Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hoito ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja peräsuolen syöpä (CRC) on muuttunut merkittävästi viime vuosina käyttöönoton kasvutekijän reseptorin (EGFR) estäjien kliininen käytäntö. Ymmärtämistä mekanismeja, jotka säätelevät solujen herkkyys näille lääkkeille on tarpeen niiden optimaalisesta käytöstä.

In vitro malli kehittynyt resistenssi kaksi tyrosiinikinaasiestäjät (TKI) kohdistaminen EGFR, erlotinibi ja gefitinibiä, ja joka TKI kohdistaminen EGFR ja VEGFR, vandetanib, kehitettiin jatkuvasti käsittelemällä ihmisen NSCLC solulinjaa CALU-3 ja ihmisen CRC solulinja HCT116 kanssa nousevia annoksia kunkin lääkkeen. MTT, western blot-analyysi, muuttoliike, invaasio ja kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeenmuodostuskyvyn testit suoritettiin in vitro ja kokeiluja perustettu ksenograftien kateenkorvattomissa nude-hiirissä suoritettiin in vivo herkillä, villityypin (WT) ja TKI-kestävä CALU-3 ja HCT116 solulinjat.

verrattuna WT CALU-3 ja HCT116 ihmisen syöpäsoluja, TKI-resistenttejä solulinjoja osoitti merkittävää kasvua tasojen aktivoitu, fosforyloidun AKT, MAPK: n, ja surviviinin. Kun otetaan huomioon rooli RAS ja RAF alavirran signaalit sekä EGFR ja VEGFR polkuja, käsittelimme resistenttien solujen sorafenibilla, estäjä C-RAF, B-RAF, c-KIT, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3, ja PDGFR-β. Sorafenibi vähensi aktivointia MEK ja MAPK ja aiheutti soluproliferaation inhibointi, invaasio, muuttoliike ankkurista riippumattomaan kasvuun in vitro ja kasvaimen kasvun in vivo kaikki TKI-resistenttejä CALU-3 ja HCT116-solulinjat.

Nämä tiedot viittaavat siihen, että vastustuskyky EGFR: n estäjien on perustuu pääosin RAS /RAF /MAPK-reitin ja voidaan voitti käsittelemällä sorafenibin.

Citation: Morgillo F, Martinelli E, Troiani T, Orditura M, De Vita F, Ciardiello F (2011) antituumorivaikutuksen Sorafenibi Human Cancer Cell Lines kehittynyt vastustuskyky EGFR ja VEGFR tyrosiinikinaasiestäjiksi. PLoS ONE 6 (12): e28841. doi: 10,1371 /journal.pone.0028841

Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerchen (CNR), Italia

vastaanotettu: toukokuu 25, 2011; Hyväksytty: 16 marraskuu 2011; Julkaistu: 09 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Morgillo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Milan, Italia. Floriana Morgillo on saaja European Society of Medical Oncology (ESMO) translaatiotutkimuksen yhteyteen. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) on keskeinen säätelijä syöpäsolujen lisääntymistä ja etenemisen useissa ihmisen syöpätyypeissä. Kliinistä tehoa EGFR: n estäjien (setuksimabi, panitumumabi, erlotinibi, gefitinibi ja vandetanib) käyttöön kliinisessä käytännössä metastaattisen syöpien rajoittuu potilaiden alaryhmään, jossa suurin osa syöpäpotilaiden osoittaa joko luontainen tai hankittu resistenssi näille lääkkeille [1].

viime edistymistä.Ehdotus tietoa syövän biologian ja huumeisiin resistenttiysmekanismi ovat tunnistaneet, joukossa solunsisäinen signalointi reittejä, jotka toimivat alas-virtana EGFR, Akt ja RAS /RAF /-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) reitit, kuten suuria vastuussa syövän kehittymiseen solun resistentiksi EGFR: n estäjien [2] – [4].

olemme kuitenkin äskettäin osoitettu, että meidän in vitro ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) malli hankitun resistenssin erlotinibille ja gefitinibin hoito useita aineita, jotka tiedetään kohdistaa suoraan tai välillisesti AKT-signalointireitin, kuten mainos LY294002, deguelin ja everolimuusi, ei ollut tehokas estämään erlotinib- (ERL-) ja gefitinibi – (GEF-) resistenttien syöpäsolujen lisääntymistä [5].

