Krooninen sairaus

tiivistelmä

rooli kalsiumia sitovan proteiinin, Calbindin 2 (CALB2), vasteen säätelyssä paksusuolen syöpä (CRC) soluja 5-fluorourasiili (5-FU), tutkittiin. Reaaliaikainen RT-PCR: llä ja Western blot-analyysi osoitti, että CALB2 mRNA: ta ja proteiinia ilmentyminen alas-säädellä p53 villityypin ja p53-tyhjä isogeenisistä HCT116 CRC solulinjoissa seuraavien 48 h ja 72 h 5-FU hoitoon. Lisäksi 5-FU: n indusoiman apoptoosin väheni merkittävästi HCT116 ja LS174T CRC solulinjoja, joissa CALB2 ilme oli vaimennettu. Edelleen tutkimus osoitti, että CALB2 siirtämisellä mitokondriot seuraavat 5-FU hoidossa ja että 5-FU-aiheuttama mitokondrion kalvon potentiaali (Δψ

m) kumottiin CALB2-vaiennetaan soluissa. Lisäksi CALB2 hiljentäminen laski 5-FU aiheuttama sytokromi c ja SMAC vapautumista mitokondrioita ja myös laski 5-FU aiheuttama kaspaasien aktivaatio 9 ja 3/7. Huomattavaa on, että co-vaimentaminen XIAP voitti 5-FU resistenssin CALB2-vaiennetaan soluissa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että sen jälkeen 5-FU-hoidon CRC solulinjoissa, CALB2 on mukana apoptoosin kautta luontainen mitokondrioiden kautta. Tämä osoittaa, että CALB2 voi olla tärkeä välittäjäaine 5-FU-solukuolema. Lisäksi alas-säätely CALB2 vastauksena 5-FU voi edustaa luontainen resistenssimekanismi tähän syöpälääkkeeksi.

Citation: Stevenson L, Allen WL, Proutski I Stewart G, Johnston L, McCloskey K, et ai. (2011) Calbindin 2 (CALB2) Säätelee 5-fluorourasiili Herkkyys peräsuolen syövän moduloimalla Luonnostaan ​​Apoptotic Pathway. PLoS ONE 6 (5): e20276. doi: 10,1371 /journal.pone.0020276

Editor: Andrei L. Gartel, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 joulukuu 2010; Hyväksytty: 28 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 24, 2011

Copyright: © 2011 Stevenson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli saadut Cancer Research UK (C212 /A7402); ja tutkimus- ja Development Office Pohjois-Irlanti, Department of Health, sosiaali- ja Public Safety (RRG /3261/05, RRG 6,42). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Professori Patrick Johnston on perustaja ja johtaja Almac Diagnostics, Craigavon, Iso-Britannia. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Euroopassa ja USA: ssa 5-fluorourasiili (5-FU) -pohjaisen kemoterapiahoitojen pysyvät vakiohoito CRC sekä adjuvanttia ja kehittynyt sairaus asetukset. Kuitenkin Hoitovaste 5-FU-hoidon ovat välillä 10-20% Metastasoituneessa [1]. Yhdistelmä 5-FU topoisomeraasi I: n estäjä, irinotekaani (CPT-11), tai DNA-vaurioittava aine, oksaliplatiini, on huomattavasti parantunut vaste jopa 50% [2] – [3]. Uusien aineiden, kuten monoklonaalisia vasta-aineita setuksimabi, panitumumabipitoisuus (epidermaalisen kasvutekijän reseptori-inhibiittoreita), ja bevasitsumabi (verisuonen endoteelin kasvutekijä-inhibiittori) ovat myös osoittaneet edullisia vaikutuksia, kun se yhdistetään kemoterapia [4] – [6]. Tästä huolimatta ennuste suurimmalla osalla potilaista, joilla on edennyt CRC edelleen heikko johtuen luontaisen tai hankittu chemoresistance. Näin ollen, tunnistaminen signalointimolekyylien välittämisessä osallisena vaste CRC 5-FU on määritettävä taustalla olevien mekanismien 5-FU vastus.

Calbindin-2 (CALB2, joka tunnetaan myös calretinin) on 29 kDa kalsium (Ca

2 +) sitovan proteiinin EF-käden perhe [7], joka on perheen proteiineja sisältävien Ca

2 +: aa sitova motiivit koostuu kahdesta helices (E ja F). Ca

2 + indusoimaa konformaatiomuutoksiin mukaan CALB2 todennäköisesti kuulua ryhmään Ca

2 + anturi proteiineja Kyseiseen perheeseen [8]. Ihmisillä CALB2 ensisijaisesti ilmaistaan ​​tietyt solut hermoston, mutta voi myös löytyä munasarjojen soluissa [9]. Normaali paksusuolen epiteelisolut eivät ilmennä CALB2, mutta se löytyy paksusuolikarsinoomat [10], solulinjat johdetut koolontuumoreissa [11], ja se on diagnostinen markkeri mesotelioomatapausten [12] – [13]. Rooli CALB2 moduloinnissa hermosolun ärtyvyyttä on johdonmukaisesti osoitettu [14]. Kuitenkin fysiologista toimintaa CALB2 syöpäsoluissa vielä selvittämättä.

