Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

PTEN fosfataasi vaikuttaa fosfatidyyli 3,4,5-trifosfaattia johtuvat fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) aktivointi. PTEN ilmentyminen on osoitettu olevan vähentynyt peräsuolen syöpä. Tiedetään vähän kuitenkin niin erityisten solujen roolia PTEN ihmisen suolen epiteelisolujen. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia roolia PTEN ihmisen peräsuolen syövän soluja.

Menetelmät /Principal Havainnot

Caco-2/15, HCT116 ja CT26 soluja infektoitiin yhdistelmä-lentivirukset ilmentävien shRNA suunniteltu knock-down PTEN. Vaikutus PTEN downregulation analysoitiin solujen polarisaation ja erilaistumista, solujen välinen risteys eheys (ilmaus solu-solu adheesioproteiineja, suojavaikutuksen), maahanmuutto (haavan määritys), invaasiota (Matrigel päällystetty siirtoaltaat) sekä kasvainten ja etäpesäkkeiden muodostumista hiirillä . Elektronimikroskooppiha- analyysi osoitti, että lentiviraalinen infektiota PTEN shRNA estivät merkittävästi Caco-2/15 solu polarisaatio, toiminnallinen eriyttäminen ja harjareunusten kehitystä. Vahva vähentäminen klaudiini 1, 3, 4 ja 8 havaittiin myös samoin kuin lasku epiteelin vastarintaa. Menetys PTEN ilmaisun kasvoi leviämistä, muuttoliike ja hyökkäys valmiuksia paksusuolisyövän soluja

in vitro

. PTEN downregulation myös lisääntynyt kasvaimen koko ihonalaisen injektion paksusuolisyövän soluja nude-hiirissä. Lopuksi menetys PTEN ilmaisun HCT116 ja CT26, mutta ei Caco-2/15, johti lisääntymiseen metastasoituneeseen mahdollisia seuraavien tail-vein injektiot hiirillä.

Johtopäätökset /merkitys

Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että PTEN ohjaa solun polariteetti, perustamalla solu-solu liittymissä, parasellulaarisen läpäisevyys, muuttoliike ja tuumorigeenisia /metastaattinen potentiaali paksu- ja syöpäsoluja.

Citation: Langlois MJ, Bergeron S, Bernatchez G , Boudreau F, Saucier C, Perreault N, et al. (2010) PTEN Fosfataasiaktiivisuutta Controls Suoliston epiteelisolujen Polarity ja Barrier Tehtävä: Rooli peräsuolen syövän etenemiseen. PLoS ONE 5 (12): e15742. doi: 10,1371 /journal.pone.0015742

Editor: Hang Thi Thu Nguyen, Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 elokuu 2010; Hyväksytty: 22 marraskuu 2010; Julkaistu: 23 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Langlois et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Kanadan Institutes of Health Research (CIHR: www.cihr-irsc.gc.ca) (CTP-82942) ja MT-14405 (NR). N.R. on vastaanottaja kanadalaisen Research Chair in Signaling ja Digestive fysiopatologia. J. C., C. S. ja F. B. ovat tutkijat Fonds de la Recherche en Santé du Québec. S. B. on vastaanottaja post doc apurahan Kanadan Association of Gastroenterology /CIHR /CCFC. N. R., J. C., C. S., N. P., ja F. B. ovat jäseniä FRSQ rahoittaman ”Centre de Recherche Clinique Étienne Lebel”. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat länsimaissa. Tunnusmerkki peräsuolen syöpä on menetys solujen organisaation. Histologinen arvosana peräsuolen karsinoomat on tärkeä prognostisia muuttuja ja on riippuvainen siitä, missä määrin rauhas eriyttäminen ja solujen napaisuus. Korkea-asteen, huonosti eriytetty peräsuolen kasvaimet ovat yleensä aggressiivisempia kuin matala-asteista, hyvin erilaistunut kollegansa [1].

epiteelisolujen solujen soluadheesiota ja apikaalisella-pohjapinta napaisuus ylläpidetään muodostumiseen useiden välistä adheesiota, kuten tiukka liittymissä (TJS). TJ säätelee parasellulaarisen diffuusion ja toiminnallisesti erottelee solukalvon kahteen osastoon, joka on edellytys koko polarisaation epiteelisolujen [2]. Neoplastiset solut käyttäytyvät usein rakenteellisia ja toiminnallisia puutteita sekä tiukka ja tarttuu liittymissä [3] – [5]. Kuten tarkastelleet Martin ja Jiang [4] Ilmaisulla monien tiiviin liitoksen proteiinit on säätelemätön sisään kolorektaalisyövissä. Vyöliitos proteiini E-kadheriinin on myös vähentynyt invasiivisia paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [6]. Lisäksi ekspressiokuviota hDlg ja hScribble, tiedetään säätelevän perustamista apikaalisella-pohjapinta polariteetin epiteelisoluissa [7], muuttuu huomattavasti aikana peräsuolen syövän etenemiseen down-regulation molemmat proteiinit liittyessä puute epiteelisolujen polariteetin ja sekavaa kudosrakenne [8].

