Krooninen sairaus

tiivistelmä

pisaroiden digitaalisen PCR (ddPCR) voidaan käyttää havaitsemaan matalan taajuuden mutaatioita onkogeenin-ajettu keuhkosyöpä. Valikoima

KRAS

pistemutaatioita havaitaan NSCLC edellyttää multiplex lähestymistapa tehokkaaseen mutaation havaitsemiseksi kiertävä DNA. Kirjoittajat raportoivat suunnitteluun ja optimointiin kolme syrjivä ddPCR multiplex määrityksissä tutkivat yhdeksän erilaista

KRAS

mutaatioita käyttämällä PrimePCR ™ ddPCR ™ mutaatio Analyysit ja Bio-Rad mX100 järjestelmä. Yhdessä nämä mutaatiot muodostavat 95% nukleotidin muutosten löytyy

KRAS

ihmisen syövässä. Multiplex reaktiot optimoitu genomista DNA: ta

KRAS

mutantti solulinjoissa ja testattu DNA uutetaan kiinteä kasvain kudosta kohortin keuhkosyöpäpotilaiden ilman aiempaa tietoa tietyn

KRAS

genotyyppi. Multiplex ddPCR määrityksissä oli toteamisraja on parempi kuin 1 mutantti

KRAS

molekyyliä 2,000 villityypin

KRAS

molekyylejä, jotka hyvin verrattuna raja havaitseminen 1 50 ensi sukupolven sekvensointi ja 1 10 Sanger sekvensointia. Multiplex ddPCR määrityksissä siten tarjoaa hyvin tehokkaan menetelmän tunnistaa

KRAS

mutaatioita keuhkoadenokarsinooma.

Citation: Pender A, Garcia-Murillas I Rana S, Cutts RJ, Kelly G, Fenwick K , et ai. (2015) Tehokas genotyypin

KRAS

Mutant ei-pienisoluinen keuhkosyöpä käyttäminen Multipleksoidut pisaroiden Digital PCR Approach. PLoS ONE 10 (9): e0139074. doi: 10,1371 /journal.pone.0139074

Editor: Giuseppe Viglietto, UNIVERSITY Magna Graecia, ITALIA

vastaanotettu: 12 helmikuu 2015; Hyväksytty: 09 syyskuu 2015; Julkaistu: 28 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Pender et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat kiitollisena tunnustavat tueksi työn National Health Service (Englanti) kautta rahoitusta National Institute for Health Research Biomedical Research Centre The Royal Marsden Hospital. He myös kiitollisena tunnustavat rahoitusta Institute of Cancer Research and Cancer Research UK, ositettu Medicine ohjelma. Tämä tutkimus tuki myös osittain Revere Charitable Trust, rajoittamattoman koulutus avustusta Pierre-Fabre Ltd, European Research Council Advanced Grant RASTARGET ja Wellcome Trust Senior tutkija Award, 103799 /Z /14 /Z. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: rahoitus työlle Pierre-Fabre Ltd. ei edusta kilpailevan kiinnostusta mihinkään kirjoittajien, eivätkä muut asiaan liittyvä ilmoitus työhön, konsultointi, patentit, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteita tarvitaan. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti [1] ja yli 20 000 jättämisestä pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) diagnosoitiin Britanniassa vuonna 2012 [2]. Yleisimmin muuntunut onkogeenien keuhkoadenokarsinooma ovat

RAS

perheen GTPaaseja ja

EGFR

(25% ja 15% vastaavasti [3]). Tieto molekyyliprofiilin kehittyneiden keuhkojen adenokarsinooma on kriittinen terapeuttista päätöksenteon [4] ja erityisesti sen käytön EGFR ja ALK-tyrosiinikinaasin estäjät [5,6]. Läsnäolo

KRAS

mutaatio voi myös olla terapeuttista merkitystä, jos MEK: n estäjä ja taksaania yhdistelmät osoittautuvat tehokkaiksi tässä potilasryhmässä kohortissa [7]. Saada riittävästi kasvain kudosta ratkaisevia genotyypitykseen keuhkosyöpä voi olla ongelmallista, mutta [8]. Pisara digitaalinen PCR (ddPCR) on herkkä kvantitatiivisia mutaation havaitseminen [9,10], että on mahdollista tarkasti genotyypin potilaasta peräisin materiaalin pienen määrän lähtöainetta.

havaitseminen

KRAS

hotspot mutaatioiden ddPCR on rajoitettu erilaisia ​​mahdollisia alleelien vierekkäisissä loci, vaikka jotkut

KRAS

mutaatioita esiintyy useammin syöpään kuin toiset (taulukot 1 ja 2). Neljä yleisin mutaatiota osuus 80% kaikista KRAS nukleotidin muutokset löydetty ihmisen syövissä (85% kaikista muutoksista NSCLC), kun taas yhdeksän yleisin mutaatioiden osuus 95% kaikista muutoksista ja 97,5% muutoksista NSCLC. Fluorofori-merkitystä digitaalinen PCR-koettimien täydentää tietyllä mutantti-DNA-sekvenssi ja niin vain havaita yksi erityinen

