Krooninen sairaus

tiivistelmä

tuumorista peräisin monoklonaalinen IgM-vasta-PAT-SM6 spesifisesti tappaa pahanlaatuiset solut apoptoottisen mekanismin liittyy liiallisen sisäänoton plasman lipidejä. Mekanismin oletetaan tapahtua usean pisteen kiinnitys PAT-SM6 levitettyyn proteiinivaste säädin GRP78, joka sijaitsee tuumorisolujen pinnalla, joka on kytketty samanaikaisesti sitovat plasman alhaisen tiheyden lipoproteiinin (LDL). Olemme valmistaa ja ominaista LDL- ja hapettuneen LDL käyttämällä sedimentoitumisnopeuden ja saxs (SAXS) analyysi. Entsyymi-immunologinen (ELISA) merkittyjä tekniikoita dissosiaatio- vakioiden noin 20 nM sitoutumisen LDL tai hapettuneen LDL: n PAT-SM6. ELISA kokeet osoittivat risti kilpailua LDL estämällä PAT-SM6 sitoutumisen immobilisoituun GRP78, kun taas, päinvastaisessa kokeessa, GRP78 esti PAT-SM6 sitoutumisesta immobilisoituun LDL. Toisin kuin tulokset ELISA-kokeita, laskeutumisnopeus kokeet osoittivat suhteellisen heikko vuorovaikutukset LDL ja PAT-SM6, mikä viittaa siihen, immunoabsorbance on mikrotiitterilevy ohjaa aviditeettijärjestyksellä-pohjainen sitovan menetelmän avulla. Tärkeys Sidosvoiman ja Multipoint kiinnitys antigeenejä PAT-SM6 tutkittiin tarkemmin käyttämällä antigeeni-päällystettyjä polystyreenipallosten. Imeytymistä GRP78 tai LDL polystyreenin mikropallojen johti kasvuun inhibitio PAT-SM6 sitoutumisen mikrotiitterilevyt päällystettiin GRP78 tai LDL, vastaavasti. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että biologinen vaikutus PAT-SM6 tuumorisolun apoptoosia riippuu moniarvoinen luonteesta PAT-SM6 ja kyky olla vuorovaikutuksessa samanaikaisesti LDL ja useita GRP78 molekyylit ryhmitellään annetun kasvainsolun pinnalla.

Citation: Rosenes Z, Mok YF, Yang S, Griffin MAT Mulhern TD, Hatters DM, et al. (2013) samanaikainen Sidonta Anti-Cancer-IgM-vasta-PAT-SM6 Low lipoproteiinien ja GRP78. PLoS ONE 8 (4): e61239. doi: 10,1371 /journal.pone.0061239

Editor: Gunnar F. Kaufmann, The Scripps Research Institute ja Sorrento Therapeutics, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 tammikuu 2013; Hyväksytty: 06 maaliskuu 2013; Julkaistu: 19 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Rosenes et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee ARC sidoksen avustus (LP100100392) ja Patrys Ltd, jonka tällä hetkellä kliinisten kokeiden PAT-SM6 mahdollisena anti-syövän hoitoon. FH on toimitusjohtaja Patrys, GmbH. PAT-SM6 vasta-aine omistaa ne Patrys Limited ja yhtiö suostuu tekemään tehdä vapaasti saataville kaikki materiaalit ja kuvatut tiedot niiden julkaisemista, jotka voidaan kohtuudella pyydetään varten akateemista, ei-kaupallinen tutkimus. Koska oma luonne vasta-osapuolten tulee solmia materiaalin siirtosopimuksen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tätä työtä tukee ARC sidoksen avustus (LP100100392) ja Patrys Oy, yritys tällä hetkellä kliinisten kokeiden PAT-SM6 mahdollisena anti-syövän hoitoon. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. FH on toimitusjohtaja Patrys, GmbH. PAT-SM6 vasta-aine omistaa ne Patrys Limited ja yhtiö suostuu tekemään tehdä vapaasti saataville kaikki materiaalit ja kuvatut tiedot niiden julkaisemista, jotka voidaan kohtuudella pyydetään varten akateemista, ei-kaupallinen tutkimus. Koska oma luonne vasta-osapuolten tulee solmia materiaalin siirtosopimuksen.