Fosfoinositidien ovat viime vuosina esiin yleisinä määräävät sekä polariteetin ja identiteetin useita kalvoja. Viimeaikaiset tiedot osoittavat, että PtdIns (4,5) P2 on keskeinen tekijä apikaalisella pinnalla epiteelisolujen [9]. Itse asiassa ei-polarisoituneet MDCK-soluissa, sekä PtdIns (4,5) P2 ja PtdIns (3,4,5) P3 colocalize on solu-solu ja solu-soluväliaine yhteyksiä. Kuitenkin alkuvaiheissa polarisaation, PtdIns (4,5) P2 tulee pääosin keskittyneet apikaalisen kalvon soluissa, kun taas PtdIns (3,4,5) P3 pysyy paikallistettu basolateraaliseen kalvoon ja ulkopuolelle apikaalisella kalvo. Lipidi fosfataasi PTEN paikantuu apikaalisella domain ja on välttämätöntä eriytymistä PtdIns (4,5) P2 apikaalisella pinnalle, koska sen defosforyloimaan toimia D3-fosfaatti ryhmä PtdIns (3,4,5) P3 [10 ]. Lisäksi PTEN toimii negatiivisena säätelijänä inositoli-3-kinaasi (PI3K) /Akt-signalointireitin ja sen on osoitettu vaikuttavan monet prosessit vapautettiin kasvainten synnyssä kuten proliferaatiota ja elossa pysymistä, muuttoliike ja invaasio [11], [12] .

PTEN koodaa

fosfataasi ja tensin homologin poistetaan kromosomissa 10

(

PTEN

) tuumorisuppressorigeeniä, joka on toiseksi useimmin mutatoitunut geeni ihmisen syövissä seuraavat

TP53

[12]. Lisäksi menetys PTEN immunovärjääminen kolorektaalisyövissä kudoksissa on liittynyt edenneen taudin, maksan etäpesäke ja huono potilaan eloonjääminen [13] – [16], mikä viittaa sen mahdollinen suojaava rooli vastaan ​​etenemistä paksu- ja syövän synnyn. Koska PTEN ohjaa polariteetin normaaleissa epiteelisoluissa, voisi spekuloida, että menetys tämä proteiini voi olla riittävä laukaisemaan epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), kriittinen varhainen tapahtuma ja metastaasit monien syöpien, mukaan lukien CRC. Aiemmissa tutkimuksissa vaikutuksia PTEN menetys on ensisijaisesti on mitattu syöpäsolulinjoissa jotka tarjoavat sataman lukuisia muita muuntamiseen ja onkogeenisten mutaatioiden ja jotka ovat menettäneet epiteelin fenotyyppi [17] – [19]. Tällainen lähestymistapa on tehnyt vaikeaa määrittää, mitkä fenotyypit suoraan myönnettyä menetys PTEN ja määritetään vaiheet tumorigeneesin jotka on erityisesti muutettu solujen PTEN menetys. Jotta edelleen luonnehtia välisen yhteyden PTEN menetykset, polaarisuus ja peräsuolen syövän etenemiseen, käytimme Caco-2/15 solulinja on peräisin suhteellisen hyvin erilaistunut paksu- ja adenokarsinooma. Tämä klooni vanhemman Caco-2 cell line on laajalti tunnettu sen kyvystä toteuttaa täysi morfologiset ja toiminnalliset suoliston epiteelin erilaistumista prosessi, joka tapahtuu spontaanisti, kun yhtymäkohta on saavutettu ja joka on saatu valmiiksi jälkeen 15-20 päivää post-yhtymäkohta . Tarkemmin sanottuna nämä paksusuolen solut muodostavat apikaalisella tiukka ja tarttuu junktionaalinen kompleksit ja muodostavat polarisoitunut yksikerroksista usean päivän jälkeisen yhtymäkohta, joilla epiteelin sähkövastus (TEER) samanlainen

in vivo

havainnot [20] – [22 ]. Seuraavat ”de-eriytetty” CRC solulinjoja analysoitiin myös: Tällä HCT116 signaalien etsimiseen-epävakaa ihmisen CRC solulinjassa ja CT26, hiiren metastaattinen koolonikarsinoomasolulinjan. Tulokset osoittavat, että PTEN voi toimia esteenä syövän kehitystä kontrolloimalla solujen polaarisuus, perustamalla solu-solu liittymissä, parasellulaarisen läpäisevyys, muuttoliike ja metastaattisen potentiaalin paksu- ja syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaali ja vasta

