Krooninen sairaus

tiivistelmä

raportoivat mekanismiin perustuvaa näyttöä varten syövän vastaisia ​​ja chemopreventive tehoa [6] -gingerol, suuret aktiivinen periaate lääkekasvi, inkivääri (

Zingiber officinale

), paksusuolen syöpäsoluissa. Yhdiste arvioitiin kahdessa ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa solumyrkkyvaikutuksessa ja herkin solulinjaa, SW-480, valittiin mekanistinen arviointia syövän vastaisia ​​ja chemopreventive tehoa. Myrkytön luonne [6] -gingerol vahvistettiin elinkelpoisuuden määritykset nopeasti jakautuvissa normaaleissa hiiren paksusuolen solut. [6] -gingerol esti solujen lisääntymistä ja indusoi apoptoosin osoituksena eriyttämisestä fosfatidyyliseriinin SW-480, kun taas normaali paksusuolen solut pysyivät muuttumattomina. Herkkyys [6] -gingerol SW-480-soluissa, jotka liittyvät kaspaasien aktivaatio 8, 9, 3 7 ja lohkaisu PARP, joka osoittaa induktio apoptoottisen solukuoleman. Mekanistisesti [6] -gingerol alassäädetty forbolimyristaattiasetaattia (PMA) indusoi fosforylaation ERK1 /2 ja JNK MAP-kinaasien ja aktivointi AP-1-transkriptiotekijän, mutta oli vain vähän vaikutuksia fosforylaatioon p38 MAP-kinaasin ja NF -kappa B. Lisäksi se täydensi inhibiittorit joko ERK1 /2 tai JNK MAP-kinaasin lopetettua PMA-indusoidun soluproliferaation SW-480-soluissa. Raportoimme estyminen ERK1 /2 /JNK /AP-1-reitin mahdollisena mekanismia syövän vastaista sekä chemopreventive tehoa [6] -gingerol vastaan ​​paksusuolen syöpä.

Citation: Radhakrishnan E, Bava SV , Narayanan SS, Nath LR, Thulasidasan AKT, Soniya EV, et ai. (2014) [6] -Gingerol indusoi kaspaasiriippuvaisen Apoptosis ja Estää PMA-indusoitua proliferaatiota in koolonkarsinoomasoluissa estämällä MAPK /AP-1 Signaling. PLoS ONE 9 (8): e104401. doi: 10,1371 /journal.pone.0104401

Editor: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, Intia

vastaanotettu 17. maaliskuuta 2014; Hyväksytty: 13 heinäkuu 2014; Julkaistu: 26 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Radhakrishnan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Ruby John Anto on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

Colon syöpä on kolmanneksi eniten diagnosoitu syöpä ja kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolleisuutta Yhdysvallat. Maailmanlaajuisesti se on neljänneksi yleisin kuolinsyy johtuu syövästä. Vaihtelut ruokailutottumuksiin ja lisääntynyt kulutuksen punaisen ja lihajalosteiden osallistumaan tähän kasvuun ilmaantuvuuden paksusuolensyöpä [1], [2] .Surgical menettelyjä ja kemoterapia muodostaa suurimman hoito-paksusuolen syövän [3]. Kasvu lääkeresistenssin vaikeuttaa hoitoa paksusuolen syövän ja ongelmat, jotka liittyvät metastaasiin lisää sen vakavuudesta. Search on käytössä uusia terapeuttisia aineita, jotka on suunnattu molekyyli signalointi reittejä paksusuolensyöpä voidakseen pidättää sen kasvua ja etäpesäkkeiden.

Inkivääri (

Zingiber officinale

) on pitkään käytetty perinteisessä lääketieteessä ja on kutsutaan ”

Maha-aushadhi

” Ayurveda, joka tarkoittaa ”

suuri lääke

” [4]. Juurakon päässä inkivääri sisältää monia pistävä fenolisia yhdisteitä, kuten [6] -gingerol, [6] -shagol, [6] -paradol ja zingerone [5] .Nämä yhdisteitä on tutkittu niiden anti-bakteeri, antioksidantti, anti- tulehduksellinen ja kasvaimen ominaisuudet [6], [7]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet syövän ominaisuuksia näiden fenoliyhdisteiden syöpiä vastaan ​​eri alkuperää. Juurakosta inkivääri on ainesosa päivittäistä ruokavaliota monissa maissa, ja on aktiivinen ainesosa monissa perinteisten järjestelmien kasviperäisten lääkkeiden, kuten itämaisen lääketieteen ja Ayurveda, hallintaan monien sairauksien kuten ruoansulatushäiriöt ja muita ruoansulatuskanavan häiriöt. Tämä perinteinen tieto laukaisee erityisen kiinnostuneita kuvaavat kemiallis-ennaltaehkäisevän ja anti-syöpä luonne fenoliyhdisteiden vastaan ​​syöpien, kuten paksusuolen ja peräsuolen syövän tai haimasyöpä.

