteiinille joka välittää Ca

2 + riippumaton homofiilisiä solu-soluadheesion [10], [ ,,,0],15], [16]. Epiteelin terveiden yksilöiden ilmaisee EpCAM, lukuun ottamatta levyepiteelin ja erityisten epiteelisolujen aikuisten hepatosyyttien ja keratinosyyteissä [17]. EpCAM on yli-ilmentynyt eriasteisesti lukuisissa ihmisen karsinoomia [18], [19], syöpää aloittamista solujen ja kantasoluihin ja normaalit kantasolujen [20]. Äskettäin on osoitettu, että EpCAM ylössäätelee

c-myc, sykliini A:

ja

E

ja se vaikuttaa solusyklin ja tehostaa solujen lisääntymistä [21]. Lisäksi se on mukana ydinaseiden Wnt-signalointireitin, joka myös edistää solujen lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen [20].

Vaikka tarkkaa roolia EpCAM on vaikeasti munasarjasyövän etenemisessä EpCAM yli ilmaus merkittävästi korreloi väheni eloonjäämisaste potilaiden vaiheessa III /IV taudin ja yli ilmentyminen EpCAM rintasyövän ja sappirakon syöpä on vahva korrelaatio huonon ennusteen [22] – [24]. Anti-EpCAM-vasta-aineita käytetään tunnistamaan verenkierrossa olevia kasvainsoluja veressä syöpäpotilailla, ja tarjota prognostista tietoa, joka mahdollistaa potilaiden hoidossa [25]. Lisäksi suora yhdistys EpCAM kanssa etenemisen munasarjasyövän ehdotti, että se voi toimia mahdollisina terapeuttisina tavoitteeksi munasarjasyövän hoitoon ja erilaisia ​​lähestymistapoja on perustettu kohdistaa EpCAM [26], [27]. EpCAM vasta kuten MT201 poistaa tehokkaasti syöpäsolujen munasarjasyöpä potilaille [28]. Esimerkiksi, Katumaksomabi on hyväksytty pahanlaatuisten vatsaonteloon sekä sitä on käytetty munasarjan epiteelin ja ei-munasarjasyövät [29] – [31]. Vaikka anti-EpCAM monoklonaalisia vasta suojaavat syöpää [32], [33], vasta riippuva sytotoksisuus vetoaa CH2-domainin vasta-aineen, joka vaihtelee merkittävästi eri erissä aikana vasta-aineiden tuotantoa [34]. Lisäksi anti-EpCAM vasta ole esittänyt mitään kliinisiä suojaa peräsuolen ja eturauhasen syöpä johtuu suuresta koosta vasta jossa vain kuljetuksen ja jakelun [34] – [36]. Siksi paremmin ja yleisemmin strategioita kohdennettua tukahduttamisesta EpCAM tarvitaan.

Vaihtoehtoisena lähestymistapana, kasvaimia synnyttävän toiminnon EpCAM estyi vähentämällä ilmaus sen geenin. Yksi menetelmä tämän saavuttamiseksi on soveltamisen antisense-RNA, joka on johtanut voimakkaaseen laskuun soluproliferaatioon ja aineenvaihduntaa ihmisen karsinoomasolut [21]. Vastaavalla lähestymistapaa, siRNA välittämä vaimentaminen EpCAM ilmaisun vähensi voimakkaasti solujen vaeltamiseen ja invasiivisia potentiaalin rintasyövän solujen [23]. EpCAM ilmentyminen myös vaiennetaan ilmaus Sinkki sormen proteiini, joka sitoutuu EpCAM promoottori [37] ja fuusion, jossa EpCAM kohdistaminen Sinkki finger domain joiden repressorin verkkotunnuksen [38]. Kuitenkin kaikki nämä lähestymistavat eivät johda pysyvään alas asetus, joka stimuloi yritetty yhdistää geenin repression kanssa epigeneettiset merkkejä, kuten DNA: n metylaatio. DNA: n metylaatio on tärkeä rooli epigeneettisellä geenin ilmentymisen säätelyyn [39] – [42]. Nisäkkäillä, DNA: n metylaatio tapahtuu C5 asemaan sytosiini pääasiassa yhteydessä CpG-dinukleotidejä. CpG rikkaita alueita kutsutaan CpG-saarekkeiden ja esiintyvät usein geenin promoottori alueilla [43]. EpCAM promoottori sisältää CpG-saarekkeen, metyloinnin joka käänteisesti korreloi EpCAM ilme, kasvaimen invaasio ja etenemistä eri syöpätyyppejä [13], [44]. Tämän tukemiseksi konseptin, voitiin osoittaa, että DNA: n metylaatio esiteltiin promoottori suuntaamaton tavalla johti alas sääntelyä EpCAM geenin [45].

