Krooninen sairaus

tiivistelmä

Merkittävää edistystä on saavutettu kohti valaisemaan molekyylitason mekanismeja että taustalla rintasyöpä etenemisen; mutta paljon vähemmän tiedetään liittyvien solujen biofyysisestä piirteitä. Tämän vuoksi käytämme aikaa kulunut konfokaalimikroskopia tutkia vuorovaikutusta keskuudessa solun liikkuvuus, kolmiulotteinen (3D) matriisi jäykkyys, matriisi arkkitehtuuri, ja muuttamassa potentiaali on rintaepiteelisolulinja solu (MEC) syövän etenemisessä sarjassa. Käytämme hyvin tunnettu rintasyövän etenemisen malli, jossa ihmisestä peräisin MCF10A MEC yli-ilmentävät joko ErbB2, 14-3-3ζ, tai molemmat ErbB2 ja 14-3-3ζ, tyhjällä vektorilla kontrollina. Solun liikkuvuus määritykset osoittivat, että MEC: illa, jotka yliekspressoivat ErbB2 yksinään osoitti huomattavan suuri muuttoliike nopeuksilla, kun viljellään huipulla kaksiulotteinen (2D) matriiseja, kun taas yli-ilmentyminen 14-3-3ζ yksinään useimmissa tukahdutetaan maahanmuuton huipulla 2D matriiseja (verrattuna ei-transformoituja MEC: illa). Tuloksemme osoittavat myös, että co-yliekspressio 14-3-3ζ ja ErbB2 proteiineja helpottaa solun vaeltavia kapasiteettia 3D matriiseja, mikä näkyy solujen vaeltamiseen nopeudella. Lisäksi 3D-matriiseja riittävä jäykkyys voi merkittävästi haitata leviämiskyky osittain transformoitujen solujen, mutta kasvoi 3D matriisi jäykkyys on pienempi vaikutus aggressiivista vaeltavia käytös näytteillä täysin transformoituja soluja, jotka samanaikaisesti yli-ilmentävät sekä ErbB2 ja 14-3-3ζ. Lopuksi, tämä tutkimus osoittaa, että MEC jolla osittaista tai kokonaista muuntamiseen potentiaalin, ne yli-ilmentävät ErbB2 yksin näyttää suurinta herkkyyttä solun muuttonopeus matriisin arkkitehtuuri, kun taas ne, jotka yli-ilmentävät 14-3-3ζ yksin näyttely vähiten herkkyyttä matriisiin arkkitehtuuriin. Koska nykyinen tietämys rintasyövän mechanobiology nämä havainnot yleinen viittaavat siihen, että solun liikkuvuus säännellään monimutkainen vuorovaikutus matriisin mekaniikka ja muuttaa mahdollisia.

Citation: Baker EL, Srivastava J, Yu D, BONNECAZE RT, Zaman MH (2011) Cancer Cell Migration: Integroitu roolit Matrix Mechanics ja Transforming Potential. PLoS ONE 6 (5): e20355. doi: 10,1371 /journal.pone.0020355

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 09 helmikuu 2011; Hyväksytty: 19 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 27, 2011

Copyright: © 2011 Baker et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli mahdollista, että United Negro College Fund (UNCF) /Merck Graduate Science Research Väitöskirja Fellowship ELB Hyväntekeväisyys koulutusorganisaatio (PEO) Scholar Award ELB, Charles Tate Foundation UT Seed Grant on MHZ ja DY, ja National Institutes of Health rahoitus (1R01CA132633) ja MHZ. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suurin osa rintasyövän liittyvien kuolemien johtuvat etäpesäkkeitä; Näin ymmärtäminen vuorovaikutus solun microenvironment ja rintasyöpä metastaattisen potentiaali on erittäin tärkeää kehittää tehokkaita hoitoja tähän tautiin. Merkittävää edistystä on saavutettu kohti paljastavia molekyylitason mekanismeja, jotka ovat pohjana rintasyövän eteneminen [1], [2]; kuitenkin, kvantitatiivinen luonnehdinta liittyvien solujen biofyysisestä määritteitä on edelleen kesken. Pohjimmiltaan etäpesäke etenee kautta migraation ja invaasion syöpäsolujen muuttuvin soluväliaineen (ECM) ympäristöissä, ja tutkimukset ovat osoittaneet, että solujen vaeltaminen on todellakin herkkä matrix mekaanisia ominaisuuksia [3], [4], [5]. Silti järjestelmien tason välisiä suhteita matriisi mekaniikka, sairauden etenemisen ja soluliikkuvuus rintasyövässä ei ymmärretä hyvin, etenkin kun kyse on fysiologisesti relevantti kolmiulotteisia (3D) matriisi ympäristöissä.

Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana , avain rintasyöpä biomarkkerit on tunnistettu ja liittyvät eri vaiheiden taudin. Kaksi merkittävää tekijää ovat ErbB2 (HER2 /neu) ja 14-3-3ζ proteiineja, joiden kummankin yli-ilmentyminen on korreloitu huonon kliinisen ennusteita rintasyöpäpotilaiden [6], [7]. ErbB2 ja 14-3-3ζ on samalla osoitettu aiheuttavan solujen ominaisuuksia in vitro, jotka ovat verrattavissa kliinistä esityksiä. ErbB2 on transmembraaninen reseptori tyrosiinikinaasin epidermaalisen kasvutekijän reseptorin perheen proteiinien ja on mukana useita signalointireittejä, jotka moduloivat solun kasvua, erilaistumista, apoptoosia, ja muut tärkeät soluprosessien [8]. Vastaavasti MEC jotka ovat suunniteltu yliekspressoimaan ErbB2 on osoitettu näytteille liikakasvu ja luminal täyttämällä 3D kulttuuri, joskaan ei täysin transformaatio ja hyökkäys [9], [10]. ErbB2 on epäilemättä yksi eniten tutkittu molekyylien alalla rintasyövän [11] ja on kriittinen tavoite lääkekehitykseen. Itse asiassa, kun otetaan huomioon sen kyky resistenssiä tiettyjen syöpien hoidossa ja sen ennusteen arvioinnissa, määrittämällä sen asema suhteessa äskettäin diagnosoitu rintasyöpä tapauksista on tullut normaali käytäntö [12]. On silmiinpistävää, ErbB2-proteiinia yli-ilmennetään yli 50% alkuvaiheessa ei-invasiivisia rintasyövistä (duktaalikarsinooma in situ, DCIS) [13]; vielä, se yliekspressoituu vain noin 25% myöhemmin invasiivisen ja metastaattisen rintasyöpiä [7]. Selitys näistä näennäisesti epäjohdonmukaisia ​​ErbB2 ekspressioprofiileja on välttivät tutkijoita mennessä; kuitenkin, tulokset ilmoitetaan tässä viittaavat siihen, että tämä ilmiö voidaan selittää osittain jonka rintarauhasen epiteelisolujen (MEC) herkkyys matriisi arkkitehtuuriin.

14-3-3ζ proteiini on osa suurempaa perheen seitsemän 14- 3-3 säätelyproteiineja, jotka ovat laajasti ilmaistaan ​​ja osallistuvat erilaisiin solujen homeostaattista prosesseja, mukaan lukien yleinen solun eloonjäämisen /anti-apoptoottiset mekanismi [14]. On osoitettu, että yli-ilmentyminen 14-3-3ζ annetaan MEC 3D viljelmässä on merkittävä vastus anoikis [15] (tyyppi apoptoosin, joka tapahtuu, kun epiteelisolujen irrottaa solunulkoisia ligandeja), joka edistää luminaalisen täyttö- ja ajaa MEC: t kohti muutos [16]. Yliekspressio 14-3-3ζ on myös osoitettu indusoivan merkittäviä morfologisia ominaisuuksia epiteelin-mesenkymaalitransitioon, jotka ovat tunnusomaisia ​​etenemisen kohti invasiivisen fenotyypin [9], [15], [17]. Lisäksi analyysit potilaan koepaloja osoittavat, että yli 40% metastasoituneen rintasyövistä yli-ilmentää tätä proteiinia [6]. Huolimatta kykyä suoda ei-transformoitujen solujen onkogeenisella ominaisuuksia, yliekspressio ei ErbB2 eikä 14-3-3ζ yksinään riittää antamaan täydellisen muodonmuutoksen in vitro. Kuitenkin niiden osuuskunta yli-ilmentyminen on osoitettu edistävän etenemistä ei-invasiivisen karsinooman ja kohdunkaulan syöpä in vitro ja liittyy myös etenemiseen DCIS invasiivisia ja metastaattisen rintasyövän potilailla [9].

Koska aiemmin vahvistetut korrelaatiot rintasyövän biomarkkereita ja metastasointiin sekä nykyinen tietämys alustan riippuvan solun liikkuvuus ja soluväliaineen vuorovaikutuksia, seuraavat peruskysymyksiä joihin ajan yksittäisten MEC suhteen matriisi mekaniikka: (1) Onko MEC motiliteettiin reagoivien 3D matriisi jäykkyys? (2) Onko tämä reagointikykyä liittyvät muuttamassa potentiaalia? Ja (3), on olemassa suhde soluliikkuvuus ja muuttaa mahdollisia, annetaan määrätietoinen matriisi arkkitehtuuri? Tässä tutkimuksessa olemme määrällisesti tutki näitä kysymyksiä käyttämällä aikaa kulunut konfokaalimikroskopia vaikutuksen tutkimiseksi matriisin jäykkyys ja arkkitehtuurin siirtonopeutta ja pysyvyys yksittäisten MEC jotka viljellään huipulla 2D matriisit ja ne, jotka ovat upotettuja 3D-matriiseja erilaisten elastinen moduli. Tutkimme ihmisperäinen MEC vaihtelevaa transformoivan potentiaalin suhteen matriisien muotoiltu natiivi tyypin I kollageenia, joka on ensisijainen rakenteellinen osa rintarauhasen strooman. Tutkimuksemme tarjota uusia oivalluksia rintasyövän mechanobiology osoittamalla, että matriisi jäykkyys ja arkkitehtuurin pari muuttamassa potentiaalia hallitsemaan muuttavia ominaisuuksia MEC: illa.