Näistä fenoliyhdisteitä, [6] -gingerol (1- [4′-hydroksi-3′-metoksifenyyli] -5-hydroksi-3-dekanoni) on tutkittu sen sytotoksisia vaikutuksia erilaisissa syöpäsolulinjoissa, mukaan lukien peräsuolen syöpä. [6] -gingerol on osoitettu aiheuttavan solukuolemaa kohdunkaulan syövän solulinja, HeLa, kaspaasi-3 riippuvaista apoptoosia ja autophagy [8]. Se voi estää etäpesäkkeiden MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen ja indusoida apoptoosia LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa [9], [10]. Anto [6] -gingerol inhiboi kasvun useita erilaisia ​​hiiren kasvaimia, kuten melanoomat, munuaiskarsinoomia ja paksusuolen karsinoomat lisäämällä tunkeutumisia kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä CD4 ja CD8 T-solut ja B220

+ B-solujen [11]. [6] -gingerol myös osoitettu estävän etenemistä forboliesterillä aiheuttamaa ihon kasvaimen ICR [12]. Vain rajallinen määrä tutkimuksia on julkaistu syövän ominaisuuksia on [6] -gingerol ja sen vaikutusmekanismi vastaan ​​paksusuolen syöpää [13], [14], [15].

Tässä tutkimuksessa sytotoksisia vaikutuksia [6] -gingerol SW-480 koolonsyöpäsoluihin verrattiin sen vaikutukset nopeasti jakautuviin normaalit suolen epiteelisolujen hiiren. Tutkimus suoritti myös

in vitro

mekanistinen arvion inhiboivia vaikutuksia [6] -gingerol on forboli-12-myristaatti-13-asetaatti (PMA) indusoi anti-apoptoottiset signaalit SW-480-soluja.

Materiaalit ja menetelmät

2.1. Materiaalit

Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) saatiin Life Technologies (Grand Island, NY, USA); Naudan sikiön seerumia (FBS), PAN Biotech (GmbH, Aidenbach, Saksa); Hankin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS), epidermaalisen kasvutekijän (EGF) ja insuliinin, transferriini, seleeni, natriumpyruvaattia liuosta (ITS-A) Invitrogen; Vasta-aineita fosfo-p38, fosfo-ERK1 /2, fosfo-JNK, beeta-aktiini ja caspases ostettiin Cell Signaling (Beverly, MA, USA) ja vasta-aineet poly ADP riboosi-polymeraasi (PARP) oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). [6] -gingerol hankittiin Biomol (Hampuri, Saksa). MAP estäjät U0126, SP600125, SB203580 ja NF-kappaB estäjä SN50 hankittiin Calbiochem (San Diego, CA). Kaikki muut kemikaalit, kuten forboli-12-myristaatti-13-asetaatti (PMA) ostettiin Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA).

2,2. Soluviljely

Ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa, SW-480 ja HCT116 saatiin National Centre for Cell Sciences (NCC), Pune, Intia. Soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) sekä 100 U /ml penisilliiniä, 50 mikrogrammaa /ml streptomysiiniä ja 1 mikrogramma /ml amfoterisiini B-solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO2 ja oli osa-viljeltiin kahdesti viikossa.

Normaali suolen epiteelisolujen (IECS) eristettiin hiiren paksusuolen kohti vahvistettu protokollaa [16], [17], joissa on asianmukaiset muutokset, jotka on hyväksytty Institutional Animal eettisen lautakunnan, Rajiv Gandhi biotekniikan keskus kohti sääntöjen

komitea tarkoitus ohjaus ja valvonta eläinkokeiden

, ympäristö- ja Forest, Intian hallitus ( seuraamus No: IAEC /151 /Ruby /2012). Lyhyesti, hiiren (

Swiss albino

7 viikkoa vanhoja, IAEC seuraamuksia No: IAEC /151 /Ruby /2012) paksusuoli leikattiin pois ja puhdistetaan aseptisesti 1 × Hankin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS) poistamaan ulostetta . Suoli pituussuunnassa auki ja leikataan 1 cm: n paloiksi ja inkuboitiin läsnä ollessa tyypin 1 kollagenaasia (200 U /ml) 30 minuutin ajan voimakkaasti ravistellen. Irronneen epiteelisolut eristettiin sentrifugoimalla supernatantti. Näitä soluja viljeltiin suuren glukoosipitoisuuden DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää ja 2 x antibiootit, joka sisälsi 10 ng /ml epidermaalinen kasvutekijä (EGF) ja 5 ug /ml insuliini-transferriini-seleeni-natriumpyruvaattia (ITS-A) (Invitrogen, USA ). Tämä solulinja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ja oli osa-viljeltiin kerran kuukaudessa.