On selvää, vähentää sivuvaikutuksia epigeneettisestä geenien hoito, joka on kohdistettu annostelu hiljentäminen epigenetic merkkien kuten DNA: n metylaatio tarvitaan. Tämä edellyttää kytkimen ja katalyyttinen ryhmä, joka toimittaa hiljentäminen signaalin suunnattu osa, joka takaa spesifinen sitoutuminen katalyyttisen kokonaisuuden määritelty genomisen kohde [46] – [48] (Fig. 1). Eri molekyylikokonaisuuksiin ovat käytössä järjestyksessä kohdistamisesta toiminto, mukaan lukien fuusio DNA metyylitransferaasi osan triplex muodostava oligonukleotidi [49], fuusion suunniteltu sinkkisormipolypeptidiin proteiineja (katso alla), TAL effektorit [50], [51] ja tulevaisuudessa mahdollisesti suunnitellut CRISPR /CAS järjestelmien [52]. Koska sinkki sormet olivat ensimmäiset proteiinia moduuleja jonka suunnittelussa sekvenssin tietyn DNA: ta sitovaa tuli mahdolliseksi [53] – [58], alustava kohdistettuja metylointi tutkimukset tukeutunut keinotekoinen sinkki sormella proteiineja kohdistaminen laite [59]. Tämän lähestymistavan, tukahduttaminen virusgeenien [60], alas-säätely maspiini ja Sox2 [61] ja VEGFA geenisuppression [62] on saavutettu ihmisen solulinjoissa. Tässä työssä olemme sulatettu sinkkisormipolypeptidiin proteiini, joka kohdistaa EpCAM promoottori [37] DNA metyylitransferaasi 3a (Dnmt3a) katalyyttinen domeeni, jotta metyloimaan EpCAM promoottori, joka myöhemmin tulisi johtaa EpCAM hiljentäminen. Käytimme SKOV3- soluja, jotka ovat peräisin ihmisen naisen adenokarsinoomasoluja ja niitä on käytetty mallina munasarjasyöpä [45]. Osoitamme, että kohdennettu metylaatio promoottorin johtaa vähentämiseen EpCAM geenien ilmentymisen, mikä tukee käsitystä siitä, että kohdennettu DNA: n metylaatio on yleinen lähestymistapa geenien. Lisäksi osoitamme, että hiljentäminen on EpCAM johtaa vähenemiseen leviämisen SKOV3- soluja.

Sininen palkki edustaa ZF sitoutumiskohtaan, täyttämättömiä tikkareita edustavat metyloimattomia CpG: t ja täynnä tikkareita edustavat metyloitu CpG: t.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, transfektio ja rikastaminen transfektion

SKOV3 ihmisen munasarjasyövän solut hankittiin ATCC (American type Culture collection). Soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen alustassa (PAA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja 2 mM L-glutamiinia (PAA). Ohimeneviä transfektiota 3,5 x 10

5-soluja ympättiin T25-pulloihin ja solut transfektoitiin yhden päivän jälkeen 12 ui FuGENE HD transfektioreagenssia (Promega) ja 6 ug kolme plasmidi-DNA, joka ilmaista eri Zinc finger fuusiorakenteet käytetty tässä työssä LNGFR merkki, ja GFP suhteessa 10:2.5:1 kuten aikaisemmin on kuvattu [62]. Transfektoidut solut rikastetaan käyttämällä MACSelect ™ LNGFR-järjestelmä (Miltenyi Biotec) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, kun soluja kotransfektoitiin kanssa LNGFR molekyyli, se ilmentyy solun pinnalla. Neljän päivän jälkeen soluja inkuboitiin magneettisten helmien kanssa, jotka on konjugoitu anti-LNGFR-vasta-ainetta 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Transfektoidut solut johdettiin MACS erotuskolonniin sijoitettu MACS erotin ja pestiin kahdesti PBE puskurilla (fosfaattipuskuri suolaliuos, jossa oli 0,5% naudan seerumin albumiinia ja 5 mM EDTA) pestä pois transfektoimattomat solut. Pesun jälkeen vain transfektoidut solut sitovat magneettiset helmet pysyvät pylvääseen ja rikastunut solut eluoitiin PBE ja käytetään edelleen metylointianalyysi.