vasta toteamiseen PTEN (A2B1), HNF1α (C-19) ja HNF4α (C-19) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). -Aineita, joita E-kadheriinin ja villiiniä olivat BD Biosciences (Mississauga, ON, Kanada). Vasta-aineiden havaitseminen fosfo-AKT (Ser473) ja AKT olivat Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Β-aktiini-vasta-aine oli peräisin Chemicon (Temecula, CA). Occludin, claudins ja ZO-1 vasta-aineet olivat kaikki peräisin Zymed Laboratories (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada). Monoklonaalinen vasta-aine HSI-14 vastaan ​​sakkaroosi-isomaltaasin ystävällisesti toimitti Dr. Andrea Quaroni (Cornell University, Ithaca, NY). CDX2 immunoblottaus suoritettiin kanin polyklonaalinen vasta-aine CDX2 aikaisemmin tunnettu siitä, [23]. Kaikki muut materiaalit hankittiin Sigma-Aldrich (Oakville, ON), ellei toisin mainita.

Soluviljely

kolme koolonsyöpäsolulinjoissa käytettiin esillä olevassa tutkimuksessa:

1-The peräsuolen adenokarsinoomasolulinja Caco-2/15 saatiin A. Quaroni (Cornell University, Ithaca, NY). Tämä solulinja tarjoaa ainutlaatuisen ja hyvin tunnettu malli, jolla tutkitaan suolen epiteelisolujen erilaistumisen koska nämä solut läpikäyvät sekä toiminnallisia että rakenteellisia eriyttäminen kohteena on suoliston ilmiasuun suolinukan, kupoli muodostumista ja ilmaus sakkaroosi-isomaltaasin useita päiviä päästyään yhtymäkohdassa [20] – [22]. Nämä solut ilmaista katkaistu

APC

ja mutatoitunut

p53

mutta niillä villityypin

K-Ras

,

β-kateniinin

ja mismatch korjaus (MMR) proteiinit; ne ovat siis microsatellite stabiileja (MSS) [24], [25]. Näitä soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Invitrogen ™), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS). 2- HCT116-solut saatiin ATCC: stä (CCL-247). Nämä solut kasvavat useita kerroksia ja ovat kykenemättömiä polarisaation tai suoliston epiteelin erilaistumista [20]. Nämä solut ovat hMLH1 puutteesta, ilmaista villityypin

p53

, villityypin

APC

ja kuljettaa aktivoimalla

K-Ras

,

pi3kca

, ja

β-kateniinin

mutaatioita [26]. Nämä solut ovat metastasoituneen [27], [28] avulla voimme analysoida vaikutuksia PTEN menetys ilmaisun pitkälle edennyt peräsuolen syövän. Näitä soluja viljeltiin McCoyn elatusaineessa (Wisent, St-Bruno, Quebec, Kanada), joka sisälsi 10% FBS: ää. 3- CT26-solut (saatiin ystävällisesti Pr Nicole Beauchemin, Université McGill, Kanada) olivat peräisin erilaistumattomaan hiiren adenokarsinoomaa joka aiheutettiin peräsuolen ruiskuttamalla

N

-nitroso-

N

-methylurethane Balb /c-hiirissä. Nämä solut kantavat aktivoimalla

K-Ras

mutaatioita [29], villityypin

p53

eivätkä ilmaise E-kadheriinin tai ZO-1 [30]. CT26-soluja ylläpidettiin RPMI-alustassa (Invitrogen ™), joka sisälsi 10% FBS: ää ja penisilliini-streptomysiiniä.

Plasmidirakennelmia ja lentivirukset tuotannon

lentiviraalinen shRNA ekspressiovektori (pLenti6-U6), rakennettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [31]. ShRNA oligonukleotidit ihmisen PTEN suunniteltiin mukaan Ambion ohjeiden (Technical Bulletin # 506) käyttämällä siRNA sekvenssit gctaagtgaagatgacaatca (# 1), gcacaagaggccctagatttc (# 2), gccagctaaaggtgaagatat (# 3) ttcaagaga kuin silmukka järjestyksessä. Oligonukleotidi-hehkutettu tuotteet subkloonattiin pLenti6-U6 välillä

Bam

HI ja

Xho

I sivustoja. Irrelevantti Plenti-shGFP (gccacaacgtctatatcatgg) tai mutatoidun Plenti-shPTEN (shMUT) käytettiin negatiivisena kontrollina. Mutatoidun Plenti-shPTEN muodostettiin muuttamalla 3 nukleotidien sekvenssin tehokkain shRNA vastaan ​​PTEN (# 2), jolloin siRNA-sekvenssin gcacaagataacctagatttc. ShRNA vastaan ​​hiiren muodossa PTEN (TRCN0000028992) ja vastaava kontrolli shRNA (shTGFP) vastaan ​​TurboGFP ™ (SHC004) saatiin Sigma-Aldrich. Lentiviruksiin tuotettu 293T-solut käytettiin soluinfektiomalleissa mukaan Invitrogen suositusten (ViraPower Lentivirusvektorikonstruktit Expression System). O induktio

OAS1

geenin ilmentyminen havaittiin Q-PCR-analyysi Kokeissa, joissa lentivirukset infektio (tuloksia ei ole esitetty).