Tulokset

Jotta tutkia suhteita rintasyövän muuttamassa potentiaali ja soluliikkuvuus suhteen matriisi mekaniikka, analysoimme hyvin tunnettu syövän etenemistä sarja joka on saatu ei-transformoitu, ihmisperäinen MCF10A solulinja. Tutkimme neljä MCF10A alilinjat, jonka laajuus muuttamassa potentiaali on ominaista niiden kasvua piirteet ja morfologiset ominaisuudet muodostettaessa acinar rakenteiden 3D kulttuuri [9]. Kuten aiemmin on kuvattu [9], [17] alalinjoja (Fig. 1

) koostui [1] 10A.vec-ei-transformoitu ohjaus solulinja, [2] 10A.ErbB2-a hyperplastinen, apoptoosi-resistenttejä osittain transformoitu solulinja, joka yli-ilmentää ErbB2: ta, [3] 10A.14-3-3ζ-a depolarisoitu, apoptoosin kestävä, ja morfologisesti epänormaali osittain transformoitu solulinja, joka yli-ilmentää 14-3-3ζ, ja [4] 10A.ErbB2.ζ-invasiivinen, täysin transformoitua solulinjaa että overepxresses sekä ErbB2 ja 14-3-3ζ.

(

) Duktaalinen /yksilohkoisen poikkileikkaus kuvaus MCF10A rintojen syövän etenemisessä sarja: 10A.vec (ei-transformoituja), 10A.ErbB2 (osittain transformoitu), 10A.14-3-3ζ (osittain transformoitu), ja 10A.ErbB2.ζ (muuttui täysin). (

B

) Keskiarvo solumigraation nopeus

S

huipulla 2D matriiseja; p-arvot ovat suhteessa

S

ja 10A.vec soluja. (

C

) Cell väestö pysyvyys ajan

P

huipulla 2D matriiseja (keskiarvo

R

= 0,87). Kaikki p-arvot (*, p≤0.05; **, p≤0.01; ***, p≤0.001) määritetään

t

-testaukset varten parittomia näytteitä.

vaikutus muuttamassa potentiaalia soluliikkuvuus huipulla 2D matriiseja

soluliikkuvuus tutkittiin ensin suhteen 2D matriisi arkkitehtuuri, joka on analoginen MEC kerrokseen että linjat sisäpinta tiehyen tyvikalvon alkuvaiheessa invaasion taustalla kollageeni I-rikas strooman in vivo (Fig. 1

). Tässä ympäristössä, MEC yliekspressoivat ErbB2 yksin muuttivat nopein keskimääräinen siirtonopeutta

S

(Fig. 1

B

). Ei-transformoitujen solujen osoitti toiseksi korkein liikkuvuutta, jonka jälkeen alalinjoja yli-ilmentäviä 14-3-3ζ (Fig. 1

B

). Kaksiulotteinen motiliteettia kuviot osittain muunnetaan ja täysin transformoidut solut ovat myös yhdenmukaisia ​​transwell motiliteetin käyttäytymistä, joka on raportoitu aikaisemmin: 10A.ErbB2 solut siirretään, jolla on korkein nopeus, jota seuraa 10A.ErbB2.ζ ja sitten 10A.14-3 -3ζ [9]. Pysyvyys aika

P

(saatu käyränsovitusmenetelmiä hellittämättömään satunnaispolkumallin [18], katso materiaalit ja menetelmät) ei-transformoitujen solujen oli suurempi kuin kaikkien alilinjat joilla muuttamassa potentiaali (Fig. 1

C

).

vaikutus muuttamassa potentiaalia soluliikkuvuus sisällä 3D-matriiseja

Seuraavaksi soluliikkuvuus arvioitiin suhteessa 3D matriisi arkkitehtuuri, joka on analoginen in vivo ympäristö, jossa geenimuunnelluille (osittain tai täysin transformoidut solut) ovat tunkeutuneet paikallisiin tyvikalvon ja tunkeutunut taustalla stroman (Fig. 1

). Soluliikkuvuus määritykset osoittivat, että muuttamassa potentiaali oli huomattava vaikutus muuttonopeus