KRAS

mutaatio. Näitä määrityksiä käyttäen on duplex koettimena mutantti alleeli, ja koettimena villityypin alleelin avulla mutantti alleeli Murtolukulaskenta tietyn mutaation, mutta tämä lähestymistapa edellyttää mahdollisesti useita määrityksiä ja käyttää enemmän materiaalia, ennen kuin oikea tunnistaminen genotyyppi. Kehittäminen multiplex määrityksestä, joka yhdistää useita eri mutantti koettimia samassa reaktiossa on näin ollen houkutteleva vaihtoehto. Multiplex

KRAS

digitaalinen PCR-määrityksissä on kuvattu käyttäen sadepisara ™ Digital PCR -järjestelmää (Raindance Technologies, Billerica, Massachusetts, USA) pitkälle peräsuolen syövän [11] mutta ei vielä kanssa Bio-Rad mX100 järjestelmä, edullinen digitaalinen PCR, jossa kaupallisesti saatavilla koettimia useita

KRAS

mutaatioita, eikä ole multiplex työkalua on käytetty keuhkosyöpään.

Lähdimme suunnittelemaan multiplex digitaalinen PCR-määrityksissä, jotka täsmällisesti yhdeksän eri

KRAS

mutaatioiden ja osoittaa soveltaa näitä määrityksiä potilaalle johdetun materiaalin käyttäen Bio-Rad mX100 järjestelmä.

Materiaalit ja menetelmät

Digital PCR tinmääritysmenetelmillä

Jokainen digitaalinen PCR koetin on oligonukleotidi spesifinen kiinnostuksen kohteena olevan alueen, jossa on 5 ’fluoroforin ja 3’ sammuttaja. Fluorofori on joko HEX varten spesifisiä koettimia villityypin sekvenssit tai FAM mutantti-koettimia.

KRAS

c.35G T (G12V; kissa ei. DHsaCP2500592), c.35G A (G12D; kissa ei. DHsaCP2500596), c.35G C (G12A; kissa ei. DHsaCP2500586), c .34G A (G12S; kissa ei. dHsaCP2500588), c.34G C (G12R; kissa ei. dHsaCP2500590), c.34G T (G12C, dHsaCP2500584), c.37G T (G13C; cat no. dHsaCP2500595 ), c.38G A (G13D; kissa ei. dHsaCP2500598), c.183A C (Q61H; kissa ei. dHsaCP2000133), WT c.35G T (WT G12V, kissa ei. dHsaCP2500593), WT c.35G A (WT G12D, kissa ei. dHsaCP2000002), WT c.35G C (WT G12A; kissa ei. dHsaCP2000004), WT c.34G A (WT G12S, luettelonro. dHsaCP2000012 ), WT c.34G C (WT G12R, kissa ei. dHsaCP2000010), WT c.34G T (WT G12C, kissa ei. dHsaCP2000008), WT c.37G T (WT G13C; cat no. dHsaCP2500595), WT c.38G A (WT G13D, kissa ei. dHsaCP2000014) ja WT c.183A C (WT Q61H; kissa ei. dHsaCP2000132) 20x PrimePCR ™ ddPCR ™ mutaatio Analyysit (joka sisälsi molempien alukkeiden ja ddPCR koettimet) ostettiin Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornia, USA) ja käytettiin tässä tutkimuksessa.

Pitoisuus optimointi ja DNA: n kvantifiointiin

Digital PCR-määrityksissä optimoitiin käyttämällä solulinjaa genomista DNA (gDNA) tai synteettisiä oligonukleotideja tarvittaessa. Käytetyt solulinjat tätä tutkimusta varten autentikointia STR profiloinnilta Cell Services laitokseen Cancer Research UK London Research Institute ja Institute of Cancer Research. Näihin sisältyvät NCI-H727 (

KRAS

G12V, keuhko), NCI-H358 (

KRAS

G12C, keuhko), A549 (

KRAS

G12S, keuhko), SK- LU-1 (

KRAS

G12D, keuhko), A427 (

KRAS

G12D, keuhko), HCT-116 (

KRAS

G13D, paksusuoli) ja NCI-H1975 (

KRAS

WT, keuhko). Kaikki solulinjat saatiin suoraan Cancer Research UK Cell palvelut lukuun ottamatta HCT-116 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA; kat. No ATCC