2,3. Huumehoito

[6] -gingerol varastosta (20 mg /ml) valmistettiin etanoliin ja työ- pitoisuudet valmistettiin laimentamalla tämän kannan dimetyyli sufoxide (DMSO). MTT-määritys, 5 x 10

3 solua /kuoppa ihmisen paksusuolen syövän soluja, ja 10

4 solua /kuoppa hiiren IECS ympättiin 96-kuoppaisille levyille. Soluja käsiteltiin [6] -gingerol 48 h, 72 h tai 96 h, ennen kuin suoritetaan MTT-määritystä, ja 16 tuntia ennen anneksiini-V-värjäyksellä. PMA (5 mg /ml) valmistettiin DMSO: hon ja säilytetään -20 ° C: ssa. Kaikissa yhdistelmähoidot [6] -gingerol lisättiin 2 tunnin ajan ennen hoitoon PMA. Solun elinkyvyn /Western blot yhdistelmähoidot, joissa MAP-kinaasin estäjien (2,5 mikromolaarinen U0126, 5 mikromolaarinen SP600125, 1’micromolar SB203580) tai NF-kappaB-inhibiittori (18-mikromolaarinen SN50), soluja käsiteltiin ensin estäjän 1 tunnin ajan ja tämän jälkeen esikäsitelty [6] -gingerol 2 h, minkä jälkeen altistus PMA: ssa 48 tuntia ennen kuin suoritetaan MTT-määritys. Sillä elektroforeettinen liikkuvuus Shift Assay (EMSA), 10

6 soluja SW-480 ympättiin 60 mm: n maljoille ja soluja esikäsiteltiin [6] -gingerol 2 h, ja sitten PMA: lla 30 min.

2.4. Solunelinkykyisyysmääritys

sytotoksiset vaikutukset [6] -gingerol määritettiin MTT-analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [18], ja suhteellinen solujen elävyys prosenttiosuus ilmaistaan ​​[A

570 käsitellyn kuoppiin /A

570 käsittelemättömän kaivojen × 100].

2.5. Anneksiini V-propi- Jodi värjäys

kalvo flip-flop indusoima 16 h hoito [6] -gingerol analysoitiin värjäämällä solut fluoreseiini-isotiosyanaatti-konjugoidulla anneksiini V /PI (Santa Cruz Biotechnology) mukaisesti valmistajan ohjeita ja apoptoottisten solut valokuvattiin fluoresenssimikroskoopissa [19]. Kokonaismäärä solujen mikroskooppinen kenttä on laskettiin faasikontrastimikroskooppia ja määrän fluoresoivia soluja saman alan laskettiin fluoresenssimikroskoopilla. Osa fluoresoivien solujen kokonaismäärään solujen on esitetty prosentteina apoptoottisten solujen. Tämä toistui useilla aloilla saman hyvin ja keskimääräinen otettiin piirtämistä.

2.6. Immunoblottaus

proteiinin kokonaismäärän on eristetty soluista seuraavista käsittelyistä, kanssa tai ilman PMA /[6] -gingerol, tehtiin Western-blottaus, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti sanottuna, 60 mikrogrammaa kokosolulysaatissa erotettiin 10-15% polyakryyliamidigeelillä, blotattiin PVDF-kalvolle, tutkittiin vastaavan vasta-aineen ja havaittiin käyttämällä ECL (Millipore, Billerica, MA, USA).

2.7. Elektroforeettinen liikkuvuus Shift Assay (EMSA) B

EMSA suoritettiin arvioimiseksi DNA-sitova aktiivisuus NF-kappa B: n tai AP-1 transkriptiotekijöitä käsiteltyjen solujen PMA: lla ja /tai [6] -gingerol, kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, 10 mikrogrammaa tumaproteiinit eristetty soluista seuraavista lääkehoitojen, inkuboitiin 30 min

32P-end-leimattu kaksijuosteinen 45-meerioligonukleotidiä NF kappaB (5’TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGG-3 ’; 37 ° C) tai 21-meerinen oligonukleotidi AP-1 (5’-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3 ’; 30 ° C), ja DNA-proteiini-kompleksi eroteltiin 6,6% ei-denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä, joka kuivattiin ja visualisoitiin Phosphor Imager (Personal Molecular Imager FX, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.8. Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolmena rinnakkaisena (n = 3). Virhepalkit edustavat ± keskihajonta (S.D) kokeista. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä ja symbolit *, ** ja *** edustaa P-arvot, p≤0.05, p≤0.005, ja p≤0.001 vastaavasti.