stabiili solulinja sukupolvi, 2 x 10

5 solua ympättiin per kuoppa 6-kuoppaisille levyille, ja soluja transfektoitiin 6 ui FuGENE HD transfektioreagenssia ja 2 ug EpCAM ZF-Dnmt3aCD plasmidi-DNA. 48 tunnin kuluttua soluja kasvatettiin elatusaineessa, joka sisälsi 800 ng /ml G418: aa kuusi viikkoa. Monoklonaaliset pesäkkeitä ja laajennettiin edelleen G418: n läsnäollessa, joka sisältää keskipitkän ja kaksi stabiileja solulinjoja käytettiin lisäkokeisiin.

metylointi analyysi EpCAM-promoottorin ja ei-kohde- geenin metylaatio

Genominen DNA eristettiin käyttämällä QIAamp® DNA mini kit (QIAGEN), ja bisulfiittikonversion suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [63]. Lyhyesti 400 ng genomista DNA: ta pilkottiin SphI restriktioentsyymillä yön yli 37 ° C: ssa. Bisulfiittikonversion suoritettiin, kun läsnä on NaOH: n ja natriumbisulfiitin käyttäen seuraavia olosuhteita: 15 min inkubaation 99 ° C: ssa, 30 min 50 ° C: ssa, 5 min 99 ° C: ssa, 1,5 tuntia 50 ° C: ssa, 5 min 99 ° C: ssa ja 1,5 tuntia 50 ° C: ssa. Inkuboinnin aikana bisulfiitin kanssa, metyloitumattoman sytosiinin muunnetaan urasiili mutta metyloidut sytosiinit säilyvät ennallaan. Tämän jälkeen DNA konsentroitiin ja puhdistettiin käyttäen Amicon Ultra sentrifugisuodattimet (Millipore) ja PCR-monistettiin käyttäen bisulfiitin alukkeita. Urasiilia vahvistuu kuin Tymiiniä tässä reaktiossa. PCR-tuote alakloonattiin käyttäen StrataClone PCR -kloonaustarvikesarjaa ja yksittäisiä klooneja sekvensoitiin. Analysoida sen metylaatiostatuksen, 220 emäsparia EpCAM promoottorin sisältävä 16 CpG: t monistettiin käyttämällä spesifisiä alukkeita (For: 5′-CTT TTT AAG GTT TTA GAG TAG-3 ’ja Rev: 5’-AAA AAA TAA ATA AAC TCC CCT CCC -3 ’). Ei-kohdegeenin metylaatio, neljä amplikoneihin geeneistä (KIAA0179, DSCR3, Sumo3 ja WRB, vastaavasti) analysoitiin; sekvenssit kaikkien amplikonien ja lista käytettyjen alukkeiden annetaan Täydentäviä tietoja S1. Tiedot analysoitiin käyttämällä Bisma ohjelmistoa [64].

RT qPCR analyysi

Yhteensä RNA eristettiin vakaa solulinjojen ja ohjata SKOV3- soluihin käyttäen Purelink ™ RNA Mini Kit (Ambion). Kaikkiaan 1,0 ug RNA muunnettiin komplementaarisen DNA käyttäen M-MuLV käänteistranskriptaasi (NEB) oligo dT-alukkeita. Q-RT-PCR suoritettiin käyttäen CFXConnect ™ Real-Time-järjestelmä (Bio-Rad). EpCAM-transkriptin ilmentyminen kvantitoitiin käyttäen SsoFast ™ EvaGreen® SuperMix (Bio-Rad) ja EpCAM spesifisiä alukkeita (for: 5′-GAACAATGATGGGCTTTATG-3 ’, rev: 5′-TGAGAATTCAGGTGCTTTTT-3′) käyttäen beeta-aktiini sisäisenä kontrollina (for : 5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3 ’, rev: 5′-ACCGGAGTCCATCACGATG-3’). Suhteellinen määrä transkriptin mitattiin kynnyksen syklin monistusta (C

T), joka on kääntäen korreloi määrän RNA: ta läsnäololla. Taitteen muutos EpCAM RNA laskettiin ΔΔCt menetelmällä. Ct-arvot määritetään keskiarvona kolmen rinnakkaisen ja koe suoritettiin kaksi teknistä toistuu.

