Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Poistettu in maksasyövän 1 (DLC1) on Rho GTPaasia aktivoiva proteiini (RhoGAP) usein poistetaan ja ali-ilmentynyt maksasolukarsinoomassa (HCC) sekä muissa syövät. Viimeaikaiset riippumattomissa tutkimuksissa on osoitettu vuorovaikutuksesta DLC1 jäsenten kanssa tensin keskipiste Adhesion Protein perheen Src Homologia 2 (SH2) domain-riippuvainen mekanismi. DLC1 ja tensins vuorovaikutuksessa ja yhteistyössä paikantuvat on pistemäinen rakenteita polttovälin kiinnikkeistä. Kuitenkin mekanismit vuorovaikutusta DLC1 ja eri tensins pysyvät kiistelty.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käytimme samanaikainen immunosaostus määritys tunnistaa aiemmin pimeiltä sitoutumiskohdan 375-385 of DLC1 että pääasiassa vuorovaikutuksessa fosfotyrosiinisignaali sitova (PTB) verkkotunnus tensin2. DLC1-tensin2 vuorovaikutus poistetaan kokonaan on DLC1 mutantti, josta puuttuu tämä uusi PTB sitoutumiskohta (DLC1ΔPTB). Kuitenkin, kuten on osoitettu immunofluoresenssilla ja samanaikainen immunosaostus, kumpikaan fokaalisen adheesion sijaintia eikä vuorovaikutusta tensin1 ja C-terminaalinen tensin-like (cten) vaikutti. Mielenkiintoista, toiminnallinen merkitys tämän uuden sivuston oli näytteillä osittaisen vähentäminen RhoGAP toimintaa, mikä puolestaan ​​heikensi kasvu esti aktiivisuus DLC1 kun sen poistaminen DLC1.

Johtopäätökset /Merkitys

Tämä tutkimus on tarjonnut uusia todisteita siitä, että DLC1 myös vuorovaikutuksessa tensin2 on PTB domain-riippuvaisella tavalla. Lisäksi oikein paikallistamisen paikallisia tarttumista ja säilöntä RhoGAP toimintaa, DLC1 vuorovaikutus tensin2 kautta tämä uusi fokaalisen adheesion sitoutumiskohta edistää kasvua esti aktiivisuutta DLC1.

Citation: Chan LK, Ko FCF, Ng IO L, Yam JWP (2009) Poistettu Liver Cancer 1 (DLC1) hyödyntää uutta Binding Site Tensin2 PTB Domain Vuorovaikutus ja tarvitaan Kasvain-ehkäisevästä toiminto. PLoS ONE 4 (5): e5572. doi: 10,1371 /journal.pone.0005572

Editor: Neil Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 21. 2009; Hyväksytty: 15 huhtikuu 2009; Julkaistu: May 15, 2009

Copyright: © 2009 Chan et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus rahoitettiin osittain Hongkongin tutkimusapurahoja neuvoston (HKU 7674 /06M ja HKU 1 /06C) ja Michael Kadoorie Cancer Genetic Research Programme on Kadoorie hyväntekeväisyysyhdistykseksi. I.O.L. Ng on Loke Yew professori Pathology. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pieni, monomeerinen G-proteiinin Rho on klassisesti määritelty keskeisiä biologisia säädin aktiinisytoskeletonin [1] – [3]. Puolestaan ​​dynaaminen solun tukirangan liikevaihdon ohjaa monenlaisia ​​liittyviä biologisia vasteita, jotka vaihtelevat määritelmästä solun muodon edistämiseen solumigraatio, soluadheesion ja solun leviämisen [4], [5]. Yhä suurempi todistusaineisto viittaa siihen, että Rho osallistuu myös ohjaavat biologisia toimintoja, kuten solujen proliferaatiota ja invaasion ja geenin transkriptio [6] – [11]. Rho on sekaantunut Karsinogeneesin kuten on todettu aktivoida eri ihmisen syövissä [12], [13].

Poistettu in maksasyövän 1 (DLC1) B on tuumorisuppressorigeeniä sijaitsee kromosomissa 8p21.3-22 ja sen on osoitettu olevan usein uusia, on monenlaisia ​​ihmisen syövissä, mukaan lukien maksasolusyövän (HCC) [14] – [23].

DLC1

koodaa usean domain RhoGAP proteiinin selektiivinen aktiivisuus RhoA, B ja C ja vähemmän kohti Cdc42 muttei Rac1 [23], [24]. Laajat tutkimukset ovat osoittaneet, että DLC1 hyödyntää tätä RhoGAP toimintaa tukahduttaa soluproliferaatiota [15], [18], [23], [25] – [29], laukaista apoptoosin [25] ja vähentää solumigraatiota [26], [28 ], soluinvaasiota ja tuloksena syövän etäpesäkkeiden solulinjoissa sekä hiiri malleja eri kudoksista peräisin [29] – [31]. Tuoreessa tutkimuksessa rooli DLC1 kuin

bona fide

tuumorisuppressori HCC vahvistettiin hiirimallissa, jossa on maksa-erityistä, lyhyen hiusneula-RNA-välitteisen DLC1 pudotus [32]. Vaikka rooli DLC1 suojella soluja syöpään liittyvien ominaisuuksien on tullut selväksi, kysymyksiä sen biologista asetus ei tule vastausta.