S

sisällä suhteellisen yhteensopiva 3D matriiseja (Fig. 2

A

jäykkyys

G

c

= 104 Pa). Non-transformoituja MEC (10A.vec) oli hitainta keskinopeus, kun taas täysin muuttaneet MEC (10A.ErbB2.ζ) siirtyi nopeimmalla (Fig. 2

B

). MEC yliekspressoivat ErbB2 tai 14-3-3ζ yksinään, vaikka osittain muuttaneet, eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia liikkuvuudessa suhteessa 10A.vec soluihin (Fig. 2

B

) compliant 3D matriiseja. Lisäksi muuttonopeus

S

compliant matriisit korreloi negatiivisesti pallomaisuuden solumorfologia index

Ψ

että olemme aiemmin raportoitu näistä alilinjat viljeltynä samoissa 3D matriiseja [17]. Kuten on esitetty kuviossa. 2

B

(upotus) [17],

Ψ

pienenee

S

lisää, mukaan MEC muutosta profiiliin. Compliant matriisit, solupopulaatio pysyvyys ajan

P

oli pienin täysin invasiivisia soluja (Fig. 2

E

).

(

) Skannaus nimikroskooppikuvia yhteensopiva (104 Pa) ja jäykkä (391 Pa) 3D-matriiseja; mittakaavajana on 2 pm. (

B

) Keskiarvo solumigraation nopeus

S

compliant 3D matriiseja. (Upotus) solun pallomaisuuden

Ψ

otettuna Baker et al. [17]; p-arvot ovat suhteessa

S

(Ja

Ψ

) on 10A.vec soluja. (

C

) Mean solumigraation nopeus

S

in jäykkä 3D matriiseja; p-arvot ovat suhteessa

S

ja 10A.vec soluja. (

D

) Prosenttia väheneminen

S

Solujen sisällä yhteensopiva matriisit suhteessa soluihin jäykkä matriiseja. P-arvot näytetään mustana heijastaa eroa

S

solujen välillä yhteensopiva matriisit ja samalla solujen jäykkä matriiseja; p-arvot punaisella heijastaa eroa%: n lasku

S

keskuudessa alalinjoja. (

E

) Cell väestö pysyvyys ajan

P

compliant ja jäykkä 3D matriisit (keskiarvo

R

= 0,87). (

F

) Prosenttia väheneminen

S

Solujen huipulla 2D matriiseja suhteessa solujen yhteensopiva 3D matriiseja. P-arvot näytetään mustana heijastaa eroa

S

Solujen välinen huipulla 2D matriiseja ja samaan solujen yhteensopiva 3D matriiseja; p-arvot punaisella heijastaa eroa%: n lasku

S

keskuudessa alalinjoja. Kaikki p-arvot (*, p≤0.05; **, p≤0.01; ***, p≤0.001) määritetään

t

-testaukset varten parittomia näytteitä.

vaikutus 3D matriisi jäykkyys soluliikkuvuus

suhteellisen jäykempi 3D matriiseja (Fig. 2

, jäykkyys

G

c

= 391 Pa ), soluliikkuvuus määritykset paljastivat käyttäytymistä merkittävästi erilainen kuin havaitut yhteensopiva matriiseja. Vuonna jäykempi matriisi ympäristö, täysin muuttaneet MEC siirtyneet nopeammin kuin kaikki muut alilinjat (Fig. 2

C

). Kuitenkin osittain transformoiduissa soluissa (10A.ErbB2 ja 10A.14-3-3ζ) muuttivat selvästi hitaampaa kuin sekä ei-transformoituja ja täysin transformoidut solut. Siirtymä soluliikkuvuus välillä yhteensopiva ja jäykkä matriisit on edelleen näytetään prosentin lasku siirtonopeutta, mukaan muunnos profiilin (Fig. 2

D

); Tämä kuvaus osoittaa, että joukossa alilinjat jonka siirtonopeutta oli herkkä 3D matriisi jäykkyys, motiliteettia muuttui täysin solujen vähiten vaikutti kasvu matriisiin jäykkyys. Verrattuna soluihin yhteensopiva 3D matriiseja, solu pysyvyys aika

P

jäykkä 3D matriiseja (Fig. 2

E

) oli alhaisempi soluja hallussaan osittaista tai kokonaista muuntamiseen potentiaali, mutta huomattavasti korkeammat ei-transformoidut solut (10A.vec).