Tulokset

3.1. [6] -gingerol indusoi annosriippuvaista sytotoksisuutta paksusuolen syöpäsoluja ja normaalit suolen epiteelisolujen ei vaikuta

[6] -gingerol seulottiin sen sytotoksisia vaikutuksia SW-480 ja HCT116-soluissa eri pitoisuuksina 5 mikromolaarinen 300 mikromolaarinen, 72 tuntia, käyttäen MTT-määritystä. Annoksesta riippuvat muutokset solun morfologiassa oli selvästi havaittavissa alle faasikontrastimikroskooppia (Fig. 1A). Tulokset on esitetty [6] -gingerol olevan sytotoksinen kohti sekä SW-480 ja HCT116-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla, näkyvä sytotoksisuutta korkeammissa konsentraatioissa tuottaa IC

50-arvo on 205 ± 5 mikromolaarinen ja 283 ± 7 mikromolaarinen vastaavasti (Fig. 1 B ja Fig. 1 C) kantavassa vaikutus oli huomattavampi tapauksessa SW-480 kuin HCT116 ja näin entinen käytettiin kaikissa lisätutkimuksia. Päinvastoin, tulokset MTT-määritystä hiiren normaali IECS havaittiin vain 10-15% sytotoksisuutta jopa kaksi kertaa IC

50 konsentraatio [6] -gingerol vastaan ​​SW-480.The solujen morfologia ja solujen määrä havaittiin laajalti muuttumattomina jopa 500 mikromoolin [6] -gingerol (Fig. 2A). Tutkimalla ajasta riippuva vaikutus [6] -gingerol on tehokas pitoisuuksilla paljasti kasvu sytotoksisuuden SW-480-soluja ajan 48 h 96 h, vaikka solujen elinkelpoisuus hiiren normaali IECS pysyi ennallaan (Fig. 2B) .Nämä tulokset viittaavat siihen, spesifisyys [6] -gingerol aiheuttaen sytotoksisuutta syöpäsoluissa ilman myrkyllisiä normaaleille soluille edes korkeammissa konsentraatioissa.

(A) faasikontrastimikroskopialla kuvia morfologisia muutoksia SW-480-soluja hoidetuilla konsentraatiot [6] -gingerol 72 tuntia. (B) Suhteellinen solujen elinkelpoisuus SW-480-soluja, kun [6] -gingerol hoidon, määritetään MTT-määrityksellä ja ilmaistiin prosentteina käsittelemättömään kontrolliin. 5000 solua /kuoppa SW-480-soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden [6] -gingerol 72 tuntia ennen MTT-määrityksellä. (C) Suhteellinen solujen elinkelpoisuus HCT-116-solut sen jälkeen, kun [6] -gingerol hoitoon. Tulokset on esitetty keskiarvona ja rinnakkaisessa kokeessa ± keskihajonta (SD).

(A) faasikontrastimikroskopialla kuvia IECS käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla [6] -gingerol 72 tuntia. (B) Aika riippuvainen sytotoksisia vaikutuksia [6] -gingerol SW-480 ja IECS 48, 72 ja 96 tuntia. 5000 solua /kuoppa SW-480 ja 10000 solua /kuoppa IECS hoidettiin 48-96 h ilmoitetuilla annoksilla [6] -gingerol ennen MTT-määritys. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta rinnakkaisesta kokeita.

3.2. [6] -gingerol indusoi apoptoosia koolonkarsinoomasoluissa, mutta ei normaalissa suolen epiteelisolujen

Sen arvioimiseksi, onko induktio sytotoksisuuden [6] -gingerol välittyy apoptoosin, kalvo kiikku ja ulkoistamisen phosphotedylserine seurattiin [6] -gingerol käsitelty SW-480-solujen suorittamalla anneksiini V /PI värjäystä. Tulokset anneksiini-V /PI-värjäyksen vahvistettiin alussa tapahtumien apoptotis in [6] -gingerol käsiteltiin SW-480-soluja, kuten käy ilmi annoksesta riippuva nousu fluoresoivia soluja (Fig. 3A) kantavassa tulokset samanlainen tutkimus suoritettiin hiiren IECS osoitti vain vähäinen määrä fluoresoivia soluja, jopa 500 mikromoolin [6] -gingerol treatment.100 mikromolaarinen 5-Fluro urasiilia (5-FU) toimi positiivisena kontrollina anneksiini V värjäystä normaalilla IECS (Fig. 3B ).

(A, ylempi paneeli) SW-480-soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla [6] -gingerol 16 tuntia ja värjättiin anneksiini V /propidiumjodidi (PI) positiivisuutta. Green-fluoresenssi osoittaa anneksiini V: n sitoutumisen vahingoittuneeseen solukalvon alkupuolella apoptoosin ja punainen fluoresenssi ilmaisee PI sitoutumisen paljaan DNA aikana myöhään apoptoosin. (A, alempi paneeli) Graafinen esitys prosenttiosuus anneksiini V /PI positiivinen SW-480-solujen suhteen [6] -gingerol pitoisuus. (B, ylempi paneeli) IECS hoidettiin enintään 500 uM [6] -gingerol 16 tunnin ennen suorittamista anneksiini V-PI värjäystä. Käsittelemällä 100 uM 5-FU: ta käytettiin positiivisena kontrollina apoptoosin. (B, alempi paneeli) edustaja histogrammin prosenttiosuus anneksiini /PI-positiivisia IECS seuraavasti [6] -gingerol /5-FU hoitoon. Tulokset on esitetty keskiarvona kolminkertaisista kokeista ± SD.