Johdanto

Ihmisen IgM monoklonaalinen vasta-aine, PAT-SM6, johdettu ihmisen kasvainkudoksessa [1] , on potentiaalinen syövän ainetta, joka kykenee indusoimaan tuumorisolujen apoptoosin prekliinisissä malleissa ihmisen syövän [2]. Vaikka tarkkaa mekanismia PAT-SM6 solukuolema ei tunneta, prosessia on mukana solunsisäisten lipidien kertyminen johtaa olettamukseen, että PAT-SM6 helpottaa sisäänottoa plasman lipideihin. Yhdenmukainen tämä ehdotus on havainto, että molemmat alhaisen tiheyden lipoproteiinien (LDL) ja hapettuneen LDL vuorovaikutuksessa PAT-SM6 ja parantaa PAT-SM6 aiheuttaman apoptoosin [2]. PAT-SM6 sitoutuu myös laskostumattoman proteiinin vaste säädin GRP78, joka on yli-ilmentynyt ulkoisesti solun pinnalla tuumorisolujen [3]. GRP78, joka tunnetaan myös nimellä BiP (immunoglobuliinin raskasketjun sitova proteiini), on jäsen lämpöä pösokkiproteiini 70 (HSP70), perheen, joka estää stressin indusoiman apoptoosin. Entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA: t), käyttäen eri pitoisuuksia pinnoite GRP78, on aiemmin perustettu korkean aviditeetin vuorovaikutus PAT-SM6 ja GRP78 välittämän monipiste kiinnitys PAT-SM6 ja GRP78 ryhmittyneet pinnalla on mikrotiitterilevy [4]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme aviditeetin vuorovaikutuksesta PAT-SM6 LDL ja hapettuneen LDL ja kilpailun luonteen sitoutumisen LDL ja GRP78 PAT-SM6. Rooli monivalenssinen välisessä vuorovaikutuksessa PAT-SM6 kanssa kohdeantigeeneja tutkittiin käyttämällä antigeeni-päällystettyjä polystyreenipallosten. Tulokset osoittavat, että on tärkeää antigeenin klustereiden tuottavan korkean avidities, jotka luonnehtivat PAT-SM6 antigeenin vuorovaikutus. Kyky PAT-SM6 sitoa sekä GRP78 ja LDL on sopusoinnussa ehdotuksen että PAT-SM6 tappaa soluja toimittamalla ylimääräistä lipidien muodossa LDL kasvaimiin sitomalla samanaikaisesti GRP78 pinnalla syöpäsolujen [2].

Kokeelliset menetelmät

Materiaalit

ihmisen monoklonaalinen vasta-aine PAT-SM6 ilmennettiin ja puhdistettiin stabiili suspensio viljelmistä ihmisen solulinjassa in seerumittomassa elatusaineessa [5], [6]. Isotyyppikontrollia IgM saatiin Jackson Immuno- Labs, Inc, West Grove, PA. PAT-SM6 leimattiin fluoresenssi käyttäen fluoreseiini-isotiosyanaatti (Sigma-Aldrich) val- mistajan ohjeiden mukaisesti. Aikuinen ihmisen GRP78 sisältää C-pään 6 x His-tag ilmennettiin ja puhdistettiin

E. coli

kuten aiemmin on kuvattu [4].

Ethics lausunto

Tuoretta ihmisen verinäytteitä saatiin St Vincentin sairaalan, Melbourne protokollien avulla hyväksymä St Vincentin sairaalan Melbourne Human Research Ethics komitea . Kirjallinen suostumus osallistujilta saatiin alkuperäistä ihmisen työ, joka tuotti verinäytteet eristämiseksi LDL. LDL eristettiin tiheys fraktioimalla preparatiivisella ultrasentrifugoinnilla käyttäen KBr [7]. Hapettuneen LDL valmistettiin lisäämällä 20 uM CuSO

4-200 ug /ml LDL ja inkubaatio huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan [8]. Hapettuminen seurattiin mittaamalla absorbanssi 234 nm: ssä ja tioflaviini T (THT) fluoresenssi. THT lisättiin LDL loppukonsentraatioon 8 pM ja fluoresenssi mitattiin käyttämällä

f

max

Platereader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), joissa on 444/485 nm: n virityksellä /emissiosuodattimia. Hapetus lopetettiin lisäämällä EDTA: ta lopulliseen konsentraatioon 1 mM. LDL ja hapettuneen LDL dialysoitiin fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS; 20 mM natriumfosfaatti, 150 mM NaCl, pH 7,4), joka sisälsi 1 mM EDTA: ta ja 0,1% NaN

3 ja säilytettiin 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus LDL määritettiin absorbanssi 280 nm: ssä korjataan valon sirontaa [9] ja käyttämällä ekstinktiokerrointa 844 cm

2 /g arvioida aminohappokoostumus apolipoproteiini B molaarinen konsentraatio LDL laskettu olettaen arvo 2,2 × 10

6 keskimääräinen molekyylipaino ihmisen LDL [10].

saxs (SAXS) B

Synchrotron SAXS inline kokoeksluusiokromatografialla (SEC-SAXS) LDL ja hapettuneen LDL suoritettiin Australian synkrotronisäteilylaitoksessa SAXS /WAXS beamline. Näytteet altistettiin SEC pylvääseen, jonka huokoskoko on 500 Å (WTC-050N5, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA), joka antaa tehokkaan proteiini MW erottaminen alueella 15000 5000000 Da. Pylväs tasapainotettiin puskurilla, joka sisälsi PBS: ää, virtausnopeudella 0,4 ml /min. Injektiot olivat 20 ui, joiden proteiinipitoisuus on 3 mg /ml. Palkki kokoisista näytteessä oli 250 um vaaka × 150 pm pystysuora (FWHM). Pilatus 1M ilmaisin kuvat analysoitiin keskiarvoina kymmenen peräkkäisen 2 s vastuut ja muunnetaan yksittäisiin

I

(

q

) SAXS profiileja Scatterbrain ohjelmistoa (Australian Synchrotron).