kopiointia,

DLC1

ilmentyminen on havaittu olevan epigeneettiseltä vaiennettu erilaisissa ihmisen syövissä. Hypermetylaatiota geenin promoottorialueen tukahdutetaan

DLC1

geenin transkriptio ja sen erilaisissa kudoksissa [16], [17], [19], [22], [24], [33] – [35]. Posttranslationaalisesti, rotan DLC1 on osoitettu fosforyloituvan, jonka Akt-kinaasin [36]; kuitenkin, sen esiintyminen ihmisen DLC1 ja sen biologista merkitystä on edelleen kyseessä. Toisaalta, tuore tutkimus tunnistettu DLC1 mutaatioita eturauhas- ja rintasyövistä tiettyinä tyrosiini- ja seriinitähteiksi. Nämä mutaatiot inaktivoimiseksi DLC1 RhoGAP toiminnan kautta tuntematon mekanismi [37]. Tähän mennessä parhaiten karakterisoitu sääntely DLC1 proteiinitasolla on sen vuorovaikutus tensin proteiineihin [27], [28], [38]. Tensins ovat keskeisiä adheesioproteiineja kuljettavat Src-homologia 2 (SH2) ja fosfotyrosiinia sitovia (PTB) verkkotunnuksia niiden C-päät [39]. Kertyvät todisteet osoittavat, että DLC1 vuorovaikutuksessa useiden tensins. Yleensä DLC1 hyödynnetään SH2 sitova motiivi, johon jäännös Y442 vuorovaikutuksessa SH2-domeenin tensin1 ja C-terminaalinen tensin-like (cten). Mutaatio Y442 aiheutti DLC1 menettää polttovälin tarttuvuus lokalisointi ja tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden. Tämä havainto viittaa siihen, että tensin sitoutuminen on keskeinen sääntelyn tapahtuma solunosasijaintia ja kasvaimen tukahduttava funktio DLC1 [27], [28]. Olemme kuitenkin dokumentoitu vuorovaikutukset DLC1 ja tensin2 PTB verkkotunnuksen [38]. Täten mekanismi vuorovaikutusta DLC1 ja eri tensins ja sen biologiset vaikutukset ovat edelleen kiistanalaisia.

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme löytäneet uuden sitovan mekanismin välillä DLC1 ja tensin2 tunnistamalla pimeiltä sitoutumiskohta DLC1, muiden kuin SH2 sitovan motiivin kuvanneet muiden vuorovaikutukseen tensin2 PTB verkkotunnus. Tämä uusi sivusto on hyvin konservoitunut DLC perheitä. Tarjoamme myös ensimmäinen todisteet tensin2 vuorovaikutuksen yhteisenä ominaisuus DLC1 ja DLC2. Sen lisäksi, että sitovaa mekanismia, olemme myös osoittaneet toiminnallista merkitystä tämän uuden sitoutumiskohdan säätelyssä tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden DLC1.

Tulokset

Euroopan tensin2 PTB verkkotunnuksen vaadittiin DLC1 vuorovaikutus

osoittivat, että C-pää tensin2 fragmentti, mukaan lukien SH2 ja PTB domeeneja (SH2-PTB kuviossa. 1 B), oli riittävä sitomaan DLC1 (Fig. 1A). Arvioimaan, kuinka tärkeitä yksittäisten domeenien DLC1 vuorovaikutuksessa, valmistimme useita tensin2 häviämämutantteja lukien tensin2 ΔSH2ΔPTB, ΔSH2 ja ΔPTB ja testataan niiden sitoutumisaffiniteetti kohti DLC1 (Fig. 1 B). Tensin2 ΔSH2ΔPTB osoittivat johdonmukaisesti täydellinen menetys DLC1 sitoutumisen. Toisin kuin muita raportteja, huomasimme, että poistamalla SH2 toimialue tensin2 vain osittain pelkistetyt DLC1 sitova. Mielenkiintoista on, poistamalla PTB verkkotunnuksen tensin2 oli riittävä täydellisesti poistaa DLC1 vuorovaikutusta, mikä osoittaa, että PTB domain tarvitaan sitoutumisen (Fig. 1 C). On raportoitu, että DLC1 Y442 ja S440 muodostavat fosfo-riippumatonta sitoutumista motiivin SH2-domeenin tensin1 ja cten [27], [28]. Me seuraavaksi tarkastetaan säilyttämistä näiden jäämien sitoutumisen tensin2 SH2 verkkotunnus. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että DLC1 Y442F ja S440A mutantit osoittivat vain osittaista vähentämistä tensin2 sitovia. Sen testaamiseksi, Y442 ja S440 välittävät vuorovaikutus tensin2 SH2 domain, tarkistimme sitoutumisaffiniteetti välillä DLC1 ja tensin2 R1165A, joka on SH2 domain mutantti, joilla on heikentynyt tunnustamista ja sitoutumisen tyrosiinifosforyloitunut tavoitteita. Huomasimme, että mutaatio R1165A in tensin2 johti laskuun tensin2-DLC1 sitova. Vastaavia sitoutumisaffiniteetti kohti R1165A välillä havaittiin DLC1 villityypin, Y442F ja S440A. Tämä osoitti, että Y442 ja S440 voi olla tehokasta vain, jos SH2 verkkotunnuksen tensin2 oli ehjä (Fig. 1 D). Yhdessä nämä tulokset tukevat johtopäätöstä, että SH2 domain kautta välittyvä mekanismi myötävaikuttaa myös DLC1-tensin2 vuorovaikutuksia.