Western blotting

Solulysaatit valmistettiin stabiileja solulinjoja ja ohjata SKOV3-soluja käyttäen RIPA-puskuria (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP40: tä ja 1 mM PMSF: ää), ja kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin kvantitatiivisesti BCA ™ Protein assay kit (Thermo Scientific). Neljä ug kokonaisproteiinia erotettiin 10% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Membraani blokattiin yön yli inkuboimalla 4% naudan seerumin albumiinia fosfaattipuskurisuolaliuoksessa, ja tutkittiin kanin anti-ihmisen EpCAM-IgG 1:4000 laimennus (Abcam Ab71916), minkä jälkeen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua vuohen anti-kani-lgG: tä 1: 4000 laimennus (GE Healthcare). Täplät kehitettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssi Western blotting ratkaisu (Thermo Scientific), ja kuvien vangittiin röntgenfilmit, skannattu, ja kvantitoitiin käyttäen Image J ohjelmisto.

Soluproliferaatiomääritys (CCK8 määritys) B

soluproliferaatiomääritykset suoritettiin käyttäen Cell laskenta kit-8 (CCK8) määritys (Dojindo) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, SKOV3- soluja tai stabiileja solulinjoja CD1 ja CD2 ympättiin tiheydellä 1,5 x 10

4 solut 200 pl: ssa väliainetta 96-kuoppaiselle soluviljelylevylle ja kasvatettiin kolmen päivän ajan DMEM: ssä, jossa oli 10% FCS: ää, 37 ° C 5% CO

2. Kolmen päivän jälkeen solut käsiteltiin 10 ui CCK8 reagenssia per kuoppa ja inkuboitiin 4 h CO

2-inkubaattorissa. Sitten 100 ui supernatanttia kustakin kuopasta siirrettiin uudelle 96-kuoppaisille levyille ja absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä käyttäen spektrofotometriä. CCK8 reagenssi sisältää WST-8 [2- (2-metoksi-4-nitrofenyyli) -3- (4-nitrofenyyli) -5- (2,4-disulfofenyyli) -2H-tetratsolium, mononatriumsuola] liuotetaan veteen ja solujen viljelyväliaine, joka voi syöttää soluun, jossa se vähennetään dehydrogenaaseja, jolloin saatiin oranssinvärinen formatsaanituotetta. Formatsaanituotteen määrän muodostunut suoraan verrannollinen elävien solujen lukumäärään.

Cell laskenta määritys

SKOV3- soluja tai stabiileja solulinjoja CD1 ja CD2 ympättiin kuudella hyvin soluviljelylevy on tiheys on 2 × 10

5cells kuoppaa kohti ja niitä viljeltiin neljä päivää DMEM 10% FCS 37 ° C: ssa 5% CO

2. Neljän päivän jälkeen solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuria suolaliuoksella, trypsinoitiin ja kerättiin erikseen ja yksittäisten solujen suspensio valmistettiin. Solut laimennettiin Trypan blue stain 0,4% (Gibco) kanssa suhteessa 01:01, ja kokonaismäärä elävien solujen kussakin kaivossa laskettiin käyttämällä Neubauer laskenta kammio tai hemosytometriä. Elävät solut voidaan erottaa kuolleita soluja, koska kuolleiden solujen tarttua väriainetta ja tahra tummansininen taas kalvot elävien solujen ovat ehjät ja estää otto väriaineen.