Integrated vaikutusten matriisin arkkitehtuuri, matriisi jäykkyys, ja muuttaa potentiaali soluliikkuvuus

Verrattaessa muuttoliike nopeudet solujen huipulla 2D matriiseja niihin upotettu samankaltaisia 3D-matriiseja osoittaa, että matriisi arkkitehtuuri on merkittävä vaikutus solun liikkuvuus. Kuva 2

F

kuvaa tätä muutosta liikkuvuutta kuin prosentin lasku nopeudella solujen huipulla 2D matriiseja verrattuna niihin kuuluvat yhteensopiva (104 Pa) 3D matriiseja. Todellakin, potevilla 3D matriiseihin pienenee merkittävästi kaikkien solujen alilinjat tutkittu; kuitenkin, että alilinjat joilla osittaista tai kokonaista muuntamiseen potentiaali, solut yli-ilmentävät ErbB2 yksinään (10A.ErbB2) osoitti suurinta herkkyyttä matriisiin arkkitehtuuriin. 10A.ErbB2 alalinja esiintyi huomattava 94% lasku (15-kertainen pieneneminen) solussa siirtonopeutta, kun 3D-matriiseja verrattuna, että kun nämä solut liitetty 2D matriiseja.

Examination of 3D Windrose tonttien ( kuva 3) on laaja, yhteenveto näkymä vaeltavien merkin näytteillä tämän MCF10A etenemistä sarja (rivit edustavat matriisi kunnossa, kun taas pylväät edustavat alalinjan).

XY

suuntainen confocal kuvia (Fig. 4) osoittavat myös tyypillinen edustaja solujen ja morfologisia ominaisuuksia näytteillä kutakin neljää alilinjat, jossa voi olla jonkin yhdistyksen muuttaviin Tässä esitetyt tiedot sekä solujen jäykkyys havaintoja, olemme raportoineet aiemmin [17]. MEC yli-ilmentävät 14-3-3ζ yksin näytteillä putkimainen kohoumat (Fig. 4, vihreät nuolet) [19] kaikissa matriisi olosuhteissa, kun taas yhteistyössä yli-ilmentävät sekä ErbB2 ja 14-3-3ζ näytteillä ohut, tankomainen laajennukset ( Fig. 4, keltainen karaattia) kaikille matriisi olosuhteissa. Yli-ilmentäviä soluja ErbB2 yksin oli minimaaliset tankomainen laajennuksia ja vain silloin, kun upotettu suhteellisen jäykkiä (391 Pa) matriiseja, kun taas loput MEC alilinjat näkyy samanlainen astetta pullistuma vaatimustenmukaiselle ja jäykkä matriiseja. Nopein vaeltavien solujen 2D matriiseja (10A.vec ja 10A.ErbB2) osoitti levymäisten solujen prosesseja tässä ympäristössä (Fig. 4, sininen suluissa).

Ylärivi listoja solulinja; vasemmassa sarakkeessa luetellaan matriisi kunnossa. Solut 2D matriiseja esillä mahdollisimman suurta liikkuvuutta, jonka jälkeen solut yhteensopiva (104 Pa) 3D matriisit ja sitten soluja jäykkä (391 Pa) 3D matriiseja.

Ylärivi listoja solulinja; vasemmassa sarakkeessa luetellaan matriisi kunnossa. Keltainen karaattia osoittavat ohut, sauvamainen solu prosesseja. Vihreät nuolet osoittavat putkimainen cellular ulokkeita. Blue Suluissa arkkimaisen solujen ulokkeita.

Keskustelu

soluliikkuvuus voidaan vaikuttaa useiden parametrien, mukaan lukien solunulkoiset kemiallinen kaltevuudet [20], matriisi mekaaniset ominaisuudet [4] , matriisi hajoaminen [21], solunsisäinen contractility [5], ja solujen adheesiivisuudessa [22]. Yhä, syöpäsolut ovat tullut keskittyä tutkimuksia, tutkia vaikutusta solunulkoisen ympäristön solujen homeostaasin [4], [23], solu viskoelastisuus- [24], [25], ja solun liikkuvuus. Vaikka merkittävää edistystä on saavutettu paljastamiseksi joitakin molekyylitason mekanismeja ja signalointireitteihin että taustalla rinta- ja muissa syövissä [8], [14], paljon vähemmän tiedetään liittyvien solujen biofyysisestä määritteitä. Jo pitkään on vahvistettu, että rintasyöpä etäpesäke on pohjimmiltaan suorittaa solun siirtymistä ensisijainen kasvain massa läpi taustalla strooman ja että rinta kollageeni tiheys korreloi rintasyövän eteneminen [26]. Lisäksi syöpäsolu vaeltavien kyky voidaan vaikuttaa jäykkyys ECM [5]. Kuitenkin suhde ulkoisen solujen mekaanista ympäristöä ja motiliteettia rintasyöpäsoluissa ei ymmärretä. Vuorovaikutus näiden parametrien lisäksi sekoitti vaiheessa rintasyövän eteneminen, ja voi olla myös suhteessa solunsisäisen mekaaniset ominaisuudet [17]. Tutkiakseen vuorovaikutusta keskuudessa matriisi mekaniikka, solun liikkuvuus, ja muuttamassa potentiaalia rintasyövän, olemme käytetty aika-rauennut konfokaalimikroskopia mitata siirtonopeutta ja pysyvyys MEC jotka on liitetty 2D matriisit ja ne, jotka ovat upotettu 3D matriisit, molemmat koostuvat natiivin tyypin I kollageeni. Tarkastelemalla rintasyöpä etenemisen sarjan alilinjat jotka ovat peräisin yhdestä MEC vanhempi linja, voimme suoraan vertailla kinesis solujen hallussaan vaihteleva muuttamassa potentiaalia.