analysoitiin myös solu-uutteiden SW-480-soluja käsiteltiin [6] -gingerol varten kaspaasien aktivaatio-8, 9, 3 , 7 ja lohkaisu PARP käyttää immunoblottaus kokeiluja. Kaspaasit ovat perheen kysteiiniproteaasien, jotka aktivoidaan aikana apoptoottisen ohjelman. Havaitsimme merkittävän pilkkominen pro-kaspaasi 8: sen aktiiviset fragmentit (P43 /41) ja prokaspaasi-9 sen aktiiviset fragmentit (p35 /37) (Fig. 4A ja 4B). Aktivointi efektori kaspaasien 3 ja 7 indusoituu myös [6] -gingerol annoksesta riippuvalla tavalla, pilkkomalla prokaspaasi-3 sen aktiiviset fragmentit (p17 /19) ja lisäämällä pilkkominen prokaspaasi-7 sen aktiivinen fragmentti (p20) (Fig. 4C ja 4D). Lopuksi tutkittiin pilkkomalla DNA korjaukseen proteiinia, PARP, joka on substraatti kaspaasi-3.Upon käsittelemällä soluja 200 ja 300 mikromoolin [6] -gingerol, 116 kDa: n muoto PARP on lohkaista 89 kDa fragmentti (kuvio. 4E), joten kaspaasi välittämän apoptoosin. Koska 200 mikromoolin [6] -gingerol on tehokkaasti aktivoimalla kaspaasien johtaa PARP lohkominen ja apoptoosia, tämä pitoisuus on käytetty lisäsignalointisignaalille tutkimuksissa.

SW-480-soluja (10

6 solua /kuoppa) käsitelty osoitetuilla pitoisuuksilla [6] -gingerol 48 tuntia ja koko solu-uutteet Western blotattiin PVDF-kalvolle. Aktivointi kaspaasien ja PARP pilkkominen havaittiin tunnustelemalla blotatun membraanin vasta-aineita kaspaasi-3, 7, 8, 9 ja vastaan ​​PARP. Blotit kehitettiin käyttäen Enhanced Chemiluminescence (ECL). Suhteellinen kertainen erot taajuuskaistojen valvonnan hoitoja kvantifioitiin volyymin analyysin nauhojen avulla Biorad- Määrä Yksi ohjelmisto. p-aktiini toimi latauskontrollina kussakin tapauksessa.

3.3. [6] -gingerol estää PMA-indusoidun aktivoitumisen MAP kinaasien SW-480-solujen

PMA on yleisesti tunnettu kasvain promoottori, joka aktivoi lähes kaikki proteiinikinaasi C (PKC) isotsyymien, jotka ovat näkyvästi alkupään sääntelyviranomaisten on mitogeeniaktivoidun proteiini (MAP) kinaasireitin [22], [23] kantavassa kinetiikka fosforylaation Ras /Raf /solunulkoisen signaalin säädelty kinaasi (ERK1 /2), c-jun NH2-terminaalisen kinaasin (JNK) ja p38 MAP-kinaasi SW-480 solujen hoitovastetta 50 ng /ml (80 nM) PMA eri aikavälein tutkittiin. Western blot -analyysi paljasti aikariippuvainen fosforylaatio ERK1 /2, JNK ja p38.In kaikissa kolmessa tapauksessa, fosforylaatio oli ilmeistä 5 min PMA hoitoon, ja se oli suurimmillaan 30 minuutin ajan ja sitten vetäytyessä 120 min (Fig. 5A). Vaikutus [6] -gingerol on PMA-indusoidun ohimenevä fosforylaation MAP-kinaasien tutkittiin 30 min PMA-käsitellyn SW-480-soluja, esikäsitellään 200 mikromolaarinen [6] -gingerol 2 tuntia. Mielenkiintoista, [6] – gingerol esikäsittely poisti PMA aiheuttama ohimenevä fosforylaation ERK1 /2 ja JNK lähes kokonaan, mutta vain osittain poisti fosforylaatiota p38 MAP-kinaasin in SW-480-soluissa (kuvio. 5B).