(A) Expression of tensin2 SH2-PTB fragmentti (kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät sekä hahmoteltu kuvassa. 1B) oli riittävä vuorovaikutukseen DLC1. HEK293T-solut transfektoitiin Myc-merkityn tensin2 fragmentti ja FLAG-merkittyä DLC1 konstrukteja kuten on osoitettu. Selvitetty solulysaateista inkuboitiin anti-Myc-vasta-aine immunosaostaa tensin2. DLC1 että saostumat havaittiin immunoblottauksella anti-FLAG-vasta-ainetta. (B) Kaaviokuva esittää domeenirakenne Myc-merkittyjen tensin2 ja sen C-terminaalinen katkaistu mutantteja. Mutantit oli joko sekä SH2 ja PTB verkkotunnuksia (ΔSH2ΔPTB) tai oli yksittäisiä toimialueita poistetaan (ΔSH2 ja ΔPTB). SH2-PTB oli tensin2 C-päähän käytettiin kuvion. 1A. (C) Mapping DLC1 sitova sivusto tensin2. HEK293T-solut transfektoitiin Myc-merkittyjä tensin2 ja FLAG-merkittyä DLC1 konstrukteja kuten on osoitettu. Selvitetty solulysaateista inkuboitiin anti-Myc-vasta-aine immunosaostaa tensin2. DLC1 että saostumat havaittiin immunoblottauksella anti-FLAG-vasta-ainetta. Poistaminen tensin2 SH2 domain (ΔSH2) johti osittaiseen vähentämiseen DLC1 sitovia. Täydellinen menetys DLC1 sitoutuminen havaittiin, kun poiston tensin2 PTB verkkotunnuksen (ΔPTB). Bändi voimakkuus kussakin vyöhykkeessä mitattiin IP ja Co-IP paneelit ja lukemat normalisoitiin kaistaa 2. Suhteellinen Co-IP-to-IP-suhteet myös mukana. (D) karakterisointi välisen sitoutumisen tensin2 ja fokaalisen adheesion lokalisointi-viallisen DLC1 mutantteja. Villityypin tensin2 tai SH2 domain mutantti, R1165A, on kotransfektoitiin DLC1 villityypin, Y442F ja S440A. Solulysaatti suoritettiin immunosaostus anti-Myc-vasta-ainetta, minkä jälkeen immunoblottauksella anti-FLAG-vasta-ainetta. Y442F ja S440A osoitti osittainen alentaminen tensin2 sitova, mutta SH2 toimialueen mutantti, R1165A, ei.

tunnistetiedot tensin2 PTB sitovan domeenin DLC1

Seuraava kyseenalaiseksi joka alue DLC1 vaadittiin tämän PTB domain-riippuvainen tensin2 vuorovaikutus. Olemme aiemmin oli ehdotettu keskialueella 375-509 ja DLC1 olevan alueen tarpeen tensin2 vuorovaikutusta [38]. Tarkkaan tutkittava tämän ehdotetun sitova alue, me kloonattu ja ilmennetty eri DLC1 mutantteja eri katkaisut uusimmat tällä alueella (kuvio. 2A). Huomasimme, että N-päät DLC1 1-400 ja 1-440, molemmat puuttuvat raportoidut tensin SH2 sitoutumiskohta (Y442 of DLC1), riittivät vuorovaikutuksessa tensin2. Toisaalta, toisensa poissulkevat C-pään fragmentti, 400-stop, jossa on ehjä SH2 sitoutumiskohta ei ole riittävä vuorovaikutuksessa tensin2 (Fig. 2B). Samanlainen tulos havaittiin, kun 450-stop, joka ei sisällä mitään ennustaa tensin sitoutumiskohdat, käytettiin (Fig. 2B). Antaa lisää todisteita siitä, että N-pää DLC1 vuorovaikutuksessa tensin2 kautta PTB domain-riippuvaisen mekanismin, tarkastetaan vuorovaikutus DLC1 1-400 ja edellä tensin2 deleetiomutantteja. Havaitsimme, että vuorovaikutus DLC1 1-400 ja tensin2 ei ollut vaikutusta, vaikka SH2-domeenin tensin2 oli poistettu. Sen sijaan, vuorovaikutus kahden jälleen kumottiin, kun PTB verkkotunnuksen tensin2 oli poistettu, mikä osoittaa, että tämä sitoutuminen oli ainoastaan ​​PTB domain-riippuvaista (Fig. 2C). Edelleen osoittaa PTB sitoutumiskohdan DLC1, tutkimme sitoutumisen paneelin DLC1 N-pään fragmentit tensin2. Näistä fragmenteista, olemme havainneet, että DLC1 1-385 oli lyhin fragmentti, joka kykeni sitoutumaan tensin2 (Fig. 2D). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että alue DLC1 375-385 toimii tensin2 PTB sitoutumiskohta, jota tarvitaan tensin2 sitoutumisen.