in vivo solunulkoisen mikroympäristössä on heterogeeninen väliaineessa, joka koostuu useammasta osasta, jossa suhteellinen tasapaino ja merkitys näiden komponenttien laajuudesta riippuen syövän etenemisen. Tässä tutkimuksessa olemme probed motiliteettia MEC, joilla on kyky vapaasti liikkua niiden ECM. Tapaukselle 3D matriisien, tämä on fysiologisesti eniten verrattavissa yksittäisiä MEC että ovat tunkeutuneet niiden paikalliset duktaalisia tyvikalvon ja voivat siirtyä sisällä oleva stroman (Fig. 1

); tapaukselle 2D matriiseja, tämä on kaikkein analoginen varhaisessa vaiheessa syöpäsolut voivat osoittaa lisääntynyttä motiliteettia pitkin sisemmän duktaaliseen tyvikalvon alkuvaiheessa invaasion taustalla kollageeni I-rikas avanne (Fig. 1

). Tutkimme yksittäisistä soluista, jotka ovat kokonaan kytketty matriisin (mutta irrallaan muut solut), jotta kokeellisesti kontrolloida, missä määrin ja tyyppi solun pinnan kiinnityksen; Siten MEC käsitellä tässä muodossa soluväliainekonstruktissa liitetiedostoja β1 integriinien [27].

Tutkitaan solumigraation suhteen sekä 2D- että 3D-matriiseja tarjoaa laajan näkökulman MEC liikkuvuutta (Fig. 3). Yliekspressio ErbB2 on osoitettu aiemmin suoda MEC lisääntynyt proliferatiivista kapasiteettia [10], ja se on myös liitetty kliinisesti varhaisvaiheen rintasyöpä (DCIS) [9]. Itse asiassa, matriisi ympäristön alkuvaiheen rintasyövistä (DCIS) lähemmin muistuttaa 2D matriisi arkkitehtuuri kuin se 3D matriisi ympäristössä (Fig. 1

). Viljeltynä huipulla 2D matriiseja, MEC yliekspressoivat ErbB2 yksin siirtynyt nopeimmalla (Fig. 1

B

); ei-transformoitujen solujen osoitti toiseksi korkein liikkuvuutta, jonka jälkeen alalinjoja yli-ilmentäviä 14-3-3ζ (Fig. 1

B

). Merkittävästi vähentyneellä siirtymisnopeudesta 14-3-3ζ yli-ilmentäviä alalinjoja suhteessa kahden jäljellä alalinjoja viittaa siihen, että 14-3-3ζ-välitteinen downregulation E-kadheriinin [9], [15], voidaan tuottaa vähemmässä vaikutus solujen liikkuvuuteen huipulla 2D matriiseja kuin MEC että tehtävänä on navigoit 3D matriisi ympäristössä. Tämä taas korostaa monimutkainen vuorovaikutus muuttamassa potentiaali ja matriisi mekaniikka säätelevät solun liikkuvuus. Korkea pysyvyys ei-transformoitujen solujen suhteessa jäljellä geenimuunnelluille alilinjat (Fig. 1

C

) osoittaa, että muuttamalla potentiaali voi myöntää MEC kanssa ymmärtäväisesti 2D matriisi topografia, mikä näkyisi satunnaisesti muuttuvassa solussa liikeradat verrattuna enemmän suunnattu solun liikkumista ei-transformoitujen solujen. Lisääntynyt herkkyys matrix topografisten vihjeet olisi edullista solut, jotka pyrkivät hyökätä paikalliseen tyvikalvon.

Tuloksemme viittaavat siihen, että sisällä suhteellisen yhteensopiva 3D matriiseja (104 Pa), muuttaen potentiaali yhdessä morfologisten piirteitä ovat hallitsevat tekijät, jotka vaikuttavat solun liikkuvuus. Kuten on esitetty kuviossa. 2

B

, täysin transformoidut solut (10A.ErbB2.ζ) siirtyi nopeimmalla

S

tässä ympäristössä, jonka jälkeen morfologialtaan muuttuneita 14-3-3ζ yli-ilmentäviä soluja, ja sitten

vertailu MEC potevilla yhteensopiva matriiseja kuin MEC tiukentavasti matriiseihin viittaa siihen, että solu muuttavien kyky ei ole pelkästään vaikutus muuttamassa potentiaalin; vaan se säätelee tasapaino luontainen solun biofysikaalisten ominaisuuksien ohella matriisi mekaniikka. Lievä parannus ohut, sauvamainen laajennuksia näytteillä 10A.ErbB2 soluja jäykemmät matriiseja (Fig. 4), vaikka hienovarainen, saa olla yhdistyksen korkea jäykkyys tunnistusominaisuus että olemme aiemmin raportoitu tämän alalinjan [17]. Vaikka morfologisia ominaisuuksia tietyn alalinjan olivat samanlaisia ​​3D matriiseja eri jäykkyys (Fig. 4), järjestelmä laajuinen muuttonopeus profiilit osoittavat selvästi kuvioita suhteessa matrix jäykkyys (Fig. 2