(A) Yön yli kasvanut SW-480-soluja käsiteltiin 50 ng /ml PMA: ta eri aikavälein (0-120 min) ja kokosolulysaatissa immunoblotat- PVDF-kalvo, tutkittiin käyttäen vasta-aineita vastaan, fosfo-ERK1 /2, fosfo-JNK ja fosfo-p38 kehittämä ECL. Kinetiikka PMA-indusoidun fosforylaation näistä MAP-kinaasien seurasivat tämän blot (B) SW-480-soluja esi-käsiteltiin 200 uM [6] -gingerol ennen käsittelemällä 50 ng /ml PMA: ta 30 minuutin ajan ja koko solulysaatit immunoblotattiin, testattiin ja havaittiin, kuten edellä. Suhteellinen kertainen ero taajuuskaistojen valvonnan hoidot esitetään alla kunkin kaistan. β-aktiini toimi latauskontrollina kussakin tapauksessa. (C) SW-480-soluja, esikäsitellään ilmoitetuilla pitoisuuksilla [6] -gingerol 2 tuntia, käsiteltiin PMA: lla (50 ng /ml) 30 minuutin ajan. Ydin- uutteet kustakin käsittelystä analysoitiin aktivointia AP-1 tai (D) NF-kappaB, suorittamalla transkription sitoutumismääritys on isotoopilla leimattu AP-1 /NF-kappaB tietyn DNA: ta sitovan koettimen ja analysoida sen elektroforeettisen liikkuvuuden muutos (EMSA). Nuolenpää kussakin tapauksessa osoittaa komplekseja välillä AP-1 /NF-kappaB ja DNA-koetin.

3.4. [6] -gingerol estää transkription sitovaa aktiivisuutta PMA-indusoidun AP-1, mutta ei NF-kappaB, SW-480

PMA on tunnettu aktivaattori transkriptiofaktoreiden AP-1 ja NF kappaB erilaisissa syöpäsoluissa [24], [25], [26], [27]. Määrittää transkriptionaalisen sitovaa aktiivisuutta AP-1: SW-480, indusoituvat vasteena PMA, tumauute soluista käsiteltiin 50 ng /mikrolitra PMA 1 h käytettiin EMSA. Selkeä annosriippuvainen aktivointi AP-1 havaittiin SW-480-solujen upon PMA hoitoon (Fig. 5C, kaista 5) .A annoksesta riippuvaa säätely alaspäin tämän PMA-indusoidun AP-1-sitoutumista todettiin upon 2 h pre HOIDON kanssa [6] -gingerol (Fig. 5C, kaista 6-8). [6] -gingerol esikäsittely ei osoittanut dramaattinen vaikutus transkription sitova ominaisuus NF-kappaB, vaikka oli merkittävä inhibitio sen DNA: ta sitovan 300 mikromolaarisella [6] -gingerol (Fig. 5D; Lane 6-8 ).

3.5. [6] -gingerol estää PMA-indusoidun soluproliferaation SW-480 estämällä ERK1 /2 ja JNK MAP-kinaasin reitit

Jotta edelleen ymmärtää mekanistinen yksityiskohtia takana estäviä vaikutuksia [6] – gingerol PMA-aktivoitu signaali väyliä SW-480, elinkelpoisuutta ja leviämisen SW-480-soluja tarkkailtiin MTT: llä jälkeen käsittelemällä niitä eri yhdistelmiä PMA, [6] -gingerol ja inhibiittorit MAP kinaasien tai NF-kappaB. Ensisijaisesti PMA hoito tehostetun leviämisen SW-480-soluissa merkittävästi. Mutta, [6] -gingerol esikäsittely solujen kaatoi PMA-indusoineet rajusti. Kuitenkin elinkelpoisuus SW-480-soluja, kun [6] -gingerol hoitoon, oli suhteellisesti korkeampi läsnä ollessa PMA (Fig. 6A).

(A) Yön yli kasvanut SW-480-soluja esikäsitellään estäjien ( U0126, SP600125, SB203580 ja ERK1 /2, JNK: n ja p38 MAP-kinaasien, vastaavasti tai SN50 NF-kappaB) 1 h ja sitten käsiteltiin [6] -gingerol 2 h, minkä jälkeen altistus PMA 48 tuntia, ennen kuin suorittamalla solunelinkykyisyysmääritys käyttäen MTT. Suhteellinen kannattavuus SW-480 solut kussakin käsittelyssä edustettuina prosentteina käsittelemättömään kontrolliin. Esitetyt arvot ovat keskiarvoa kolmesta kokeita ± SD. Yhteensä lysaatit soluista, käsiteltiin yhdistelmällä [6] -gingerol kanssa (B) U0126 ja (C) SP600125 estäjät ja asianmukaisen valvonnan hoidot olivat Western blotattiin ja koetettiin anti-kaspaasi-3-vasta-aineen ja blotit kehitettiin käyttäen ECL. Beeta-aktiini toimi latauskontrollina.