Ca

2+ on määritelty messenger, joka koordinoi Endoplasmakalvosto (ER) -mitochondrial vuorovaikutusta apoptoosia säätelevissä [15]. Monenlaiset solustressiä tiedetään aiheuttavan Ca

2 + vapautumista ER ja myöhemmät Ca

2+ virtaa mitokondrioita menetyksen mitokondrion kalvon potentiaalia seurasi sytokromin c vapautumiseen ja SMAC [16]. Induktio ER stressin on raportoitu parantaa kemoterapia herkistymistä [17]. Mitokondrioiden Ca

2 + dynamiikka ovat mukana myös säätelyyn solujen energia-aineenvaihduntaa ja prosesseissa, kuten solun liikkuvuus ja välittäjäaineen vapautumista. Siksi sääntely Ca

2 + julkaisu on tiukassa valvonnassa, ja monet Ca

2 +: aa sitova proteiineja, kuten CALB2, voi toimia alavirtaan ER Ca

2+ päästämistä moduloida apoptoosia tai muita solujen toimintaan.

DNA-siru tekemässä tutkimuksessa ryhmämme käyttämällä HGU133 plus 2,0 array (Affymetrix, UK) tarkasteli ekspressioprofiilit p53

+ /+ HCT116 CRC soluja käsiteltiin 5-FU [ ,,,0],18]. Tässä tutkimuksessa CALB2 todettiin mahdolliseksi uusi säädin 5-FU vastausta. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia mekanismia, jolla CALB2 säätelee 5-FU vaste CRC soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

5-FU hankittiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Kantaliuokset valmistettiin steriiliin PBS: ään ja säilytettiin 4 ° C: ssa ennen käyttöä. CALB2 vasta-aine hankittiin Chemicon International (Temecula, CA). Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) vasta-aine hankittiin PharMingen (San Diego, CA, USA). SMAC /DIABLO ja Sytokromi c vasta-aineet hankittiin BD biotieteiden (Oxford, UK). Sytokromi-c-oksidaasi alayksikkö IV (Cox IV) ja X-linked apoptoosi-inhibiittori-proteiinin (XIAP) vasta-aineet ostettiin Cell Signaling Technology, Inc (Danvers, MA, USA). Alfa-tubuliinin vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). GAPDH ostettiin ABD Serotec (Kidlington, UK). Propidiumjodidia ostettiin Sigma (Poole, UK) ja FITC-anneksiini V hankittiin BD Biosciences (Oxford, UK). Yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä, Z-VAD (OMe) -FMK, hankittiin Calbiochem (Darmstadt, Saksa).

Soluviljely

Lapsen HCT116 ja isogeenisistä p53

– /- ja Bax

– /- CRC solulinjat ystävällisesti professori Bert Vogelstein (Johns Hopkins University, Baltimore, MD). LS174T solulinja hankittiin ATCC® (CL-188 ™). HCT116 solulinjoja ylläpidettiin McCoyn 5A-alustassa (Invitrogen, UK) ja LS174T solulinjaa ylläpidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (Invitrogen, UK). Media oli täydennetty 10% dialysoitua vasikan sikiön seerumia, 50 ug /ml penisilliini-streptomysiiniä, 2 mM L-glutamiinia ja 1 mM natriumpyruvaattia ja inkuboitiin 5% CO

2 37 ° C: ssa.

solunelinkykyisyysmääritys

solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttämällä 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT, Sigma) määritys, kuten on kuvattu aiemmin [19].

Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi

Yhteensä-RNA eristettiin käyttäen RNA STAT-60 reagenssia (Biogenesis, Poole, UK) mukaan valmistajan ohjeiden. Käänteistranskriptio suoritettiin 8 ug RNA: ta käyttäen Moloney hiiren leukemiaviruksen (M-MLV), joka käänteistranskriptio (Invitrogen, UK) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaaliaikainen käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [18]. Alukesekvenssit olivat seuraavat: CALB2 (forward) 5′-GCAGAGCTGGCGCAGATC- 3 ’, CALB2 (reverse) 5′-GCTCATCGTACGGCCGGTTCG- 3’; GAPDH (eteenpäin) 5 ’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT- 3’ ja GAPDH (reverse) 5 ’- GACAAGCTTCCCGTTCTCAG -3’. Geenien ilmentyminen normalisoitiin ilmentymisen GAPDH viite-geenin. Lopullinen ilmaisu arvot esitettiin suhteessa käsittelemättömiin ajan sovitettua kontrolli.