Tulokset

Kohdennetut DNA metylaatio EpCAM promoottorin munasarjasyövän SKOV3- solujen

Juuri tämän tutkimuksen tavoitteena saavuttaa kohdennettuja metylaatio EpCAM promoottorin ja hiljaisuus EpCAM geeniekspressiota. Olemme käyttäneet muokatun sinkkisormen proteiini, joka sitoo spesifisesti EpCAM-promoottori [37], ja fuusioitunut sen kanssa katalyyttinen domeeni Dnmt3a DNA metyylitransferaasin (Dnmt3aCD), joka on aiemmin käytetty menestyksekkäästi käyttöön kohdennettu DNA: n metylaatio [60], [62 ]. Kohde-erityisiä metylaation, SKOV3- syöpäsolut, joilla on metyloitumattomat EpCAM-promoottori ja aktiiviset EpCAM ilmaisun [11], transfektoitiin lyhytaikaisesti kimeerisen Zinc finger – Dnmt3a katalyyttinen domeeni (ZF-Dnmt3aCD) rakentaa. Neljän päivän kuluttua transfektoidut solut rikastettiin MACS valinta ja metylaatiostatuksen ja EpCAM-promoottorin (Fig. 2) analysoitiin bisulfiittikonversion ja sekvensointi yksittäisiä klooneja. Kahdessa riippumattomassa kokeessa, transfektoimattomista SKOV3- solut osoittivat pohjapinta tasolla 4-8% DNA: n metylaation. Kuitenkin metylointi nousi 29% (± 4%) in ZF-Dnmt3aCD transfektoituja soluja kahdessa riippumattomassa kokeessa (Fig. 3). Tärkeää on, meidän tiedot osoittavat, että metylaatio tasot 80% voitaisiin saavuttaa tiettyjä CpG sivustoja kohdealueen, kuten sivustoja 14-16. EpCAM-promoottori osoitti perustason metylaation on SKOV3- soluissa, jotka transfektoitiin kontrollivektoreihin joko vektorisäätö yksin, sinkkisormen ilman Dnmt3aCD tai Dnmt3aCD ilman sinkkisormi, vastaavasti (Fig. 3). Havainto, että ilmaus kohdistamattomia Dnmt3a katalyyttinen domeeni ei johtanut suureen kasvuun DNA: n metylaatio on EpCAM promoottori on samaa mieltä aiempien havaintojen toisessa kohdelokus [62].

Geeni näkyy sinisenä , sen CpG saari vihreä ja amplikonin mustana. Amplikonin sekvenssi on annettu alla, ZF sitoutumiskohta sekvenssi on varjostettu punaisena. Tämä kuva luotiin käyttäen Kalifornian yliopisto, Santa Cruz genomin selaimen (https://genome.ucsc.edu/) [66].

Seuraavia lyhenteitä käytettiin: SKOV3 solut, käsittelemättömät solut; ZF, SKOV3- transfektoidut solut Zinc finger konstruktilla, ZF-Dnmt3aCD, transfektoitujen solujen Zinc finger Dnmt3a katalyyttinen domeeni konstrukti; VEC cntrl, solut transfektoitu tyhjällä vektorilla; Dnmt3aCD, solut, jotka on transfektoitu Dnmt3aCD rakentaa ilman Zinc finger; CD1, vakaa joka ilmentää ZF-Dnmt3aCD 1; CD2, stabiili solulinja, joka ekspressoi ZF-Dnmt3aCD 2. vaakariviä osoittavat CpG: t on amplikoni analysoidaan ja pystysuoran rivit edustavat yksittäisiä klooneja, jotka sekvensoitiin. Sininen ja punainen väri edustaa metyloimattoman CpG ja metyloitu CpG vastaavasti valkoisen värillinen sivustoja, metylaatiotila on tuntematon teknisistä syistä.

Koska teimme Metylointilaitteistoon kokeita väliaikaisesti transfektoiduissa soluissa jälkeen MACS valinta, taustalla transfektoimattomilla solujen oli vielä läsnä, jonka arvioimme olevan välillä 20% perustuen mikroskooppinen tarkkailu. Homogeenisen solu- näyte, jossa kaikki solut käsiteltiin kimeerisen metyylitransferaasi, me syntyy kaksi riippumatonta stabiileja solulinjoja (joita kutsutaan CD1 ja CD2), jotka ilmentävät Zinc finger Dnmt3aCD kimeerisen metyylitransferaasi. Genominen DNA eristettiin molemmissa solulinjoissa ja metylaation tilan EpCAM-promoottorin analysoitiin kuten edellä on kuvattu. Tuloksemme osoittavat, että metylaatio tasot EpCAM promoottorin nostettiin 46% vakaa solulinjassa CD1 ja 48% vuonna CD2 (Fig. 3).