(A): n N-pään DLC1 oli riittävä vuorovaikutukseen tensin2. HEK293T-solut transfektoitiin Myc-merkityn tensin2 fragmentti ja FLAG-merkittyä DLC1 konstrukteja kuten on osoitettu. Selvitetty solulysaateista inkuboitiin anti-Myc-vasta-aine immunosaostaa tensin2. DLC1 että saostumat havaittiin immunoblottauksella anti-FLAG-vasta-ainetta. (B) C-päähän DLC1 ei kyennyt sitoutumaan tensin2. Myc-merkittyjen tensin2 oli ko-transfektoitiin kaksi FLAG-merkitty DLC1 C-pään fragmentit, kuten on ilmoitettu. Nämä DLC1 C-terminaalissa fragmentteja ei voitu yhteistyössä immunosaostettiin tensin2. (C) N-terminaalista fragmenttia 1-400 oli mukana tensin2 PTB sitovia. FLAG-merkitty DLC1 1-400 voitaisiin osallistua immunosaostettiin tensin2. Poistaminen tensin2 SH2 domain ei vaikuttanut affiniteettiin sitoutua 1-400, mutta ehjää PTB domain oli tarpeen sitovia. (D) Fine mapping PTB sitova sivusto DLC1. Myc-merkittyjen tensin2 oli ko-transfektoitiin paneelin FLAG-merkitty DLC1 N-pään fragmentit. FLAG-merkitty fragmenttien saostumat havaittiin immunoblottauksella analyysi anti-FLAG-vasta. Fragmentti 1-385 oli lyhin fragmentti kyetään yhteistyössä immunosaostettiin tensin2. Bändi voimakkuus kussakin vyöhykkeessä mitattiin IP ja Co-IP paneelit ja lukemat normalisoitiin kaistaa 2. Suhteellinen Co-IP-to-IP-suhteet myös mukana.

säilyttäminen tensin2 PTB sitovan domeenin DLC2

tarkista biologisen säilyttämistä kartoitettu tensin2 sitovat alueet muissa DLC perheenjäseniä, suoritimme aminohapporinnastuksen välillä DLC1 ja DLC2 [40], [41]. Huomasimme, että sekä SH2 ja PTB sitoutumiskohdat ovat hyvin säilyneet DLC2. Vastaavat seriini (S457) ja tyrosiini (Y459) jäämät SH2 sitova alue löydettiin DLC2. PTB sitova sivusto DLC1 375-385 todettiin ottelun DLC2 400-410, mikä viittaa mahdolliseen rooliin tällä alueella välittämisessä PTB domain-riippuvaisen sitoutumisen välillä DLC perheenjäsenten ja tensin2 (Fig. 3A). Perustuen suojelusta tensin sitoutumiskohdista DLC2, me arveltu, että DLC2 saattavat vuorovaikutuksessa tensin2. Käyttämällä samanaikainen immunosaostus osoitimme, että DLC2α ja tensin2 vuorovaikuttavat, jotka vahvistivat meidän spekulointia. Kuten DLC1, The RhoGAP aktiivisuus DLC2 ei ollut tarpeen tensin2 vuorovaikutukseen, kuten on esitetty myönteinen vuorovaikutus DLC2 RhoGAP mutantti, R740E, jossa tensin2 (Fig. 3B). Me epäilivät DLC2 myös lokalisoitu polttovälin kiinnikkeistä SMMC-7721-soluissa. Huomasimme, että ilmentyminen DLC2γ aiheuttama vakava solun kutistuminen. Helpottaakseen havainto, me sen sijaan käytetään toiminnallisesti aktiivinen mutantti, DLC2γ R622E, että kanna mutaatio sen RhoGAP domain [41]. Olemme havainneet, että DLC2γ R622E toimia samanaikaisesti paikallistaa kanssa vinkuliinin (Fig. 3C), mikä osoittaa, että muut DLC proteiinit voivat myös paikallistaa ja paikallisiin tarttumisiin.