Toisaalta, mutaatiot K-RAS-geeni on kuvattu niin NSCLC ja peräsuolen syöpä (CRC) potilasta vastuulliseksi huono ennuste ja huono vaste EGFR: n estäjien [6]. Nämä mutaatiot aiheuttavat KRAS proteiineja kerääntyä GTP-sitoutuneen, aktiivinen muoto johtaa konstitutiivinen, kasvutekijän reseptorin riippumaton aktivaatio KRAS alavirran signalointia tuumorisoluissa [7]. Kehittäminen hoitostrategioita potilaille, joilla KRAS mutaatioita on siten tärkeä kliininen tavoite. RAF seriini-treoniini-kinaasit ovat pääasiallinen efektoreita RAS MAPK-signalointireitin, ja on näin ollen potentiaalinen kohde syövän hoidossa. Tähän mennessä menestynein kliininen estäjä RAF toiminta on sorafenibia (Nexavarin, BAY 43-9006) [8] – [10], suun kautta otettava multi-kohdistetun estäjä, joka estää aktivoitumista C-RAF, B-RAF (sekä villityypin ja aktivoitu V600E mutantti), c-KIT, FLT-3, RET, verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptori 2 (VEGFR-2), VEGFR-3, ja verihiutaleiden kasvutekijän reseptorin β (PDGFR β) [8] – [10], nykyisin hyväksytty metastaattisen munuaissyövän (RCC) ja pitkälle maksasolusyövän (HCC), ja tutkittavana muiden pahanlaatuisten kasvainten. Sorafenibi vaikuttaa kasvaimen kasvua suoraan estämällä kasvainsoluproliferaation ja apoptoosin edistämiseksi erilaisissa kasvaimen tyyppejä sekä estämällä kasvaimen aiheuttama neoangiogeneesiin.

laboratorio on äskettäin esittänyt todisteet synergistisen vuorovaikutuksen sorafenibia ja erlotinibi tai välillä sorafenibia ja setuksimabi, monoklonaalinen vasta-aine on kohdistettu solunulkoinen alue EGF-reseptorin, joka paneeli NSCLC ja peräsuolen syöpä (CRC) solulinjat,

in vitro

ja

in vivo

, joka mukana on merkitty ja jatkuva estyminen MAPK- ja AKT-riippuvaista solunsisäisiä signaaleja [11].

Oletimme, että sorafenibihoidon voisi voittaa indusoi EGFR-TKI-vastus sen kyky estää useita kasvutekijä reseptori-odotuksiin signaaleja. Lisäksi koska sorafenibi lohkot B-RAF, ja se voisi olla tehokas syövän solulinjoissa ilmentävät aktivoivan K-RAS mutaatioita.

Tässä tutkimuksessa olemme raportoivat kehityksestä ja karakterisointiin ihmisen NSCLC ja CRC solulinjoja, joilla on hankittu vastustuskyky kaksi tyrosiinikinaasiestäjät (TKI) kohdistaminen EGFR, erlotinibi ja gefitinibi, sekä TKI kohdistaminen EGFR, VEGFR ja RET, vandetanib, sekä antituumorivaikutukset sorafenibin näissä resistenttien syöpäsolujen linjat.

tulokset

kehittäminen ja karakterisointi TKI-resistenttien CALU-3 ja HCT116 syöpäsolujen

ihmisen NSCLC CALU-3 solulinja ja ihmisen CRC HCT116 solulinja satama villityypin EGFR geeni ja aktivoivan K-RAS (KRASp.G13D) geenimutaatio. Toisin kuin muut K-ras-mutaatioiden, tämä mutaatio on kuvattu ei vaikuttavat herkkyyttä anti-EGFR-hoito, erityisesti setuksimabin [11]. Nämä syöpäsolulinjoissa on aiemmin tunnettu ryhmämme ilmentämiseen neljän EGF liittyvät kasvutekijän reseptoreita (EGFR, ErbB2:, erbB3 ja erbB4) ja kolme VEGF-reseptorit (VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 ), sekä ilmentymisen kolmen EGFR: n ligandien (amfireguliini, EGF ja TGFa) ja kolme VEGFR-ligandien (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C), kvantitatiivisella RT-PCR: llä (qRT-PCR) [12]. Kaikki testatut ligandi-mRNA: t ilmennettiin CALU-3 ja HCT116 solulinjoissa. CALU-3-soluissa ilmaisivat myös EGFR mRNA, kun taas alhainen ErbB2 ja ErbB3 mRNA: t olivat mitattavissa. VEGFR-2 ja VEGFR-3 mRNA: n ekspressiota havaittiin CALU-3-solulinjassa. Expression EGFR ja sen ligandien viittaa siihen, että näillä ihmisen syöpäsolulinjoissa EGFR-odotuksiin autokriinisten reitti on merkitystä syövän solujen lisääntymisen. Itse asiassa, CALU-3 ja HCT116-solut ovat kasvua inhiboidaan käsittelemällä selektiivinen EGFR TKI, kuten gefitinibi tai erlotinibi [13]. Lisäksi nämä syöpäsolut ilmentävät sekä VEGF ligandeja ja VEGFRs ja ovat kasvu estyy käsittelemällä antiangiogeenisestä TKI [13].