Off-kohdegeenin metylaatio

analysoida metylaatio muissa loci liitettävästä meidän kohdistettuja metylaatio, tutkimme metylaatiostatuksen neljä ylimääräistä kuin kohdegeenien (KIAA0179, DSCR3, Sumo3 ja WRB) kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. SKOV3- solut osoittivat metyloinnin 1%, 1%, 17%, ja 2%: lla, ja neljän amplikonien (Fig. 4 ja [62]). SKOV3- solut transfektoitiin väliaikaisesti ZF-Dnmt3aCD osoitti metylaatiotasoilla 1%, 1%, 22%, ja 1%, jotka ovat lähes samoja tuloksia, jotka saatiin käsittelemätöntä SKOV3- solut (Fig. 4). Stabiili solu- CD1 ja CD2 osoitti myös metylaation hyvin samanlainen kuin kontrolli solut (Fig. 4). Vaikka nämä tulokset eivät sulje pois ylimääräisiä metylointi tapahtuvat joitakin yksittäisiä loci, ne osoittavat, että metylaatio EpCAM promoottori ei liity massiivinen, epäspesifinen ja genomin laajuinen DNA: n metylaatio, mikä osoittaa, että kohdentaminen on ainakin osittain onnistunut.

metylointi neljässä ei-kohdegeenien analysoitiin (KIAA0179, DSCR3, Sumo3 ja WRB). Tietojen esitystapa on kuten kuvassa. 3. sekvenssit tutkituilla alueilla täällä annetaan lisätiedot S1.

EpCAM ilmentyminen on tukahdutettu kohdennetulla DNA: n metylaatio on EpCAM geenin promoottori

Voit selvittää promoottori metylointi johti transkription hiljentäminen EpCAM-geenin ilmentymistä, kokonais-RNA eristettiin SKOV3- soluihin ja stabiilit solulinjat CD1 ja CD2, ja EpCAM-mRNA-tasot määritettiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä. Kuten on esitetty kuviossa. 5A ja B, havaitsimme väheneminen EpCAM ilmentymisen 80% vakaassa solulinjassa CD1 ja 60% vakaan solulinjassa CD2. EpCAM tukahduttaminen kohdennetulla DNA metylaatio vahvistettiin proteiinin tasolla western blottauksella, jossa havaitsimme vastaavan alennuksen EpCAM ilmaisun tallissa solulinjoissa verrattuna SKOV3- soluihin (kuvio. 5C ja D).

) Esimerkki RT qPCR analyysi EpCAM (vasemmalla) ja beeta aktiini (oikealla) mRNA rahamäärien SKOV3- soluissa ja kaksi riippumatonta solulinjoissa, jotka ilmentävät stabiilisti ZF-Dnmt3a rakentaa (CD1 ja CD2). B) kvantifiointi RT qPCR analyysin EpCAM ilmaisun esitetyn paneelissa A. Suoritimme kaksi riippumatonta RNA valmisteita kukin analysoitu kolme teknistä toistoa. Kuvassa keskiarvo molemmat tulokset, virhe palkit osoittavat keskivirheen. C) Esimerkki Western blot-analyysi EpCAM ilmentymisen SKOV3- soluihin ja CD1 ja CD2 vakaa solulinjojen (ylempi paneeli). Beta aktiini käytettiin latauskontrollina (alempi kuva). EpCAM ja beeta aktiini bändejä on merkitty nuolilla. D) kvantifiointi Western Blot analyysi EpCAM ilmaisun kuten paneelissa C esitetyn Kuvassa on keskimäärin kaksi erillistä koetta, virhe palkit osoittavat keskihajonnan datan.