I

(

q

) on hajallaan röntgen intensiteetin funktiona suuruuden momentinsiirron vektori

q

= (4πsinθ) /λ, jossa sirontakulma on 2θ ja X-ray aallonpituus on λ (1,12713 Å). Tiedot kerättiin 298 K kameralla pituus 3,3 m, joka mahdollisti intensiteettiä kerätään yli

q-

valikoiman 0,00429-0,24575 Å

-1. SAXS profiilit analysoitiin käyttämällä ATSAS (versio 2.4) sarja ohjelmia [11].

laskeutumisnopeus Analysis

laskeutumisnopeus kokeellisesti absorbanssia optiikalla suoritettiin käyttäen XL-I analyyttinen ultrasentrifugissa (Beckman Coulter, Fullerton, CA), joka on varustettu An-60 Ti -roottorissa 20 ° C: ssa. Proteiini Näytteet lisättiin kaksinkertainen sektorin EPON täytetty centrepieces PBS vertailu- osastoon. Radial absorbanssi tiedot hankittiin roottorin nopeudella 28000 rpm, käyttäen aallonpituutta 280 nm, ja säteittäisellä välein 0,003 cm jatkuvassa skannaustila. Laskeutumisnopeus suoritettiin myös käyttämällä XL-A analyyttinen -ultrasentrifugissa varustettu fluoresenssidetektoinnilla järjestelmä (FDS; Aviv Biomedical) seurata laskeutumisen fluoreseiinileimatulla PAT-SM6 ja KBPA-101. Sedimentoituva rajat sovitettiin malliin olettaen jakauman sedimentaatio kertoimia ei-vuorovaikutuksessa lajeja, c (S), käyttäen ohjelmaa SEDFIT [12]. Tiedot sovitettiin käyttäen mahdollisimman entropian laillistamista, P-arvo 0,95 ja kitka- suhdetta 1,9 [4]. Sedimentaatio kertoimet korjattiin vaikutuksia LDL liuoksen tiheys ja viskositeetti, olettaen arvot 0,967 ml /g ja 3,4 ml /g osittaista tietyn määrän ja rajaviskositeetti LDL vastaavasti [10].

Entsyymi immunosorbenttimääritys (ELISA) B

Antigeenit päällystettiin 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn lokeroita (Nunc Maxisorp) inkuboimalla yön yli 4 ° C: ssa. Sen jälkeen levyt pestiin 3 kertaa PBS: ssä, 3 kertaa PBS: ssä + 0,1% Tween 20, 3 kertaa PBS: ssä ja blokattiin 5% (w /v) BSA: lla PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin sitten jälleen kuten edellä. Kaikki vasta-ainevalmisteet tehtiin 5% (w /v) BSA: ta PBS: ssä. Epäsuoria ELISA kokeet, vasta-aineet levitettiin suoraan levylle ja inkuboitiin 1 tunti. Kilpailukykyisen ELISA-vasta-aineita inkuboitiin liuoksessa eri määriä antigeeniä ennen hakemuksen mikrotiitterilevylle. Pesun jälkeen jälleen kuten edellä, peroxidise-konjugoitua kanin anti-ihmis-IgM-sekundaarista vasta-ainetta (Dako) levitettiin levylle ja inkuboitiin 1 tunti mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lopullisen pesun jälkeen vasta-aineen sitoutuminen määritettiin käyttäen 100 ui kuoppaa kohti 3,3 ’, 5,5’-tetrametyylibentsidiiniä substraattiliuosta (Sigma) ja mittaamalla värin muutos 655 nm: ssä. Aikakäyrän Värinkehitys olennaisesti lineaarisia optinen tiheys alueella 0-3. Mittaukset tehtiin 15 minuutin kuluttua lisäämällä substraattia. Kontrollikokeissa, joissa suora päällystys levyjen kanssa PAT-SM6, pitoisuusvälillä 0-2,5 ug /ml, systemaattinen kasvu havaittiin ELISA-signaalin lisääntynyt pinnoite keskittyminen, mikä merkitsee suoraa korrelaatiota ELISA signaalin ja vasta-aineen määrä levyyn sitoutuneen. ELISA tiedot titraus primaarisen vasta-aineen sitoutumisen immobilisoituun LDL analysoitiin olettaen yksinkertaista Langmuirin sitoutumisen isotermin kuvataan suhdetta Y = K

a /(1-K

a), jossa Y on suuruus ELISA-signaalin ja K

a = näennäinen sitova vakio, olettaen yhden luokan sitoutumiskohdista.