Siksi CALU-3 ja HCT116-solut valittiin malliksi tutustua hankittu resistenssi mekanismeja hoito EGFR TKI erlotinibin ja gefitinibi, tai dual EGFR /VEGFR tyrosiinikinaasin estäjä vandetanib.

gefitinib- (GEF-R), erlotinib- (ERL-R) ja vadetanib- (VAN R) resistenttejä solulinjoja saatiin jatkuvasti viljelemällä CALU-3 ja HCT116-solut, kun läsnä on kasvavia annoksia kutakin lääkeainetta 12 kuukautta. Perustamisen jälkeen kolmen eri TKI-resistenttejä CALU-3 ja kolme erilaista TKI-resistenttejä CALU-3 HCT116 solulinjat, me tunnettu siitä, niiden resistentti fenotyyppi tekemällä soluproliferaatiomääritykset, kun läsnä on kunkin nämä inhibiittorit. Kuten on esitetty taulukossa 1, noin 10-kertainen lisäys IC

50 kunkin TKI-resistentti solulinja, verrattuna emo-soluja havaittiin. ERL-R, GEF-R ja VAN-R CALU-3 ja HCT116 ihmisen syövän solulinjat rajat resistenttejä joko gefitinibi, erlotinibi tai vandetanib hoitoon. Seuraavaksi me vahvisti vakaiden TKI-resistenttejä CALU-3 ja HCT116 syöpäsolujen huume-viljelyalusta. Itse asiassa, kaikki kuusi TKI-resistenttejä solulinjoja voivat kasvaa ilman kunkin lääkkeen pitkiä aikoja (kolmesta kuuteen kuukautta), ja säilyttävät TKI-resistentti fenotyyppi (tuloksia ei ole esitetty).

edelleen karakterisoimiseksi TKI-resistenttejä CALU-3 ja HCT116-solulinjat, tutkimme ero proteiinin ilmentymisen keskuudessa villityypin, herkkä CALU-3 ja HCT116-solut ja niiden TKI-resistenttien johdannaisten.

aktivointi EGFR johtaa monimutkaiseen solunsisäisen signaloinnin, joka sisältää aktivoinnin pro-selviytymisen PI3K /AKT-reitin ja mitogeeninen RAS /RAF /MEK /MAPK-reitin [13], [14]. Me siis tutkittava immunoblottauksella analyysi näiden molekyylien reittejä. Kuten kuviossa 1 on esitetty, EGF-stimuloidun aktivointi EGFR tehokkaasti estetty WT ja ERL-R, GEF-R ja VAN-R-soluja, kuten osoittaa EGFR auto-fosforylaation (P-EGFR).

Western blotting-analyysi EGFR ja alas-stream signaalireaktioteissä vanhempien ihmisten CALU-3 ja HCT116-solut (WT) ja niiden TKI-resistenttejä johdannaiset (ERL-R, GEF-R, VAN-R). β-aktiini sisällytettiin latauskontrollina.

Koska aktivoitu, fosforyloidun Akt-muotoja ja MAPK ovat keskeisiä solunsisäisiä välittäjiä kasvutekijä-aktivoitujen solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota signaalit [13], [14] tutkivat aktivaatiotilaa näiden molekyylien polkuja voi olla kiinnostusta ymmärtämään resistenssimekanismeja. MAPK: ja AKT kasvaessa niiden fosforyloidun muodoissa (P-MAPK: n ja P-AKT) sekä kasvua Surviviiniproteiini tasot havaittiin kaikissa kolmessa TKI-resistenttejä CALU-3-solulinjojen ja kaikissa kolmessa TKI-resistenttejä HCT116 solulinjoja verrattuna niiden vanhempien vastine (kuva 1).

Yhteenvetona nämä tulokset viittaavat siihen, että tässä syöpäsolun mallin hankittu resistenssi kolmelle eri TKI, aktivointi AKT- ja MAPK-odotuksiin solunsisäisiä signaaleja voi olla vastuussa syöpäsolujen kasvua läsnäollessa joko selektiivisen anti-EGFR TKI, kuten gefitinibi tai erlotinibi, tai laajavaikutteiset TKI, kuten vandetanib.

vaikutukset sorafenibin on TKI-resistenttejä CALU-3 ja HCT116 syöpäsolujen kasvua

valossa rooli RAS ja RAF alavirran välittäjinä sekä EGFR ja VEGFR signaaleja solun pinnalla, testasimme anti-proliferatiivista vaikutusta sorafenibin, multi- kohdennettuja estäjä, estää aktivointi C-RAF, B-RAF, c-KIT, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3, ja PDGFR-β [8] vanhempien WT ja TKI-resistenttejä CALU -3 ja HCT116 syöpäsoluja. Merkittävä solujen kasvun esto havaittiin sekä WT CALU-3-soluissa ja WT HCT116-solut ja niitä vastaavat kolme TKI-resistenttien johdannaisten seuraavat sorafenibihoidon, jossa IC