Western blotting

Western blotit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Immunodetektio suoritettiin käyttäen ensisijaista hiiren monoklonaalisia vasta-aineita CALB2, PARP, Smac, sytokromi c, XIAP, α-tubuliinin tai GAPDH yhdessä piparjuuren peroxidise-konjugoidulla lampaan anti-hiiri-vasta-ainetta (Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, Englanti). Kanin polyklonaalinen vasta-aine Cox IV käytettiin yhdessä aasin anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (Amersham). Fluoresoiva signaali havaittiin käyttäen Super Signal kemiluminesenssiosoitusta järjestelmän (Pierce, Rockford, IL), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Western blot-proteiinin määrän

Densitometria arvot Proteiinivyöhykkeet hankittiin käyttäen ChemiDoc-XRS järjestelmät aluksen asiakirjajärjestelmä (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Bändit analysoitiin sitten käyttämällä Määrä One®1-D analyysi ohjelmisto (Bio-Rad Laboratories, Inc., versio, 4.5.2).

Analyysi subG1 /G0

DNA-pitoisuus solut arvioitiin propidiumjodidilla (PI) värjäys kuten aiemmin on kuvattu [18]. Mittaukset ja analyysi suoritettiin FACS Calibur virtaussytometrillä kanssa CellQuest ohjelmisto (BD Biosciences, San Diego).

FITC anneksiini V /propidiumjodidia analyysi

Solut kerättiin ja analysoitiin valmistajan ohjeet (BD Biosciences, Oxford, UK). Lyhyesti, tasot apoptoosin laskettiin summana FITC-anneksiini V positiivinen /propidiumjodidia negatiivinen (varhainen apoptoosi) ja FITC-anneksiini V positiivinen /propidiumjodidia positiivinen (myöhäinen apoptoosin) solupopulaation. Mittaukset ja analyysi suoritettiin FACS Calibur virtaussytometrillä kanssa CellQuest ohjelmisto (BD Biosciences, San Diego).

Mitokondrioiden kalvon potentiaalia analyysi

Voit selvittää menetys mitokondrion kalvon potentiaali (Δ

ψ

m), soluja inkuboitiin 25 nM tetrametyylirodamiini, etyyliesteri percholate (TMRE) 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan ja kerätään trypsinoinnilla. Solut pelletoitiin sentrifugoimalla 800

g

5 min 4 ° C: ssa ja suspendoitiin uudelleen 0,5 ml: aan PBS: ää. Mittaaminen ja analysointi suoritettiin FACS Calibur virtaussytometrillä kanssa CellQuest ohjelmisto (BD Biosciences, San Diego).

siRNA transfektion

CALB2 kohdistaminen (siCALB2) ja ei-kohdistuksen ohjaus (SC) siRNA-rakenteet ostettiin Dharmacon Inc. (Chicago, IL). SiCALB2 rakentaa sekvenssejä käytettiin GGCUCUGGCAUGAUGUCAAdTdT (sense) ja UUGACAUCAUGCCAGAGCCdTdT (antisense). SC konstruktio sekvenssit käytettiin UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT (sense) ja ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT (antisense). Lisäksi 4 CALB2 kohdistaminen siRNA-sekvenssi hankittiin Qiagen: siCALB2_5 (SI02660980), siCALB2_6 (SI03190824), siCALB2_7 (SI04157790) ja siCALB2_8 (SI04267697). Valmiiksi suunniteltu siRNA varten XIAP ostettiin Cell Signalling Technology (Danvers, MA, USA). siRNA transfektiot suoritettiin Oligofectamine reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 5 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin vanhempien ~IC

60 (72 h) annoksia 5-FU (5 uM HCT116 ja 20 uM LS174T). Solut otettiin talteen seuraavat 72 h 5-FU käsittely ennen analyysiä virtaussytometrialla ja Western blot.

Sub-solun fraktioinnin

Solut kerättiin sentrifugoimalla, pestiin 1 ml: lla jääkylmää mitokondrioiden eristäminen puskuria (200 mM mannitoli, 70 mM sakkaroosi, 1 mM etyleeniglykoli-bis (α-aminoetyylieetteri) –

N

,

N

,

N

1

N

1

, tetraetikkahappoa, 10 mM HEPES, 0,5 mg /ml naudan seerumin albumiinia, pH 7,4) ennen Dounce homogenointi. Solujäte otettiin talteen sentrifugoimalla 800

g

10 min. mitokondriofraktiosta pelletoitiin sentrifugoimalla 10000

g

10 min. Supernatantti, joka sisälsi sytosolifraktion siirrettiin uuteen putkeen, ja mitokondriaalisen pelletti suspendoitiin uudelleen 50 ui: aan RIPA-puskuria (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton-X100, 0,1% SDS), joka sisälsi proteaasi- estäjä cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa).