antigeeni-pinnoite polystyreeni mikropallot

Jousitus 1 um halkaisijaltaan polystyreeni mikropalloja (Polysciences, Inc.) pitoisuutena 2,5% (w /v) pestiin toistuvasti pelletointi (x 3) mikrofugissa ja suspendoimalla uudelleen PBS: ään, PBS-0,1% Tween 20, ja sitten viimeisen kerran PBS: llä. Pestyt mikropallot pelletoitiin sitten ja suspendoidaan uudelleen 2 mg /ml antigeeni (LDL tai GRP78) tai 5% (w /v) BSA: ta (blokkausliuoksessa) lopulliseen mikropallo pitoisuus on 2,5% (w /v). Putket mikropallopohjaisesta /antigeenin seosta inkuboitiin yön yli pyörivällä alustalla 4 ° C: ssa. Asteen määrittämiseksi antigeenin sitovia, mikropallot pelletoitiin, ja absorbanssi supernatantissa mitattiin 280 nm: ssä ja sitä verrattiin absorbanssi alkuperäisen antigeenin liuokseen. Päällystetyn mikropallot pestiin kuten edellä, ja sen jälkeen estetty 5% BSA: ta ja säilytettiin 4 ° C: ssa, kunnes valmis käytettäväksi.

Tulokset

hapetus LDL

Cu

2+ indusoi LDL: n hapettumista seurattiin mittaamalla valon absorbanssi 234 nm: ssä (kuvio 1A). Absorbanssin kasvua 234 nm: ssä lähestyy enintään 24 tunnin kuluttua ja johtuu muodostumista konjugoitujen dieenien [13]. LDL hapettumista seurattiin myös jatkuvalla THT määritys [8]. Tulokset osoittavat, että THT fluoresenssi LDL inkuboitiin 20 mM CuSO

4 kasvaa saman ajanjakson aikana saavuttaa tasanteen 16 tunnin ilman vastaavia muutoksia havaittu valvontaa inkuboinneissa LDL tai THT yksin. Lisäksi luonnehdinta hapettuneen LDL: n suoritettiin käyttäen laskeutumisnopeus analyysiä. Sedimentaatiovakio jakaumat (kuvio 1 C) esiintyi yksi symmetrinen piikki LDL kanssa modaalinen sedimentaatiovakio noin 4,5 S, kun jakelu saadaan hapettuneen LDL oli bimodaalinen suurimpien huippu sedimentoituva kanssa modaalinen sedimentaatiovakio noin 8 S. Tämä lisäys lasko johtuu muutoksesta hiukkasten tiheyden vuoksi merkittävän menetyksen lipidien seuraavista hapettumista [8].

(A) muutos absorbanssin 234 nm funktiona inkubaatioajan. (B) Aika kurssi muutoksen THT fluoresenssin LDL (yhtenäinen viiva), LDL inkuboitiin 20 mM CuSO

4 (katkoviiva) tai pelkkää PBS: ää (katkoviiva). (C) sedimentaatiovakio jakelu saadaan laskeutumisnopeus analyysiin LDL (katkoviiva) ja hapettuneen LDL (yhtenäinen viiva).

saxs (SAXS) analyysi LDL ja hapettuneen LDL

SAXS analyysia on käytetty laajasti kuvaamaan LDL ja Cu

2 + käsiteltyä hapettuneen LDL [14], [15], [16]. Tämä tekniikka antaa tietoa kokoa ja muotoa lipoproteiinipartikkelien parametrien kuten jäyhyyssäde (

R

g) ja suurin mitta (

D

max), sekä tietoa sisäisestä rakenteesta hiukkaset pari matkan ajossa toiminto

P

(

r

). Täällä, LDL ja hapettuneen LDL tehtiin synchrotron kokoeksk- SAXS (SEC-SAXS) [4]. Tämä menetelmä parantaa laatua SAXS tietojen toimittamalla fraktioitiin koon näytteen suoraan säteeseen, ja siten erottaa sirontaa hiukkanen kiinnostusta minkään aggregaattien, mutta myös tarjoaa lähes täydellinen puskuri ottelu vähennyslaskumerkin datan vähennys prosessia.

eluointi LDL ja hapettuneen LDL: pylväästä tarkkailtiin absorbanssilla 280 nm: ssä ja SAXS intensiteetti nolla-kulma (

I

(0)) funktiona tilavuus. SAXS profiilit piikin lajien on esitetty kuviossa 2A. Kunkin lajin,

R

g laskettiin kulmakerroin niiden Guinier tontteja (ln [

I

(

q

)] vs.

q

2) (kuvio 2B). LDL Guinier juoni oli lineaarinen

q

.