50 vaihtelevat 0. 1-0,5 uM, (kuvio 2 ) Meillä edelleen tunnettu vaikutuksia sorafenibihoidon solunsisäisiin signalointi Western-blottauksella. Kuten on esitetty kuviossa 3, hoitoon ERL-R, GEF-R ja VAN-R CALU-3 ja HCT116-solujen sorafenibilla 48 tuntia ei vaikuta kokonais-MEK ja MAPK-proteiinien tasot, kun se aiheutti huomattavaan vähenemiseen fosforyloidun, aktivoituja muotoja MEK (P-MEK) ja MAPK (P-MAPK). Lisäksi olemme tutkineet aktivoinnin tilan kaikki molekyylikohteista sorafenibiannos jonka studing proteiinin ekspressiotasot C-RAF, B-RAF, c-Kit: hen, flt-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3 ja PDGFRβ, ja niiden phosphoryation aseman western blotting-analyysi. Kaikista tavoitteet sorafenibia toimintaa, vain C-RAF ja B-RAF, johti aktivoituu kestävä CALU-3 ja HCT116 syöpäsolun linjat, ja siksi voimakkaasti inhiboivat sorafenibihoidon (kuva 3).

MTT soluproliferaatiota määritykset suoritettiin vanhempien keuhkoadenokarsinooma CALU-3 ja peräsuolen syövän HCT116-soluissa. (WT) ja niiden TKI-resistenttien johdannaisten (ERL-R, GEF-R, VAN-R), käsiteltiin kolme päivää osoitettujen konsentraatioiden sorafenibin. Tulokset edustavat keskiarvoa (± SD) kolmesta eri kokeesta, joista kukin suoritettiin neljänä rinnakkaisena.

Western blotting-analyysi C-RAF, B-RAF, MEK ja MAPK aktivointi käsittelyn jälkeen ilmoitetun pitoisuuden sorafenibi keuhkojen adenokarsinoomaa CALU-3 ja peräsuolen syövän HCT116-solut TKI-resistenttejä johdannaiset (ERL-R, GEF-R, VAN-R). β-aktiini sisällytettiin latauskontrollina.

Effects of sorafenibihoidon on invaasio, muuttoliike ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua TKI-resistenttien CALU-3 ja HCT116 syöpäsolujen

on ehdotettu, että syöpäsolut käynnissä resistenttejä EGFR lääkitys saattaa saada aggressiivisempi ja metastaattisen fenotyypin lisääntynyt kyky hyökätä, siirtyä ja muodostaa pesäkkeitä puolikiinteässä väliaineessa [15]. Siksi arvioimme nämä ominaisuudet TKI-herkillä WT CALU-3 ja HCT116 syöpäsolujen ja niiden TKI-vastustuskykyisiä johdannaisia. Kuten kuviossa 4, WT CALU-3 ja HCT116-solut osoittivat vähän tai ei kykyä hyökkäyksen ja muuttoliike. Päinvastoin, kaikki TKI-resistenttejä CALU-3 ja HCT116 solulinjat osoittivat merkittävää invasiivisia ja muuttavien kykyjä. Lisäksi niiden kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeen kasvu oli lisääntynyt noin 3-kertainen verrattuna WT-solut (kuvio 4). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että syöpäsolujen linjat hankittu resistenssi erlotinibille, gefitinibi ja vandetanib saaneet enemmän invasiivisia ja mahdollisesti enemmän metastaattinen käytös.

Anchorage riippumattoman kasvun (A), muuttoliike (B) ja invaasio (C), arvioitiin TKI-resistenttejä CALU-3 ja HCT116 johdannaiset (ERL-R, GEF-R, VAN-R) käsittelyn jälkeen ilmoitettuina pitoisuuksina sorafenibin. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, kussakin tehdään kolmena kappaleena. Edustavia kuvia näytetään siirtymiselle ja hyökkäys kyvyt CALU-3 WT ja kestävä solulinjoissa.

vieressä arvioitiin vaikutuksia Sorafenibin on invasiivisia ja muuttavien ominaisuuksia TKI vastustuskykyisten CALU-3 ja HCT116 solulinjat. Emme vaikutus testattiin sorafenibihoidon on TKI-herkkiä WT syöpäsolulinjoja huomioiden puuttuessa muuttavien ja invasiivisen kyvyn. Merkittävä annoksesta riippuva esto hyökkäyksen ja muuttoliikkeen havaittiin kaikissa TKI-resistenttejä solulinjoja seuraavista sorafenibihoidon (kuva 4).