OAS1

(2050 oligoadenylaattisyntetaasi) on klassinen interferoni kohdegeenin ja on suositeltu keskeisenä testi interferoni induktioon ennen liittämällä tietty vastaus geenin kohdennettu [32].

Protein louhinta ja Western blot-analyysi

Protein uuttamisen ja Western blot-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [22].

Transmissioelektronimikroskopia

Näytteet käsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [22] ja havaittu Hitachi H-7500 transmissioelektronimikroskoopin.

pyyhkäisyelektronimikrosko-

Caco-2/15 solut ympättiin pieni lamellit 12 mm halkaisijaltaan ja vahvistetaan aikaisemmin kuvattu transmissioelektronimikroskopiaa [22] asti dehydraatiovaihe etanoliin. Näytteet olivat kriittisiä pisteen kuivataan CO

2 ja päällystetty kulta-palladium kanssa sputterointiaika päällystyskoneen. Päällystetyt jälkeen soluja havaittiin JEOL pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (malli: JSM-840).

määritys epiteelin sähkövastuksen

Caco-2/15-solut maljattiin TRANSWELL® läpäisevät kalvot ( Corning, Acton, MA). TEER mitattiin 3 ja 9 päivän kuluttua solut olivat saavuttaneet yhtymäkohdassa epiteelin Voltommeter (World Precision Instrument, malli EVOM-G).

RNA-analyysi

Yhteensä RNA: n eristys, RT-PCR ja Q-PCR: t suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [31]. Target ilmentyminen kvantifioitiin suhteen PDGB ilme. Alukkeet kunkin geenin suunniteltu aikana eksoni-eksoniliitokset käyttäen Primer3 ohjelmistoa [33]. Alukesekvensseissä ja Q-PCR-olosuhteet ovat saatavilla pyynnöstä.

Migration määrityksissä

Analyysit suoritettiin terävä partakoneen terä tekniikka aiemmin raportoidun [34].

Analyysit Rac ja Cdc42 toiminta

GTP-sidottu tasot Rac ja Cdc42 analysoitiin G-LISA aktivaatiomääritys biokemia kit (Cytoskeleton, Denver, CO) mukaan valmistajan ohjeiden.

Invasion määritykset

Invasion analyysit suoritettiin käyttäen BD BioCoat ™ matrigeelin ™ Invasion Chambers 8 um polycarbonated suodattimet (BD Biosciences). Solut ympättiin media ilman seerumia läsnäollessa 2 mM hydroksiurean, farmakologinen estäjä solujen ribonukleosidia reduktaasin pidättämään solusyklin G1 /S-vaiheessa [35]. Väliaineessa, joka sisälsi 20% FBS: ää käytettiin kemoattraktantti. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 48 tuntia 37 ° C: ssa, ei-invasiivisia solut poistettiin mukaisesti valmistajan menettelyä ja tunkeutuvat solut kiinnitettiin metanolilla 100%. Sitten solut värjättiin kristalliviolettia 1%.

eläinmallit

Female nude-hiirissä CD1

nu /nu

ja Fox Chase SCID Beige hiiriä ostettiin Charles River (Wilmington , MA). Kaikki koeprotokollaa hyväksynyt eettinen komitea eläinten koe Université de Sherbrooke.

Kasvaimen kasvu

: yhteensä 2 x 10

6 solua suspendoitiin 100 ul: aan DMEM injisoitiin selän ihonalaiseen kudokseen 5-viikkoisen naaras-hiiret CD1

nu /nu

. Hiiret tapettiin 42 päivän kuluttua injektion varten Caco-2/15 ja 30 päivää injektion varten HCT116. Kasvaimet leikattiin irti ja punnittiin.

Experimental häntälaskimoon määritykset:

hännän laskimoon 5-viikkoisen naaras-CD1

nu /nu

hiiriä tai Fox Chase SCID Beige hiiriin ruiskutettiin 10

6 Caco-2 /15, HCT116 tai CT26-solut suspensoitiin 100 ui DMEM. Eläimet lopetettiin mitään merkkejä hengitysvaikeus tai laihtuminen, tai 14 päivän kuluttua injektion varten CT26, 75 ja 35 päivää injektion varten HCT116 pistetään vastaavasti CD1

nu /nu

ja Fox Chase SCID Beige hiirillä ja 60 päivää injektion varten Caco-2/15 solut injektoidaan Fox Chase SCID Beige hiirillä. Keuhkot pidettiin Bouinin fiksatiiviin 24 tunnin ajan. Yksittäiset liuskat erotettiin ja kokonaismäärä pinta-näkyvissä etäpesäkkeitä määritettiin.