R

g valikoiman 0,8-2,4, joka antaa

R

g arvo 134 ± 1 Å.

R

g huipun LDL laji mitattuna tässä hyvässä sopusoinnussa julkaistujen keskiarvon 139 Å väliltä 121-160 Å tarkkailtiin 17 LDL valmisteet 12 luovuttajien [16]. Sillä hapettuneen LDL Guinier juoni oli lineaarinen

q

.

R

g välillä 0,8-1,6 joka antaa

R

g arvo 112 ± 3 Å. Edellinen röntgen- ja neutronisirontaa tutkimuksissa LDL hapettumisen palveluksessa staattinen näytteet, jotka osoittivat ajasta riippuvaa ja [Cu

2 +] – riippuvaisia ​​nousua näennäinen

R

g, jopa ~160 Å johtuen aggregaattien muodostusta [16], [17]. SEC-SAXS johdettu

R

g arvo ilmoitetaan tässä on ensimmäinen mittaus eristetty hapettuneen LDL partikkelien puuttuessa aggregaatteja. Kunkin SAXS profiili

P

(

r

) toiminto arvioitiin epäsuoralla Fourier (kuvio 2C).

P

(

r

) analyysi osoitti, että LDL ja hapettuneen LDL oli samanlaisia ​​

D

max arvot ~250 Å, joka on yhdenmukainen aiempien mittausten [ ,,,0],16].

R

g vastinetta LDL

P

(

r

) analyysi oli 131 ± 2 Å ja hapettuneen LDL oli 109 ± 3 Å, jotka ovat hyvässä kanssa arvot Guinier analyysit. Cu

2 + -välitteisen hapettumista aiheuttaa ominaisuus muutoksia sisäinen organisaatio LDL partikkeli, jossa on katsottu johtuvan menetyksen määräsi kolesteroliesterin ja triacyglycerol rakenne [16].

P

(

r

) analyysi on diagnostinen tästä muutoksesta, koska

P

(

r

) käyrä LDL on voimakas negatiivinen piikki

r

= 135 Å, joka on täysin menetetty, kun hapetus (kuvio 2C). On ehdotettu, että tämä negatiivinen huippu on negatiivisten kontrastin tilata hiilivetyketjujen ulko yksikerroksista LDL, joka on pienempi elektronien tiheys kuin ympäröivä liuotin. Hapetus uskotaan johtavan hapen lisääminen tyydyttymättömään asyyliketjuista, mikä tekee niistä elektroni tiheän kuin vettä ja aiheuttaa positiivisen sijaan [16], [17].

. SAXS tiedot näytetään keskimääräisenä intensiteetti

I

(

q

) ± 1 keskihajonta, funktiona momentinsiirron

q

LDL (kiinteät ympyrät) ja hapettuneen LDL (avoimet ympyrät). (B) Guinier tontit SAXS tuloksia matalilla

q

LDL (kiinteät ympyrät) ja hapettuneen LDL (avoimet ympyrät). Alempi ja ylempi

q

.

R

g rajat Guinier analyysit osoitetaan. (C) Pair etäisyys kertymäfunktio

P

(

r

) funktiona radiaalisen etäisyyden

r

LDL (umpinaiset ympyrät) ja hapettuneen LDL (avoimet ympyrät).

Entsyymi-immunologiset määritykset PAT-SM6 vuorovaikutukset LDL ja Hapettunut LDL

ELISA-kokeet suoritettiin käyttäen erilaisia ​​PAT-SM6 pitoisuudet ja levyt päällystettiin eri pitoisuuksilla joko LDL tai hapettuneen LDL: n (kuvio 3). Tulokset osoittavat systemaattista kasvu ELISA-signaalin funktiona PAT-SM6 konsentraatio laajempaa sitoutumista havaittu suuremmilla antigeenin päällysteen pitoisuuksia. Tiedot sovitettiin yksinkertainen Langmuirin sitoutumisen isotermin saada näennäinen sitoutumisvakio (K

a) funktiona LDL päällysteen pitoisuus (kuvio 3C). Tulokset osoittavat, että vuorovaikutus PAT-SM6 LDL tai hapettuneen LDL on samanlainen ja suhteellisen riippumaton päällysteen pitoisuuksien kanssa näennäinen K

arvoihin noin 50gM

-1, vastaten dissosiaatiovakioita 20 nM. Nämä arvot osoittavat, että vuorovaikutus PAT-SM6 ja LDL on heikompi kuin vuorovaikutus PAT-SM6 ja GRP78, jossa ELISA-tutkimukset tuottivat ilmeistä dissosiaatiovakiot noin 4 nM [4].