Vaikutukset Sorafenibin on TKI-resistenttejä CALU-3 ja HCT116 tuumoriksenografteissa

lopulta tutkittiin in vivo tuumorin vastainen aktiivisuus sorafenibin kantavissa nude-hiirissä WT CALU-3 ja HCT116 tai TKI-resistenttejä CALU-3 ja HCT116-solulinjoja, jotka oli kasvatettu subkutaanisesti ksenografteja. WT CALU-3 ja HCT116 tuumoriksenografteja, sorafenibihoidon aiheutti merkittävän vähenemisen kasvaimen koon verrattuna kontrollieläimiin käsittelemättömiin hiiriin. Esimerkiksi päivänä 35 lähtöpisteestä hoidon jälkeen kasvaimen tilavuus hiirillä WT tuumoriksenografteja ja käsiteltiin sorafenibilla oli vastaavasti 38% ja 31% vuonna CALU-3 ja HCT116 verrattuna ohjata käsittelemättömiin hiiriin (kuvio 5, 6 ). Lisäksi hiirissä, jotka kantoivat ERL-R, GEF-R tai VAN-R CALU-3 ja HCT116 tuumoriksenografteja, sorafenibihoidon indusoi merkittävästi vähentää kasvaimen kasvua (kuvio 5, 6). Tässä suhteessa, päivänä 35 lähtöpisteestä hoidon jälkeen kasvaimen volyymit sorafenibin-käsiteltyjen hiirten vaihteli välillä 27% ja 40%, verrattuna ohjata käsittelemättömiin hiiriin.

A, Lapsilukko (WT) CALU-3 syöpäsolujen; B, GEF-R CALU-3 syöpäsolujen; C, VAN-R CALU-3cancer solut; D, ERL-R CALU-3 syöpäsoluja. Kateenkorvattomiin nude-hiiriin ruiskutettiin ihonalaisesti selkäpuolen kylkeen 10

7 syöpäsoluja. Sen jälkeen 7-10 päivää (kasvaimen keskimääräinen koko 75 mm

3), hiiriä käsiteltiin kuten Materiaalit ja menetelmät 5 viikkoa. Jokainen hoitoryhmä koostui 8 hiirtä. Tiedot edustavat keskiarvoa (± SD). Opiskelijan

t

testiä käytettiin vertaamaan kasvainten kokoja eri hoitoryhmissä päivänä 35 jälkeen hoidon aloittamisesta. A, CALU-3 WT: sorafenibille lla kontrolliryhmään verrattuna (kaksipuolinen p 0,001); B, CALU-3 GEF-R: Sorafenibin lla kontrolliryhmään verrattuna (kaksipuolinen p 0,001). C, CALU-3 VAN-R: Sorafenibin lla kontrolliryhmään verrattuna (kaksipuolinen p 0,001); D, CALU-3 ERL-R: Sorafenibin lla kontrolliryhmään verrattuna (kaksipuolinen p 0,001).

, Lapsilukko (WT) HCT116 syöpäsoluja; B, GEF-R HCT116 syöpäsolujen; C, VAN-R HCT116 syöpäsolujen; D, HCT116 syöpäsoluja. Kateenkorvattomiin nude-hiiriin ruiskutettiin ihonalaisesti selkäpuolen kylkeen 10

7 syöpäsoluja. Sen jälkeen 7-10 päivää (kasvaimen keskimääräinen koko 75 mm

3), hiiriä käsiteltiin kuten Materiaalit ja menetelmät 5 viikkoa. Jokainen hoitoryhmä koostui 8 hiirtä. Tiedot edustavat keskiarvoa (± SD). Opiskelijan

t

testiä käytettiin vertaamaan kasvainten kokoja eri hoitoryhmissä päivänä 35 jälkeen hoidon aloittamisesta. A, HCT116 WT: sorafenibille lla kontrolliryhmään verrattuna (kaksipuolinen p 0,001); B, HCT116: sorafenibi lla kontrolliryhmään verrattuna (kaksipuolinen p 0,001). C, HCT116 VAN-R: Sorafenibin lla kontrolliryhmään verrattuna (kaksipuolinen p 0,001); D, HCT116 ERL-R: Sorafenibin lla kontrolliryhmään verrattuna (kaksipuolinen p 0,001).

Keskustelu

aktivointi EGFR ja VEGFR polkuja avainasemassa kehitettäessä ja etenemistä enemmistön epiteelisyövissä lukien NSCLC ja CRC. Kuitenkin vain potilaiden alaryhmässä eduista hoitojen lääkkeillä kohdistettu EGFR tai VEGFR reitit [16]. Silloinkin aluksi vastaaville potilaille toissijainen tai hankitun resistenssin ilmenee aiheuttavan syöpää etenemisen ja hoidon epäonnistumisen. Useat molekyylitason mekanismeja on ehdotettu selittämään hankinnan syöpäsolujen vastustuskyky molekulaarisesti kohdistettuja syöpälääkkeet [16].