Ihmisen kasvaimet

Näytteet paksusuolen syöpien ja pariksi normaalin paksusuolen kudokset (vähintään 10 cm: n kasvain) on saatu potilailla, joille tehdään kirurginen resektio. Potilaat eivät saaneet neoadjuvanttikemoterapian tai sädehoitoa. Kudokset saatiin jälkeen potilaan kirjallinen lupa, protokollan mukaisesti hyväksymän Institutional Human Aihe Review Board of Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. Kliiniset ja patologiset informaatiota saatiin potilastietoja. Adenooma näytteet olivat endoskooppisesti leikkaushoitoon ja määritellään kehittyneitä, koska niiden kokoa suurempi kuin 1 cm tai läsnäolo dysplasiaan tai villous komponentti. Potilaan syöpiä histologisesti luokitellaan ja porrastettu yleisen TNM pysähdyspaikan kriteerien (perustuu kasvain-, imusolmukkeiden Node- ja Metastatic- tila). Kaikki kudokset jäädytettiin nestetypessä 15 min resektio suosittelema Kanadan Kasvaimen Repository Network (www.ctrnet.ca). Proteiinin uutto, pariksi kudokset lyysattiin Triton näytepuskuriin (100 mM NaCl, 5 mM EDTA [pH 8,0], 50 mM Tris-HCI [pH 7,5], 1% Triton X-100, 5% glyserolia, 1 mM PMSF, 0,2 mM ortovanadaatti, 40 mM β-glyserofosfaatti, 50 mM NaF, ja 2% proteaasiestäjäseostabletit [P 8340, Sigma-Aldrich]) ja immunoblotattiin kuten aikaisemmin on kuvattu [22].

Data esitys

Tyypilliset tulokset ovat edustavat 3 itsenäistä koetta. Tilastot laskettiin käyttämällä Student kahden tailed t-testiä. Erot katsottiin merkitsevä * p≤0.05 tai *** p≤0.005. Densitometristä analyysit suoritettiin käyttäen Image J ohjelmisto.

Tulokset

PTEN ohjaa paksusuolen epiteelisolujen polarisaatio ja erilaistumista

tutkimiseksi vaikutuksen PTEN menetys ilmaisun erilaistumiseen ja polarisaation peräsuolen syövän soluja, rekombinantti lentivirukset koodaavat lyhyitä hiusneula-RNA: ita (shRNAs) oli ensimmäinen kehitetty, jotta vakaasti tukahduttaa PTEN mRNA tasot Caco-2/15 solut. Useita lentiviruksen konstrukteja testattiin niiden kyky knock-down PTEN. Tehokkain shRNA nimettiin shPTEN (tuloksia ei ole esitetty). Caco-2/15-soluja vastedes infektoitiin shPTEN lentivirukset tai merkityksetön shGFP lentivirukset tai lentivirukset ekspressoivat shPTEN 3 mismatch nukleotidia (shMUT) negatiivisina kontrolleina. PLenti6-U6 lentivirusvektorilla, joka coexpresses blastisidiinia S resistenssigeenin, yhteydessä on valittu puhtaan populaatioiden transdusoidut solut 7 päivän kuluessa. Kuten kuviossa 1A on esitetty, PTEN-proteiinin tasot olivat lähes täysin tippuu alas Caco-2/15-soluja, jotka ilmentävät shPTEN ( 90%); pieneneminen säilyi jälkeisessä konfluenssiin. Huomattavaa on, että PTEN alassäätöä liittyi myös lisääntymiseen AKT fosforylaation, tärkein alavirtavaikuttajainhibiittorit PI3K, jossa vahvistetaan, että PI3K polku aktivoitiin shPTEN ilmentävät-soluissa.

Caco-2/15 solut olivat tartunnan joko yhdistelmä-lentiviruksien koodaa shRNA joka nimenomaan koputtaa alas PTEN (shPTEN) tai negatiivinen kontrolli shRNAs (shGFP tai shMUT). A ja C. valinnan jälkeen infektoiduista soluista, Caco-2/15 lyysattiin -2, 0, 3, 6, 9 ja 12 päivää post-yhtymäkohta. Proteiinit analysoitiin sitten Western-blotilla. B. Left paneelit Hiljattain yhtenäisiksi Caco-2/15 solut ilmentävät shGFP tai shPTEN havainnoitiin optisella mikroskoopilla. Mittaviivat = 100 pm. Middle paneelit: Äskettäin yhtenäisiksi Caco-2/15 solut ilmentävät shGFP tai shPTEN fiksoitiin ja havaittiin transmissioelektronimikroskopialla. Mittaviivat = 2 um. Oikea paneelit: Äskettäin yhtenäisiksi shGFP tai shPTEN ilmentävät-soluja havaittiin pyyhkäisyelektronimikroskoopilla. Mittaviivat = 1 pm.