Määritykset suoritettiin käyttäen ( A) LDL tai (B), hapettuneen LDL: n on pinnoite pitoisuuksilla 0 pg /ml (avoimet ympyrät), 1 ug /ml: lla (umpinaiset kolmiot), 2 ug /ml: lla (avoimet vinoneliöt), 3 ug /ml: lla (täytetyt neliöt), 4 ug /ml: lla (avoimet käänteiset kolmiot), ja 5 ug /ml: lla (umpinaiset ympyrät). (C) Tiedot sovitettiin yksinkertainen sitova isotermi saada näennäinen sitoutumisvakio (K

a) PAT-SM6 sitova funktiona päällysteen pitoisuus LDL (avoimet ympyrät) tai hapettuneen LDL: n (umpinaiset ympyrät). Virhe palkit edustavat 95%: n luottamusväli asennuksesta ELISA datan Langmuir sitova käyrä.

samanaikainen Sidonta LDL ja GRP78 PAT-SM6

Kyky PAT-SM6 vuorovaikutuksessa samanaikaisesti GRP78 ja LDL tutkittiin käyttäen kompetitiivinen ELISA kokeiluja. Tulokset suoritettiin käyttäen alhaisen pinnoitus pitoisuuksia GRP78 tai LDL mahdollistaa tehokkaamman eston PAT-SM6 sitova lisäämällä liukoisen antigeenin. Tulokset käyttäen liukoista LDL kilpailijana osoittivat, että merkittävä inhibitio PAT-SM6 sitoutumista todettiin levyille päällystettiin joko GRP78 tai LDL. Käänteisesti tuloksia käyttämällä GRP78 kilpailijana paljasti merkitsevän eston PAT-SM6 sitoutumisesta immobilisoituun GRP78 tai LDL, vahvistaa kyky GRP78 ja LDL kilpailemaan toistensa kanssa sitoutumisesta PAT-SM6. Toinen havainto kuviosta 4 on, että korkeammat pitoisuudet LDL tarvitaan puoleen maksimaalisesta eston verrattuna GRP78, sopusoinnussa suurempi affiniteetti GRP78 PAT-SM6 paljasti suoralta ELISA kokeita (kuva 3 ja [4]).

Kuopat päällystettiin 7,5 mg /ml GRP78 (ympyrät), 7,5 mg /ml LDL (kolmiot) tai jätettiin päällystämätön (neliöt). PAT-SM6 (5 mg /ml) inkuboitiin eri pitoisuuksien kilpailijan ennen hakemuksen mikrotiitterilevylle.

laskeutumisnopeus Analyysi PAT-SM6 ja LDL

Tulokset kuviossa 3 osoittivat, että näennäinen K

arvoihin vuorovaikutukselle PAT-SM6 immobilisoidun LDL tai hapettuneen LDL oli riippumaton antigeenin päällysteen pitoisuus. Nämä havainnot ovat ristiriidassa saatujen tulosten kanssa GRP78 [4], jossa voimakas riippuvuus PAT-SM6 sitoo päällysteen pitoisuus GRP78 otettiin todisteena antigeenin klusterointi ne määräävät oleellisesti vahvuus PAT-SM6 sitovaa vuorovaikutusta. Tulokset havaittiin LDL ehdotti, että LDL voidaan ryhmittyneet sen mikrotiitterilevyn, pieninäkin pinnoitus pitoisuudet tai että PAT-SM6 voi sitoutua suoraan yksittäisille LDL hiukkasia. Tutkimaan viimeksi mainitun mahdollisuuden, laskeutumisnopeus kokeet suoritettiin kuvaamaan vuorovaikutusta liukoisen LDL ja PAT-SM6. Tulokset kuviossa 5A osoittavat sedimentaatiovakio jakaumat seosta LDL ja PAT-SM6. Kaksi suurta piikkiä havaitaan kanssa modaalinen sedimentaatio kertoimien lähelle arvoja havaittiin LDL yksin ja PAT-SM6 yksin. Analyysi keskimääräinen sedimentaatiovakio nopeammin huippu, korjaukset on pieni vaikutus LDL on liuoksen tiheys ja viskositeetti, ei paljastanut mitään merkittävää eroa verrattuna keskimääräiseen sedimentaatiovakio PAT-SM6 yksin. Koska mitään havaittavissa muutosta keutumisnopeuden PAT-SM6 läsnä LDL osoittaa hyvin vähän vuorovaikutusta näiden lajien näissä olosuhteissa ja on ristiriidassa voimakkaan vuorovaikutuksia havaittu ELISA kokeissa (kuviot 3 ja 4). Yksi mahdollisuus katsoa oli, että käyttämällä 50 mg /ml BSA: ta estävää ainetta ELISA-kokeet voivat toimia suurimolekyylistä syrjäyttämisen ainetta ja lisätä sitoutumisaffiniteettia [18]. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi laskeutumisnopeus kokeet suoritettiin käyttäen fluoresoivasti leimattua PAT-SM6 ja fluoresenssin havaitsemisen järjestelmä analyyttisen ultrasentrifugissa. Tämän ansiosta keutumisnopeuden leimatun PAT-SM6 valvottavan läsnä ollessa ja ilman korkeita pitoisuuksia BSA. Tulokset kuviossa 5 osoittavat, että LDL on hyvin vähän vaikutusta sedimentoitumisen fluoresoivasti leimattuja PAT-SM6 joko läsnä tai poissa ollessa 50 mg /ml BSA: ta. Laskeutumisnopeus Tulokset Kuviossa 5 sulkea suuren affiniteetin vuorovaikutus liukoisen LDL ja yksittäisten sivustoja PAT-SM6 ja tukevat ehdotusta, että sitoutuminen PAT-SM6 LDL immobilisoitu mikrotiitterilevyille ohjaa aviditeettijärjestyksellä perustuva sitova mekanismi toisin heikko vuorovaikutukset (ainakin korkealla uM alue).