(A) Kaaviokuva tensin2 SH2 ja PTB sitoutumiskohtia DLC1. Sisällä minimaalinen tensin2 sitova alue 375-509, erilliset elementit ovat mukana välittämässä tensin2 sitovia kautta PTB tai SH2 mekanismeja. Nämä elementit ovat hyvin konservoituneita DLC1 paralogi, DLC2. Konservoituneiden tähteiden korostettiin. (B) välinen vuorovaikutus DLC2 ja tensin2 on RhoGAP riippumattomalla tavalla. HEK293T-solut transfektoitiin Myc-merkittyjä tensin2 ja GFP-leimatun DLC2 konstrukteja kuten on osoitettu. Selvitetty solulysaateista inkuboitiin anti-Myc-vasta-aine immunosaostaa tensin2. DLC2 että saostumat havaittiin immunoblottauksella anti-GFP-vasta-ainetta. (C) GFP-DLC2γ osoitti fokaalisen adheesion lokalisointia RhoGA riippumattomalla tavalla. Expression of GFP-DLC2γ aiheuttama vakava solun kutistuminen, kun ilmaistaan ​​SMMC-7721-soluissa. Focal tarttuvuus lokalisaatio DLC2γ RhoGAP mutantti R622E havaittiin. Endogeeninen vinkuliini visualisoitiin anti-vinkuliini vasta-aine. Asteikko bar = 10 pm.

DLC1ΔPTB mutantti osoitti erityistä menetys tensin2 sitova, mutta säilyttänyt fokaalisen adheesion lokalisoinnin

tutkimiseksi roolia tensin2 PTB sitovaa domeenia DLC1, me kloonattu kolme erillistä DLC1 mutantteja oli vähäistä muutokset seuraavat rakenneosat: Δ375-390 (ΔPTB # 1), Δ375-385 (ΔPTB # 2) ja Δ380-390 (ΔPTB # 3), joissa molemmissa on erityinen sisäisen deleetion sisällä PTB verkkotunnuksen (DLC1ΔPTB) (Fig. 4A). Vahvista roolin PTB toimialueen tensin2 sitova, me testattiin ensin sitoutumisen näiden mutanttien kanssa tensin2. Jossa on samanaikainen immunosaostus määrityksessä havaittiin, että kaikki DLC1ΔPTB mutantit osoittivat menetys tensin2 sitoutumisen (Fig. 4B). Menetys sitoutumisen vahvistettiin edelleen vähentynyt kolokalisaation välillä DLC1ΔPTB # 1 ja tensin2 (Fig. 4C). Voit osoite spesifisyyden kartoitettu PTB sitovan motiivin toisia tensin proteiineja, suoritimme samanaikainen immunosaostus määritys käyttäen C-pään fragmentti tensin1, 648-stop. Tensin1 648-stop kattaa C-terminaalisen pään SH2 ja PTB domeeneja, joiden on osoitettu olevan tärkeitä DLC1 sitoutumisen [28]. Olemme vahvistaneet roolin DLC1 vuorovaikutuksessa meidän samanaikainen immunosaostus järjestelmä (Fig. S1). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että tensin1 648 luukun osoittivat verrattavissa sitoutumisaffiniteetin kanssa DLC1 villityypin ja DLC1ΔPTB (Fig. 4D). Positiivinen vuorovaikutus DLC1 havaittiin myös, kun cten immunosaostettiin yhteistuotantoa immuunisaostustesti (Fig. 4E). Nämä havainnot tukevat erityistä osallistumista tämän PTB sitovan motiivin kanssa tensin2. Puuttumaan onko poistaminen PTB verkkotunnuksen vaikuttaisi fokaalisen adheesion lokalisointia DLC1, tutkimme lokalisoinnin DLC1ΔPTB in SMMC-7721 HCC solujen immunofluoresenssimenetelmällä. Huomasimme, että DLC1ΔPTB mutantit säilyttivät polttovälin tarttuvuus lokalisointi, kuten niiden kolokalisaation kanssa polttoväli-tartunta liittyvä proteiini vinkuliini. Tämä havainto viittasi siihen, että poistaminen PTB sitova sivusto DLC1 vaikuttaa sen sitomiseksi tensin2 mutta säilyttää sen polttoväli tarttuvuus lokalisointi, mahdollisesti kautta vuorovaikutusta muiden tensins kautta PTB-riippumatonta sitoutumista mekanismin (Fig. 4F).