®CCL-247

TM). Solujen gDNA eristettiin käyttäen DNeasy ™ Blood and Tissue Kit (Qiagen, Venlo, Limburg, Alankomaat) kohti valmistajan ohjeiden mukaan. DNA käytettiin seuraavissa digitaalisen PCR-reaktiot, paitsi synteettisiä oligonukleotideja, kvantifioitiin on mX100 ddPCR järjestelmän avulla ihmisen RNaasi P TaqMan® kopiomäärän Viite-määritys (Life Technologies Corporation, Carlsbad, Kalifornia, USA). 1 ui eluaattia lisättiin digitaalisen PCR-reaktio sisälsi 10 ui ddPCR Supermix anturien (Bio-Rad) ja 1 ui TaqMan kopiomäärän Viite Pitoisuus, ihmisen, RNaasi P (Life Technologies) on kokonaistilavuudessa 20 ui. Reaktio jaettiin ~ 14000 pisaroiksi per näyte QX-100 pisaran mukainen generaattori valmistajan ohjeiden mukaisesti. Emulgoitu PCR-reaktiot ajettiin 96-kuoppaisen levyn (Eppendorf, Stevenage, UK) G-Storm GS4 lämpösyklilaitteeseen (G-Storm, Somerton, Somerset, UK) inkuboimalla levyjä 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 60 sekuntia, mitä seurasi 10 min inkubaatio 98 ° C: ssa. Lämpötila ramppi lisäys oli 2,5 ° C /sek kaikissa vaiheissa. Levyt luettiin Bio-Rad QX-100 pisara lukija käyttäen QuantaSoft v1.4.0.99 ohjelmisto (Bio-Rad). Ainakin yksi negatiivinen kontrolli kuoppiin ilman DNA: ta sisältyy jokaiseen aikavälillä. Määrä monistettavissa RNaasi P DNA kvantifioitiin keskittymän tarjoamia ohjelmisto. Kvantifioinnin jälkeen, solulinja-DNA pilkottiin käyttämällä Hind 3-HF ™ restriktioentsyymillä (New England BioLabs, Ipswich, Massachusetts, USA) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan.

pisaroiden digitaalisen PCR KRAS mutaation havaitsemiseen

PCR reaktioseokset valmistettiin kokonaistilavuudessa 20 ui, joka sisälsi: 10 ui 2x Supermix varten Probes ilman dUTP (Bio-Rad), asiaankuuluvat aluke koetin määrityksiä, DNA (vaihteleva tilavuus) ja nukleaasitonta vettä (Life Technologies Corporation, Carlsbad, Kalifornia, USA). Useita kaivoja käytettiin tarvittaessa analysoida tarvittavat DNA eluaatti. Vähintään 500 pg vastaava DNA eluaattia analysoitiin kussakin multiplex määrityksessä kullekin potilaalle. 20 ui PCR-reaktioseos siirrettiin näyte hyvin kertakäyttöiseen pisaran generaattori kasetti (Bio-Rad). 70 ui pisaran sukupolven öljyä (Bio-Rad), pantiin sitten öljyn ja kunkin kanavan ja kasetti laitettiin mX100 pisaroiden Generator (Bio-Rad). Pisarat siirrettiin sitten 96-kuoppaiselle PCR-levylle. Emulgoitu PCR-reaktiot ajettiin G-Storm GS4 lämpösyklilaite inkuboimalla levyjä 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä 94 ° C 30 sekuntia ja 54 ° C: ssa 60 sekuntia, mitä seurasi 10 min inkubaatio 98 ° C. Lämpötila ramppi lisäys oli 2,5 ° C /sek kaikissa vaiheissa. Levyt luettiin Bio-Rad QX-100 pisara lukija käyttäen QuantaSoft v1.4.0.99 ohjelmistoja Bio-Rad. Ainakin yksi negatiivinen kontrolli hyvin ilman DNA sisältyy jokaiseen aikavälillä. Jokainen kuoppa luettiin sitten käyttäen mX100 pisaroiden Reader (Bio-Rad) ja pisarat analysoitiin päästö HEX tai FAM aallonpituuksia. Kaksiulotteinen amplitudi tonttien näytetään mitattu HEX ja FAM amplitudi kunkin pisaran osoittaa neljästä pisara väestö; pisaroita, joissa ei ole monistettu DNA, pisaroita vain mutantti-DNA ja korkea FAM amplitudi, pisaroita vain villin tyypin DNA ja korkea HEX amplitudi ja pisarat sekä villityypin ja mutantti monistettu DNA ja korkea FAM ja HEX amplitudi. Jos useita kopioita villityyppi- ja mutantti-DNA sisältyvät samaan pisara, pisarat, joilla on korkeampi FAM ja HEX amplitudi luetaan. Nämä pisarat on jätetty analyysien koko tämän tutkimuksen.

Digital PCR-analyysillä

arvioimiseksi mutantti alleeli jae, pitoisuus mutantti-DNA (kopiota mutantti-DNA pisaraa kohden) arvioitiin Poisson-jakauman. Lukumäärä mutantti kopiota pisara MMU = -ln (1- (NMU /n)), missä NMU = määrä pisaroita positiivisia mutantti FAM-koetinta ja n = kokonaismäärä pisaroita. DNA: n konsentraatio reaktiossa oli arvioitu seuraavasti: MDNAconc = -ln (1- (nDNAcon /n)), jossa nDNAconc = määrä pisaroita positiivisia mutantti FAM-koetinta ja /tai villityypin HEX koetin ja n = kokonaismäärä pisaroita. Mutantti alleeli jae = MMU /MDNAconc. Mitatut mutantti alleeli taajuus kuvataan mutantti alleeli jae ilmaistuna prosentteina.