Cancer solun resistentiksi EGFR antagonistit voisivat johtua useista syistä. Isäntä liittyviä mekanismeja, kuten vialliset immuunijärjestelmän toimintaa, nopea aineenvaihdunta tai huono imeytyminen, ovat vastuussa luontaisen tai ensisijainen vastus. Lisäksi geneettinen epävakaus näiden solujen tuottaa syöpäsolun kloonia on kehittynyt resistenssi seuraava pitkäaikainen altistuminen EGFR: n estäjien. Koska EGFR salpaavat sähköisestä aktivoitumista useiden solunsisäisten reittien, jotka ohjaavat solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, apoptoosin, metastaattinen kyky, invaasio ja kasvainten angiogeneesissä, on selvää, että useat eri molekyyli- muutokset voisivat olla vastuussa resistenssin kehittyminen nämä inhibiittorit [ ,,,0],16].

Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että syöpäsoluja, jotka kehittävät vastustuskyvyn EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittorit seuraavat pitkään hoidon (hankittu resistenssi) näytteille aktivoitu RAS /RAF /MAPK ja AKT polkuja. EGFR-riippumaton aktivaatio näiden alavirran reittien tekee syöpäsolujen herkkä EGFR inhibition ja on yksi yleisimmin raportoituja syistä kestävyys EGFR kohdistetun hoidon kiinteitä kasvaimia.

konstitutiivista aktiivisuutta vähintään yhden näiden kahden reitin on osoitettu pystyä määritellään kestävä fenotyypin vaikuta hoidon gefitinibin kanssa ja setuksimabin [2], [17].

pysyviä fosforylaation RAS /RAF /MAPK ja /tai AKT- polkuja voidaan selittää aktivoitumista solun pinnan reseptoreihin kuin EGFR, kuten insuliinin kaltainen kasvutekijä-1-reseptorin (IGF-1 R) ja MET [18] – [21], joiden tiedetään olevan iperexpressed tai aktivoida läsnäollessa pysyviä estämällä EGFR.

Lisäksi lisääntynyt reseptorin riippumaton aktiivisuus RAS /RAF /MAPK ja /tai AKT reitit voivat tulokset suorasta geenimonistuksen, aktivoivat /inaktivoivat mutaatiot tai tappio molekyyli- säädin [ ,,,0],22], [23].

kuitenkin, kun taas inhibitio AKT reitin ei häiritse leviämisen resistenttien solujen inhibitio RAF /MEK /MAPK-reitin sorafenibihoidon voimakkaasti vähentää solujen kasvua ja selviytymistä . Todellakin, joukossa kaikki molekyylikohteista sorafenibia, vain C-RAF ja B-RAF, johti aktivoituu resistenttejä solulinjoja luultavasti alkupään reseptorien ei testattu tässä työssä; mutta tämä tieto viittaa siihen, että aktivointi RAF riippuvaisten solunsisäisiä signaaleja voisi olla tärkeä mekanismi hankinnan vastustuskykyä EGFR terapia.

RAS /RAF /MAPK -signalointireitistä on lupaava terapeuttinen kohde antanut keskeinen rooli säätelyssä nisäkkään soluproliferaation, uudelleensijoittamista solunulkoisia signaaleja ligandisitoutuneena reseptorityrosiinikinaasien solun pinnalta tumaan kautta kaskadin tietyn fosforylaation tapahtumia. Mutaation asema RAS ja B-RAF geenien on osoitettu vaikuttavan herkkyys kasvainten solulinjat inhibiittorit EGFR [24]. Kuitenkin terapeuttiset kohdentamista RAS-reitin toistaiseksi epäonnistuneet. RAF seriini-treoniini-kinaasit ovat pääasiallinen efektoreja RAS ja pidetään tärkeä kohde syövän hoidossa. Aineet, kuten sorafenibille jotka ohittavat RAS ja estävät efektorimolekyyleille alavirtaan mutantti GTPaasi (esim RAF) arvioidaan parhaillaan. Prekliiniset tiedot viittaavat siihen, että sorafenibi estää solujen kasvua aiheuttamalla G1 pidätys NSCLC solulinjoissa riippumaton KRAS genotyypin [8].

Toinen mahdollinen mekanismi resistenssin EGFR esto voi olla lisääntynyt angiogeeninen potentiaali tehostetun endoteelisolujen leviämisen ja läpäiseväksi. Perusteella tämän informaatiota, useissa prekliinisissä tutkimuksissa on toteutettu, jonka tarkoituksena on löytää vaikutuksia yhdistetyn kohdistaminen erbB ja VEGF reittejä käyttäen erilaisia ​​lähestymistapoja [25] – [29]. Sen lisäksi, että mahdollisuus käyttää anti- EGFR hoitomuotojen yhdistelmänä anti-VEGF lääkkeiden joukon tyrosiinikinaasien jotka estävät sekä EGFR ja VEGF-reseptori TK kehitettiin, kuten vandetanib, joka on osoittanut merkittävää aktiivisuutta monoterapialla ja yhdistettynä perinteiseen kemoterapeuttisten useissa ihmisen kasvaintyypeissä [27] – [29].

Usein EGFR estäjä kestävä ihmisen syövän solulinjoissa näytteille, koska yhteinen piirre, VEGFR yliekspressio, lisääntynyt eritys VEGF ja istukan kasvu tekijä, ja täydennetty muuttoliike ominaisuuksia. Sorafenibi estää useita RTK: t, jotka osallistuvat uudissuonittumista, mukaan luettuina verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptorin (VEGFR) -2 ja VEGFR-3 [30]. Angiogeneesin inhibitio voisi sen vuoksi odottaa myötävaikuttaa kasvaimen kasvun inhibition tämän lääkkeen lisäksi sen vaikutukset RAF signalointia. Vaikka sorafenibi on aiemmin osoitettu estävän kasvua ihmisen erilaisten kasvainten hiirissä [8], on ollut vaikea mitata suhteellinen osuus sen on antiangiogeeninen aktiivisuus, ja sen suora antituumorivaikutus välittämä RAF inhibition. Lisäksi työmme, kehittäminen ihmisen syöpäsoluja resistenttejä vandetanib, sulkea pois sitä mahdollisuutta, että sorafenib’efficacy voi riippua estämällä VEGFR.

Todisteet myönteistä vuorovaikutusta sorafenibia ja anti-EGFR lääkkeet on hiljattain toimittanut ryhmämme [12]. Prekliiniset todisteet tukevat vahvasti antiproliferatiivinen ja anti-muuttavien vaikutuksia NSCLC ja CRC syöpäsolulinjoissa jälkeen yhdessä sorafenibilla plus ant-EGFR lääkkeitä [12]. Lisäksi viime vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa tukivat yhdistelmä erlotinibin ja Sorafenibin iäkkäillä potilailla, joilla on edennyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, kun otetaan huomioon korkeamman 1 vuoden pysyvyys [30].

Tässä tutkimuksessa olemme tarjonneet todisteita että sorafenibi toimii tuumorin solujen kasvua

in vitro

ja

in vivo

ihmisen syöpäsolujen resistenttejä estäjä EGFR ja /tai VEGFR. Aktiivisuus sorafenibi tiukasti sidoksissa sen kyky estää RAF signalointi kautta RAS /RAF /MEK /MAPK-reitin.

Methods

Solulinjat, huumeet ja kemikaaleja

ihmisen NSCLC CALU-3 ja ihmisen CRC HCT116 solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja pidettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Life Technologies, Gaithersburg, MD), joka kosteassa ilmakehässä 5% CO

2. Gefitinibi ja vandetanib toimittivat AstraZeneca, Macclesfield, UK; erlotinibia annettiin Roche, Basel, Sveitsi; sorafenibi saatiin Bayer Schering Pharma, Leverkusen, Saksa. Ensisijainen vasta-aineita P-EGFR (Tyr1173), EGFR, P-MAPK44 /42 (Thr202 /Tyr204), MAPK44 /42, P-AKT (Ser473), AKT, P-MEK (Ser217 /221), MEK, PB-RAF (ser 445), P- C-RAF (ser 338) surviviiniperäiset saatiin Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA. Soluinvaasiota ja migraatiokokeessa sarjat saatiin Chemicon, Millipore, CA, USA. Kaikki muut kemikaalit hankittiin Sigma Aldrich, MO, USA.

perustaminen CALU-3 ja HCT116 syöpäsolun linjat kehittynyt resistenssi eri TKI

Yli 12 kuukautta, ihmisen CALU -3 keuhkojen adenokarsinoomasoluja ja ihmisen HCT116 kolorektaalikarsinooman solut altistuvat jatkuvasti kasvavia konsentraatioita joko gefitinibi, erlotinibi tai vandetanib, kuten aiemmin on kuvattu (12). Aloitusannos oli annos aiheuttaa inhibition 50% syöpäsolujen kasvua (IC

50) kunkin EGFR-inhibiittoria (ts .: erlotinibin, 3 uM, gefitinibi, 6 uM, vandetanib, 1 uM). Lääkkeen annosta lisätään asteittain 15 uM noin kaksi kuukautta, 20 uM, kun muut kaksi kuukautta, 25 uM jälkeen vielä kaksi kuukautta, ja lopulta, 30 uM yhteensä 12 kuukautta. Vakiintuneet kestävät syöpä solulinjoja pidettiin sitten jatkuvassa viljelyssä kanssa maksimaalisesti saavutettu annos kutakin TKI joka mahdollisti solujen lisääntymistä (30 uM kutakin lääkettä).

Soluproliferaatiomääritys

Syöpäsolut olivat ympättiin 96-kuoppalevyille ja käsiteltiin eri lääkkeiden, kuten erlotinibi, gefitinibi, vandetanib tai sorafenibi 72 tuntia. Soluproliferaatiota mitattiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT). IC

50 määritettiin interpoloimalla annos-vaste käyrät. Tulokset edustaa mediaani kolmen erillisen kokeen kussakin suoritetaan neljänä kappaleena.

Western blotting -analyysi

hoidon jälkeen, syövän solut hajotettiin Tween-20 lysis-puskuria (50 mmol /L HEPES, pH 7,4 , 150 mmol /l NaCI: a, 0,1% Tween-20, 10% glyserolia, 2,5 mmol /l EGTA: a, 1 mmol /l EDTA, 1 mmol /l DTT: tä, 1 mmol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja 10 ug /ml leupeptiiniä ja aprotiniinia ) ja sonikoitiin. Yhtä suuret määrät proteiinia, analysoitiin SDS-PAGE: lla. Sen jälkeen, proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille ja analysoitiin erityisillä primaarisilla vasta-aineilla, kuten on osoitettu kokeessa. Proteiinit havaittiin inkuboimalla piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita ja ECL-kemiluminesenssidetektiojärjestelmää.

Invasion määrityksessä

invasiivinen kyky in vitro mitattiin käyttäen transwell kammioita, mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut ympättiin kalvon ylemmän kammion transwell pitoisuutena 2 x 10

5 /ml 500 ul: aan RPMI-väliainetta ja jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin osoitetun annokset sorafenibiannos 24 tuntia. Väliaineen ylempään kammioon oli seerumittomassa. Väliaineen alempaan kammioon sisälsi 10% FBS: ää lähteenä Chemo-houkuttimia. Solut, jotka läpi Matrigel päällystetty kalvo värjättiin Cell Stain Solution sisältävä kristallivioletin toimitetaan Transvvell- invaasiomääritys (Chemicon, Millipore, CA) ja valokuvattiin kun 20 tunnin inkubaation jälkeen. Absorbanssi mitattiin 562 nm: ssä ELISA-lukijalla liuottamisen jälkeen värjäytyneiden solujen 10%: ista etikkahappoa. Määritykset suoritettiin kolminkertaisina.

migraatiokokeessa

Solun muuttoliikettä arvioitiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla kemotaksismäärityksessä. Lyhyesti, soluja inkuboitiin RPMI seerumia 24 käsin jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin osoitetun annoksilla sorafenibia, jonka jälkeen ne irrotettiin pulloista, suspendoitiin vaimentaa väliaineessa (seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi 5% naudan seerumin albumiinia) ja EDTA, ja ympättiin Boyden muuttoliike kammioon insertit laitettiin 24-kuoppalevylle. Insertit sisältävät mikrohuokoisen membraanin, jossa on 8-um huokoskoko. Insertit sijoitettu yli kuoppiin, jotka sisältävät seerumittomassa alustassa plus kemoterapia-houkuttimena (10% FBS). Sen jälkeen, kun 48-tunnin hoitojakson aikana, solut /media heitettiin pois ylhäältä puolelta siirtymisen kammion sisäosan ja kammion pantiin kuoppiin uuden 24-kuoppalevylle, joka sisälsi solujen irtoaminen ratkaisu. Inkuboinnin jälkeen 30 min ajan 37 ° C: ssa, insertti heitettiin pois, ja liuos, jossa oli lyysipuskuria ja CyQuant GR väriainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan. CyQuant on vihreä fluoresoiva väriaine, jolla on vahva parannus fluoresenssin sitoutuessaan solun nukleiinihappojen vapautuu hajotuspuskuria, joka mahdollistaa arvioida suhteellinen määrä siirtynyt soluja. Fluoresenssi määritettiin fluorometrillä klo 480/520 nm. Määritykset suoritettiin kolminkertaisina.

Kasvu pehmeässä agarissa

Solut (10

4 solua /kuoppa) suspendoitiin 0,5 ml 0,3% Difco Noble agaria (Difco, Detroit, MI) täydennetty valmiissa elatusaineessa. Tämä suspensio kerrostettiin 0,5 ml 0,8% agar-väliaineessa pohjakerroksen 24 monikuop- klusterin ruokia (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla sorafenibin. Jälkeen 14 päivää, solut värjättiin nitrosinitetratsoliumia (Sigma, St. Louis, MO) ja pesäkkeitä suurempi kuin 0,05 mm, laskettiin.