Seuraavaksi suoritettiin samat kokeet SW-480-soluja esikäsitellään estäjien jäsenten MAP-kinaasin perheen ja NF-kappaB. U0126 käytettiin spesifinen inhibiittori ERK1 /2-reitin, SP600125 estäjänä JNK aktivaation ja SB203580 kuin inhibiittori p38 MAP-kinaasin pathway.SN50 käytettiin estäjä NF-kappaB transkriptiotekijä. Mikään edellä estäjien ollut sytotoksinen vaikutus SW-480 solut testattu pitoisuus (Fig. 6A). Mutta, esikäsittely U0126 ja SP600125 vähensi PMA-indusoidun proliferaation SW-480-soluja samaan jatkaa, vaikka vähemmässä määrin verrattuna [6] -gingerol esikäsittelyä (Fig. 6A). Nämä tulokset todistavat keskeinen rooli ERK1 /2 ja JNK MAP-kinaasien reittejä indusoimaan SW-480-solujen läsnäollessa PMA. Esikäsittely SB203580 ja SN50 oli vain vähän vaikutusta PMA-indusoi SW-480-solut (Fig. 6A), jotka osoittavat, ettei osallistuminen p38 MAP kinaasireitin ja NF-kappaB transkriptiotekijä tässä prosessissa.

Lopuksi, [6] -gingerol käsittely suoritettiin SW-480-soluja esikäsitellään kunkin edellä mainitun estäjien ennen induktion PMA. Yllättäen, kussakin tapauksessa solujen elävyys laski tasolle samanlainen kuin esikäsittely vain [6] -gingerol ennen PMA hoitoa. Tämä tulos viittaa siihen, että läsnä U0126, [6] -gingerol täydentää tätä ERK1 /2-estäjän kumoamalla aktivointi JNK MAP-kinaasin ja, läsnä ollessa SP600125 se estää ERK1 /2 aktivointi, mikä vähentää solujen elinkelpoisuutta samaan taso näissä molemmissa tapauksissa. Läsnä ollessa SB203580 ja SN50-inhibiittorit [6] -gingerol kykenee sen inhiboivia vaikutuksia sekä ERK1 /2 ja JNK MAP-kinaasin reitit, mikä laskee solujen elävyys samalle tasolle kuin edellä. Nämä tulokset todistavat yhtäläinen osuus molempien ERK1 /2 ja JNK MAP-kinaasin reittejä [6] -gingerol estoa PMA-indusoidun soluproliferaation SW-480. Koska ei ole additiivinen tai synergistinen inhiboiva vaikutus proliferaatioon PMA-käsiteltyjen SW-480-soluja, jotka johtuvat ennen hoitoa yhdistelmällä [6] -gingerol kanssa U0126 tai SP600125, verrattuna ennen hoitoa [6] -gingerol yksin , ERK1 /2 ja JNK MAP kinaasireitin näyttää olevan keskeinen signalointireittejä vaikuttaa [6] -gingerol aikana esto PMA-indusoidun soluproliferaation SW-480.

jotta testata, onko estäviä vaikutuksia on PMA-indusoidun solun proliferaation SW-480-soluihin [6] -gingerol ja U0126 tai SP600125 oli apoptoosivälitteisiin, me seurannut kaspaasi 3 kustakin näistä hoidoista Western-blottauksella. Havaitsimme pilkkominen prokaspaasi 3 kaikissa hoitoja, joihin [6] -gingerol, U0126 tai SP600125 ja yhdistelmänä [6] -gingerol ja näiden estäjien (Fig. 6B ja 6C). Se oli myös mielenkiintoista huomata, että mitään ylimääräistä hajoamista kaspaasi 3 äiti vyöhyke syntyy, kun inhibiittorit ja gingerol käytettiin yhdessä. Tämä todistaa, että alas-säätely ERK1 /2 /JNK /AP-1-reitin aiheuttamien PMA, vastaa estäviä vaikutuksia [6] -gingerol PMA-indusoidun soluproliferaation SW-480.

keskustelu

anti-cancer ja anti-inflammatoriset ominaisuudet [6] -gingerol on tunnustettu jo pitkään, ja monet tutkimukset ovat eri molekyylitason mekanismeista näitä ominaisuuksia. Estovaikutukset [6] -gingerol syöpiä vastaan ​​eri alkuperää raportoitu aikaisemmin. [6] -gingerol on osoitettu olevan erityisen tehokkaita ihon karsinooma ja inhiboimaan angiogeneesiä endoteelisolujen [28], [29]. Ginger on ravintolisä ja tärkeä ainesosa monia perinteisiä lääkkeitä, on loogista tutkia, mitä vaikutuksia [6] -gingerol syöpää maha-suolikanavan, kuten paksusuolen syöpä. Lisäksi farmakokineettiset tutkimukset aktiiviset komponentit inkivääri peräisin suun kautta inkivääri uutteita ihmisillä havainnut merkittäviä määriä [6] -gingerol joko vapaassa tai konjugaatteina, plasmassa ja paksusuolen kudokset [30], [31]. Toinen tutkimus hyötyosuuteen [6] -gingerol rotilla ehdotti, että kun suun kautta havaitaan pitoisuuksina 4,3 mikrog /ml plasmassa kymmenen minuutin kuluttua annosta. Samassa tutkimuksessa määritettiin myös sen korkea jakautuminen kudoksiin korkein pitoisuus kudoksissa ruoansulatuskanavassa. Kudos plasma-suhde on [6] -gingerol ilmoitettiin olevan 1 ja johtui Lipofiilisuuden [32]. Kaikki nämä seikat tukevat tutkimuksen syöpälääkkeen vaikutuksia [6] -gingerol paksusuolen syöpä.