FFPE kudosten DNA pääsy ja louhinta

formaliinilla parafiiniin (FFPE) kasvain näytteet pienisoluista keuhkosyöpää ylijäämä kliinisen hoidon olivat kerätään kirjallinen potilaan suostumuksella The Royal Marsden NHS Foundation Trust. FFPE kudos-DNA uutettiin (sen jälkeen, kun macrodissection tarvittaessa varmistaa 10% kasvaimen sisältöä) käyttäen Qiagen DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen), kuten valmistajan ohjeiden. Eluoitu DNA säilytettiin -20 ° C: ssa.

Ethics selvitys

Kaikki potilaat kunhan kirjallinen suostumus tämän tutkimuksen (etiikka hyväksyntä 13 /LO /1389, NRES komitea Lontoo-Central), joka sisällytetty ylijäämä somaattisten DNA Cancer Research UK Stratifioitu Medicine ohjelma (etiikka hyväksyntä 11 /EE /0202, NRES komitea Itä-Englanti).

Sangerin sekvensoinnilla

kiinnostava alue monistettiin käyttäen 10 uM eteenpäin (5′-TATTATAAGGCCTGCTGAAAATG-3 ’) ja reverse (5′-TTGGATCATATTCGTCCACAA-3’) alukkeina, 10 ui Amplitaq Gold® PCR Master Mix (Life Technologies) ja 3 ng templaatti FFPE peräisin olevan DNA: n tai 5 ng gDNA. PCR-olosuhteet olivat kohti valmistajan suositusten mukaisesti. Puhdistettu PCR-tuote sitten tehtiin edelleen PCR-vaiheessa käyttäen ketjun päättävä dideoksinukleotidejä (BigDye® 1,0, Life Technologies) ja myöhemmin DNA-sekvenssi luettiin automatisoidulla sekvensserin.

Ion torrent protoni sekvensointi

Sequencing kirjastot valmistettiin Ion AmpliSeq ™ Cancer hotspot Panel v2 (Life Technologies) käyttäen Ion AmpliSeq kirjaston valmistaminen protokollaa 3-5ng DNA, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen viivakoodaus, kirjastot kvantitoitiin käyttäen qPCR ja laimennetaan 100 pM. Kirjastot olivat malleihin kanssa Ion OneTouch2 järjestelmän (Life Technologies) ja sekvensoitiin PI sirun avulla Ion PI OT2 200 Kit (Life Technologies), 520 virtojen ja keskimääräinen amplikoni pituus 112 emästä on keskisyvyys x2721307. Sekvensointi johti 45272-11767856 lukee näytettä kohti.

Ion torrent Variant soittajan v4.0-r73742 ilman hotspot alueen ja konfigurointi ”Germ Line löysissä” käytettiin soitosta variantteja. Lue laskee kaikilla paikoilla laskettiin käyttäen pileupin (SAMtools v1.1 [12]) ja kyseiset tiedot analysoitiin mahdollisista vaihtoehdoista käyttämällä mukautettuja Perl ja R skriptejä. Muunnelmat 3% raportoitu sekä analyysimenetelmät ja ei ilmoiteta 1000 Genomes Project tietokanta (www.1000genomes.org) havaittiin mahdollinen somaattisia mutaatioita. Aineisto rajat viitataan vastaan ​​Cosmic tietokannan V70 (cancer.sanger.ac.uk) tunnistamaan mahdolliset hotspot mutaatioita.

Tilastollinen

Lineaarinen regressio suoritettiin käyttäen kaavaa r

2 = 1- (SS

reg /SS

tot), jossa SS

reg viittaa neliöiden summa on etäisyydet parhaiten sopivaa lineaarista regressiosuoran ja SS

tot viittaa summa neliöt pystyetäisyydet peräisin nollahypoteesi (y = keskiarvo kaikkien y arvot) käyttäen GraphPad Prism versio 6.0a (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornia, USA).

KRAS multiplex spesifisyyttä

92 kuoppiin

KRAS

villin tyypin gDNA analysoitiin jokaisen multiplex. Toteamisrajan asetettiin 0,05% heijastavat mittaustulokset piikkitelalla

KRAS

mutantti gDNA lajeja (S8 kuvio). Yksittäiset pisarat ryhmiteltiin niiden HEX amplitudi kahteen ryhmään käyttäen kMeans algoritmia. Kynnys mutantit arvioitiin perustuen 1,5 kertaa mediaani FAM-arvot näiden tippaa, jotka kuuluvat klusterin korkeampi HEX luokkia. Vääriä positiivisia ”mutantti” pisaroita luokiteltiin pisaroita, jotka olivat alhaisemmat HEX klusterin, mutta joiden FAM arvo ylittää kynnysarvon pohtimaan FAM ja HEX amplitudit mitataan tahansa KRAS mutantti lajien testataan kyseisessä multiplex määrityksessä. Väärä positiivinen tulos määriteltiin kolme vääriä positiivisia ”mutantti” pisaroita kohti Rare Mutaatio Detection Best Practices suuntaviivat [13]. Arvioida konkreettisesti, laskimme binomisen todennäköisyys saavuttaa vähemmän kuin kolme ”mutantti” pisaroita per 6000 villityypin pisaroita kunkin multiplex määrityksen.