Vähentynyt EpCAM ilme assosioituu vähenemiseen soluproliferaation

sen tutkimiseksi, alennetun EpCAM lauseke vaikutti leviämisen SKOV3- soluja, yhtä monta käsittelemättömien solujen sekä CD1 ja CD2 solut ympättiin ja soluproleferaatiomäärityksessä suoritettiin jälkeen kolme päivää. Tämän jälkeen solut käsiteltiin CCK8 reagenssin liuotetaan soluviljelyväliaineessa ja inkuboitiin 4 tunnin ajan inkubaattorissa. Tänä aikana reagenssi voi diffundoitua soluihin, missä se vähennetään solujen dehydrogenaasien tuottaa oranssin värinen formatsaaniksi tuote, joka voidaan havaita absorptiolla 450 nm: ssä. Koska määrä formatsaanin on suoraan verrannollinen elävien solujen lukumäärään, tässä määrityksessä mahdollistaa helpon arvio elävien solujen lukumäärä näytteessä. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, oli 60% vähennys elävien solujen CD1 ja 40% CD2 verrattuna SKOV3 soluun valvontaa, mikä on erittäin hyvä korrelaatio vähentäminen EpCAM ilmaisun molemmissa solulinjoissa. Näiden tulosten vahvistamiseksi, myös suorittaa elävien solujen laskenta käyttäen trypaanisini, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Tämän sama määrä soluja ympättiin ja inkuboitiin neljän päivän ajan. Sen jälkeen, yhteensä elävien solujen lukumäärä laskettiin. Kuten on esitetty kuvion. 6B, tulokset vahvistivat soluproleferaatiomäärityksessä, koska siellä oli noin 50%: n vähennys määrän elävien solujen CD1 ja noin 40% CD2. Olemme päätellä, että säätelyä alaspäin EpCAM johtaa merkittävään vähentämiseen proliferatiivisen potentiaalin SKOV3 solujen in vitro.

A) tulokset CCK8 soluproliferaatiomäärityksissä suoritettu CD1 ja CD2 stabiileja solulinjoja ja SKOV3- solujen viite. Tulokset piirretään ovat neljästä itsenäisestä kokeesta ja virhepalkkien osoittavat keskivirheen keskiarvon. B) elävien solujen luku laskenta suoritetaan trypaanisini värjäystä. Käyrä edustaa tietoja kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta ja virhepalkkien osoittavat keskivirheen keskiarvon.

Keskustelu

Kohdennetut DNA: n metylaatio fuusioimalla DNA metyylitransferaasi verkkotunnuksen (tässä katalyyttinen domeeni Dnmt3a) ja kohdistaminen laitteen (tässä suunnitellussa Sinkki sormi) on houkutteleva lähestymistapa geenien [46] – [48]. On joitakin aiempia esimerkkejä onnistuneesta soveltamisesta tämän menetelmän saavuttaa geenien ihmisen soluissa [60] – [62]. Tässä osoitamme, kohdennettuja metylaatio ja geenien ja EpCAM-geenin, joka on lupaava kohde kasvaimen hoidossa. Osoitamme puuttuminen off-tavoite vaikutuksia lainkaan loci jotka tarkastettiin tämän, mikä osoittaa, että kohdistaminen oli (ainakin osittain) onnistunut. Tuloksemme tukevat käsitystä, että kohdennettu metylaatio ja geenien on universaali lähestymistapa laaja sovellettavuus. Lisäksi osoitamme, että hiljentämisen EpCAM ilmentymisen johtaa vähenemiseen proliferatiivisen potentiaalin SKOV3- soluja.