Caspase aktivaatiotesteissä

n vapautumisen mitattiin Caspase Glo 3/7, 8 ja 9 määritykset (Promega) mukaan valmistajan ohjeiden.

tilastollinen analyysi

tulokset tiivistää keskiarvo ± keskivirhe keskiarvon (SEM) 3 riippumattoman kokeen. Tilastollinen merkitys tietojen testattiin käyttämällä 2-tie ANOVA (GraphPad PRISM® 5.01).

mikrosiruanalyysi

5-FU-resistenttejä HCT116 sub-line syntyi meidän laboratoriossa, kuten aikaisemmin on kuvattu [20]. HCT116 emosoluista ja HCT116 5-FU resistenttejä tytär-soluja käsiteltiin 5 uM 5-FU: ssa 24 tuntia tunnistaa geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti. Kokonais-RNA eristettiin

in vitro

kokeita käyttäen RNA STAT-60 yhteensä RNA: n eristämistä reagenssia (Tel-Test) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA (5 ug) lähetettiin Almac Diagnostics cDNA-synteesiä varten, cRNA synteesi, pirstoutuminen, ja hybridisaatio päälle peräsuolen tautikohtaisten Array (DSA, Almac Diagnostics) mikrosiruja. Kaikki

in vitro

määritykset suoritettiin kolmena kappaleena. Kaikki microarray data on MIAME yhteensopiva ja kaikki raaka tiedot on talletettava MIAME yhteensopiva tietokanta (ArrayExpress hakunumero: E-MEXP-1691).

Generation geenien luetteloiden

Aluksi kunkin matriisin oli normalisoitu mediaani signaalin voimakkuus kaikkien taulukot. Sillä lääkkeellä käsiteltyjen paneelit, 24 h 5-FU käsiteltyjen näytteiden Sitten normalisoitiin käsittelemättömiin kontrollinäytteisiin. Kun kyseessä on pohjapinta kokeen, 5-FU-resistenttejä paneelit normalisoitiin HCT116 vanhempien taulukot. Kaikki microarray data (E-MEXP-1691) suodatettiin sitten käyttäen seuraavia kriteereitä: Affymetrix lippu puhelut (P /M kaikissa näytteissä), Cross Gene Error Model (keskiarvo base /verrannollinen cut-off), kertainen muutos (1,5-kertainen ) ja t-testi (p 0,05), vain geenit kulkee kaikki 4 suodattimia säilytettiin ja käytettiin lopullisessa toimi genelists. Kolme

in vitro

genelists luotiin: 5-FU-indusoituvaa vanhempien, 5-FU-indusoituvaa 5-FU-resistenttien ja konstitutiivisesti vapautettiin 5-FU-resistenttejä.

tunnistetiedot reitit liittyy 5-FU-vastus

Kegg koulutusjakson toimintoa GeneSpring GX (v7.3.1) käytettiin tunnistamaan vapautuneilla polkuja kulkee 1,5 kertainen muutos ja t-testiä (p 0,05) päässä microarray

in vitro

genelists.

Association of CALB2 ilmaisun kliinisen vasteen

ladataan CALB2 ekspressiotietojen julkisista microarray aineistoja. GraphPad Prism 5 ohjelmistoa käytetään tuottamaan Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyrien perustuu mediaani CALB2 ilmaisun jokaisen eri kasvaimen vaiheesta tai yhdistettynä lavastus. Nämä tiedot asetetaan sisältyvät CRC kohortti (GSE12945; PMID: 19399471) 62 potilasta (13 vaihe 1, 23 vaihe 2, 21 vaiheessa 3 ja 5 vaihe IV) tehdään elektiivinen standardi onkologian resektio [21] ja rintasyövän kohortti (GSE9893; PMID: 18347175) 132 tamoksifeenia saaneista potilaista) [22].

tulokset

CALB2 ilmentyminen HCT116-soluissa säätyy alas 5-FU hoidossa

edellinen mikrosirujen tutkimuksessa ryhmämme raportoitu CALB2 geenin ilmentyminen HCT116-solulinjassa olevan säädelty seuraavat 24 tuntia 5-FU hoitoa verrattuna hoitamattomaan 0 h ohjaus [18]. Kuitenkin lisäksi analyysit paljastivat, että konstitutiivinen CALB2 ilmentyminen lisää ajan mittaan (kuvio. S1), siksi uudelleen analysoitiin 5-FU aiheuttamaa mRNA muutoksia CALB2 geeniekspressiotasot suhteessa hoitamattomaan, aika-sovitettua kontrolli. Toisin kuin edellisessä tutkimuksessa, tämä menetelmä osoitti, että käsittelyllä ~IC

60 (72 h) annos (5 uM) 5-FU todella johti merkittävään, ajasta riippuva alas-säätely CALB2 geeniekspressiota p53

+ /+ HCT116-solulinjassa (kuvio. 1A). P53

– /- HCT116 solulinja, CALB2 geenin ilmentyminen ei muuttunut merkittävästi 24 tunnin kuluttua 5-FU hoidossa, mutta oli huomattavasti alassäädetty 48 h ja 72 h (Fig. 1 B). Western blot-analyysi osoitti, että tämä alassäätöä näkyi vähensi CALB2 proteiinin ilmentymistä 5-FU käsitellyt solut (Fig. 1 C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CALB2 ilmentyminen HCT116-soluissa on akuutisti alassäädetty vastauksena 5-FU hoidossa ja että tämä mukauttaminen ei ole riippuvainen p53.