Tulokset

KRAS

mutaatio duplex ddPCR

Testasimme kaikki

KRAS

ddPCR määrityksissä erikseen poikki lämpökäsittelylämpötilaan kaltevuus optimoimiseksi lämpösykliolosuhteita. Kukin määritys testattiin sopivan gDNA tai oligonukleotidi yksin ja sitten duplex villiin ja

KRAS

mutantti-DNA ja sekä asiaan FAM ja HEX koettimia läsnä. Vähenevät hehkutus lämpötila nousi FAM amplitudi mutantti koetin tasanteelle 54 ° C: ssa

KRAS

G12V, D, A, S, R ja C sekä G13C ja 13D koettimet (kuvio 1).

KRAS

Q61H koetin oli edelleen vähäinen nousu FAM amplitudiltaan 53.4 ° C verrattuna 54 ° C. Kaikki koettimet testattiin oli hyvä erottelu neljästä eri pisara ryhmää 54 ° C: ssa, joka mahdollistaa selvästi lueteltu eikä määritetty erilaisten DNA populaatioiden.

Droplet väestön havaittu kunkin duplex määrityksessä testattiin villin tyypin ja asiaa mutantti solulinja gDNA tai oligonukleotidi optimaalisella hehkutus lämpötila esim G12V paneeli vasemmassa yläkulmassa näkyy pisara populaatiot nähty WT G12V määritystä, G12V määritys, NCI-H727 gDNA ja NCI-H1975 gDNA läsnä. HEX amplitudi on jopa 6000 x-akselilla ja FAM amplitudi jopa 11000 y-akselin kunkin paneelin. Avain: Musta drops- tyhjä pisaroita, blue-mutantti-DNA FAM positiivinen pisaroita, vihreä- villityyppisen DNA HEX positiivinen pisaroita, ruskea-villityypin ja mutantti-DNA kaksinkertainen positiivinen pisaroita.

KRAS

multiplex ddPCR määrityksen suunnittelu

Suunnittelimme digitaalisen PCR-pohjainen multiplex työkalu seuloa yleisimpiä

KRAS

mutaatioita keuhkoadenokarsinooma; G12C, G12D ja G12V (https://www.sanger.co.uk/cosmic). Villityypin koetin määrityksissä jokaisen mutaation testattiin yhdessä erilaisina pitoisuuksina mutantin koettimen määrityksiä, jotka aiheuttavat mutantti pisara populaatioiden vaihtelevan FAM amplitudi (kuva 2). HEX amplitudi kaikkia villityypin koetin määrityksissä havaittiin olevan hyvin samanlainen ja siten WT G12C, WT G12V ja WT G12D määritykset valittiin viittaukset kaikkiin myöhempiin

KRAS

G12 ja G13 mutantti määritykset . Niistä erilaisia ​​yhdistelmiä mutantti määrityksiä kokeiltu, multiplex määritys, joka antoi parhaan erottaminen pisaran väestön käytetty 900 nM alukkeita ja 500 nM G12C koetin, 562,5 nM alukkeita ja 312,5 nM G12D koetin ja 225 nM alukkeita ja 125 nM G12V anturi (kuvio 2 , vasemman paneelin yläreunassa).

KRAS

G12C mutantti pisara populaatiot merkitty punaisella katkoviivalla neliö,

KRAS

G12D mutantti väestön sinisellä katkoviivalla neliö ja

KRAS

G12V mutantti väestö on keltainen katkoviiva neliö. Jokainen multiplex määritys, jossa yhdistyvät kaikki asiaankuuluvat FAM ja HEX määrityksissä,

KRAS

WT gDNA ja G12V, D ja C mutantti gDNA, näkyy yläpaneelissa. Vastaava duplex määritys kunkin mutaation, käyttäen samoja FAM ja HEX määritys konsentraatio

KRAS

WT DNA ja tarvittavaa

KRAS

mutantti-DNA läsnä, on esitetty paneelien alla jokaisen multiplex määrityksen. Multiplex 1 (ylhäällä vasen paneeli) on määritys yhdistelmä 900 nM alukkeita ja 500 nM G12C koetin, 562,5 nM alukkeita ja 312,5 nM G12D koetin ja 225 nM alukkeita ja 125 nM G12V anturin 450 nM alukkeita ja 250 nM WT G12C anturi. Multiplex 2 käyttää samaa pitoisuutta G12V ja WT G12C määrityksessä Multiplex 1 lisäksi sisältää 450 nM alukkeita ja 250 nM G12C koetin ja 675 nM alukkeita ja 375 nM G12D anturi. Multiplex 3 käyttää samaa pitoisuus