( A) Kaaviokuva rakenteen kolmen FLAG-leimatun DLC1ΔPTB mutanttien: Δ375-390, Δ375-385 ja Δ380-390 (ΔPTB # 1-3). (B) DLC1ΔPTB oli vähentynyt tensin2 sitovia. HEK293T-solut transfektoitiin Myc-merkittyjä tensin2 ja FLAG-merkittyä DLC1 konstrukteja kuten on osoitettu. Selvitetty solulysaateista inkuboitiin anti-Myc-vasta-aine immunosaostaa tensin2. DLC1 että saostumat havaittiin immunoblottauksella analyysi anti-FLAG-vasta-ainetta. Poistaminen PTB sitovan domeenin DLC1 johti menetykseen tensin2 sitovia. (C) DLC1ΔPTB osoitti alentuneita kolokalisaation kanssa tensin2. SMMC-7721-soluja väliaikaisesti kotransfektoidaan kanssa GFP-vektorilla tai GFP-tensin2 ja osoitti Myc-merkityn DLC1. DLC1 visualisoitiin käyttämällä anti-Myc-vasta-ainetta, jota seurasi Texas Red-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella. Asteikko bar = 10 um. (D) DLC1ΔPTB voisi vuorovaikutuksessa tensin1. HEK293T-solut transfektoitiin Myc-merkityn tensin2 SH2-PTB (kuten on esitetty kuviossa. 1B) tai Myc-merkittyjä tensin1 C-pään 648-stop (kuten on esitetty kuviossa. S1) ja FLAG-merkitty DLC1 konstrukteja kuten on osoitettu. Selvitetty solulysaateista inkuboitiin anti-Myc-vasta-aine immunosaostaa tensin2 tai tensin1. DLC1 että saostumat havaittiin immunoblottauksella analyysi anti-FLAG-vasta-ainetta. Poistaminen PTB sitovan domeenin DLC1 ei vaikuttanut tensin1 sitova. (E) DLC1ΔPTB voisi vuorovaikutuksessa cten. HEK293T-solut transfektoitiin Myc-merkityn tensin2 tai Myc-merkittyjä cten ja FLAG-merkittyä DLC1 konstrukteja kuten on osoitettu. Selvitetty solulysaateista inkuboitiin anti-Myc-vasta-aine immunosaostaa tensin2 tai cten. DLC1 että saostumat havaittiin immunoblottauksella analyysi anti-FLAG-vasta-ainetta. Poistaminen PTB sitovan domeenin DLC1 ei vaikuttanut cten sitova. (F) DLC1ΔPTB osoitti fokaalisen adheesion lokalisointiin SMMC-7721-soluissa. SMMC-7721-soluja väliaikaisesti kotransfektoidaan GFP-tensin2 ja FLAG-merkitty DLC1 kuten on osoitettu. DLC1 visualisoitiin käyttämällä anti-DLC1 vasta-ainetta, jota seurasi FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Endogeeninen vinkuliinin visualisoitiin anti-vinkuliinin vasta-ainetta, jota seurasi Texas Red-konjugoidulla vasta-aineella. Asteikko bar = 10 pm.

DLC1ΔPTB osoitti osittainen alentaminen RhoGAP toimintaa vaan riitti tukahduttaa aktiini stressisäikeiden muodostumista

Aktiivinen RhoA tunnetaan parhaiten sen roolista simuloidaan aktiini stressisäikeiden muodostus. Koska negatiivinen säätelijä RhoA, DLC1 estää aktiini stressiä kuidun muodostuksen RhoGAP riippuvalla tavalla [26]. Käyttämällä aktiini stressi kuituja epäsuorana biologinen lukeman, kysyimme, onko RhoGAP toiminta DLC1ΔPTB mutanttien vaikuttaisi. Olemme havainneet, että DLC1ΔPTB mutantti-transfektoiduissa soluissa oli vähentynyt aktiini stressiä kuidun muodostumista verrattuna viereisiin ei-transfektoiduissa soluissa. Tämä havainto oli samanlainen kuin, että fokaalisen adheesion localization-puutteelliset mutantit ja DLC1, Y442F ja S440A, joista kukin kantaa pistemutaatio tensin SH2 sitovan domeenin (Fig. 5A). Suoraan määrällisesti RhoA inaktivaatio, teimme Rhotekin pull-down sen määrittämiseksi Rho-GTP aktiivisuuden tasoja soluissa, jotka ilmentävät eri DLC1 mutantteja. Vaikka olemme huomanneet, että DLC1ΔPTB mutantti voi tukahduttaa Rho-GTP aktiivisuutta, oli mielenkiintoista, että tämä estyminen oli vähemmän tehokas verrattuna villin tyypin DLC1 (Fig. 5B). Toisaalta on huomattava, että Y442F ja S440A mutantit myös vähensi tukahduttamaan Rho-GTP aktiivisuudesta. Kaiken kaikkiaan olemme huomanneet, että DLC1ΔPTB mutantti osoitti osittainen alentaminen luontainen RhoGAP toimintaa, mutta tämä aktiivisuus oli riittävä tukahduttamaan aktiini stressiä kuitujen muodostumista.

(A) SMMC-7721 HCC-solut transfektoitiin ilmoitetuilla Myc leimatun DLC1 rakentaa ja aktiini stressi kuidut värjättiin TRITC konjugoidulla phalloidin 1 tunnin kuluttua seerumin induktioon. Tähti (*) merkitsee DLC1-transfektoiduissa soluissa. DLC1 Y442F, S440A, ΔPTB # 1 ja # 2 voi tukahduttaa aktiini stressiä kuidun muodostumista yhtä tehokkaasti kuin DLC1 WT. Asteikko bar = 10 um. (B) HEK293T-solut transfektoitiin ilmoitetuilla FLAG-merkitty DLC1 plasmidin 24 tuntia. Transfektion jälkeen solut pidettiin seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ja stimuloitiin 5 uM Lysofosfatidihappo 30 minuuttia. Solulysaattia sitten talteen ja altistetaan GST-RBD avattavasta varten RhoA-GTP. Pull-down näytteet altistettiin SDS-PAGE-analyysi ja immunologisesti anti-RhoA-vasta-aineita. Kaistan intensiteetti aktiivisen RhoA kussakin vyöhykkeessä mitattiin ja lukemat normalisoitiin vektori-transfektoiduissa soluissa. DLC1, tubuliinia ja RhoA yhteensä solulysaattia immunologisesti anti-FLAG, anti-tubuliinia ja anti-RhoA vasta-aineiden. (C) HeLa-soluja transfektoitiin ilmoitetuilla DLC1 rakentaa ja valita G418 2 viikkoa. Pesäkkeet muodostuvat visualisoitiin kristalliviolettivärjäys- värjäystä. Keskimääräinen ero pesäkkeiden muodostumisen tehokkuutta ryhmien välillä todettiin olevan tilastollisesti merkitsevä (

p

0,001, yksisuuntainen ANOVA-testi).