Reaaliaikainen RT-PCR kvantifiointiin CALB2 mRNA tasojen isogeenisistä (A) p53

+ /+ ja (B) p53

– /- HCT116-soluissa 24 h, 48 h ja 72 h 5-FU hoidossa (vanhempien ~IC60

(72 h) annoksella 5 uM). Kertainen muutos ilmaisun arvot ovat suhteessa käsittelemättömiin ajan sovitettua kontrolli. Virhe palkit edustavat keskiarvoa ± SEM, NS: ei merkittävää eroa, ** p 0,01, *** p 0,001. (C) Western blot-analyysi CALB2 vuonna HCT116 solulinjoissa seuraavat 72 tuntia 5-FU (5 uM) käsittely ja vastaavaa tiheysmittaus tiedot CALB2 ilmaisun suhteessa GAPDH latauskontrollina.

5-FU aiheuttamaa alas-säätely CALB2 on kaspaasin riippumaton

onko lasku CALB2 proteiinia vastauksena 5-FU oli kaspaasiriippuvaisen, HCT116 vanhempien soluja käsiteltiin ~IC

60 (72 h ) annos (5 uM) 5-FU yksin tai yhdessä 10 uM annos pan-kaspaasi-inhibiittori (Z-VAD) 72 tuntia. Esto kaspaasiaktiivisuus seuraavista Z-VAD käsittely validoitiin käyttämällä kaspaasi 3/7-spesifinen aktiivisuus määritys (Fig. 2A). 5-FU hoidossa merkitsevästi (p 0,05) lisääntyi kaspaasi 3/7 aktiivisuuden ~ 4 kertaiseksi, verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin, ja tämä oli täysin kumottu Z-VAD. Tärkeää on, että Z-VAD co-hoito ei inhiboi 5-FU-indusoidun down-regulation of CALB2 geenin ilmentymistä (Fig. 2B) tai proteiinin ilmentymisen (Fig. 2C), mikä osoittaa, että CALB2 down-regulation ei kaspaasi-riippuvainen.

p53

+ /+ HCT116-soluja käsiteltiin ~IC60

(72 h) annoksella 5-FU yksin tai yhdistettynä 10pM annos yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä Z-VAD (OMe ) -FMK (Z-VAD) 72 h (A) kaspaasi 3/7 aktiivisuus kvantitoitiin käyttäen lusiferaasireportteri- määrityksessä. Arvot ovat RFU luku-out suhteessa solujen elinkelpoisuus, määritettynä MTT. (B) Reaaliaikainen RT-PCR kvantifiointi CALB2 mRNA (fold-muutos suhteessa käsittelemättömän, aika-sovitettua kontrolli). (C) Western blot-analyysi CALB2 ilmaisun ja vastaavat tiheysmittaus tiedot CALB2 ilmaisun suhteessa GAPDH latauskontrollina.

CALB2 hiljentäminen annetaan 5-FU vastus

Koska CALB2 on alaspäin säännelty seuraavia 5-FU hoidossa, tutkimme sen roolia välittämässä 5-FU-vasteen. Geeni hiljentäminen lähestymistapaa käytettiin määrittämään toiminnon CALB2 5-FU: n indusoiman apoptoosin. CALB2 kaataa siRNA varmistettiin Western blot (kuvio. 3A). siRNA-välitteinen vaiennettu CALB2 ilmentyminen edelleen tehostaa 5-FU co-hoito, todennäköisesti johtuu tukahduttamiseen CALB2 mRNA vastauksena 5-FU hoidossa (Fig. 1A). PARP pilkkominen, indikaattori solukuoleman, havaittiin ohjaus siRNA-transfektoiduissa p53

+ /+ HCT116-soluissa 5-FU hoitoon. Tämä oli täysin kumottiin vuonna CALB2-vaiennettu soluissa, osoittaa kevennettyä 5-FU aiheuttama kuolema. Nämä tulokset tukevat virtaussytometrialla tietoja sen osoittamiseksi, että taso 5-FU: n indusoiman apoptoosin vähensi merkitsevästi (p 0,05) välillä -30% vuoden siRNA ohjaus solujen on noin 17% vuoden CALB2-vaiennettu p53