KRAS

mutantti määrityksiä kuten Multiplex 2 mutta WT G12V koetin määritystä läsnä, käytetään samassa konsentraatiossa kuin WT G12C määritystä kanavanipussa 1. multiplex 4 on määritys yhdistelmä G12C määrityksen kuten Multiplex 2 225 nM alukkeita ja 125 nM G12D koetin ja 675 nM alukkeita ja 375 nM G12V koetin kanssa WT G12D määritys samassa pitoisuudessa kuin WT G12C määritystä Multiplex 1. Key: musta – tyhjä pisarat, sini- mutantti-DNA FAM positiivinen pisaroita, vihreä- villityyppisen DNA HEX positiivinen pisaroita, ruskea-villityypin ja mutantti-DNA kaksinkertainen positiivinen pisaroita. Samaa asteikkoa käytetään kaikissa paneelien (HEX amplitudi jopa 7000 ja FAM amplitudi jopa 22000).

Kyky testata useita

KRAS

mutaatioita auttaisi havaitsemaan sub -clonal populaatiot soveltamalla multiplex lähestymistavan kliinistä näytettä, joista lähtömateriaali on niukasti. Mallintaa tätä, käytimme solulinjaan peräisin gDNA varten kolme mutaatiota ja testattu sen kukin koetin duplex varmistaa spesifisyyden (S1 Kuva). Läsnä on G12D mutantti koetin ja

KRAS

G12D, V ja C mutantti-DNA, toinen mutantti populaatio pisaroiden havaittiin alemmalla FAM amplitudin G12D mutantti-DNA-populaation (punainen haudottu laatikko, vasen ylin paneeli ). Tämä populaatio ei havaittu, kun kukin mutantti-DNA lajin testattiin duplex kanssa G12D anturi (vasen toinen paneeli). Samanlainen toinen mutanttipopulaation havaittiin kanssa G12V mutantti koetin ja kaikki kolme mutantti-DNA-lajeja verrattuna kunkin mutantin DNA kaksipuolinen (vasen alempi paneeli). Tämä toinen populaatio, varsinkin kun nähty G12D mutantti koetin, kaatuisi odotettu FAM amplitudi eri

KRAS

mutaatio multiplex määrityksessä ja johtaa vääriä positiivisia mutaation havaitsemiseen. Edelleen tutustua, FFPE kudos yksilön DNA: ta tiedetään olevan

KRAS

12/13 mutaatio (F124), varmennettuna Cobas® testaus (Cobas®

KRAS

mutaatiotesti, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) analysoitiin (S1 kuvio, oikea paneeli). Multiplex määritys havaitsi mutantti tippojen kanssa FAM amplitudi joka tulkittiin G12D tai G12V mutaatio. Kun näyte testattiin kunkin duplex määrityksessä erikseen, ei mutanttipopulaation joko G12V tai G12C havaittiin, kun taas väestö pienemmällä FAM amplitudi odotettua kanssa G12D mutantti määrityksessä havaittiin. Myöhempiä sekvensointi ja edelleen kehittäminen digitaalisen PCR-analyysi kudoksen DNA, tämä näyte tunnistettiin myöhemmin

KRAS

G12A mutantti (taulukko 3).

Cross-reaktiivisuus

KRAS

koetin määrityksiä yhdistelmä

Koska tiivistä yhtäläisyyksistä DNA-sekvenssit eri

KRAS

mutaatioita, merkittäviä ristireaktiivisuutta välillä todettiin koettimia suunniteltu mutaatioita samalla alueella. Tämä oli erityisen selvää koettimilla suunniteltu vaihdot samaan nukleotidin eli

KRAS

G12V, D ja A ja

KRAS

G12S, R ja C. ristireaktiivisuus anturin määrityksen kanssa ” paritonta ”DNA kuljettaa eri

KRAS

mutaatio (S2 ja S3 kuvissa) johtaa tippojen vaihtelevan FAM ja VIC amplitudit suhteellisen lähellä tyhjän tippojen ja toinen väestö lähellä todellista villityypin tippojen . Asema näistä ylimääräisistä pisaran populaatioiden sanelee suunnittelu multiplex määritysten vähennetään mahdollisia virheelliset tulkinnat

KRAS

genotyypit. Siksi kolme multiplex määritykset suunniteltiin kullekin yhdistää koettimena mutaation nukleotidipositiossa 35, koettimena mutaation asemassa 34 ja koettimena mutaation joko asemassa 37, 38 tai 183.