B

ja

C

ja Fig. 3). Molemmissa matriisi ympäristöissä, ei-transformoituja MEC liikkui hitaammin täysin muuttaneet MEC, joka liikkui nopein nopeuksilla. Kuitenkin jäykempi matriiseja (391 Pa), osittain transformoiduissa soluissa (10A.ErbB2 ja 10A.14-3-3ζ) muuttivat huomattavasti hitaammin kuin ei-transformoitujen solujen. Lisääntynyt matriisi jäykkyys johti vähentynyt leviämiskyky täysin transformoitujen solujen, mutta tämä vaikutus oli vielä selvempi osittain transformoituja soluja (Fig. 2

D

). Nämä tulokset viittaavat siihen, että riittävän tiheästi riippuva 3D matriisi jäykkyys voi olla rooli merkittävästi haittaavat leviämiskyky osittain transformoitujen solujen; kuitenkin, tämä lisäys 3D matriisissa jäykkyys ei ehkä runsaasti voittaa aggressiivista käyttäytymistä näytteillä täysin invasiivisia soluja, mistä on osoituksena vain kohtalainen väheneminen muuttoliikkeen nopeus 10A.ErbB2.ζ soluja (Fig. 2

D

). Tulokset meidän ennen tutkimuksen näistä alilinjat osoittivat, että jäykempi matriiseja, 10A.ErbB2 soluilla korkein solunsisäisen jäykkyyttä, kun taas muuttui täysin 10A.ErbB2.ζ soluilla kohtalainen jäykkyys, ja 10A.14-3-3ζ solut näytteille suhteellisen alhainen jäykkyys [17]. Kaikkiaan ottaen huomioon vallitsevat liikkuvuuden data yhdessä tulokset aiempien tutkimusten ehdottaa, että MEC muuttoliike 3D ympäristöissä etenee optimaalinen tasapaino geneettisissä muutos profiilin, solunsisäinen jäykkyys, edullisia morfologisia ominaisuuksia ja matriisi jäykkyys. Niinpä lisäys solujen vaeltavia nopeudella, joka voi muuten aiheuttaa osittaista tai täydellistä transformaatio voidaan lieventää osittain tiheyden riippuva matriisi jäykkyys.

Lopullinen analyysi Tämän tutkimuksen (Fig. 2

F

) esittelee erittäin provosoiva tulos, kun otetaan huomioon, että ErbB2-onkogeenin havaitaan harvemmin in invasiivisia ja metastasoituneen rintasyöpiä kuin se on alkuvaiheessa rintasyöpiä. Itse asiassa, esiintyvyys ErbB2 yli-ilmentymisen invasiivisen ja metastaattisen rintasyövän on vain

puolet

että varhaisen vaiheen syöpiä [9], joka on ollut hämmentävä ilmiö. Tulokset meidän motiliteetti määritysten mukaan siirtymä matriisiin arkkitehtuuri voi liittyä tähän käyttäytymiseen. Kun MEC siirtyminen ei-invasiivisia varhaisessa vaiheessa syöpä invasiivista ja sitten metastaattinen, ne siirtyvät huipulla 2D tyvikalvon pinnalle sisällä ympäröivän 3D strooman ja siten kokea muutos matriisiin arkkitehtuurin (Fig. 1

). Tässä tutkimuksessa, motiliteettia 10A.ErbB2 solujen esittää suurimman herkkyyden muutosta matriisin arkkitehtuuri, verrattuna muihin alalinjoja, joilla on osittainen tai täydellinen transformoivan potentiaalin (Fig. 2

F

). Tästä seuraa, että solut sillä on merkitsevästi vähentynyt strooman leviämiskyky voi olla vähemmän todennäköisesti täysin hyökätä paikalliseen rajoja ja edelleen kulkea ympäröivän strooman myöhemmin ilmetä metastasoitunut rintasyöpä. On myös huomattava, että yli-ilmentyminen 14-3-3ζ merkittävästi tukahdutti 2D muuttoliike (Fig. 1

B

), kun taas synergistisesti parantaa 3D siirtyminen, kun sitä ErbB2 myös yli-ilmentyy (Fig. 2

B

ja

C

). Näin ollen, motiliteettia yliekspressoivien solujen 14-3-3ζ yksinään osoitti vähiten herkkyys matriisin arkkitehtuuri, verrattuna 10A.ErbB2 ja 10A. ErbB2.ζ solut (Fig. 2

F

).