+ /+ HCT116-solut (Fig. 3B). P53

– /- HCT116-solulinjaa, 5-FU: n indusoiman apoptoosin väheni myös merkitsevästi (p 0,05), mistä -14%, että siRNA-ohjaus solujen ~9% on CALB2-vaimennettu-soluissa (kuvio . 3C). Pienentynyt herkkyys p53

– /- HCT116 solujen 5-FU on aikaisemmin todennut ryhmämme ym [23], [24]. Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin toisessa CRC solulinjassa, LS174T, jossa apoptoosi lisääntyi merkittävästi jälkeen ~IC

60 (72 h) annoksella 20 uM 5-FU ja CALB2 hiljentämiseen vähensi tätä (Fig. 3d, p 0,01 ). CALB2 kaataa varmistettiin Western blot (kuvio. 3D upotus) ja kuten HCT116 solulinjoissa, CALB2 proteiini tasot olivat alassäädetty seuraavat 5-FU hoidossa. Poissulkemiseksi off-tavoite vaikutukset CALB2 kohdistaminen siRNA, käytimme anneksiini /PI virtaussytometria määrittää vaikutus ylimääräisen 4 CALB2 kohdistamisen siRNA sekvenssit 5-FU aiheuttama apoptoosin p53

+ /+ HCT116-solut (Fig. 3E). Merkittävä väheneminen 5-FU: n indusoiman apoptoosin havaittiin kaikilla 4 ylimääräistä CALB2 siRNA sekvenssit ja CALB2 hiljentäminen varmistettiin Western blot-analyysi (upotus).

(A) Western blot-analyysi CALB2 ja PARP vuonna p53

+ /+ HCT116 solulinja seuraavat transfektion ohjaus siRNA (-) tai CALB2 kohdistamisen siRNA (+) ja 72 h yhtäaikainen käsittely ~IC60

(72 h) annoksella 5-FU. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Propidiumjodidia virtaussytometria analyysi osoittaa prosenttiosuuden solupopulaation Saharan G1 /G0 varten (B) p53

+ /+ ja (C) p53

– /- HCT116-soluissa transfektion ohjaus siRNA (SC) tai CALB2 kohdistaminen siRNA (siCALB2) ja 72 h yhtäaikainen käsittely 5 uM 5-FU. (D) anneksiini V /propidiumjodidia virtaussytometria-analyysi LS174T CRC solulinjan transfektion jälkeen ohjaus- siRNA (SC) tai CALB2 kohdistaminen siRNA (siCALB2) ja 72 h yhtäaikainen käsittely ~IC60

(72 h) annos on 5-FU: ta (20 uM). ** P 0,01, virhepylväät edustavat keskiarvoa ± SEM. (Upotus) Western blot-analyysi CALB2 ilmaisun LS174T. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (E) p53

+ /+ HCT116-soluissa transfektion ohjaus siRNA (SC), CALB2 kohdistaminen siRNA (siCALB2) tai muita CALB2 kohdistamisen siRNA sekvenssit (siCALB2_5, siCALB2_6, siCALB2_7 ja siCALB2_8) ja 72 h yhtäaikainen käsittely 5 uM 5-FU. (Upotus) Western blot-analyysi CALB2 ilmaisun seuraavien 72 h transfektion ohjaus siRNA (SC) tai CALB2 kohdistaminen siRNA p53

+ /+ HCT116-soluissa. α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina.

5-FU vastus liittyy de-sääntelyn Ca

2 + signalointi

tunnistaminen CALB2 roolia välittäjänä 5-FU: n indusoiman apoptoosin yhdessä Ca

2 + sitova ominaisuus johti meidät tutkimaan vaikutusta 5-FU Ca

2 + signalointi yleensä. Transkription profilointi kokeet suoritettiin HCT116 vanhempien ja 5-FU-resistenttejä tytärsoluksi linjat esi- ja jälkikäsittely 5 uM 5-FU 24 tuntia. Microarray-analyysi tunnistettu 1389 geenien HCT116-emosoluista ja 922 geenien 5-FU-resistenttejä tytärsoluja, jotka muutettiin (≥1.5-kertainen, p 0,05), kun 5-FU hoitoon. Myös 1329 geenejä tunnistettiin konstitutiivisesti muuttunut (≥1.5-kertainen, p 0,05) välillä HCT116 vanhempien soluihin ja 5-FU-resistenttejä tytär soluja. Saatu genelists käytettiin sitten reitin analyysillä käyttämällä Kegg reitin toimintoa GeneSpring GX (v7.3.1). Pathway analyysi tunnistettu 60 pääsyväylistä HCT116 vanhempien soluja ja 24 reittejä 5-FU-resistenttejä tytär soluja, jotka oli muuttunut (≥1.5-kertainen, p 0,05) seuraavat 24 h 5 uM 5-FU hoidossa. Myös 49 reittejä tunnistettiin konstitutiivisesti muuttunut (≥1.5-kertainen, p 0,05) välillä HCT116 vanhempien soluihin ja 5-FU-resistenttejä tytärsoluksi (taulukko S1). Tulokset polku analyysi osoitti, että 11 reitit olivat yleisesti muuttaa kussakin kolmessa genelists (taulukko 1). Erityisen merkittävä olevassa tutkimuksessa olivat Ca