KRAS

multiplex ddPCR määrityksen optimointi

Multiplex A on yhdistelmä FAM määritykset

KRAS

G13C, G12C ja G12V. Useita erilaisia ​​yhdistelmiä mutantin koettimen pitoisuudet testattiin ja käyttämällä villityypin anturi G12C ja G13C vaihtelevina pitoisuuksina (S4 kuvassa). Oli merkittävää päällekkäisyyttä HEX amplitudi villityypin pisaran väestön ja läheisyyden vuoksi asianomaisen nukleotidiemästen ja arvioitu koettimen pituus, katsottiin, että 450 nM alukkeita ja 250 nM G12C, V tai D villin tyyppi koetin oli riittävä kvantifiointiin sekä G12 ja G13 villityypin populaatiot. Optimaalinen multiplex määritys (S4 kuvio, ylhäällä vasemmalla paneeli) käsitti 900 nM alukkeita ja 500 nM G13C mutantti koetin, 450 nM alukkeita ja 250 nM G12C koetin ja 225 nM alukkeita ja 125 nM G12V anturi. Multiplex B on yhdistelmä FAM määritykset

KRAS

G12S, G12D ja G13D. Kaikista testatut pitoisuudet, optimaalinen yhdistelmä mutantti koetin määrityksissä oli 675 nM alukkeita ja 375 nM G12S anturi, 450 nM alukkeita ja 250 nM G12D koetin ja 225 nM alukkeita ja 125 nM G13D koetin (S5 kuvio, ylhäällä vasemmalla paneeli). Multiplex C analyysit

KRAS

mutaatioita G12R, G12A ja Q61H. Se vaatii villityypin koetin sekä G12 /13-asemassa ja Q61 kanta tarkkaan kvantifiointiin mutanttialleelin taajuus. Määritys optimoitu 450 nM alukkeita ja 250 nM G12C koetin ja 900 nM alukkeita ja 500 nM Q61H koetin kuin villityypin määrityksissä. Paras erottaminen mutantti pisaran populaatioiden saavutettiin käyttämällä 675 nM alukkeita ja 375 nM G12R anturi, 450 nM alukkeita ja 250 nM G12A koetin ja 900 nM alukkeita ja 500 nM Q61H mutantti koetin (S6 kuvio, ylhäällä vasemmalla paneeli).

Kaikki optimoitu multiplex määritykset (kuvio 3) testattiin ristireaktiivisuutta eri lajien

KRAS

mutantti-DNA (S7 kuvio). Ei ole päällekkäisiä halutun pisaran populaatiot ja väestön muiden

KRAS

mutantti-DNA-lajeja kaikilla kolmen kanavanipun. Lisäksi asema pisaran populaatioiden vuoksi ristireaktiivisuus on hyvin toistettavissa ja voidaan alkaa selvittää, mitkä

KRAS

genotyyppi on läsnä multiplex määrityksessä sisältää muita mutantti antureista.

Multiplex A (ylin vasen paneeli) on määritys yhdistelmä 900 nM alukkeita ja 500 nM G13C anturi (punainen katkoviiva neliö), 450 nM alukkeita ja 250 nM G12C anturi (sininen katkoviiva neliö) ja 225 nM alukkeita ja 125 nM G12V koetin (keltainen murskautuvat neliö). Multiplex B (ylin keskimmäinen paneeli) on määritys yhdistelmä 675 nM alukkeita ja 375 nM G12S anturi (punainen katkoviiva neliö), 450 nM alukkeita ja 250 nM G12D anturi (sininen katkoviiva neliö) ja 225 nM alukkeita ja 125 nM G13D koetin (keltainen murskautuvat neliö). Multiplex C (ylhäällä oikealla paneeli) on määritys yhdistelmä 675 nM alukkeita ja 375 nM G12R anturi (punainen katkoviiva neliö), 450 nM alukkeita ja 250 nM G12A anturi (sininen katkoviiva neliö) ja 900 nM alukkeita ja 500 nM Q61H koetin (keltainen murskautuvat neliö). Multiplex C on 900 nM alukkeita ja 500 nM Q61H villityypin koetin lisäksi G12C villityypin määrityksessä. Kaikki muut villityypin pisara väestön esitetty, paitsi Q61H duplex määritys, ovat 450 nM alukkeita ja 250 nM G12C villityypin koetin. Kaikki paneelit vasemmalle ja keskelle sarakkeissa FAM amplitudi jopa 18000 ja HEX amplitudi jopa 6000. Paneelit oikeassa sarakkeessa on FAM amplitudi jopa 18000 ja HEX amplitudi jopa 11000

KRAS

multiplex ddPCR määrityksen luonnehdinta

Vähentämällä määriä NCI-H358 (

KRAS

G12C) ja A549 (

KRAS

G12S) gDNA terästettiin osaksi

KRAS

villin tyypin gDNA (NCI-H1975) ja testattiin sopiva

KRAS

multiplex määrityksen. Toteamisrajan varten

KRAS

G12C mutantti-DNA: multiplex A oli 0,03% ja

KRAS

G12S DNA multiplex B oli 0,045% (S8 kuvio, ylälevyissä) Mitattu mutantti alleeli taajuus korreloivat hyvin vähenee määriä piikki

KRAS

mutantti gDNA vuonna kanavanipuissa A ja B (r2 = 0,9992 ja 0,0998 vastaavasti), jotka osoittavat lineaarisuutta mutaation havaitseminen multiplex määrityksissä. Mutant alleelifrekvensseiltään ilmeni vähän sisäisiä hyvin vaihtelu joko multiplex määrityksen ja korkea toistettavuus kahden eri operaattorin kolmella toinen päivä eri alleelin taajuuksilla (S8 kuvio, keski ja pohja-paneelit).

Samankaltaisia ​​

KRAS

alleelin esiintymistiheys havaittiin käyttäen multiplex tai duplex määrityksissä molemmissa solulinjassa DNA (yksittäinen laji

KRAS

mutantti gDNA ja yhdistelmät

KRAS

mutantti gDNA vaihtelevilla alleelifrekvenssit) tai oligonukleotidien ja FFPE kudoksen DNA: ta (kuvio 4; r2 = 0,9302 ja 0,9542 vastaavasti).

analysoitiin useita kuoppiin NCI-H1975

KRAS

villityypin gDNA kanssa kunkin kolmen

KRAS

multiplex määrityksiä ja lasketaan todennäköisyys vääriä positiivisia mutaation havaitseminen, jossa määritysrajan 0,05% heijastavat mittaustulokset piikkitelalla

KRAS

mutantti gDNA lajeja (S8 kuvio). Spesifisyys jokaisen multiplex on 99,99995%, 99,99857% ja 99,85578% Kanavanippujen A, B ja C (S1 taulukko).

vertailu

KRAS

multiplex määrityksen mutantti tunnistus Sangerin sekvensoinnilla

erilaisia ​​näytteitä sisältävien laskussa määriä NCI-H358 (

KRAS

G12C) tai A549 (

KRAS

G12S) gDNA oli lisätty

KRAS

villin tyypin DNA (NCI-H1975) olivat samanaikaisesti analysoitiin käyttämällä digitaalista PCR ja Sanger sekvensoinnilla.

KRAS

G12C mutantti-DNA oli havaittavissa käyttämällä kanavanipussa alas mutanttialleelin taajuus 0,2%, kun taas mutantti piikin kromatogrammin on vain näkyvissä mutantti alleeli taajuudella 31,5% ja alle 10% (S9 Kuva, top paneelit).

KRAS

G12S mutantti-DNA edelleen havaittavissa digitaalisen PCR: llä käyttäen kanavanipun B mutantti alleelin frekvenssi 0,1%, mutta on näkyvissä vain käyttämällä Sangerin sekvensointia 17%. (S9 kuvio, alempi paneeli).

havaitseminen

KRAS

mutaatioita FFPE kudoksessa DNA

FFPE kudosta DNA: ta 11 tapausta kehittyneiden

KRAS

mutantti NSCLC (S2 taulukko) analysoitiin käyttämällä kutakin multiplex määritystä. Läsnäolo

KRAS

12/13 mutaatio tunnetaan ennen Cobas® testaus (Cobas®

KRAS

mutaatiotesti, Roche), mutta tutkijat sokaisi erityisten

KRAS

genotyyppi. Vähintään yksi

KRAS

mutaatio havaittiin kussakin tapauksessa ja kahdessa tapauksessa oli kaksi havaittavissa

KRAS

klooneja (kuvio 5). Mutaatiot vahvistettiin sopivalla duplex määrityksessä. Alhainen taajuus G12D mutaation tapauksessa S011 voi edustaa FFPE artefakti johtuen usein Deaminoimalla guaniininukleotidit aikana kudoksen säilyttämisen prosessi [14]. G12F mutaatio S018 tunnistettiin myöhemmin sekvensoimalla kudosnäytteen jälkeen tarkkailuun ristireaktioita tippojen kaikissa multiplex määrityksissä. Lisäksi kaksi lajia KRAS mutantti gDNA terästettiin osaksi taustalla

KRAS

villin tyypin DNA (NCI-H1975) gDNA luoda kolme näytettä, joka sisältää suuria ja pieniä KRAS klooni; C1 on yhdistelmä NCI-H358 (

KRAS

G12C) ja A549 (

KRAS

G12S) gDNA, C2 on yhdistelmä NCI-H358 (

KRAS

G12C) ja A427 (

KRAS

G12D) gDNA ja C3 on yhdistelmä A427 (

KRAS

G12D) ja A549 (

KRAS

G12S) gDNA. Kaikki KRAS lajit olivat havaittavissa käyttäen KRAS multiplex määrityksissä, mukaan lukien pienet klooneja alas mutantti alleelin frekvenssi 0,3% mitattiin

KRAS

G12D mutantti-DNA-näytteen C3 (kuvio 6).