ensimmäinen vuosikymmen 21

luvulla oli lisääntynyt useita tutkimuksia kuvaavat mekanismeja anti -cancer vaikutukset phytochemicals. Tutkimukset mekanistinen arviointiin syövän ominaisuuksia on [6] -gingerol vastaan ​​erilaisia ​​syöpiä tarjotaan arvokasta tietoa sen useita toimintamekanismeja aikaansaamisessa sytotoksisen tai pro-apoptoottisia vaikutuksia syöpäsoluissa. Eräät viimeaikaiset raportit syövän toimintaa [6] -gingerol vastaan ​​paksusuolen syövän esitetään eri mekanismit toimia eri koolonsyöpäsolulinjaa [13], [14], [15], [33]. Tämä tutkimus on SW-480 solulinja osoittaa

in vitro

sytotoksisuus [6] -gingerol kanssa IC

50 arvoon 205 mikromolaarinen. Aikaisempi tutkimus

in vitro

sytotoksisia vaikutuksia [6] -gingerol SW-480-solulinja raportoitu vain 17% solukuolema tässä pitoisuudessa [13] .Nämä erot suuruus vaikutukset saattavat johtua vaihtelut käytetty menetelmä tutkii sytotoksisuutta. On myös huomattava, että samassa tutkimuksessa raportoitu vain 13% sytotoksisuuden LoVo soluihin, kun käsitellään 200 mikromoolin [6] -gingerol 72 tuntia, joka myöhemmin raportoitu eri tutkimuksessa 75% 50 mikromolaarinen samassa solulinjassa kuluttua 48 h hoidon [15]. Annoksesta riippuvaa kasvu apoptoottiset solut (anneksiini-V /PI-positiivisia soluja) SW-480-solujen käsittelyllä [6] -gingerol, jopa 25-taittuu 300 uM, osoitetaan, että sytotoksisuus indusoitiin pääasiassa apoptoosin. Aiemmat tutkimukset raportoitu sekä solu- syklin pysähtymisen ja apoptoosin kuin vaikutusmekanismi [6] -gingerol [13], [34]. Kaksi-kertainen apoptoosin ilmoitettiin olleen samoja ehtoja SW-480 [13], mutta ne myös osoittivat merkittävää G2 /M pidätys solusyklin vastauksena [6] -gingerol hoitoa. Monissa aiemmissa raporteissa ehdotti, että [6] -gingerol indusoi apoptoosin ainoastaan ​​tai lähellä 300 mikromolaarinen syöpäsoluissa [13], [34], [35], [36] ja tämän alapuolella keskittyminen se aiheuttaa sytotoksisuus pääasiassa muilla mekanismeilla. Kuitenkin havaitsimme fluoresoivia soluja SW-480 hoidettu jopa 100 mikromolaarisella [6] -gingerol, selvästi viittaa varhaisen apoptoosin tapahtumia jopa pienemmillä pitoisuuksilla. Lisäksi annoksesta riippuvaa kaspaasien aktivaatio-8,9, 3 ja 7 tutkimuksessamme vahvistivat lisäksi apoptoosin merkittävä mekanismi solukuoleman SW-480-soluja käsiteltiin [6] -gingerol. Kaspaasi-9 [6] -gingerol vahvistaa osallistumista mitokondrioiden väylän [6] -gingerol välittämän apoptotis. Kuitenkin lohkaisu kaspaasi-8 indusoi [6] -gingerol ei saa olennaisesti ehdottaa osallistumista reseptorivälitteisen reitin, kuten mitokondrioiden reitti voi myös johtaa pilkkominen kaspaasi-8: sta pilkkomalla BH3 vuorovaikutuksessa-domain syöttämällä agonistin (BID ) [37]. Apoptoosin SW-480, joka on p53-mutantti koolonisyöpäsolulinja, jonka [6] -gingerol on erityisen mielenkiintoinen, koska p53-mutanttien solujen katsotaan olevan vastustuskykyisiä standardin kemoterapeuttisia ja säteilyn [13], [36]. p53-riippumattoman apoptoosin induktiolle [6] -gingerol on raportoitu aiemmin haimasyövän solulinjoissa, joissa ilmentyminen sykliini-riippuvaisen kinaasin estäjä, p21

CIP1, lisättiin riippumaton p53 ilmentymistä johtaa laskevan sykliini A ja