2 + signalointi ja apoptoosin polkuja, jotka muutettiin sekä vanhempien ja 5-FU-resistenttien solujen seuraavat 5-FU hoidossa ja myös basaalisesti vapautettiin 5-FU-resistenttien solujen verrattuna parentaalijaksoja. Tämä viittaa siihen, että Ca

2 + signalointi ja apoptoosin voi olla välittäjiä 5-FU herkkyys /vastus tässä ympäristössä.

CALB2 hiljentäminen kumoaa 5-FU: n indusoiman apoptoosin kautta sisäisen reaktiotien

Koska Ca

2 + sitovat ominaisuudet CALB2 ja keskeinen rooli Ca

2 + signalointi luontaisen apoptoottisen reitin, rooli CALB2 välittämisessä 5-FU aiheuttama mitokondrioiden sääntelemättömien apoptoosin tutkittiin edelleen. Tutkiminen HCT116-solukomponenttien jakeet osoittivat, että käsittelemättömissä soluissa, CALB2 sijaitsi sytosoliin ja ei liittynyt mitokondrioissa (Fig. 4A). Kuitenkin seuraavat 72 h 5-FU hoidossa, CALB2 tasot sytosoliin laski, kun taas mitokondrio CALB2 nousivat, osoittaa 5-FU-indusoitu CALB2 translokaatio mitokondriot. Western blot -analyysi α-tubuliinin ja CoxIV osoitti puhtauden näiden osa-solufraktiossa (kuvio. S2). Nämä tulokset osoittavat indusoitavan assosiaation CALB2 ja mitokondriot vasteena 5-FU hoitoon.

(A) Western blot -analyysi CALB2 mitokondrioiden ja solulimafraktiot p53

+ /+ HCT116-soluissa transfektio ohjaus siRNA (-) tai CALB2 kohdistamisen siRNA (+) ja 72 h yhtäaikainen käsittely 5-FU. Cox IV käytettiin mitokondrioiden lastaus ohjaus ja a-tubuliinia käytettiin sytosolin lastaus ohjaus. (B) TMRE virtaussytometrianalyysin kertoo prosentuaalisen isogeenisen p53

+ /+ ja p53

– /- HCT116-solujen menetyksestä Δψ

m (% depolaroidulla) seuraavat transfektion ohjaus siRNA (sc) tai CALB2 kohdistaminen siRNA (siCALB2) ja 72 h yhtäaikainen käsittely 5 uM 5-FU. ** P 0,01, virhepylväät edustavat keskiarvoa ± SEM. (C) TMRE virtaussytometria koe toistetaan toisella siCALB2 järjestyksessä. (D) Western blot analyysi smac ja sytokromi C mitokondrioiden ja solulimafraktiot 5-FU käsitellään p53

+ /+ HCT116-soluissa. Cox IV ja α-tubuliinin käytettiin lastaus valvontaa. (E) kaspaasiaktiivisuus määritykset p53

+ /+ HCT116-soluissa. RFU-arvot normalisoitiin solujen elinkykyä (MTT-määritys) ja ilmaistiin kertamuutosta RFU että CALB2 vaimennettu solujen suhteessa siRNA ohjaus (SC) soluja. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SEM. (F) anneksiini V /propidiumjodidi virtaussytometria-analyysi apoptoottisen p53

+ /+ HCT116-soluissa CALB2 tai XIAP hiljentäminen yksin tai yhdistelmänä. Soluja yhteistyössä käsiteltiin 5 uM 5-FU: ssa 72 tuntia, kuten osoitettu. * P 0,05, ** p 0,01, virhepylväät edustavat keskiarvoa ± SEM. (Upotus) Western blot-analyysi XIAP ilmaisun transfektion jälkeen 10 nM ohjaus siRNA (-) tai 10 nM XIAP suunnattu siRNA (+). GAPDH käytettiin latauskontrollina.

välinen yhteys CALB2 ja mitokondriot seuraavat 5-FU hoito sai meidät tutkimaan tarkemmin roolia luontainen apoptoottisen väylän 5-FU vastarintaa. Pro-apoptoottisten Bcl-2-perheen jäsen, Bax on tärkeä aloittaja mitokondrioiden-välitteistä apoptoosia. Siksi tutkittiin HCT116 vanhempien ja isogeenisistä Bax null solujen käsittelyn jälkeen emo ~IC