Yhteenvetona esillä oleva tutkimus tarjoaa uusia oivalluksia rintasyövän motiliteettia osoittamalla, että muuttamalla mahdollisia parit matriisi jäykkyys ja arkkitehtuurin vaikuttamaan siirtonopeutta ja pysyvyys MEC: illa. Lukuisat Ennakkotutkimukset ovat merkittävästi vaikuttaneet nykyisen ymmärrystä tutkimalla ErbB2 ja 14-3-3ζ välittämän vaikutuksista solunsisäiseen jäykkyys [17], MEC potevilla liukoinen kemiallinen kaltevuudet [20], syöpäsolun muuttoliikkeen suhteen ligandin saatavuus [5] ja liikkuvuuteen aiheuttama matriisi remodeling [28]. Käyttämällä aika-kulunut kuvantamisen, olemme lisänneet tähän tietoon suoraan migraation mittaamiseksi nopeutta MEC sekä viljeltyjen huipulla 2D matriiseja ja upotettu 3D matriiseja. Väliset suhteet rintasyövän soluliikkuvuus ja alustan ominaisuudet ovat monimutkaisia; lisäselvityksiä näistä yhteyksistä voi syntyä ylimääräisiä tulevissa tutkimuksissa, joissa tarkastellaan vaikutuksia 2D matriisi jäykkyys ja matriisi proteiinia perustuslain motiliteettia alilinjat käsitellä tässä. Selkeämpi käsitys MEC-matriisin vuorovaikutuksia omistaa laaja lupauksen, jotka voivat lopulta ohjata kehitystä kohdennettuja hoitomuotojen ja syöpää keskittynyt translaatiotutkimuksen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

motiliteetin määritykset suoritettiin stabiileja alalinjoja, jotka muodostetaan kuten aiemmin on kuvattu [9]: n ei-syöpä, ihmisperäinen MCF10A MEC line (tri Robert Pauleyn on Karmonos Cancer Institute, Detroit, MI). Solulinjoja ylläpidettiin 2D yksikerrosviljelmään DMEM /F12 kasvualustojen [29] sisällä kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2 asti kokeilua.

Kollageeni matriisi valmistus ja karakterisointi

Kaksiulotteinen matriiseja luotiin laimentamalla korkea pitoisuus Tyyppi 1 kollageenia 2 mg /ml käyttäen 20 ui etanolia-dialized 2,0 um karboksyloidulla, keltainen-vihreä fluoresoiva polystyreeni merkkiaine helmiä (Molecular Probes, Carlsbad, CA) (noin 2% kiinteää ainetta), ja loput 0,01 M HCl: ää; 1,5 ml liuosta, kerrostettiin sitten kaivoon 35 mm: n lasin pohjalle astian ja annettiin inkuboitua huoneen lämpötilassa 1 tunti. Tämän ajan jälkeen liuos imettiin, jättäen vain helmi-kyllästetty kollageenin takki, joka oli tarttunut lasipohja (kts. S1

). Astiat huuhdottiin sitten kahdesti PBS: llä ja säilytettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 45 minuutin ajan, kunnes fluoresoivasti leimatut solut talletetaan lautasen.

kolmiulotteisen matriiseja, jotka on formuloitu suuren pitoisuuden Tyyppi I kollageenin (BD Biosciences, San Jose, CA), joka oli laimennettu kaksi pitoisuudet 2 ja 4 mg /ml. Yhtä suureen osaan kollageenin ja neutraloivat liuosta (100 mM Hepes 2X PBS: ssä, pH 7,3) sekoitettiin 20 ui helmisuspensiota ja tasapaino 5 x 10

5 fluoresoivasti leimattujen solujen suspendoitiin elatusaineeseen saavuttaa lopullinen konsentraatio [ ,,,0],30] (ks. S1

B

). Jokainen matriisi-liuosta (1 ml) kerrostettiin sitten pinnan poikki 35 mm: n lasin pohja astia (MatTek, Ashland, MA). Matrix liuosten annettiin geeliytyä 90 minuutin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2, johon 1,5 ml kasvualustaa talletettu huipulla 3D matriisit tarjota solujen riittävästi ravinteita myöhemmän 4,5 h inkuboinnin aikana 37 ° C: ° C, 5% CO

2. Matrix jäykkyys mitattiin kartio ja levy rheometry ja määrälliset irtotavarana leikkaus- kimmomoduuli kollageenigeelin

G

c

, joka ilmoitetaan 104 ja 391 Pa 3D Type I kollageenin geelejä pitoisuus 2 ja 4 mg /ml, vastaavasti, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Tässä käsikirjoitus, matriisit moduuli 104 Pa kutsutaan suhteellisen yhteensopivia, kun taas moduuli 391 Pa on kuvattu suhteellisen jäykkä.