Sen analysoimiseksi, onko PTEN vaikuttaa Caco-2/15 solu polarisaatio, solumorfologiaan tutkittiin ensin eri päivinä yhtymäkohta. Kuten havaitaan optisella mikroskopialla solujen superficy merkittävästi kasvoi 5,3-kertaisesti (p 0,005 analysoitiin Metamorph ohjelmisto) hiljattain yhtenäisiksi Caco-2/15-solut ilmentävät shPTEN kontrollisoluihin verrattuna (kuvio 1 B, vasen paneeli). Lisäksi siirto elektronimikroskoopilla osoitti, että vasta yhtenäisiksi säätökennoja oli jo alkanut polarisoituvan taas PTEN-vajaiden solujen silti edelleen litistetty ulkonäkö (kuvio 1 B, keskimmäinen paneeli). 3 vuorokauden kuluttua yhtymäkohta, solut, joilla on alentunut PTEN ilme vain alkoi polarisoituvan taas kontrolli solut olivat jo saaneet niiden sylinterin muotoinen (tuloksia ei ole esitetty). Down-regulation PTEN myös johti määrän väheneminen mikrovillusten solun apikaalisella kalvo havaittuna pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (kuvio 1 B, oikea paneeli). Huomattavaa on, että ekspressiotasot funktionaalisen Differentiaatiomarkkerien sakkaroosi-isomaltaasin ja villiiniä myös merkittävästi vähentynyt PTEN-köyhdytettyä soluissa (kuvio 1 C).

Seuraava todennetaan, kun PTEN hiljentäminen muuttaa ilmaus Maksasolukasvute- tumatekijöiden 1a ( HNF1α) ja 4 (HNF4α) sekä kaudaalisessa liittyvät homeobox transkriptiotekijä 2 (Cdx2), joiden tiedetään ohjata suolen epiteelisolujen erilaistumisen [36]. Kuten kuviossa 1C on esitetty, kun taas ilmentymistaso HNF4α oli hieman vähennetty konfluentteja PTEN-puutteellisia Caco-2/15-soluissa, ekspressio HNF1α ja Cdx2 oli merkittävästi vähentynyt (kuvio 1C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että PTEN on tärkeää epiteelisolujen polarisaation sekä toiminnalliset ja morfologiset erilaistumista suolen epiteelisolujen. Huomattavaa on, että nämä vaikutukset eivät näytä olevan välillisesti seurausta muutoksen solujen lisääntymisen jälkeen Caco-2/15 solut ilmentävät shPTEN oli samat proliferaationopeus kuin kontrolli solut ja lopettaa lisääntyä heti, kun ne saavuttivat konfluenssin (tuloksia ei ole esitetty) .

PTEN alassäätöä heikentää tiiviin liitoksen eheys paksusuolen epiteelisoluissa

Koska välisissä liitoksissa ovat säätelijöitä solun polariteetin [2], [5], seuraavan kerran tarkistanut, ilmaus shPTEN oli vaikutusta soluliitos. Under transmissioelektronimikroskopiaa, vyöliitos ilmestyi muuttumattomana (kuvio 2A, nuolet) PTEN-puutosta Caco-2/15 solut samalla tiiviiden liitosten esiintyi vähemmän järjestetty 3 päivän kuluttua yhtymäkohta (kuva 2A, suluissa). Koska itse asiassa, jäsentelemätöntä massa proteiinien järjestelmällisesti havaittu kiristämättä kalvon tavanomaiseen asemaan tiukka liittymissä. Niinpä barrieerifunktiota tiiviiden liitosten myös vaarantua osoituksena lasku TEER mitattuna shPTEN ilmentävien solujen verrattuna ohjata solujen 3 ja 9 päivän kuluttua yhtymäkohta (kuva 2B). Jotta saataisiin lisää tietoa tavasta, jolla PTEN ohjaa risteyksessä eheys, ekspressiotasot useiden keskeisten junktionaalinen proteiineja, kuten occludin, ZO-1 ja claudins [2] analysoitiin. Proteiinin ilmentymistä claudins 1, 3, 4 ja 8 väheni huomattavasti sekä subkonfluenteista ja post-konfluentteja shPTEN soluja (kuvio 2C). Huomattavaa on, että ilmaus vyöliitos proteiini E-kadheriinin myös heikennettyjä jälkeisessä konfluentteja shPTEN soluja (kuvio 2C).