Tuoreessa, der Gun et ai. (2013) ilmoitti noin kaksinkertaiseksi hiljentäminen EpCAM jälkeen ilmaus sinkkisormipolypeptidiin fuusioitunut repressori Kruppel-associated box (SKD) domain, joka toimitettiin retrovirusvektorilla [38]. Kiinnostavaa kyllä, tämä vähensi leviämisen rintasyöpäsoluissa, mutta ei SKOV3- soluissa. Samoin RNAi pohjainen vaiennettu EpCAM vuonna SKOV3- soluissa ei vähentänyt soluproliferaatiota tässä työssä. Nämä tulokset SKOV3- solut eivät ole samaa mieltä meidän tiedot, mutta merkittäviä eroja setup molempien tutkimusten. Ensinnäkin, van der Gun et al. (2013) käyttivät sorron verkkotunnuksen, kun käytimme DNA: n metylaatio välittämä epigenetic hiljentäminen mekanismi. Itse asiassa, EpCAM hiljentäminen oli hieman vahvempi meidän setup, 60-80% meidän solulinjoissa vs. 50% havaita van der Gun ym. (2013), jotka voivat vaikuttaa tuloksiin. Toiseksi, van der Gun ym. (2013) antoivat hiljentäminen rakentaa retrovirusvektoreilla ja käyttää tyhjiä vektoreita kontrollina. Solujen lisäkasvua tutkittiin 4-6 päivää transduktion jälkeen. Tutkimuksemme palveluksessa solulinjat, jotka ilmentävät hiljentäminen konstruktioita vakaasti jälkeen alustavan ohimenevän transfektion. Molemmat menetelmät on omat etunsa ja haittansa. Retroviraalisessa toimitus, solu vaikutukset mitataan muutaman päivän kuluttua retrovirusinfektiota, jotka voivat vaikuttaa voimakkaasti soluvasteita. Lisäksi stabiili solulinja, EpCAM hiljennettiin useita viikkoja, ennen kuin solujen lisääntymistä analyysi on suoritettu, joka antoi solun pitkän aikaa vastata vähentämiseen EpCAM ilmaisun. Sen sijaan, leviämisen testit van der Gun et al. (2013) suoritettiin 4-6 päivää transduktion jälkeen ja RNAi kokeita luetun tehtiin 1-3 päivää kuluttua siRNA transfektion, joka voi olla toinen syy ero tuloksia. Se on yksi haitta tallin solu- linjassa, että yksittäiset solulinjat tutkitaan mahdollisesti kertyneen erityisiä muutoksia. Kuitenkin se, että molemmat stabiileja linjoja tutkittu tässä osoitti samanlaisia ​​vaikutuksia, osittain käsittelee tätä huolta. Olemme päätellä, että jatkotutkimukset ovat tarpeen tämän ongelman ratkaisemiseksi, mutta vähentäminen proliferaatiopotentiaali kasvainsolun linja havaittu tässä jälkeen epigeneettiset hiljentäminen EpCAM promoottori on lupaava tulos potentiaalisia terapeuttisia sovelluksia EpCAM hiljentäminen hoidossa syöpien kanssa EpCAM yliekspressio.

tulevaisuuden sovelluksia kohdennettujen geenien, tehokkuutta toimituksen kohdennettujen metyylitransferaasi konstruktio on parannettava; useita viraalisia strategiat ovat käytettävissä tätä varten ja parhaillaan kehitetään meidän lab ja muissa paikoissa [61], [65]. Kun kehittäminen useita aktiivisia ja toiminnallisia kimeeristen metyylitransferaasit jotka toimivat soluviljelymalleissa, se tulee olemaan yksi ensi kriittinen virstanpylväs tulevaa työtä yhdistää nämä entsyymit tehokkaaksi jakelujärjestelmä, jonka avulla infektio kasvainsolujen eläimen (tai ihmisen) runko, ja johtaa tuumorin kehityksen eläinmalleissa. Jos tämä voidaan saavuttaa, se on myös tarpeen määrittää mahdolliset off-tavoite metylaatio on genomin laajuisesti ja kvantitatiivisesti tavalla eri kudoksissa. Tätä varten useat genomin laaja DNA metylointianalyysi menetelmät ovat käytettävissä. Riippuen määrästä off-tavoite metylaation ja kärsivän lokusten, riskianalyysin avulla voidaan arvioida, jos nämä reagenssit voivat olla turvallisia kliinisissä tutkimuksissa. Tarvittaessa spesifisyys kohdentaminen voitaisiin parantaa käyttämällä Sinkki sormia moduuleja, jotka tunnistavat pidempiä sekvenssejä kuin tässä käytetty. Lopulta muut kohdistustapoja, kuten TAL efektori verkkotunnuksia tai CRISPR johdettuja menetelmiä voidaan käyttää, vaikka niiden spesifisyys on kysymys samoin.

tukeminen Information

Information S1.

Primer ja amplikonin sekvenssit.

doi: 10,1371 /journal.pone.0087703.s001

(PDF) B

Kiitokset

Kiitämme panos ja apua tri . Kirsten Liebert ja tohtori Yingying Zhang varhaisessa vaiheessa projektin.