DLC1ΔPTB oli vähentynyt kasvua estävä vaikutus

kyky DLC1 tukahduttaa kasvaimen kasvua on hyvin dokumentoitu. Me epäilivät edellä mainittu DLC1ΔPTB mutantit osoittivat mitään eroa DLC1 aiheuttama kasvun hidastuminen. HeLa-solujen pesäkkeiden muodostumista määrityksessä, villityypin DLC1 suppressoi merkittävästi pesäkkeiden muodostumista verrattuna vektorin ohjaus. Sen sijaan, ektooppinen ilmentyminen DLC1ΔPTB mutanttien johti huomattavasti pesäkkeiden lukumäärä verrattuna villityypin DLC1 (Fig. 5C). Tämä havainto osoittaa, että vaikka DLC1ΔPTB näkyy oikea fokaalisen adheesion lokalisointi, menetys tämän tensin2 PTB sitova motiivi käyttö heikentää kasvun hidastuminen, johtunee osittainen alentaminen RhoGAP toimintaa. On todennäköistä, että asianmukainen tensin2 PTB sitoutumisen, myötävaikuttaa DLC1 aiheuttama kasvun estyminen.

Keskustelu

DLC1 on osoitettu olevan biologisia toimintoja, jotka muistuttavat klassisia tuumorisuppressorigeeneille. Monipuolinen kasvainta tukahduttava vaikutus DLC1 riippuvat voimakkaasti läsnä funktionaalista RhoGAP verkkotunnuksen [26], [28]. Kuitenkin, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että RhoGAP aktiivisuus yksinään ei riitä sen kasvaimen suppressoiva funktio [26] – [28], [42]. Edellinen rakenteellinen analyysi ryhmämme edellyttäen, että ensimmäinen näyttö siitä, että nämä toiminnot DLC1 voitaisiin palauttaa vain, kun välisellä alueella SAM ja RhoGAP domeenit oli mukana [26]. Tunnistaminen tensin2 kuin ensimmäinen sitova proteiini, joka on vuorovaikutuksessa tämän toiminnallisesti tärkeä alue lisäksi vihjasi suhdetta tensin2 vuorovaikutusta ja DLC1 toiminto [38]. Tämä käsite päätelmää tukevat löytö cten ja tensin1 sitovana kumppanit DLC1 myöhemmissä tutkimuksissa, mikä tarkoittaa, että se on biologisesti tärkeä tensin proteiinit töihin yhteistyöpeliä DLC1 [27], [28].

aiemmin ehdottanut, että DLC1 375-509 on minimaalinen sitova alue tensin2. Tämä alue kattaa keskeiset tähteet Y442 ja S440, jotka ehdottivat muut tutkimukset muodostavan SH2 sidoskohdan cten ja tensin1 [27], [28]. Emme kuitenkaan voi antaa suoraa näyttöä siitä, että tensin2 SH2 verkkotunnuksen riitti DLC1 sitova [38]. Tässä tutkimuksessa ja edellisessä raportissa, havaintomme osoittivat johdonmukaisesti, että tensin2 PTB sijaan SH2, domain suoraan vuorovaikutuksessa DLC1.

On muutamia mahdollisia selityksiä poikkeava havaintoja. Ensinnäkin, vaikka SH2 ja PTB domainit tensin proteiineja on korkea sekvenssihomologia, erot niiden sekvenssit voivat johtaa erilaisiin sitovia mekanismeja DLC1 ja muiden tensin perheenjäseniä. Toiseksi, eri sitoutumismääritykset käytti eri ryhmien tutkia mekanismia välisen sitoutumisen tensin ja DLC1. Esimerkiksi hiivaperustaista sitovia ja GST avattavasta määritykset käyttävät Liao et ai. ja Qian et al., vastaavasti, kun taas

in vivo

samanaikainen immunosaostus käytettiin tämänhetkiseen tutkimuksessa. Kolmanneksi, C-pään fragmentit, tensin, joka sisälsi joko yhden tai molemmat SH2 ja PTB domeenit käytettiin kartoitus DLC1 sitoutumiskohdan tutkimuksissa Liao et ai. ja Qian et al. Tämä kokeellinen suunnittelu olettaa, että N-pään alueella tensin proteiinin ole ollut mukana sitova eikä vaikuttanut normaalin proteiinin laskostumista C-pään alueella.