60 (72 h) annoksella 5-FU 72 tuntia. Vanhempien ~IC

60 (72 h) annoksella 5-FU aiheutti ~ 3-kertainen nousu apoptoosin HCT116 emosolulinjassa (p 0,01), mutta ei ollut merkittävää vaikutusta tasoilla apoptoosin Bax null-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Nämä tulokset vahvistavat aiempia havaintoja [25], [26], että Bax ja luontaisen apoptoottisen reitin ovat merkittäviä efektoreita 5-FU: n indusoiman apoptoosin.

mitokondrion kalvon potentiaali (Δ

ψ

m) samanaikaiseen julkaisun smac ja sytokromi c seuraa kaspaasi 9 ja 3/7 aktivointi on havaittu apoptoosin kautta sisäisen reaktiotien. Näin ollen, TMRE, fluoresoivaa väriainetta mittaamiseksi kalvon potentiaalia mitokondrioita käytettiin määrittämään Δ

ψ

m virtaussytometrialla (Fig. 4B). 5-FU aiheuttama menetys Δ

ψ

m, kuten ei-fluoresoivia soluja, väheni merkitsevästi (p 0,001) CALB2-vaiennettu p53

+ /+ HCT116-solut . 5-FU aiheuttama menetys Δ

ψ

m väheni myös merkittävästi (p 0,05) CALB2-vaiennettu p53

– /- solut. Tämä vaikutus varmistettiin toisella CALB2 siRNA sekvenssi (Fig. 4C), sulkee pois off-tavoite vaikutukset CALB2 siRNA. Lisäksi, Western blot-analyysi solukomponenttien fraktiot paljasti, että 5-FU-indusoidun menetys smac ja sytokromi c: n päässä mitokondriofraktiosta kumottiin CALB2-vaimennettu solut (Fig. 4D). Tämä oli samanaikainen kanssa alenemisesta smac ja sytokromi c vapautuu sytosoliin vastauksena 5-FU: n CALB2-vaimennettu soluissa. Lisäksi 5-FU-indusoidun kaspaasi 9 ja 3/7, mitattuna lusiferaasireportteri- perustuva tehtävä määrityksissä, oli merkitsevästi pienempi CALB2-vaimennettu solut (Fig. 4E). Ei merkittäviä eroja kaspaasin 8 aktivaation välillä ei havaittu CALB2-vaiennetaan solujen ja siRNA: kontrollit 72 h 5 uM 5-FU: n hoitoon (tietoja ei esitetty). Nämä tulokset edelleen viittaavat rooli CALB2 säätelyssä 5-FU aiheuttama, luontainen apoptoottisen reitin.

5-FU herkkyyttä CALB2-vaiennetaan solujen palautuu XIAP yhteistyössä hiljentäminen

edellä kuvattujen kokeiden osoittavat, että ylläpito mitokondrion kalvon potentiaalin säilyttäminen SMAC ja sytokromi c on mitokondrioita kanssa kaventumiseen kaspaasiaktiivisuus ovat kaikki liittyy lisääntynyt 5-FU resistenssin CALB2-vaiennetaan soluissa, mikä viittaa huonosti signaloinnin luontainen apoptoottisen reitin. Aiemmassa tutkimuksessa on ryhmämme osoittaneet apoptoosiresistenssiin myönnettyä vaarantunut luontainen apoptoottista polku voidaan ohittaa seuraavan XIAP hiljentäminen. XIAP estää kaspaasi 9 aktivaation kautta BIR3 domain ja kaspaasi 3 aktivaation kautta BIR2 domain. Smac julkaisu häiritsee vuorovaikutus XIAP kaspaasi 9 ja kaspaasi 3 [27], aktivoitumiseen johtavat näiden kaspaasien ja myöhempien apoptoosin. Me arveltu, että hiljentäminen XIAP voivat voittaa resistenssin 5-FU aiheuttama CALB2 hiljentäminen ohittamalla lohkon luontainen apoptoottisen reitin. Siksi vaikutus yhteistyössä hiljentäminen XIAP ja CALB2 5-FU vastetta tutkittiin. XIAP hiljentäminen in HCT116-soluissa käyttäen XIAP kohdistamisen siRNA varmistettiin Western blot (kuvio. 4F upotus). Apoptoottista osa solujen havaittiin virtaussytometrialla anneksiini V: n ja propidiumjodidin. Tämä osoitti jälleen, että 5-FU: n indusoiman apoptoosin vähensi merkitsevästi (p 0,05) CALB2-vaiennetaan soluja (Fig. 4F) katsoo, 5-FU: n indusoiman apoptoosin määrä oli lisääntynyt XIAP-vaiennetaan solut (p 0,05). Tärkeää on, että resistenssin 5-FU: n indusoiman apoptoosin myönnetty CALB2 hiljentäminen valtasi yhteistyössä hiljentäminen XIAP (p 0,01). GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina.