Krooninen sairaus

tiivistelmä

muodostuminen maksametastaaseista peräsuolen syöpäpotilailla on ensisijainen syy potilaan kuolemaan. Nykyiset hoitomuodot suunnattu maksan etäpesäke peräisin peräsuolen syöpä on ollut vähäinen vaikutus hoitotuloksia. Siksi vaihtoehtoisten hoitostrategioiden maksan etäpesäke tarvitaan. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että ihmisen rekombinantti-apolipoproteiini (a) kringle V, joka tunnetaan myös nimellä rhLK8, indusoi apoptoottisen endoteelisolujen

in vitro

kautta mitokondrioiden apoptoosireittiä. Vuorovaikutus rhLK8 glukoosin säätelemä proteiini 78 (GRP78) voi olla osallisena apoptoosin, koska esto GRP78 by GRP78-spesifisten vasta-aineiden tai siRNA pudotus esti rhLK8-välitteistä apoptoosia ihmisen napalaskimon endoteelisolujen

vuonna vitro

. Seuraavaksi arvioida vaikutuksia rhLK8 angiogeneesiin ja etäpesäkkeiden, kokeellinen malli maksan etäpesäkkeiden määritettiin injektoimalla ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinja, LS174T, osaksi pernat BALB /c-nude-hiirissä. Systeeminen anto rhLK8 merkittävästi tukahdutti maksan etäpesäke ihmisen peräsuolen syöpä solujen ja parannettu isäntä eloonjääminen verrattuna kontrolleihin. Yhdistelmä rhLK8 ja 5-fluorourasiilin huomattavasti näiden selviytymisen etuja verrattuna joko hoito yksinään. Histologinen havainto osoitti merkittävää apoptoosin induktio keskuudessa kasvaimeen liittyvien endoteelisolujen maksan etäpesäkkeiden rhLK8 käsiteltyjen hiirten verrattuna ohjaus hiirillä. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmä rhLK8 tavanomaisella kemoterapia voi olla lupaava lähestymistapa hoitoon potilailla, joilla on hengenvaarallisia peräsuolen syöpä maksassa etäpesäkkeitä.

Citation: Ahn JH, Yu HK, Lee HJ, Hong SW, Kim SJ, Kim JS (2014) Suppression paksusuolisyövän maksametastaasin jonka apolipoproteiini (a) Kringle V on Nude Mouse Model läpi apoptoosin kasvaimeen liittyvien endoteelisoluissa. PLoS ONE 9 (4): e93794. doi: 10,1371 /journal.pone.0093794

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu: 10 joulukuu 2013; Hyväksytty: 07 maaliskuu 2014; Julkaistu: 03 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Ahn et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus sai taloudellista tukea Green Cross Corporation, avustusta Korean Health 21 R Lonza, Walkersville, MD, USA) viljelmiä inkuboitiin EBM-2 media (Lonza), jota oli täydennetty 1% FBS: ää ja eri pitoisuuksia rhLK8 (0,1-5 uM) läsnä ollessa tai poissa ollessa 3 ng /ml emäksistä fibroblastikasvutekijää (bFGF). Inkubointiajan jälkeen 12 tai 24 h, solut värjättiin Hoechst 33452 (500 ng /ml; Sigma, St. Louis, MO, USA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ja apoptoosi arvioitiin ydin- kromatiinin kondensaatio käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Olympus BX51, Olympus, Center Valley, PA, USA) [22]. Random mikroskooppikentäs- tutkittiin kunkin kokeellisen kunnossa, ja niiden solujen prosentuaalinen määrä, jotka apoptoosin kunkin kentän määritettiin.

Western-blottaus Apoptoosin liittyvät proteiinit

Solut lyysattiin Triton hajotukseen -puskuria [137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10% glyserolia, 1% Triton X-100, ja 20 mM Tris-HCl (pH 8,0)], joka sisältää proteaasi-inhibiittoreita. Alikvootti kutakin lysaattia erotettiin SDS-PAGE käyttäen geelien polymeroitu 4-20%: sta akryyliamidia Tris /glysiini-puskurilla (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ja immunoblottaus suoritettiin vasta-aineiden prokaspaasi-3, prokaspaasi-9 ( Cell Signaling, Beverly, MA, USA), pilkotaan kaspaasi-3 ja prokaspaasi-8 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Eluoitiin näytteitä samanaikainen immunosaostus kokeita myös SDS-PAGE, ja elektroforeesi proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille. Kukin kalvo inkuboitiin hiiren anti-GRP78-vasta-aineita (BD Biosciences, 1:1,000) tai kaniinin anti-His-vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 1:1,000), ja sitten peroksidaasiin konjugoidulla anti-hiiri tai anti-kani-vasta-aineita (KPL, Gaithersburg, MD, USA; 1:5,000).

fraktiointi Sytosoliset ja kalvoon sitoutuneet proteiinit

Sytosoliset ja kalvon fraktiot valmistettiin selektiivisen solukalvon läpäiseväksi kanssa digitoniinipuskuriliuoksella, jonka jälkeen kalvo liukoiseksi [23]. Lyhyesti, soluja käsiteltiin 0,05% digitoniinia isotonisessa puskuria A [10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl

2, ja 1 mM EGTA (pH 7,4)], joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita [1 mM 4- (2- aminoetyyli) bentseenisulfonyyli fluoridi hydrokloridi, 0,8 uM aprotiniinia, 50 uM bestatiinia, 15 uM E-64, 20 uM leupeptiiniä, 10 uM pepstatiini A: ta] 2 min huoneen lämpötilassa. Permeabilisoitujen Solut kerättiin 4 ° C: ssa. Kun oli sentrifugoitu 15000 x g 10 minuuttia, supernatantti (sytosolifraktion) ja pelletti (membraanifraktio) kerättiin erikseen. Vapauttamaan membrane- ja organelle-sitoutuneet proteiinit, pelletti uutettiin edelleen jääkylmällä 1% Nonidet P-40 A-puskuri, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita 60 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sekä soluliman ja membraanifraktioiden analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä vasta-aineita sytokromi c (BD Biosciences).

rakentaminen ekspressiovektorin glukoosin säätelemä proteiini 78 (GRP78) ja Ohimenevä transfektio ja HEK293 Cells

GRP78

geeni monistettiin PCR: llä käyttäen seuraavia alukkeita: eteenpäin (5′- TTT TTT GGA TCC ATG AAG CTC TCC CTG GTG GCC-3 ’) ja reverse (5’-TTT TTT GCG GCC GCT CTA CAA CTC ATC TTT TTC TGC-3 ’), ja sitten kloonattiin eukaryootti-ilmentämisvektoriin pcDNA3.1-myc-his (-) b (Invitrogen). Ohimenevä transfektio HEK-293-solujen

GRP78

ekspressiovektori tehtiin käyttäen lipofektamiinia 2000 (Invitrogen) reagenssit mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut pestiin 3 kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), otettiin talteen kaapimalla ja niitä sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 500 x g. Kerätyt solut hajotettiin käyttäen IP-puskuria (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,6), joka sisälsi 1% NP-40, ja solu-uutteet analysoitiin Western-blottauksella.

Co-immunosaostus rhLK8- sitovat proteiinit

HEK293-solut, jotka on transfektoitu

GRP78

ekspressiovektorit kerättiin ja uutettiin käyttäen lyysipuskuria (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1% NP-40, 1 x proteaasi-inhibiittori, ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, pH 7,6). Solu-uutteet sekoitettiin yön yli 4 ° C: ssa 10 ug: lla monoklonaalista anti-HA-vasta-ainetta, 2 ug HA-merkitty rhLK8, ja proteiini G-agaroosilla (Sigma). Immunoadsorbensseja otettiin talteen sentrifugoimalla 5 minuutin ajan 700 x g, pestiin kolme kertaa, ja niitä sentrifugoitiin (5 min 700 x g), IP-puskurissa (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,1% NP-40, pH 7,6). Pelletit suspendoitiin uudelleen 30 ul: aan SDS-PAGE-latauspuskuria (Sigma) ja analysoitiin Western-blottauksella.

siRNA transfektio

HUVEC trypsinoitiin, laskettiin ja laimennettiin antibiootti vapaan EGM- 2 keskikokoista 2,5 × 10

5 solua /ml transfektio Dharma

fect

1 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO, USA), mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, HUVEC maljattiin 100 mm: n annoksia ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa yön yli. Yksi millilitra 2 um-TARGETplus SMARTpool siRNA (Thermo Fisher Scientific) vastaan ​​

GRP78

laimennettuna 1 × siRNA Buffer (putki-1) ja Dharma

Fect

1 (putki-2) laimennettu joissa seerumia pantiin erillisissä putkissa, inkuboitiin 5 min huoneen lämpötilassa, sekoitettiin yhteen, ja sitten inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Inkuboitu seokset siRNA ja Dharma

Fect

1 laimennettiin 8 ml seerumittomalla alustalla ja sen jälkeen lisättiin 100 mm malja kanssa HUVEC yksikerroksia. 24 tunnin jälkeen transfektion alusta korvattiin täydellisen alustalla, joka sisälsi FBS: ää ja kasvutekijöitä. Kaksi päivää transfektion jälkeen HUVEC jaettiin, ja 4. päivänä ne on korjattu tai maljattiin uudelleen muita kokeita.

Analyysi rhLK8 Sitoutuminen GRP78 sen HUVEC virtaussytometrialla

mittaamiseksi sitoutumisen rhLK8 on GRP78 proteiinin pinnalla HUVEC, rhLK8 leimattiin FITC käyttäen FITC-leimauspakkausta (Sigma) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. HUVEC jotka oli transdusoitu salattu siRNA tai GRP78-spesifisiä siRNA trypsinoitiin ja neutraloitiin trypsiinillä neutraloimalla liuosta (Lonza). 5 x 10

5 HUVEC värjättiin FITC-leimatun rhLK8 tai GRP78 vasta-1,5 h 4 ° C: ssa, pestiin PBS: llä 3 kertaa, ja ne analysoitiin virtaussytometrialla FACS Caliber (BD Biosciences).

Animal Model for Experimental Maksa Metastasis

Kateenkorvattomiin BALB /c-nude-hiiret nukutettiin intraperitoneaalisesti (ip) injektion ketamiini /ksylatsiinin (Sigma). Perna sitten exteriorized läpi vasemmalle sivusuunnassa kylki viilto. Noin 3 x 10

5 LS174T ihmisen paksusuolen ja peräsuolen karsinooman solut (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) 100 ul: ssa Hanksin tasapainotettua suolaliuosta injektoitiin perna peruskudokseen käyttämällä 27-gaugen neula. Vatsakalvon ja iho suljettiin kaksi kerrosta metalliklipseillä. Päivästä, tuumorisoluinokulaation, hiirillä oli päivittäin i.p. hallinnot 2, 10 ja 50 mg /kg rhLK8 kaksi viikkoa. Lisäksi ohjaus ja rhLK8 (2, 10 tai 50 mg /kg) saaneilla hiirillä työskentelisi eloonjäämisen kokeiden (n = 10 /kussakin ryhmässä).

tutkimiseksi terapeuttista tehoa rhLK8 hoidon yhdistettynä tavanomaisen kemoterapian jälkeen hiiret injektoitiin LS174T-soluja jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään (n = 5 ryhmää kohti) ja käsiteltiin seuraavasti: (1) päivittäin ip vehikkelin (100 mM NaCl, 150 mM L-glysiini, pH 4,2); (2) i.p. injektio 5-fluorourasiilin (5-FU; 8 mg /kg /päivä) viiden ensimmäisen päivän jälkeen pernansisäistä injektion; (3) päivittäin i.p. injektio rhLK8 (10 mg /kg); ja (4) päivittäin i.p. anto rhLK8 (10 mg /kg) ja i.p. injektio 5-FU: ta (8 mg /kg /päivä) viiden ensimmäisen päivän jälkeen pernansisäistä injektiota. Ohjaus ja rhLK8 käsiteltyjen hiiriä käytettiin myös eloonjäämisen kokeiden (n = 10 hiirtä ryhmää kohden) tai tapettiin CO

2 hengitettynä 2 viikon kuluttua hoidon, jolloin maksat kerättiin, punnittiin ja analysoitiin pintaan kasvain kyhmy numeroita tai tehtiin histologinen ja immunohistokemiallista tutkimusta.

Ethics lausunto

Kaikki kirurgisten toimenpiteiden hyväksynyt Animal Ethics komitean Mogam Biotechnology Research Institute tai Korea Research Institute of Bioscience ja bioteknologia (KRIBB-AEC-13011) ja kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen. Hoito annettiin eläimille oli suuntaviivojen mukaisesti varten hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health.

Histologia ja immunohistokemia

Jos haluat laskea sisäisen maksan kyhmyjä, kasvain- laakeri maksat leikattiin, kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin yön yli, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 4 um viipaleiksi. Leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Miles, Elkhart, IN, USA) yhdiste, jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -70 ° C: ssa. Jäädytetyt kudokset CD31 /PECAM-1 ja /tai päätelaitteen deoksinukleotidyylitransferaasilla välittämää dUTP nick end merkinnät (TUNEL) värjäys valmistettiin ja fiksoitiin kylmässä asetonissa. TUNEL määritys suoritettiin kaupallisesti saatavilla apoptoosin havaitseminen pakki (Promega, Madison, WI, USA) kanssa joitakin muutoksia. Immunohistokemia menettelyt suoritettiin ja kaikki vasta-aineet ja aineet immunohistokemiaan ostettiin lähteistä kuten aiemmin on kuvattu [24]. Ohjaus näytteitä altistetaan sekundäärinen vasta-aine yksinään eivät osoittaneet spesifistä värjäytymistä. Värjätyt leikkeet tutkittiin alla Olympus BX51 mikroskoopilla (Olympus) varustettu Olympus DP71 12,5 megapikselin mikroskooppi kamera.

Immunofluoresoivat Kaksoisvärjäys CD31 /PECAM-1 (endoteelisoluissa) ja TUNEL

TUNEL määritys suoritettiin seuraavan CD31 /PECAM-1 immunofluoresenssivärjäyksellä kuten aiemmin on kuvattu [24]. Kudosnäytteitä inkuboitiin 300 ug /ml Hoechst 33342 tahra 1 min ajan huoneenlämpötilassa. Propyyligallaatti asetettiin kaikilta levyiltä ja peitetään lasipäällyslevyn (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA). Endoteelisoluja visualisoitiin punaisen fluoresenssin, ja hajanainen DNA (TUNEL määritys) visualisoitiin vihreän fluoresenssin. Kolokalisaation punainen ja vihreä signaalit keltainen signaaleja (apoptoottisten endoteelisolujen).

Tilastollinen analyysi

Data esitetään keskiarvoina ± SD. Tilastollinen merkittävyys laskettiin Studentin

t

-testi, paitsi

in vivo

selviytymisen kokeita, joita varten käytimme log-rank analyysi Kaplan-Meier selviytymisen käyrä. Arvo

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Effects of rhLK8 endoteelisolujen apoptoosin in vitro

vaikutusten määrittämiseksi ja rhLK8 endoteelisolujen apoptoosia, HUVEC yksisolukerrokset inkuboitiin EBM-2, joka sisälsi 1% FBS: n läsnä tai poissa ollessa 3 ng /ml bFGF: ää ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla rhLK8 (0,1-5 pM), 12 tai 24 h. Apoptoottiset endoteelisoluja tunnistettiin ydin- morfologia värjäyksen jälkeen Hoechst 33452 (Fig. 1A). Hoito rhLK8 merkittävästi indusoi apoptoosia HUVEC: ien on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla puuttuessa (Fig. 1 B) tai sen läsnä (Fig. 1 C) angiogeenisten tekijöiden, kuten 3 ng /ml bFGF: ää.

HUVEC yksisolukerroksia inkuboitiin EBM-2, joka sisälsi 1% FBS: n läsnä tai poissa ollessa 3 ng /ml bFGF: ää ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla rhLK8 (0,1-5 pM), 12 tai 24 h. Endoteelin apoptoosin arvioitiin ydin- morfologia värjäyksen jälkeen Hoechst 33452.

(A)

edustaja fotomikrograafeja ohjaus (

vasemmalle

) tai rhLK8 (5 uM) hoidetun HUVEC (

oikeus

), kun läsnä oli 3 ng /ml bFGF: ssa 12 h. Apoptoottiset endoteelisolut on merkitty nuolilla.

B

ja

C

, solujen prosenttiosuus apoptoosin määritettiin soluissa, joita käsiteltiin eri pitoisuuksilla rhLK8 puuttuessa (

B

) tai läsnä ollessa (

C

) PAF jälkeen 12 (

täydet pylväät

) tai 24 h (

avoimet pylväät

). Kukin pylväs edustaa keskiarvo ± SD. (

D-F

) HUVEC inkuboitiin rhLK8 (5 uM) useina ajanjaksoina kuten. Sitten solut kerättiin ja lyysattiin ja kokosolu proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla. (

D

) aktivointi kaspaasi-3 määritettiin Western-blottauksella käyttämällä vasta-aineita prokaspaasi-3 tai 20 kDa: n prosessoidun muodon kaspaasi-3, kuten on osoitettu. (

E

) Western blottaus käyttämällä vasta-aineita prokaspaasi-9 määrittämiseksi suoritettiin kaspaasi-9. Actin (

alempi paneeli

) käytettiin latauskontrollina. (

F

) Sytosoliset ja kalvoon sitoutuneet proteiinit valmistettiin, kuten on kuvattu kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”, ja analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä vasta-aineita vastaan, sytokromi c määrittämiseksi vapautumisen sytokromi c sytosoliin. Proteiininäytteet ladattu

C-kaista-16

valmistettiin soluista, inkuboitiin ilman rhLK8 16 tuntia. Immunoblot Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. (Rinnakkaiset Fig. 1D, 1E, ja 1F ovat saatavilla Fig. S1).

kaspaasi-3 ja kaspaasi-9 aktivointi ja sytokromi C Release sytosoliin mukaan rhLK8

tutkimiseksi biokemialliset ominaisuudet rhLK8 indusoiman apoptoosin HUVEC, ensin testattiin vaikutuksia rhLK8 aktivoinnista efektori kaspaasi, kaspaasi-3, joka on keskeinen vaihe apoptoosin. HUVEC-soluja käsiteltiin rhLK8 (5 uM) osoittivat alentuneita tasoja 32-kDa: n prokaspaasi-3, mutta kohonneet 20-kDa käsitelty fragmentti kaspaasi-3 (Fig. 1 D ja kuvio. S1A), joka osoittaa kaspaasi-3 . Pilkkomisen kaspaasi-3-alustaan, poly ADP-riboosi-polymeraasi, havaittiin myös rhLK8-käsiteltyjen HUVEC-soluja (tietoja ei esitetty). Efektori kaspaasien aktivoidaan alavirran kaspaasi-8: n tai kaspaasi-9, jotka ovat initiaattorin kaspaasit osallistuvat signalointiin kahden erillisen apoptoottisia reittejä, kuoleman reseptori ja mitokondrioiden polkuja, vastaavasti [25]. Sen määrittämiseksi, mitkä reitti on vastuussa rhLK8-indusoidun endoteelisolujen apoptoosia, testasimme vaikutuksia rhLK8 (5 uM) on kaspaasi-8: n tai kaspaasi-9. Taso prokaspaasi-9 väheni merkittävästi rhLK8 saaneilla HUVEC verrattuna kontrolli-soluissa (kuvio. 1E ja Fig. S1B), kun taas ole eroa tason prokaspaasi-8 havaittiin (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että mitokondrioiden reitti (tunnetaan myös sisäisen reaktiotien) oli mukana. Koska mitokondrioiden reitti aloitetaan vapautumista sytokromi c: n ja muiden polypeptidien mitokondrion intermembrane tilaa sytosoliin, tutkimme sytokromi c vapautumisen rhLK8-käsiteltyjen HUVEC. rhLK8 (5 uM) aiheutti ajasta riippuva alentaminen sytokromi c mitokondrion kalvon, kun taas taso sytosolin sytokromi c samanaikainen lisääntynyt (Fig. 1 F ja kuvio. S1C).

rhLK8 vuorovaikutuksessa jossa GRP78

Äskettäin plasminogeenin kringle V (PK5) on raportoitu indusoivan kaspaasiriippuvaisen kasvainsolujen apoptoosia ja endoteelisolujen sitoutumalla GRP78 solun pinnalla [26]. Joka perustuu korkean sekvenssihomologia PK5 ja rhLK8, testasimme mahdollisuutta, että rhLK8 saattaa indusoida apoptoosia endoteelisolujen vuorovaikutuksessa GRP78. Olemme sekoitetaan otteet HUVEC tai HEK293-soluja, jotka ilmentävät His-merkitty GRP78 10 ug monoklonaalisia anti-HA-vasta-ainetta, 2 ug HA-merkitty rhLK8, ja proteiini G-agaroosilla ja immunoprecipitants immunoblotattiin anti-GRP78 tai anti-His- vasta-aineita. Sekä endogeeninen GRP78 in HUVEC (Fig. 2A ja Fig. S2A) ja His-GRP78 HEK293-soluissa (kuvio. 2B ja kuvio. S2B) selvästi sidottu rhLK8 lisätään samanaikainen immunosaostus seoksen. Ei kuitenkaan GRP78-proteiinia ei havaittu, kun samanaikainen immunosaostus koe suoritettiin ilman HA-merkitty rhLK8 proteiinia.

immunosaostuksella (

IP

) kokeissa, solu-uutteista (

) HUVEC-soluja tai (

B

) HEK293-soluista, jotka ilmentävät 6 x His-GRP78-proteiinia sekoitettiin yön yli 4 ° C: ssa 10 ug HA: monoklonaalinen vasta-aine, 2 ug HA-merkitty rhLK8, ja proteiini G-agaroosilla. Eluoidut näytteet erotettiin SDS-PAGE: lla. GRP78 sitoutunut rhLK8 havaittiin Western blot (

WB

) käyttäen anti-GRP78 monoklonaalinen vasta-aine tai anti-His-vasta-ainetta. Sitoutumisen määrittämiseksi on rhLK8 on GRP78 proteiinin pinnalla HUVEC, HUVEC, jotka oli transdusoitu salattu siRNA tai

GRP78-

erityisiä siRNA kerättiin ja värjättiin (

C

) FITC -leimattua rhLK8 tai (

D

) anti-GRP78-vasta-aineita ja analysoitiin virtaussytometrialla. Värjäämättömiä soluja tai värjättiin FITC-leimatun sekundaarisen vasta-ainetta ainoastaan ​​käytettiin negatiivisena kontrollina. Tiedot edustavat kahden riippumattoman kokeen. (Rinnakkaiset Fig. 2A ja 2B ovat saatavilla kuvassa. S2).

rhLK8 sitoutuu GRP78 ilmaistuna pinnalla HUVEC

Voit selvittää rhLK8 sitoutuu GRP78 ilmentyy pinta HUVEC, HUVEC käsiteltiin joko erityisiä siRNA varten

GRP78

tai salattu siRNA, värjättiin FITC-konjugoidulla rhLK8 tai anti-GRP78-vasta-aineita, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Sekä rhLK8 ja GRP78 sitoutuneet vasta-aineet pintaan HUVEC transdusoitu ohjaus siRNA annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas sitoutuminen rhLK8 ja GRP78-vasta-aineiden vähentynyt HUVEC transdusoitiin

GRP78

erityisiä siRNA (Fig. 2C ja 2D).

rhLK8 indusoi apoptoosia endoteelisoluissa in vitro Vuorovaikutus GRP78

Sen määrittämiseksi, onko GRP78 proteiinit ovat mukana rhLK8 indusoiman apoptoosin endoteelisolujen, HUVEC-oli käsitelty vasta-aine GRP78 ennen hoidon rhLK8. Hoito GRP78 vasta-aineella vähensi tasolla aktiivisen kaspaasin-3 HUVEC verrattuna kontrollisoluihin, mikä osoittaa, että GRP78 voi olla rooli rhLK8-välitteistä endoteelisolujen apoptoosia (Fig. 3A ja kuvio. S3A). Nämä tiedot tukevat edelleen tulokset osoittavat, että apoptoosin HUVEC kanssa GRP78 siRNA Knockdown ollut erilainen kanssa tai ilman hoitoa rhLK8 (Fig. 3B ja kuvio. S3B-D), kun taas apoptoosin HUVEC transfektoitu salattu siRNA oli merkitsevästi indusoitiin käsittelemällä rhLK8, määritettynä kasvu aktiivinen kaspaasi-3 ja lasku prokaspaasi-9 (Fig. 3B ja kuviossa. S3B-D). Johdonmukaisesti, GRP78 vasta-hoitoa tai

GRP78

knock-down by siRNA transfektiolla lakkautetaan rhLK8 aiheuttamaa apoptoosia HUVEC solutasolla, arvioituna useissa apoptoottisten solujen (Fig. 3C).

(

) Sen määrittämiseksi, GRP78 voi osallistua rhLK8-välitteistä endoteelisolujen apoptoosia, HUVEC yksisolukerrokset käsiteltiin rhLK8 (1 tai 5 uM) esikäsittelyn jälkeen 5 ug GRP78 vasta-ainetta 30 minuutin ajan. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (

B

) HUVEC transfektoitu salattu siRNA tai

GRP78

erityisiä siRNA käsiteltiin 5 uM rhLK8. Myöhemmin apoptoosin induktio havaittiin vasta-aineita aktiivinen kaspaasi-3 tai prokaspaasi-9. Ilmentyminen GRP78 havaittiin anti-GRP78 monoklonaalinen vasta-aine. GAPDH käytettiin latauskontrollina. Tiedot edustavat kahden riippumattoman kokeen. (C) HUVEC käsitelty GRP78 vasta-aineella tai transfektoitu

GRP78

erityisiä siRNA hoidettiin rhLK8 (5 uM) ja endoteelin apoptoosin arvioitiin ydin- morfologia värjäyksen jälkeen Hoechst 33452. edustajan mikrovalokuvia on esitetty. Apoptoottiset endoteelisolut on merkitty nuolilla. Suurennokset ovat × 100. (Rinnakkaiset Fig. 3A ja 3B ovat saatavilla kuvassa. S3).

Hoito rhLK8 estää kasvu Intrasplenically Injected LS174T solut maksassa

Koska angiogeneesi on kriittinen