Esillä olevassa tutkimuksessa, tarjoamme ensimmäinen näyttö siitä, että erityiset poistaminen SH2 ja PTB domainit tensin2 vaikuttaa DLC1 sitoutumisen eri tahtiin (Fig. 1 C). Osoittamaan, että PTB verkkotunnus on ratkaiseva rooli DLC1-tensin2 sitova, kartoitimme PTB sitovan domeenin N-päässä DLC1 (Fig. 2) ja vahvisti sen asemaa tunnusomaiset piirteet DLC1ΔPTB sisäinen deleetiomutanttien (Fig. 4A). Havaitsimme pimeiltä alueella 375-385 of DLC1 kuin PTB-domain-sitoutumiskohta ja DLC1-tensin2 vuorovaikutus katosi, kun tämä alue oli poistettu (Fig. 4B). Se on vakiintunut, että PTB domain tunnistaa NPXY aihe, kuten on esitetty sen sitomiseksi integriinin β [43]. Kuitenkin tämä motiivi ei löytynyt meidän kartoitettu alueella DLC1, mikä tarkoittaa, että tila PTB-välitteisen vuorovaikutuksen on todennäköisesti epätyypillinen. Vaikka DLC1ΔPTB osoitti menetys tensin2 sitova, se oli silti paikallistaa ja paikallisia tarttumista (kuviot. 4C ja 4F). Lisäksi olemme havainneet, että PTB domeeni oli tarpeen fokaalisen adheesion lokalisoinnin tensin2 (tuloksia ei ole esitetty). Niinpä sen lisäksi, että toimii fyysisen sitoutumiskohta DLC1, PTB domain voi olla merkitystä myös tuo tensin2 lähellä DLC1 at paikallisia tarttumista ja helpottaa niiden vuorovaikutusta. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että DLC1 hyödyntää alueella 375-385 välittämisessä tensin2 sitova, vaikka se hyödyntää Y442 ja S440 tähteiden fokaalisen adheesion kohdistamista (Fig. 6).

DLC1 suunnattiin paikallisiin tarttumisiin ja tarvittavat tähteet Y442 ja S440. Tällä fokaalisen adheesion lisäksi SH2 sitovaa mekanismia, DLC1 käytetään alueella 375-385 vuorovaikutuksessa PTB domeenin tensin2, kuten on esitetty katkoviivalla. Muodostuminen tämän sitovan kompleksin oli tärkeää DLC1 käyttämään kasvua ehkäisevästä toiminto.

Toistaiseksi ei tiedetä, onko ehdotettu tensin PTB sitovan domeenin DLC1 osallistuu sitova muiden tensins. Tämä on vielä tutkittava. On raportoitu, että ilmaus tensin1 PTB verkkotunnus riittää vuorovaikutukseen DLC1. Myös poistaa koko tensin SH2 sitova motiivi (440-448) sijasta käyttöön Y442F pistemutaatio DLC1, riittää vuorovaikutus tensin1 [28]. Tämä osoittaa, että PTB-riippuvainen sitoutuminen voi olla läsnä DLC1 ja tensin1, mutta sillä on hienovarainen rooli, toisin kuin DLC1 ja tensin2 vuorovaikutusta. Perustuvat tämänhetkisiin havaintojen voimme päätellä, että PTB sitova mekanismi on tensin2-erityinen (kuviot. 4B, 4D ja 4E), kun taas muut tensins niissä käytetään SH2 sitovaa mekanismia [27], [28]. Mahdolliset korvaukset muilla tensins saattaa selittää, miksi DLC1ΔPTB voidaan paikallistaa keskeiselle kiinnikkeistä puuttuessa tensin2 vuorovaikutusta. Lisäksi olemme havainneet, että DLC1ΔPTB osoitti osittainen alentaminen RhoGAP toimintaan, joka johti osittainen alentaminen kasvun hidastuminen (kuviot. 5B ja 5C).

rajoituksena tämänhetkiseen tutkimuksessa on käyttää ektooppisesti ilmaistuna tensin2. Detection Endogeenisen tensin2 ei ollut mahdollista, koska tensin2 vasta-ollut saatavilla laboratoriossamme. Vuorovaikutus endogeenisen DLC1 ja tensin2 on tutkittava vastaamaan niiden sitoutuminen todellinen biologinen yhteydessä. Toisaalta, teimme alustavan kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi määrittää mRNA: n ilmentymisen tasoa DLC1 ja tensin2 ihmisen HCC kudoksissa. Meidän julkaisemattomia tiedot osoittivat, että ali molemmat DLC1 ja tensin2 korreloi lyhyempi kokonaiseloonjääminen verrattuna niihin, jotka oli normaali ilmentyminen tai molempien geenien, tukemalla mahdollinen toiminnallinen yhdistys DLC1-tensin2 kanssa hepatokarsinogeneesin.

Kaikkiaan olemme tunnistaneet uuden tensin2 PTB sitova sivusto DLC1 ja osoittanut sen osallistumista tensin2 vuorovaikutusta. Vaikka poistaminen PTB sitoutumiskohdan ei vaikuta fokaalisen adheesion lokalisoinnin, se osittain vähensi RhoGAP aktiivisuutta DLC1, jonka heikennetty sen kasvua suppressoiva funktio.