(A) sedimentaatiovakio jakaumat saadaan käyttämällä imeytymistä optiikka 280 nm PAT-SM6 (0,3 uM, musta), LDL (1,8 uM, punainen) ja seosta PAT-SM6 ja LDL (0,3 uM ja 1,8 uM, tässä järjestyksessä (vihreä). (B) sedimentaatiovakio jakaumat saatu fluoresenssi optiikka FITC-leimatun PAT-SM6 (40 nM) läsnä ollessa (yhtenäinen viiva) ja ilman sitä (rikki line) LDL (1,8 uM). (C) sedimentaatiovakio jakaumat saatu, kun läsnä on BSA: ta (50 mg /ml) käyttäen fluoresenssia optiikka FITC-leimatun PAT-SM6 (40 nM) läsnä ollessa (yhtenäinen viiva) ja ilman sitä (katkoviiva) LDL (1,8 uM).

vuorovaikutuksia PAT-SM6 kanssa antigeeni-pinnoitettu Polystyreeni mikropallot

todisteet PAT-SM6 vuorovaikuttaa by monen pisteen kiinnitys ryhmittyneisiin antigeenejä ehdotti, että imeytymistä GRP78 tai LDL polystyreenin mikropallojen voi lisätä kykyä näiden antigeenien estää PAT-SM6 sitoutumisen yhteisvaikutuksia. Antigeeni-päällystettyä polystyreeniä mikrohelmiä valmistettiin inkuboimalla polystyreeniä mikrohelmiä antigeenien kanssa ja seurataan sitoutumisen laajuus käyttäen sentrifugia pelletointi määrityksessä. Tulokset kuvassa 6 osoittavat, että GRP78 ja LDL sitoutuvat nopeasti polystyreeni- helmiin. Tulokset osoittavat myös, missä määrin sitoutumisen GRP78 kasvaa funktiona GRP78 pitoisuus ja että BSA sitoutuu helmien kyllästyvän tavalla (kuvio 6).

(A) määrä sitoutuneen proteiinin grammaa kohti mikropallojen funktiona GRP78 (umpinaiset ympyrät) tai BSA pitoisuus (avoimet ympyrät). (B) ajan funktiona ja GRP78 (kiinteät ympyrät) ja LDL (avoimet kolmiot) sitoutumista polystyreeniä mikropalloja.

ELISA-kokeita sen testaamiseksi, GRP78 tai LDL päällystettyihin mikrohelmiin inhiboida PAT-SM6 ja antigeeniä päällystetyt mikrotiitterilevyillä tehtiin käyttämällä korkeita pitoisuuksia pinnoitteen antigeenin maksimoida laajuus ryhmittely lautaselle. Tulokset kuviossa 7 osoittavat, että GRP78 päällystetyt mikropallot estävät PAT-SM6 sitoutumisen mikrotiitterilevyjen päällystettiin joko GRP78 samalla, samalla konsentraatioalueella ja olosuhteet, liukoinen GRP78 tai BSA-päällystetyt ohjaus mikropallot ei estänyt. Nämä tulokset osoittavat vahvaa sitoutumista PAT-SM6 ja GRP78-päällystettyjä helmiä kautta moniarvoinen liitetiedoston sitoo PAT-SM6 ja estää sitoutumisen PAT-SM6 ja GRP78 päällystettyjä mikrotiitterilevyjä. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttäen LDL-päällystettyjä mikrotiitterilevyjä, vaikka tässä tapauksessa sekä GRP78-päällystettyjä helmiä ja liukoisen GRP78 esti PAT-SM6 sitoutumisen levyt. Tämä tulos on yhdenmukainen korkeampi näennäinen aviditeetin PAT-SM6 varten GRP78 verrattuna LDL. Tulokset Kuviossa 8 osoittavat, että LDL päällystetyt mikropallot estävät PAT-SM6 sitoutumisen mikrotiitterilevyjen päällystetty LDL, kun taas samoissa pitoisuusalue olosuhteissa liukenevia LDL tai BSA-päällystetyt ohjaus mikropallot ei estänyt. Tulokset kuviossa 8 osoittavat myös LDL-päällystetyt mikropallot eivät inhiboi PAT-SM6 ja GRP78 päällystetyille levyille, sopusoinnussa suurempi aviditeetti PAT-SM6 varten ryhmitelty GRP78 verrattuna ryhmittyneet LDL.

PAT -SM6 (5 mg /ml) inkuboitiin GRP78-päällystetyt mikropallot (ympyrät), liukoinen GRP78 (kolmiot) tai BSA-päällystettyihin mikropalloja (neliöt) ennen lisäämistä mikrotiitterilevyllä.

valokuvio SM6 (5 mg /ml) inkuboitiin LDL-päällystetyt mikropallot (ympyrät), liukoista LDL (kolmiot) tai BSA-päällystettyihin mikropalloja (neliöt) ennen lisäämistä mikrotiitterilevyllä.

keskustelu

Natural IgM- vasta osa synnynnäisen immuunivasteen jossa ne osallistuvat tunnustamista hiukkasia lukien hapettunut ja kemiallisesti muunnetut proteiinit ja transformoituja soluja [19]. Tämän luokan vasta-aine tyypillisesti alhainen antigeenispesifisyys, joilla on kyky sitoa useamman kuin yhden tyyppinen antigeenin [20]. Tämä kyky sitoa useamman kuin yhden tyyppinen antigeenin on ilmeistä, kun kyseessä on PAT-SM6, jossa ELISA-tiedot osoittavat voimakasta vuorovaikutusta rakenteellisesti eivät liity solun kalvoon liittyvä GRP78 tuumorisoluissa [3], ja sekä natiivi ja hapetetaan plasman alhaisen tiheyden lipoproteiinia [2]. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että vuorovaikutus PAT-SM6 kanssa GRP78 välittyy aviditeettijärjestyksellä-mekanismi perustuu monivalenssinen vasta-aineen. Tulokset esitetään tässä tutkimuksessa ehdottaa samanlaista aviditeetin-mekanismi toimii sitomisesta PAT-SM6 LDL. Useat havainnot tukevat tätä päätelmää. Vuorovaikutus PAT-SM6 LDL analysoitiin laskeutumisnopeus ei paljastanut mitään merkittävää muutosta keutumisnopeuden PAT-SM6 läsnäollessa LDL. Sen sijaan, vahva vuorovaikutukset immobilisoidun GRP78 ja PAT-SM6 havaittiin ELISA kokeita. Näiden tutkimusten perusteella voidaan suhteellisen heikko vuorovaikutukset (mikromolaarisella konsentraatioalueella) kun PAT-SM6 ja LDL ovat vapaana liuoksessa, mutta paljon vahvempi vuorovaikutusta LDL ryhmittyneet on mikrotiitterilevyllä. Tuki rooli klusterointi on myös, että tulokset kokeista, joissa käytetään antigeeni-päällystettyä polystyreeni mikropalloja, jotka osoittivat parannettu sitoutumisen inhibition PAT-SM6 antigeeni päällystettiin mikrotiitterilevyille, verrattuna vastaavien pitoisuuksien liukoisten muotojen antigeenin. Merkittävä ero PAT-SM6 vuorovaikutukset LDL verrattuna vuorovaikutuksia GRP78 on, että ilmeinen aviditeetti PAT-SM6 vuorovaikutukset LDL ei havaittu riippuvuutta päällysteen pitoisuus LDL. Kun kyseessä on GRP78 näennäinen aviditeetti PAT-SM6 kasvaa päällysteen pitoisuus, sopusoinnussa antigeenin klusterointivaikutus [4]. Eräs mahdollinen selitys tälle ero on suuri koko LDL ja vahvempi sitoutuminen mikrotiitterilevyn johtaa klustereiden, jopa alhaisissa pinnoitteen pitoisuuksina.

Analyysi sitoutumisen PAT-SM6 LDL ja hapettuneen LDL merkitty samankaltaisia näennäinen avidities (K

d noin 20 nM) ja yleinen heikompi sitoutuminen verrattuna vuorovaikutusta GRP78. Aikaisemmat tutkimukset vuorovaikutuksen PAT-SM6 LDL ja hapettuneen LDL: n, suoritetaan käyttämällä yhtä antigeeniä pinnoite ja PAT-SM6 konsentraatio tuotti alempi ELISA-signaali (65%) kanssa sitoutumisesta LDL verrattuna hapettuneiden LDL-partikkelien [2], toisin kuin tulokset esitetään kuviossa 3, jossa sitova käyriä PAT-SM6 LDL ja hapettuneen LDL olivat hyvin samankaltaisia. Mahdollisia selittävät tätä eroa suuria vaihteluja, että valmistukseen käytetyt menetelmät hapettuneen LDL.