. Caco-2/15 solut ilmentävät shMUT tai shPTEN fiksoitiin 3 päivän kuluttua jälkeisen yhtymäkohta ja noudatettava transmissioelektronimikroskopialla. Mittaviivat = 500 nm. Nuolet osoittavat vyöliitos kun Suluissa tiukka liittymissä. B. Caco-2/15 solut viljeltiin huokoiset jälkeen epiteelin vastus mitattiin kolmena kappaleena 3 ja 9 päivän kuluttua solut saavuttivat yhtymäkohta. *** Merkittävästi erilainen p≤0.005 (Studentin t-testi). C. Caco-2/15-solut ilmentävät shGFP tai shPTEN lyysattiin -2, 0, 3, 6, 9 ja 12 päivää post-yhtymäkohdassa, jota seuraa Western blot-analyysi liitoskohtien proteiineja.

Loss PTEN ilmentymisen Caco-2/15 solut stimuloi muuttoliike /invaasio, edistää kasvaimen kasvua, mutta ei riitä antamaan metastaattista potentiaalia

in vivo

menettäminen välisissä liitoksissa on hyvin tiedetään liittyvän lisääntynyt solujen vaeltamiseen ja invaasion valmiuksien [4]. Lisäksi PTEN on osoitettu ohjaamaan tällaisia ​​prosesseja muissa solutyypeissä [11]. Käyttämällä haavan sulkemisen määrityksissä, migraatio vasta yhtenäisiksi ohjaus soluissa verrattiin shPTEN ilmentävien populaatioiden. Kuten on esitetty kuviossa 3A, kyky shPTEN ilmentävien Caco-2/15-solujen siirtää oli merkittävästi lisääntynyt kontrollisoluihin verrattuna, kuten määritettiin mittaamalla suhteellinen pinta-ala, joita vaeltavien solujen. Havaitsimme myös, että alas-säätely PTEN selvästi stimuloi Caco-2/15 solun irtoaminen jälkeen trypsinisaation (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot osoittavat, että PTEN Geenitranskriptikuvion hiljentämisen CRC soluissa parantaa niiden kykyä levittää ja siirtää. Koska PTEN on osoitettu vaikuttavan maahanmuuton aktivoinnin pieniä GTPaaseja Rac1 ja Cdc42 [37], me seuraavaksi tutkinut, onko niiden ilmentyminen ja aktiivisuus vaikutti menetys PTEN ilmaisua. Kuten on esitetty kuviossa 3B, sekä Rac ja Cdc42 näytetään suurempi GTP: hen sitoutuneen tasot subkonfluenteista ja konfluentteja shPTEN ilmentäviä soluja verrattuna kontrollisoluihin.

. Vasen paneeli: Solujen morfologia analysoitiin faasikontrastimikroskopiassa klo alakonfluenssista. Oikea paneelit: Äskettäin yhtenäisiksi solut ilmensivät stabiilisti shMUT tai shPTEN haavoittui ja käsiteltiin 2 mM hydroksiurean. 48 h jälkeen liike yhtenäinen arkin poikki lineaarisen haavan (valkoinen viiva) arvioitiin faasikontrastimikroskopiassa. Käyrä oikealla havainnollistaa suhteellista kattama alue vaeltavien solujen arvioidaan 5 eri haavan kokeita per ehto käyttäen Image J ohjelmisto. Mittaviivat = 100 pm. B. Aktivoitu tasot GTP-sitoutuneen Ras tai Cdc42 analysoitiin G-LISA aktivaatiomääritys biokemia sarjat subkonfluenteista (SC) ja äskettäin konfluentteja (C) Caco-2/15 solut. C. Invasion solujen tutkittiin Matrigel päällystettyjä siirtoaltaat. 48 tunnin kuluttua, tunkeutuvat solut kiinnitettiin, värjättiin kristallivioletilla 1% ja laskettiin. D. aliyhtyvät shMUT ja shPTEN ilmentäviä Caco-2/15 solut hajotettiin ja kokonais-RNA eristettiin geenien ilmentymisen analysoitiin Q-PCR: t. Suhteellinen taso kunkin RNA laskettiin käyttämällä standardikäyrää menetelmä ja normalisoidaan vastaavat PDGB RNA tasolla. E. 2 x 10

6 lisääntyvissä Caco-2/15 solut ilmentävät shMUT tai shPTEN injektoitiin subkutaanisesti 5 nude-hiiriin kohti kunnossa. Kasvaimen paino arvioitiin 42 päivää injektion jälkeen. * P≤0.05, *** p≤0.005, tilastollisia eroja määritetään Studentin t-testiä.

Vaikutus PTEN vajauksen invaasio määritettiin myös käyttämällä BD BioCoat Matrigeliä hyökkäystä kammioita. Kuten kuviossa 3C on esitetty, Caco-2/15-soluja, jotka ilmentävät shPTEN selvästi esillä kasvoi invasiivisia kapasiteettia verrattuna shMUT ilmentävien solujen. Invasion ei koske vain jakautuminen solu-solu-liittymien ja lisääntynyt liikkuvuus kasvainsolujen, mutta myös polttovälin proteolyysin soluväliaineen. Kuten on esitetty kuviossa 3D, Q-PCR-analyysit paljastivat, että ekspressiotasot matriksin metalloproteinaasien 2 ja 9 (MMP2 ja MMP9), osteopontiinia (OPN) ja uPA (urokinaasityyppinen plasminogeenin aktivaattori) olivat merkittävästi säädellään ylöspäin shPTEN ilmentävien Caco- 2/15 soluja.

aiheuttavan kasvaimia Caco-2/15 solupopulaatioiden oli seuraava arvioitiin ihonalaisen injektion kylkeen nude-hiirten. Kuten kuviossa 3E, alas-säätely PTEN ilmentymisen Caco-2/15 solut vakavasti kasvattaneet kyky indusoida kasvaimiin in vivo.

Lopuksi tutkimme, PTEN vähennys Caco-2/15 solut on riittävä indusoimaan kasvaimen etäpesäkkeiden

in vivo

, käyttämällä kokeellisen metastaasin häntälaskimoon määrityksessä. Fox Chase SCID Beige hiiriä, joihin injektoitiin kontrolli tai PTEN-puutteellisia Caco-2/15-solujen häntälaskimoon ei onnistunut kehittämään etäpesäkkeitä jopa 60 päivää injektion jälkeen (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että PTEN downregulation ei riitä antamaan metastaattinen potentiaali hyvin erilaistunut CRC soluissa.

menetys PTEN ilmaisun stimuloi muuttoliike /invaasio, parantaa kasvaimen kasvua ja indusoi metastaattisen potentiaalin HCT116-solujen

in vivo

vaikutus PTEN hiljentäminen arvioitiin myös mikrosatelliittimerkki-epävakaa dedifferentoituneiden solulinja HCT116. Näissä soluissa, PTEN hiljentäminen johti myös parannettu fosfo-Akt (kuvio 4A), parannettu kapasiteetti muuttoliikkeen kun loukkaantumisesta (kuvio 4B) ja invaasiota (kuvio 4C), sen lisäksi, että liittyy merkittävä kasvu Rac aktiivisuuden (1,5 kertainen, p 0,005) ja OPN ilmentymistä (1,9-kertainen, p 0,005) (tuloksia ei ole esitetty). Huomattavaa on, että ilmentyminen MMP-2, MMP-9 ja uPA valvonta HCT116-soluja on jo huomattavasti koholla ja PTEN hiljentäminen ei edelleen parantaa mRNA-tasot näiden molekyylien (tuloksia ei ole esitetty). Tuumorigeenisyyden HCT116 solupopulaatioiden arvioitiin myös ihonalaisen injektion kylkeen nude-hiirten. Kuten kuviossa 4D, alas-säätely PTEN ilmentymisen HCT116-solujen määrä nousi niiden kyvystä indusoida kasvaimia

in vivo

.

. HCT116-solut infektoitiin joko yhdistelmä-lentiviruksien koodaavat shMUT tai shPTEN. Valinnan jälkeen infektoidut solut, jakautuvat solut lyysattiin ja proteiinin ilmentyminen analysoitiin Western blot. B. Left paneelit: Solujen morfologia analysoitiin faasikontrastimikroskopiassa klo alakonfluenssista. Oikea paneelit: Äskettäin yhtenäisiksi solut haavoittui ja käsiteltiin 2 mM hydroksiurean. 48 h jälkeen liike yhtenäinen arkin poikki lineaarisen haavan (valkoinen viiva) arvioitiin faasikontrastimikroskopiassa. Käyrä oikealla havainnollistaa suhteellista kattama alue vaeltavien solujen arvioidaan 5 eri haavan kokeita per ehto käyttäen Image J ohjelmisto. Mittaviivat = 100 pm. C. Invasion solujen tutkittiin Matrigel päällystettyjä siirtoaltaat. 48 tunnin kuluttua, tunkeutuvat solut kiinnitettiin, värjättiin kristallivioletilla 1% ja laskettiin. D. 2 x 10

6 lisääntyvien HCT116-solut ilmentävät shMUT tai shPTEN injektoitiin subkutaanisesti 5 nude-hiiriin kohti kunnossa. Kasvaimen paino arvioitiin 30 päivän kuluttua injektion. * Merkittävästi erilainen p≤0.05.

Lopuksi tutkimme, PTEN väheneminen HCT116-soluissa on riittävä indusoimaan kasvaimen etäpesäkkeiden

in vivo

, käyttämällä häntälaskimoon määrityksen.